Ocena funkcji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych podczas zakażenia malarią

W tej pracy opisujemy protokoły do badania roli pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) uwalnianych przez erytrocyty zakażone Plasmodium falciparum. W szczególności skupiamy się na interakcjach EV z komórkami śródbłonka.

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie funkcji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych uwalnianych przez czerwone krwinki zakażone pasożytem malarii. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie malarii, takie jak to, w jaki sposób pasożyty regulują komunikację pasożyt-gospodarz. Główną zaletą tej techniki jest wizualizacja pęcherzykowego zębów przez komórki indoterot w ramach badania funkcji regulacyjnej pęcherzykowego RNA przez komórki indoterot.

Procedurę zademonstrują Mya Alondez, Smartin Bagu i Bayo Babatunde, wszyscy absolwenci z mojego laboratorium. Do probówki mikrowirówkowej dodać 100 mikrogramów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych i jeden mililitr soli fizjologicznej buforowanej fosforanami. Następnie odwiruj pęcherzyki zewnątrzkomórkowe z maksymalną prędkością 20 000 razy g przez siedem minut, aby utworzyć osad.

Po zakończeniu wirowania wyrzucić supernatant bez naruszania osadu. Następnie rozpuść osad pęcherzyka zewnątrzkomórkowego w 100 mikrolitrach rozcieńczonego C.To zapewnij pełne wymieszanie, kilkakrotnie go odpipetować. Następnie, w nowej probówce do mikrowirówki, dodaj cztery mikrolitry roztworu barwnika etanolowego PKH67 do 100 mikrolitrów dilmantu C. Następnie dobrze zwiruj mieszaninę.

Przygotuj 40-mikromolowy roztwór barwnika 2XPKH67 tuż przed procesem barwienia. Następnie szybko połącz 100 mikrolitrów dwóch x zewnątrzkomórkowej zawiesiny pęcherzykowej z równą objętością etanolowego roztworu barwnika PKH67. Następnie odpipetować mieszaninę 10 razy, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie.

Po całkowitym wymieszaniu inkubować pęcherzyk zewnątrzkomórkowy i etanolowy roztwór barwnika PKH67 przez pięć minut z dala od światła. W trakcie inkubacji kontynuuj wirowanie mieszaniny trzy do czterech razy. Aby zatrzymać reakcję barwienia, dodaj 200 mikrolitrów surowicy do mieszaniny i inkubuj przez minutę, aby nadmiar barwnika się związał.

Następnie trzykrotnie przemyj pęcherzyki zewnątrzkomórkowe solą fizjologiczną buforowaną fosforanami. Po umyciu odwirować próbkę z prędkością 20 000 g przez pięć minut. Następnie rozpuść zewnątrzkomórkowy osad pęcherzykowy w 100 mikrolitrach soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, aby uzyskać końcowe stężenie jednego mikrograma na mikrolitr.

Przenieść komórki śródbłonka w jednym mililitrze kompletnej pożywki do wzrostu komórek śródbłonka na szkiełko nakrywkowe pokryte polielitenem. Pozwól komórkom wyrosnąć z monowarstwy na szkiełku nakrywkowym. Po uformowaniu monowarstwy ostrożnie usuń pożywkę i dodaj jeden mililitr świeżej pożywki, aby dwukrotnie umyć komórki.

Następnie dodać 50 mikrogramów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych barwionych PKH67 do szkiełka nakrywkowego i inkubować przez cztery godziny. Po inkubacji odessać pożywkę. Aby usunąć wszystkie niezwiązane pęcherzyki zewnątrzkomórkowe, trzykrotnie przemyj komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanem.

Należy zachować szczególną ostrożność podczas manipulacji barwieniem szkiełek nakrywkowych za pomocą drobnych szczypiec, aby uniknąć utraty komórek i pękania szkiełka nakrywkowego. Po umyciu użyj trzech procent roztworu paraformaldehydu w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, aby utrwalić komórki przez 15 minut. Ponownie trzykrotnie umyj komórki roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem i dodaj 250 mikrolitrów 0,1% tritanu x 100 w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, aby przeniknąć komórki i inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Następnie trzykrotnie przemyj komórki roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem i dodaj do komórek 400 mikrolitrów buforu blokującego. Następnie inkubuj komórki w temperaturze pokojowej przez trzydzieści minut, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu. Po zablokowaniu przemyj komórki raz solą fizjologiczną buforowaną fosforanami.

Następnie rozcieńczyć pięć mikrolitrów roztworu podstawowego falloidenu w 200 mikrolitrach soli fizjologicznej buforowanej fosforanami z jednoprocentową albuminą surowicy bydlęcej, aby przygotować roztwór barwiący dla każdego szkiełka nakrywkowego. Następnie dodać 200 mikrolitrów roztworu barwiącego na szkiełko nakrywkowe i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Po zakończeniu inkubacji trzykrotnie przemyć komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami.

Następnie użyj końcowego stężenia dwóch mikrogramów na mililitr haczykowatego 3342 w 200 mikrolitrach soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, aby przeciwdziałać barwieniu DNA przez 30 sekund. Po zabarwieniu dodaj 400 mikrolitrów soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, aby dwukrotnie zmyć szkiełko nakrywkowe. Następnie ostrożnie podnieś szkiełko nakrywkowe za pomocą kleszczy i odwróć je na wierzchu kropli środka montażowego zapobiegającego blaknięciu na szklanym szkiełku.

Za pomocą chusteczki delikatnie usuń nadmiar podłoża, a następnie uszczelnij otoczenie lakierem do paznokci. Należy również zachować dużą ostrożność, aby nie narażać komórek na zbyt dużą ilość barwnika podczas mikroskopii, aby uniknąć bielenia komórek. W 24-dołkowej wkładce do hodowli tkankowej o wielkości nalewania 0,4 mikromola, komórki śródbłonka nasiennego.

Następnie pozwól komórkom rosnąć w kulturze przez pięć dni bez zakłóceń, aby utworzyć zróżnicowaną monowarstwę. Zmieniaj podłoże co drugi dzień. Po utworzeniu monowarstwy wysiewaj 50 mikrogramów w jednym mililitrze pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w górnej komorze.

Następnie dodaj 20 miligramów na mililitr dekstranu rotominowego do górnej studzienki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla. Monitoruj migrację fluorescencyjnego dekstranu na dno studzienki, mierząc misję fluorescencji z 40 mikrolitrów pożywki avoquate. Następnie zaprogramuj długość fali wzbudzenia na 544 nanometry i długość fali emisji na 590 nanometrów dla wieloetykietowego czytnika mikropłytek.

Użyj hemocytometru, aby policzyć liczbę komórek. Następnie ponownie zawiesić komórki śródbłonka w kompletnej pożywce do hodowli śródbłonka i zasiać komórki na 96-dołkowej płytce w 100 mikrolitrach pożywki do wzrostu komórek śródbłonka. Aby osiągnąć stężenie od 0,1 do dziesięciu mikrogramów na mililitr, dodaj 100 mikrolitrów pożywki zawierającej antybiotyk.

Monitoruj żywotność komórek co drugi dzień za pomocą 20-krotnego obiektywu pod mikroskopem świetlnym. Kontynuuj hodowlę komórek przez kolejne 10 do 14 dni i wymieniaj pożywkę zawierającą antybiotyk co dwa do trzech dni, w zależności od wzrostu komórek. Następnie dodaj 10 mikrolitrów odczynnika MTS do każdej studzienki i wymieszaj odczynnik.

Inkubować 96-dołkową płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery godziny. Po czterech godzinach krótko zamieszaj płytkę na shakerze. Następnie odczytaj absorbenty komórek poddanych działaniu środka i niepoddanych działaniu substancji za pomocą czytnika płytek o długości 490 nanometrów.

Na dzień przed transdukcją lentiwirusową wysiewaj komórki śródbłonka w jednym mililitrze kompletnego podłoża. Poczekaj, aż komórki osiągną 50 do 80 procent zbiegu na transdukcję lentiwirusa Przed otwarciem probówki obracaj zawiesinę lentiwirusową 200 razy g przez 30 sekund, aby uniknąć rozlania. Następnie dodaj bromek heksydimetryny do komórek, aby dostosować się do końcowego stężenia ośmiu mikrogramów na mililitr i delikatnie zakręć płytką.

Dodaj lentiwirusa do komórek i ponownie delikatnie obracaj płytką przez 30 sekund, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie. Aby zwiększyć skuteczność transdukcji lentiwirusa, należy odwirować mieszaninę komórkowo-wirusową w temperaturze 300 razy g przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Następnie inkubuj mieszaninę komórkowo-wirusową w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc.

Następnego dnia należy wyrzucić cząstkę wirusa zawierającą pożywkę i zastąpić ją wstępnie podgrzaną, świeżą, kompletną pożywką hodowlaną. Drugiego dnia rozpocznij selekcję puromycyny. Zastąp całą pożywkę hodowlaną pożywką zawierającą puromycynę.

Po selekcji puromycyny zbierz komórki. Postępując zgodnie z instrukcjami producenta, wyizoluj RNA z komórek za pomocą zestawu do izolacji RNA. Użyj zestawu do odwrotnej transkrypcji, aby wyizolować komplementarne DNA z wybranymi mikro-RNA.

Następnie ustaw ilościową reakcję PCR. Aby monitorować internalizację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przez komórki śródbłonka, zielone pęcherzyki znakowane PKH67 analizowano za pomocą mikroskopii konfokalnej. W teście faloudyna i hookst 33342, których barwienie działają odpowiednio na czerwono i niebiesko nukleide, są używane do śledzenia translokacji pęcherzyków wewnątrz komórek śródbłonka.

Uzyskane obrazy konfokalne wskazują na gotowość do wychwytu pęcherzyków przez komórki śródbłonka po czterech godzinach. Następnie, w celu zbadania przepuszczalności zdolności dyfuzyjnej jednowarstwowej komórek śródbłonka rodaminy b izotiozjadeekstranu przeanalizowano. Test ten pokazuje, że inkubacja komórek śródbłonka z 50 i 100 mikrogramami na mililitr pęcherzyków zewnątrzkomórkowych zwiększyła przepuszczalność monowarstwy śródbłonka po dwóch godzinach.

Na wykresie oś x reprezentuje stężenie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, a oś y reprezentuje zmiany fałdowania przepuszczalności śródbłonka odczytane na poziomie 590 nanometrów. Następnie, aby określić wrażliwość komórek śródbłonka po leczeniu puromycyną, wykreślono krzywą zabijania. Krzywa zabijania pokazuje, że zaledwie 0,15 mikrograma na mililitr puromycyny wystarczy, aby zabić wszystkie komórki.

Ponadto, aby określić poziom ekspresji mikro-RNA451a wyizolowanego z komórek śródbłonka, przeprowadzono ilościową reakcję PCR w czasie rzeczywistym. Wykresy słupkowe wykazują znaczną nadekspresję transkryptu mikro-RNA451a w stosunku do genu U6 gospodyni domowej. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się chorobami zakaźnymi do zbadania roli EV w interakcji z gospodarzem i komunikacji komórkowej poprzez transfer materiału genetycznego. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wizualizować wychwyt EV przez komórki biorcy i jak badać funkcję małych, w tym RNA, w regulacji komórek śródbłonka.

Nie zapominaj, że praca z pasożytami malarii i ludzką krwią może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek, fartucha laboratoryjnego i praca pod sterylnym kapturem.