Name: Ocena funkcji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych podczas zakażenia malarią (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 45 s
Description: Poznaj metodę oceny funkcji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w zakażeniu malarią Plasmodium falciparum. Technika umożliwia wizualizację pobierania pęcherzyków przez komórki śródbłonka i analizę regulacyjnej roli RNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

To badanie było częściowo wspierane finansowo przez fundację Novartis na rzecz badań medycznych i biologicznych (dla PYM), Gottfried and Julia Bangerter-Rhyner-Stiftung (dla MW i PYM) oraz pulę badawczą Uniwersytetu we Fryburgu (dla PYM). Dodatkowe granty obejmują stypendia rządu szwajcarskiego dla naukowców zagranicznych (dla KAB i SM). Dziękujemy Isabelle Fellay i Solange Kharoubi Hess za wsparcie techniczne.

Ludzkie krwinki czerwone uzyskano z krwi zdrowych dawców, zgodnie z wytycznymi Swissethics (swissethics.ch).
UWAGA: Hodowle pasożytów P. falciparum (3D7) i produkcja EV zostały wcześniej opisane w Mbagwu, et al. 11 Ponieważ P. falciparum jest ludzkim patogenem, zapoznaj się z lokalnymi przepisami dotyczącymi obchodzenia się z nim. Kultury powinny być przez cały czas utrzymywane w sterylności.
1. Fluorescencyjne oznakowanie EV
UWAGA: Poniższa procedura wykorzystuje technologię etykietowania do stabilnego wprowadzenia zielonego barwnika fluorescencyjnego (PKH67) z dużymi alifatycznymi ogonkami w obszarze lipidowym membrany EV. Reakcję przeprowadza się w końcowej objętości barwienia 200 μL zawierającej 20 μM końcowego stężenia PKH67. Wszystkie kroki należy wykonać w temperaturze otoczenia (20-25 °C)
<ol>
	<li>Umieścić 100 μg EV w 1 ml PBS w probówce do mikrowirówki.</li>
	<li>Odwiruj EV w probówce mikrowirówki z maksymalną prędkością (20 000 x g) przez 7 minut do granulowania. 
	UWAGA: Ponieważ hemozaina jest obecna w pojazdach elektrycznych, należy zaobserwować czerwono-ciemnobrązowawe granulki. Jeśli supernatant jest czerwonawy, oznacza to, że EV uległy lizie.</li>
	<li>Po odwirowaniu należy ostrożnie zassać supernatant, aby uniknąć usunięcia jakichkolwiek EVs. 
	UWAGA: Zminimalizuj ilość pozostałego bufora przed ponownym wymieszaniem EV w rozcieńczalniku C, aby zwiększyć odtwarzalność i wydajność barwienia.</li>
	<li>Zawiesić granulat EV w 100 μl rozcieńczalnika C (zawiesina 2X EV) i delikatnie pipetować, aby zapewnić całkowitą dyspersję.</li>
	<li>Przygotować nową probówkę do mikrowirówki i dodać 4 μl etanolowego roztworu barwnika PKH67 do 100 μl rozcieńczalnika C. Dobrze wymieszać w wirze. Przygotuj ten 2x roztwór barwnika (40 μM) bezpośrednio przed barwieniem. 
	UWAGA: Aby uniknąć niejednorodnego zabarwienia, nie dodawaj roztworu barwnika etanolowego PKH67 bezpośrednio do granulatu EV.</li>
	<li>Szybko połącz 100 μl zawiesiny 2X EV (krok 1.4) ze 100 μl roztworu barwnika 2X (krok 1.5). Następnie wymieszać próbkę, pipetując w górę i w dół 10 razy.</li>
	<li>Inkubować zawiesinę EV/Dye z kroku 1,6 przez 5 minut, chroniąc przed światłem i mieszać, wirując 3-4 razy podczas 5-minutowej inkubacji. 
	UWAGA: Inkubacja zawiesiny EV/Dye przez dłuższy czas nie daje żadnych korzyści, ponieważ barwienie jest tak szybkie.</li>
	<li>Zatrzymać reakcję barwienia, dodając równą objętość (200 μl) surowicy i inkubować przez 1 minutę, aby umożliwić związanie nadmiaru barwnika. 
	UWAGA: Przed zatrzymaniem barwienia należy zubożyć surowicę z EV przez odwirowanie w stężeniu 20 000 x g przez 20 min.</li>
	<li>Przemyć 3 razy za pomocą PBS i odwirować w temperaturze 20 000 x g przez 5 minut. Ponownie zawiesić EV w 100 μl PBS, aby osiągnąć końcowe stężenie 1 μg/μL.</li>
</ol>
2. Wizualizacja wychwytu EV za pomocą mikroskopii konfokalnej
UWAGA: Poniższy protokół opisuje śledzenie internalizacji EV przez komórki śródbłonka hodowane na szklanych szkiełkach nakrywkowych. Komórki śródbłonka są częściowo unieśmiertelnionymi ludzkimi komórkami śródbłonka szpiku kostnego, zgodnie z opisem w12.
<ol>
	<li>Pracując w sterylnym środowisku, szkiełka nakrywkowe pokrywać nadmiarem 0,01% poli-L-lizyny przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Zassać roztwór poli-L-lizyny i pozostawić szkiełka nakrywkowe do całkowitego wyschnięcia.</li>
	<li>Wykonaj żywotną liczbę komórek śródbłonka za pomocą wykluczenia błękitu trypanowego i hemocytometru.</li>
	<li>Przenieś 1 x 105 komórek śródbłonka w 1 ml kompletnego podłoża do wzrostu komórek śródbłonka zawierającego mieszankę suplementów do szkiełek nakrywkowych pokrytych poli-L-lizyną i pozwól komórkom urosnąć do monowarstwy. 
	UWAGA: Pożywka zawiera czynniki wzrostu, które pozwalają komórkom tworzyć monowarstwę i tworzyć ścisłe połączenia.</li>
	<li>Gdy komórki utworzą monowarstwę, ostrożnie odessaj pożywkę i dodaj 1 ml świeżej pożywki, aby umyć komórki. Powtórz pranie jeszcze raz. Dodać 50 μg EV znakowanych PKH67 i inkubować przez 4 godziny 
	UWAGA: Aby znaleźć optymalny punkt czasowy do wchłonięcia, można przeprowadzić kurs czasowy.</li>
	<li>Po 4 godzinach odessać pożywkę i przemyć komórki 3 razy PBS, aby usunąć nadmiar i niezwiązane EV. Utrwalić komórki 3% roztworem paraformaldehydu w PBS przez 15 min. 
	UWAGA: Metanol może zakłócać działanie aktyny podczas procesu utrwalania; Dlatego najlepiej jest unikać wszelkich utrwalaczy zawierających metanol lub innych utrwalaczy na bazie rozpuszczalników. Zaleca się stosowanie formaldehydu bez metanolu jako utrwalacza.</li>
	<li>Umyj komórki 3 razy PBS. Dodaj ostrożnie 250 μl 0,1% Triton X-100 w PBS, aby przepuszczalność komórek. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
	<li>Umyj 3 razy PBS. Dodaj 400 μl buforu blokującego (5% BSA w PBS) przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby zablokować niespecyficzne wiązanie.</li>
	<li>Umyj komórki raz za pomocą PBS. Przygotować roztwór barwiący, rozcieńczając 5 μl roztworu podstawowego falloidyny w 200 μl PBS/1% BSA na każde szkiełko nakrywkowe. Odmierzyć pipetą 200 μl roztworu barwiącego na szkiełko nakrywkowe i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj 3 razy PBS. Przeciwbarwić DNA przez 30 s za pomocą Hoechst 33342 w końcowym stężeniu 2 μg/ml w 200 μl PBS.</li>
	<li>Umyj 2x szkiełko nakrywkowe, dodając 400 μl PBS. Ostrożnie chwyć szkiełko nakrywkowe kleszkami i odwróć je na wierzchu kropli środka montażowego zapobiegającego blaknięciu na szklanym szkiełku. Delikatnie usuń nadmiar podłoża chusteczką i uszczelnij każdą stronę lakierem do paznokci.</li>
	<li>Przechowywać szkiełka chronione przed światłem w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wizualizuj komórki za pomocą mikroskopu konfokalnego przy wzbudzeniach laserowych 405, 488 i 543 nm oraz obiektywu 63X, 1,3 NA z emisją fluorescencyjną przy 450-470 nm (niebieski), 505-530 nm (zielony) i 620 nm. 
	UWAGA: Typowe wyniki barwienia F-aktyną są pokazane na <silna klasa="xfig">Rysunek 1.</li>
</ol>
3. Przepuszczalność komórek śródbłonka
UWAGA: Przepuszczalność komórek śródbłonka jest oceniana poprzez pomiar transferu izotiocyjanianu rodaminy B (średnia MW 70 000) przez monowarstwę komórek śródbłonka. Dekstran stanowi doskonałe narzędzie do badania przepuszczalności naczyń krwionośnych.
<ol>
	<li>Policz żywotne komórki śródbłonka, używając 0,4% wykluczenia błękitu trypanowego i hemocytometru.</li>
	<li>Umieść komórki śródbłonka w gęstości 0,6 x 105 komórek do zbiegania się w 24-dołkowych wkładkach do hodowli tkankowych (wielkość porów 0,4 μm) i pozostaw w spokoju na co najmniej 5 dni, aby utworzyć zróżnicowane monowarstwy. Odświeżaj podłoże co drugi dzień.</li>
	<li>Gdy komórki osiągną monowarstwę, załaduj EV (50 μg w 1 ml) do górnej komory. Dodaj rodaminę-dekstran do górnej studzienki w końcowym stężeniu 20 mg/ml. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Monitorować przenoszenie dekstranu fluorescencyjnego do studzienki dennej, mierząc emisję fluorescencji z 40 μl podwielokrotności podłoża. Do pomiarów należy skonfigurować czytnik mikropłytek z wieloma etykietami przy wzbudzeniu 544 nm i emisji 590 nm. 
	UWAGA: Ilość dyfuzji dekstranu można określić ilościowo za pomocą krzywych kalibracyjnych ustalonych dla roztworu podstawowego. Dodatkowo, eksperymenty kinetyczne mogą być przeprowadzane poprzez usuwanie małych próbek ośrodka z komory zewnętrznej podczas przebiegu czasu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). Nawet bez żadnego leczenia dekstran będzie dyfundował przez monowarstwę komórkową.</li>
</ol>
4. Określ wrażliwość na puromycynę
UWAGA: Przed transdukcją linii komórkowych za pomocą lentiwirusa, ważne jest określenie krzywej zabijania wybranego leku dla tej konkretnej linii komórkowej. Aby określić minimalną ilość stężenia leku niezbędną do zabicia wszystkich komórek, należy przeprowadzić eksperyment z odpowiedzią na dawkę przy użyciu przyrostowych dawek wybranego leku. Ponieważ każda linia komórkowa ssaków ma inną czułość, przed eksperymentami należy określić optymalne stężenie antybiotyku, rozwijając miareczkowanie krzywej zabijania, jak opisano poniżej.
<ol>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru. Zawiesić komórki śródbłonka w stężeniu 1 x 105 komórek/ml w kompletnym pożywce do wzrostu komórek śródbłonka zawierającej mieszankę suplementów.</li>
	<li>Płytka 1 x 104 komórki na 96-dołkową płytkę w końcowej objętości 100 μl pożywki do wzrostu komórek śródbłonka.</li>
	<li>Dodać 100 μl pożywki zawierającej antybiotyki, aby uzyskać stężenie 0,1-10 μg/ml (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
	<li>Badaj żywotność komórek co 2 dni pod mikroskopem świetlnym za pomocą obiektywu 20X. Hoduj komórki przez 10-14 dni i wymieniaj pożywkę zawierającą puromycynę co 2-3 dni w zależności od wzrostu komórek.</li>
	<li>Dodać 10 μl/basenik odczynnika MTS do każdej studzienki, wymieszać i inkubować przez 4 godziny w temperaturze 37 °C w standardowych warunkach hodowli.</li>
	<li>Potrząśnij krótko płytką na wytrząsarce i zmierz absorbancję komórek poddanych działaniu środka i niepoddanych działaniu środka za pomocą czytnika płytek przy długości fali 490 nm (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
</ol>
5. Transdukcja komórek śródbłonka za pomocą wektora lentiwirusowego
<ol>
	<li>Płytka 1 x 105 komórek śródbłonka w 1 ml kompletnej pożywki dzień przed transdukcją. Wykonaj transdukcję, gdy komórki osiągną 50-80% zbieżności.</li>
	<li>Rozmrozić lentiwirusa na lodzie i zrobić porcje zapasów wirusa, aby uniknąć cykli zamrażania i rozmrażania. Wiruj materiał w temperaturze 200 x g przez 30 s, w tubkach przed otwarciem, aby uniknąć rozlania.</li>
	<li>Dodać bromek heksadimetryny do komórek w końcowym stężeniu 8 μg/ml. 
	UWAGA: Bromek heksadimetryny pomaga w wydajności transdukcji, jednak w niektórych przypadkach może być toksyczny dla komórek. W związku z tym optymalne stężenie należy określić, wykonując krzywą zabijania przed transdukcją.</li>
	<li>Delikatnie zakręć płytką, aby wymieszać. Dodać odpowiednią ilość cząsteczek wirusa (od 0,5 do 2 x 106 cząstek) przy odpowiedniej wielokrotności infekcji (MOI) i delikatnie obracać płytką przez 30 sekund w celu wymieszania.</li>
	<li>Odwirować mieszaninę cząstek komórkowych i wirusowych w wirówce w temperaturze pokojowej przez 45 minut przy 300 x g, aby zwiększyć wydajność transdukcji. Inkubować mieszaninę cząstek komórkowo-wirusowych w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć pożywkę zawierającą cząsteczki wirusa i odpowiednio wyrzucić. Zastąp go świeżą, wstępnie podgrzaną, kompletną pożywką hodowlaną.</li>
	<li>Rozpocznij selekcję od puromycyny drugiego dnia: usuń pożywkę i zastąp ją świeżą pożywką zawierającą prawidłowe stężenie puromycyny, jak określono wcześniej w sekcji 4 (<silna klasa="xfig">Rycina 3).</li>
	<li>Zbierz komórki po selekcji puromycyny i wyizoluj RNA za pomocą zestawu do izolowania RNA zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Przeprowadź syntezę cDNA z wybranymi miRNA przy użyciu zestawu do odwrotnej transkrypcji (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Ustaw reakcję qPCR zgodnie z cytowanym protokołem13.</li>
</ol>

<ol><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.who.int/malaria/publications/world-malaria-report-2015/report/en/">WHO Malaria Report 2015</a>. , (2015).</li>
<li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11832955">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).</li>
<li>Mantel, P. Y., Marti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+extracellular+vesicles+in+Plasmodium+and+other+protozoan+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The role of extracellular vesicles in Plasmodium and other protozoan parasites.</a> Cell Microbiol. 16 (3), 344-354 (2014).</li>
<li>Couper, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parasite-derived+plasma+microparticles+contribute+significantly+to+malaria+infection-induced+inflammation+through+potent+macrophage+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Parasite-derived plasma microparticles contribute significantly to malaria infection-induced inflammation through potent macrophage stimulation.</a> PLoS Pathog. 6 (1), e1000744(2010).</li>
<li>Schofield, L., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+processes+in+malaria+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunological processes in malaria pathogenesis.</a> Nat Rev Immunol. 5 (9), 722-735 (2005).</li>
<li>Mantel, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria-infected+erythrocyte-derived+microvesicles+mediate+cellular+communication+within+the+parasite+population+and+with+the+host+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system.</a> Cell Host Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).</li>
<li>Regev-Rudzki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+communication+between+malaria-infected+red+blood+cells+via+exosome-like+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell-cell communication between malaria-infected red blood cells via exosome-like vesicles.</a> Cell. 153 (5), 1120-1133 (2013).</li>
<li>Szempruch, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Vesicles+from+Trypanosoma+brucei+Mediate+Virulence+Factor+Transfer+and+Cause+Host+Anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extracellular Vesicles from Trypanosoma brucei Mediate Virulence Factor Transfer and Cause Host Anemia.</a> Cell. 164 (1-2), 246-257 (2016).</li>
<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+genomics%2C+biogenesis%2C+mechanism%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116 (2), 281-297 (2004).</li>
<li>Mantel, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infected+erythrocyte-derived+extracellular+vesicles+alter+vascular+function+via+regulatory+Ago2-miRNA+complexes+in+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Infected erythrocyte-derived extracellular vesicles alter vascular function via regulatory Ago2-miRNA complexes in malaria.</a> Nat Commun. 7, 12727(2016).</li>
<li>Mbagwu, S., Walch, M., Filgueira, L., Mantel, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+Characterization+of+Extracellular+Vesicles+in+Malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Production and Characterization of Extracellular Vesicles in Malaria.</a> Methods Mol Biol. 1660, 377-388 (2017).</li>
<li>Schweitzer, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+newly+established+human+bone+marrow+endothelial+cell+line%3A+distinct+adhesive+properties+for+hematopoietic+progenitors+compared+with+human+umbilical+vein+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Characterization of a newly established human bone marrow endothelial cell line: distinct adhesive properties for hematopoietic progenitors compared with human umbilical vein endothelial cells.</a> Lab Invest. 76 (1), 25-36 (1997).</li>
<li>Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probe-based+Real-time+PCR+Approaches+for+Quantitative+Measurement+of+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs.</a> J Vis Exp. (98), (2015).</li>
<li>Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routes+and+mechanisms+of+extracellular+vesicle+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake.</a> J Extracell Vesicles. 3, (2014).</li>
<li>French, K. C., Antonyak, M. A., Cerione, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+docking+at+the+cellular+port%3A+Extracellular+vesicle+binding+and+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle docking at the cellular port: Extracellular vesicle binding and uptake.</a> Semin Cell Dev Biol. 67, 48-55 (2017).</li>
<li>Montecalvo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+transfer+of+functional+microRNAs+between+mouse+dendritic+cells+via+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes.</a> Blood. 119 (3), 756-766 (2012).</li>
<li>Idro, R., Jenkins, N. E., Newton, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis%2C+clinical+features%2C+and+neurological+outcome+of+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis, clinical features, and neurological outcome of cerebral malaria.</a> Lancet Neurol. 4 (12), 827-840 (2005).</li>
<li>Jambou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum+adhesion+on+human+brain+microvascular+endothelial+cells+involves+transmigration-like+cup+formation+and+induces+opening+of+intercellular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum adhesion on human brain microvascular endothelial cells involves transmigration-like cup formation and induces opening of intercellular junctions.</a> PLoS Pathog. 6 (7), e1001021(2010).</li>
<li>Zhou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-secreted+miR-105+destroys+vascular+endothelial+barriers+to+promote+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis.</a> Cancer Cell. 25 (4), 501-515 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Kilka pasożytów, w tym Toxoplasma, Trypanosoma, Leishmania i Trichomonas, wyzwala uwalnianie EV przez zakażoną komórkę gospodarza. W zależności od patogenów, uwolnione EV mogą modulować odpowiedź immunologiczną gospodarza lub pośredniczyć w komunikacji komórkowej między pasożytami6. Jednak niewiele jest dowodów sugerujących, w jaki sposób te małe pęcherzyki przyczyniają się do choroby malarii. W tym miejscu opisaliśmy kilka sposobów badania funkcji EV podczas infekcji Plasmodium . Na przy...

Według Światowej Organizacji Zdrowia, w 2015 roku na całym świecie odnotowano 212 milionów nowych przypadków malarii i zmarło około 429 000 osób, głównie dzieci poniżej piątego roku życia1. Mechanizmy prowadzące do ciężkiej choroby, która często wiąże się z dysfunkcją naczyń krwionośnych, pozostają niezdefiniowane2. Plasmodium-iRBC wydzielają małe dwulipidowe kulki błonowe znane jako pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV). Wiadomo, że te EV są potencjalnie istotne dla procesu infekcji i odpowiedzi immunologicznej gospodarza na zakażenie; Niewiele jednak wiadomo na temat dokładnej funkcji tych małych pęcherzyków podczas infekcji malarią3. Możliwe, że odgrywają one dwie ważne role: z jednej strony mogą przyczyniać się do patogenezy poprzez aktywację makrofagów4,5; Z drugiej strony, mogą pośredniczyć w komunikacji komórkowej między pasożytami oraz między pasożytami a host6,7. W rzeczywistości pasożyty mogą przenosić białka lub kwasy nukleinowe między sobą za pośrednictwem EV. Na przykład Trypanosoma brucei rhodesiense EVs mogą przenosić czynnik wirulencji związany z opornością w surowicy () i mogą celować zarówno w inne T. brucei, jak i erytrocyty gospodarza8. Co więcej, P. falciparum-iRBC komunikują się między sobą poprzez przenoszenie kwasów nukleinowych w EV. Dzięki temu pasożyty mogą zoptymalizować i zsynchronizować swój wzrost. W rzeczywistości EV mogą być głównym regulatorem konwersji gametocytów, a tym samym przyczyniać się do regulacji etapu transmisji7.
EV nie tylko regulują pasożyty, ale także pośredniczą w interakcjach pasożyt-gospodarz. Niedawno odkryliśmy, że EV z iRBC zawierają mikroRNA pochodzące od gospodarza (miRNA; małe gatunki RNA w zakresie 21-25 nukleotydów9), które zostały wchłonięte przez ludzkie komórki śródbłonka. MiRNA w EV tworzą stabilny kompleks z Ago2 (członkiem kompleksu wyciszającego indukowanego przez RNA), który po dostarczeniu do komórek biorcy jest zdolny do specyficznego wyciszania ekspresji genów i wpływania na właściwości barierowe komórek10. W celu zbadania funkcji pojazdów elektrycznych opracowano standardowe protokoły. W tym miejscu najpierw opiszemy protokół, który umożliwia fluorescencyjne znakowanie EV w celu zbadania ich wychwytu przez komórki biorcze. Ponadto, dzięki zastosowaniu mikroskopu konfokalnego, możliwe jest śledzenie losów pojazdu elektrycznego wewnątrz ogniwa. Do śledzenia pojazdów elektrycznych można użyć kilku barwników fluorescencyjnych. Barwnik reagujący z aminą, 5-(i-6)-karboksyfluoresceina dioctan sukcynimidylu ester (CFSE) i kalceina-AM stają się fluorescencyjne po wejściu do pęcherzyków. Wolimy używać etykiety amfifilowej PKH, ponieważ daje ona jaśniejszy i bardziej jednolity sygnał. Takie podejście dostarcza ważnych informacji pozwalających zrozumieć interakcje między pojazdami elektrycznymi a komórkami biorczymi. Podczas gdy w niektórych przypadkach EV wiążą się z powierzchnią komórek, niektóre pęcherzyki są szybko wchłaniane. Po upowszechnieniu pojazdy elektryczne dostarczają swoje ładunki do komórek, w których pełnią swoje funkcje regulacyjne.
Tutaj opisujemy protokół do pomiaru funkcji barierowej komórek śródbłonka in vitro poprzez ilościowe określenie transferu fluorescencyjnego dekstranu przez monowarstwę komórkową. Można stosować bardziej czułe znaczniki, takie jak znaczniki znakowane radioizotopem. Wymagają jednak specjalnych środków ostrożności podczas użytkowania. Istnieją inne testy do pomiaru funkcji bariery in vitro, takie jak przezśródbłonkowy opór elektryczny (TEER), który mierzy integralność połączeń ścisłych. Wreszcie, wizualizacja ZO-1, białka o ścisłym połączeniu, za pomocą immunofluorescencji umożliwia również ocenę integralności połączenia ścisłego10. Ponieważ EV są złożonymi i niejednorodnymi jednostkami zawierającymi kilka ładunków o potencjalnej charakterystyce regulacyjnej, przydatna jest nadekspresja specyficznego RNA w celu zbadania jego wpływu na komórkę biorcy. Dlatego definiujemy również protokół, który ma na celu generowanie stabilnych linii komórkowych wyrażających interesujące nas miRNA10.

<table><tbody><tr><td>PKH67 Zielony fluorescencyjny łącznik komórek Mini Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI67-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Rozcieńczalnik C</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8278</td><td></td></tr><tr><td>poli-L-lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher - Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidyna CF594</td><td>Biotium</td><td>#00045</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>ThermoFisher</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>ThermoFisher</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Izotiocyjanian rodaminy B&ndash; Dextran</td><td>ThermoFisher</td><td>R9379-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Wkład z membraną PET przezroczysty Falcon&nbsp; na płytkę 24 dołki</td><td>Falcon</td><td>353095</td><td></td></tr><tr><td>Wzrost komórek śródbłonka&nbsp; Medium MV</td><td>Promocell</td><td>C-22020</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorowodorek puromycyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9620-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do testów kolorymetrycznych proliferacji komórek MTS Biovision</td><td></td><td>K300-500</td><td></td></tr><tr><td>bromek heksadimetryny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689-10G</td><td></td></tr><tr><td>MISJA&nbsp; MikroRNA Lenti, Human has-miR-451a</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HLMIR0583</td><td></td></tr><tr><td>MISJA Lenti mikroRNA, ath-miR416, kontrola negatywna 1 Cząstki transdukcji</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NCLMIR001</td><td></td></tr><tr><td>MISJA&nbsp; Lenti microRNA, Human</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NCLMIR0001</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP5</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Reverse Correctionion Kit 1000 reakcji</td><td>ThermoFisher</td><td>4366597</td><td></td></tr><tr><td>has-mir-451a&nbsp; RT/750 PCR rxns</td><td>ThermoFisher</td><td>001141</td><td></td></tr><tr><td>U6 snRNA</td><td>ThermoFisher</td><td>001973</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal Master Mix II, z systemem UNG</td><td>ThermoFisher</td><td>4440038</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Real-Time PCR</td><td>ThermoFisher</td><td>4376600</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena funkcji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych podczas zakażenia malarią

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

Malaria jest zagrażającą życiu chorobą wywoływaną przez pasożyty Plasmodium, przy czym P. falciparum jest najbardziej rozpowszechnionym na kontynencie afrykańskim i odpowiedzialnym za większość zgonów związanych z malarią na świecie. Kilka czynników, w tym sekwestracja pasożytów w tkankach, dysfunkcja naczyń krwionośnych i reakcje zapalne, wpływa na ewolucję choroby u osób zakażonych malarią. Krwinki czerwone zakażone P. falciparum (iRBC) uwalniają małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) zawierające różne rodzaje cząsteczek ładunku, które pośredniczą w patogenezie i komunikacji komórkowej między pasożytami a gospodarzem. EV są efektywnie wychwytywane przez komórki, w których modulują swoją funkcję. W tym miejscu omawiamy strategie dotyczące roli EV w interakcjach pasożyt-gospodarz. Po pierwsze, opisujemy prostą metodę znakowania i śledzenia internalizacji EV przez komórki śródbłonka przy użyciu barwnika łącznikowego z zielonymi komórkami. Po drugie, przedstawiamy prosty sposób pomiaru przepuszczalności przez monowarstwę komórek śródbłonka przy użyciu znakowanego fluorescencyjnie dekstranu. Na koniec pokazujemy, jak badać rolę małych niekodujących cząsteczek RNA w funkcjonowaniu komórek śródbłonka.

W niniejszej pracy opisujemy protokoły służące do badania oddziaływań pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EVs) z komórkami gospodarza. Pochłanianie EVs znakowanych fluorescencyjnie jest monitorowane za pomocą mikroskopii konfokalnej (Rysunek 1). Komórki śródbłonka wydajnie pochłaniają EVs, jednak czas inkubacji z tymi pęcherzykami można zoptymalizować w celu śledzenia procesu pobierania. Aby uzyskać lepszą lokalizację EVs wewnątrz komórek, należy zbarwić aktynę ...

W tej pracy opisujemy protokoły do badania roli pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) uwalnianych przez erytrocyty zakażone Plasmodium falciparum. W szczególności skupiamy się na interakcjach EV z komórkami śródbłonka.

Ocena funkcji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych podczas zakażenia malarią

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie funkcji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych uwalnianych przez czerwone krwinki zakażone pasożytem malarii. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie malarii, takie jak to, w jaki sposób pasożyty regulują komunikację pasożyt-gospodarz. Główną zaletą tej techniki jest wizualizacja pęcherzykowego zębów przez komórki indoterot w ramach badania funkcji regulacyjnej pęcherzykowego RNA przez komórki indoterot.Procedurę zademonstrują Mya Alondez, Smartin Bagu i Bayo Babatunde, wszyscy absolwenci z mojego laboratorium. Do probówki mikrowirówkowej dodać 100 mikrogramów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych i jeden mililitr soli fizjologicznej buforowanej fosforanami. Następnie odwiruj pęcherzyki zewnątrzkomórkowe z maksymalną prędkością 20 000 razy g przez siedem minut, aby utworzyć osad.Po zakończeniu wirowania wyrzucić supernatant bez naruszania osadu. Następnie rozpuść osad pęcherzyka zewnątrzkomórkowego w 100 mikrolitrach rozcieńczonego C.To zapewnij pełne wymieszanie, kilkakrotnie go odpipetować. Następnie, w nowej probówce do mikrowirówki, dodaj cztery mikrolitry roztworu barwnika etanolowego PKH67 do 100 mikrolitrów dilmantu C.

evaluation-of-extracellular-vesicle-function-during-malaria-infection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przedstawiamy metodę wykonywania mikroskopii intravitalnej ślezy z wykorzystaniem transgenicznych pasożytów malarii GFP oraz kwantyfikacji ruchliwości pasożytów i przepływu krwi w obrębie tego narządu.

Mikroskopia intravitalna śledziony: ilościowa analiza mobilności pasożytów i przepływu krwi

Opracowaliśmy model koinfekcji malarią i HIV-1 in vitro, aby zbadać wpływ Plasmodium falciparum na cykl replikacyjny HIV-1 w ludzkich pierwotnych makrofagach pochodzących z monocytów. Ten wszechstronny system można łatwo dostosować do innych typów komórek pierwotnych podatnych na zakażenie HIV-1.

Model koinfekcji In vitro do badania interakcji między Plasmodium falciparum a HIV-1 w ludzkich pierwotnych komórkach odpornościowych pochodzących z monocytów

Metoda ta bada fenotyp agregacji erytrocytów zakażonych Plasmodium falciparum (pRBC) pośredniczonej przez płytki krwi w izolatach klinicznych. Jest to realizowane poprzez izolację oraz wspólną inkubację osocza bogatopłytkowego i zawiesiny pRBC.

Prosty protokół badania agregacji erytrocytów zakażonych Plasmodium falciparum indukowanej przez płytki krwi w warunkach ograniczonego dostępu do zasobów

Opisano metodę izolacji przylegających leukocytów zapalnych z naczyń krwionośnych mózgu myszy zakażonych Plasmodium berghei ANKA. Metoda umożliwia kwantyfikację oraz charakterystykę fenotypową wyizolowanych leukocytów po barwieniu przeciwciałami fluorescencyjnymi, a następnie analizie za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja i analiza sekwestrowanych w mózgu leukocytów myszy zakażonych Plasmodium berghei ANKA

Pomiar funkcji przeciwciał jest kluczem do zrozumienia odporności na malarię Plasmodium falciparum. Metoda ta opisuje oczyszczanie żywotnych merozoitów i pomiar fagocytozy zależnej od opsonizacji za pomocą cytometrii przepływowej.

Wysokowydajne oczyszczanie merozoitów Plasmodium falciparum do stosowania w testach przeciwciał opsonizujących

Pasożyt malarii atakuje i replikuje się w czerwonych krwinkach. Dokładna ocena inwazji merozoitu i parazytemii ma zatem kluczowe znaczenie w ocenie przebiegu zakażenia malarią. W tym miejscu opisujemy protokół oparty na cytometrii przepływowej do pomiaru tych parametrów w mysim modelu malarii.

In vivo (in vivo) Ocena pasożytytemii zarodźca gryzoni i inwazji merozoitu za pomocą cytometrii przepływowej

Współinfekcja człowieka jest trudna do odtworzenia in vitro. Jednak ludzkie pasożyty malarii mogą być łatwo hodowane in vitro, podobnie jak świeżo wyizolowane ludzkie komórki jednojądrzaste krwi obwodowej naturalnie zakażone wirusem HIV. Stanowi to doskonały model do badania wczesnych odpowiedzi immunologicznych na pasożyty malarii w kontekście współzakażenia wirusem HIV.

Model in vitro do pomiaru odpowiedzi immunologicznej na malarię w kontekście współzakażenia wirusem HIV

Ludzkie mikroRNA przemieszczają się z erytrocytów gospodarza do pasożytów Plasmodium falciparum. W tym miejscu opisano techniki stosowane do transfekcji syntetycznych mikroRNA do erytrocytów gospodarza i wyizolowania wszystkich RNA z P. falciparum.  Ponadto w artykule szczegółowo opisano metodę izolacji polisomów u P. falciparum w celu określenia zajętości rybosomalnej i potencjału translacyjnego transkryptów pasożytów.

Metody badania regulacyjnej roli małych RNA i rybosomalnego zajmowania Plasmodium falciparum

Opisujemy tutaj protokół izolacji komórek szpikowych ze skóry myszy i drenowania węzłów chłonnych po śródskórnym wstrzyknięciu sporozoitów Plasmodium. Cytometria przepływowa pobranych komórek zapewnia wiarygodny test charakteryzujący reakcję zapalną skóry i węzłów chłonnych drenujących na pasożyta.

Izolacja komórek szpikowych ze skóry myszy i drenaż węzłów chłonnych po szczepieniu śródskórnym żywymi atenuowanymi sporozoitami zarodźca

Ogólnym celem tego protokołu jest dostarczenie instrukcji, jak mierzyć zdolność przeciwciał obecnych w surowicach lub osoczu osób, naturalnie narażonych na zakażenie Plasmodium falciparum, do opsonizacji i indukowania fagocytozy erytrocytów zakażonych pasożytami (IE).

Pomiar naturalnie nabytych przeciwciał indukujących fagocytozę przeciwko pasożytom Plasmodium falciparum za pomocą testu opartego na cytometrii przepływowej

Tutaj opisujemy nową metodę, która pomaga wyjaśnić mechanizmy odporności komórkowej na Plasmodium podczas fazy infekcji krwi. Jest to test in vitro, który mierzy zabijanie zakażonych krwinek czerwonych przez limfocyty cytotoksyczne.

In vitro Test zabijania krwinek czerwonych zakażonych zarodźcem przez limfocyty cytotoksyczne

Poznaj metodę oceny funkcji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w zakażeniu malarią Plasmodium falciparum. Technika umożliwia wizualizację pobierania pęcherzyków przez komórki śródbłonka i analizę regulacyjnej roli RNA.

Ocena funkcji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych podczas zakażenia malarią

Przeglądaj więcej filmów