Hodowla kryształów białkowych o różnych wymiarach przy użyciu automatycznej krystalizacji połączonej z dynamicznym rozpraszaniem światła in situ
14 sierpnia 2018
Tutaj prezentujemy protokół kontrolowanej produkcji mikrokryształów białka. W procesie wykorzystuje się zautomatyzowane urządzenie pozwalające na kontrolowaną manipulację kilkoma parametrami krystalizacji. Krystalizacja białka odbywa się poprzez kontrolowane i zautomatyzowane dodawanie roztworów krystalizacyjnych przy jednoczesnym monitorowaniu i badaniu rozkładu promienia cząstek w kropli krystalizacji.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie krystalizacji białek, takie jak punkt czasowy zarodkowania, mechanizm wzrostu kryształów czy sposób otrzymywania nano/mikrokryształów, co jest badane przez Hamburskie Centrum Ultraszybkiego Obrazowania. Główną zaletą tej techniki jest monitorowanie ewolucji próbki w czasie rzeczywistym, co umożliwia uzyskanie cennych informacji, takich jak promienisty rozkład cząstek w roztworze na różnych etapach krystalizacji. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w mikrokrystalizację białek, może być również stosowana do białek, które są używane do klasycznej krystalografii lub do wzrostu dużych kryształów białek, które mają być używane do dyfrakcji neutronów.
Wizualna demonstracja tej metody jest ważna, ponieważ pokazuje zasadę działania unikalnego urządzenia do krystalizacji. Na początek przefiltruj 16 mililitrów 1,2-molowego roztworu winianu sodu i 16 mililitrów wody destylowanej, używając sterylnego filtra strzykawkowego o grubości 2 mikronów. Napełnij butelki z środkiem strącającym i wodą pięcioma mililitrami przefiltrowanych roztworów.
Następnie zamontuj butelki w uchwytach pompki komory doświadczalnej. W oknie oprogramowania ustaw parametry eksperymentalne z temperaturą 20 stopni Celsjusza, wilgotnością względną 20 i wodą jako rozpuszczalnikiem. Otwórz przednie drzwiczki komory doświadczalnej i wyjmij nośnik szkiełka nakrywkowego.
Umieść czyste i silikonowane szkiełko nakrywkowe na nośniku i umieść je z powrotem w urządzeniu. Zamknij komorę doświadczalną, aby zabezpieczyć warunki środowiskowe. Włącz Pump Zero, korzystając z głównych charakterystyk pompy znajdujących się w protokole tekstowym i utwórz strumień wody.
Wyreguluj strumień wody, kierując pozycję w kierunku środka szkiełka nakrywkowego, ręcznie naciskając przeznaczoną do tego regulacyjną. Wyłącz pompę zero, a następnie włącz pompę pierwszą i utwórz strumień cieczy, tak jak poprzednio. Dostosuj pozycję strumienia pompy pierwszej do pozycji ustalonej dla pompy zero.
Po wyłączeniu pompy pierwszej należy wymienić zużyte szkiełko nakrywkowe na nowe, czyste szkiełko nakrywkowe do eksperymentu krystalizacji. Utwórz nowy plik eksperymentalny przy użyciu pakietu oprogramowania. W pliku doświadczalnym wprowadź białko jako Taumatynę z Thaumatococcus daniellii; stężenie białka jako 14 miligramów na mililitr, strącacz jako winian sodu, a stężenie strącacza jako 1,2 mola.
Po załadowaniu nowego pliku eksperymentu, aby aktywować te informacje, zaznacz pozycję na kropli białka, dodając małą kroplę wody, używając Pump Zero. Naciśnij przycisk Tara, aby wyzerować mikrowagę. Otwórz górną pokrywę komory doświadczalnej i odpipetuj 8 mikrolitrów roztworu taumatyny na punkcie orientacyjnym wody.
Aby zarejestrować nową kroplę Thaumatin, najpierw kliknij Nowy drop', aby przypisać warunki początkowe z pliku eksperymentalnego. Następnie kliknij Stała'przycisk, aby skompensować naturalne parowanie wody z kropli. Użyj kamery CCD, aby sprawdzić, czy pompa zero celuje w kroplę białka.
Ponownie wyreguluj położenie pompy zero, jeśli strumień wody kieruje się na zewnątrz kropli. Włącz laser DLS i umieść wiązkę lasera w kropli białka ręcznie za pomocą regulacyjnych. Wprowadź parametry DLS z czasem trwania pomiaru wynoszącym 60 sekund, czasem oczekiwania między dwoma pomiarami wynoszącym 10 sekund i liczbą pomiarów jako 300.
Kliknij przycisk Start, aby rozpocząć pomiary DLS. Sprawdź jakość próbki, wybierając jedną z reprezentacji graficznych DLS. Wprowadź warunki kroku parowania w tabeli harmonogramu, jak pokazano w protokole tekstowym.
Następnie aktywuj etap odparowywania próbki, klikając przycisk Automatyzacja. Kliknij przycisk Zatrzymaj po zakończeniu etapu parowania próbki. Aktywuj przycisk stałej, aby utrzymać stałą wagę kropli.
Cecha ta skompensuje ewentualność naturalnego odparowania próbki i zapewni, że żadne zmiany stężenia nie będą mogły nastąpić, dopóki nie zostaną podjęte dalsze działania. Następnie wprowadź warunki dla kroku dodawania środka strącającego w tabeli harmonogramu, zgodnie z listą w protokole tekstowym. Aktywuj krok dodawania środka strącającego, klikając przycisk Automatyzacja.
Aby śledzić ewolucję kropli krystalizacji w czasie, sprawdź wygląd kryształów Taumatyny za pomocą kamery CCD. Sprawdź rozkład wielkości cząstek, korzystając z reprezentacji graficznych DLS. Sprawdź również ewolucję masy i parametry eksperymentalne za pomocą okna wyświetlacza.
Wszystkie informacje wyświetlane w tym oknie są obliczane i wyświetlane w czasie rzeczywistym na podstawie zmian masy podczas krystalizacji, które są rejestrowane online przez ultraczułą wagę. Pokryj czystą standardową płytkę Terasaki, dodając do niej 3 mililitry oleju parafinowego. Wylej olej parafinowy na dołki płytowe, delikatnie przesuwając płytkę pod różnymi kątami, tak aby olej pokrył wszystkie 72 dołki.
Usuń nadmiar oleju parafinowego, wylewając olej, który unosi się na talerzu. Kliknij przycisk Zatrzymaj, aby zakończyć eksperyment krystalizacji. Ostrożnie wyjąć nośnik próbki zawierający kroplę krystalizacji.
Za pomocą pipety umieść dwie mikrolitrowe krople krystalizacji w dołkach płytki Terasaki. Odzyskując kroplę krystalizacji w płytce pod olejem, próbka może być okresowo sprawdzana pod kątem stabilności wzrostu kryształów za pomocą mikroskopu lub innych technik diolistycznych, które działają z płytkami Terasaki. Przedstawiono tutaj rozkład promieniowy wykresu pokazujący wzrost wielkości cząstek w kropli białka podczas całego procesu krystalizacji od białka monomerycznego do tworzenia jąder, nanokryształów i mikrokryształów.
W tym przypadku wykresy przedstawiają ewolucję w czasie masy kropelki białka wraz z obliczonym stężeniem białka i stężeniem strącacza. Pokazane tutaj jest nagrane zdjęcie mikrokryształów Thaumatin pod koniec eksperymentu. Kropla wykazuje bardzo dużą ilość małych mikrokryształów nasyconych roztworem białkowym.
Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w godzinę i 30 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby dostosować laser DLS w systemach mikrodozowania do kropli białka. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak łatwo obchodzić się z tym urządzeniem do krystalizacji, aby skutecznie skrystalizować próbkę białka.
Metoda ta jest możliwa dzięki dynamicznemu rozpraszaniu światła in situ, które jest bezpośrednio sprzężone z kroplą krystalizacji. Dzięki temu możemy monitorować wszystkie zmiany w rozkładzie promienia, a tym samym możemy wskazać pewne wzorce dystrybucji do krystalizacji lub wytrącania białek. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak mikroskopia krioelektronowa lub dyfrakcja elektronów, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania i zweryfikować stan krystaliczny cząstek o rozmiarach submikrometrowych w roztworze.
Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku dwuetapowej teorii zarodkowania, ponieważ mapy DLS pokazują wyraźny wzór podwójnego rozkładu cząstek w roztworze, które poprzedzają wzrost kryształów.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia opatentowane zautomatyzowane urządzenie do krystalizacji, zaprojektowane do precyzyjnego monitorowania i kontrolowania krystalizacji białek. System integruje pomiary dynamicznego rozpraszania światła (DLS) in situ oraz obrazowanie mikroskopowe w czasie rzeczywistym, co umożliwia szczegółową obserwację procesów nukleacji i wzrostu kryształów. Protokół pozwala badaczom na optymalizację warunków krystalizacji w celu otrzymania kryształów białek o pożądanych rozmiarach – od dużych kryształów odpowiednich do dyfrakcji neutronów, po mikro- i nanokryształy do zaawansowanych badań strukturalnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Krystalizacja białek
- Biologia strukturalna
- Metody biofizyczne
Wstęp
- Krystalizacja białek jest niezbędna do wyznaczania struktury za pomocą krystalografii rentgenowskiej i innych technik.
- Kontrolowanie nukleacji i wzrostu kryształów jest trudne, ale kluczowe dla uzyskania kryształów o odpowiednim rozmiarze i jakości.
- Tradycyjne metody często nie zapewniają informacji zwrotnych w czasie rzeczywistym, co utrudnia optymalizację.
- Metoda in situ DLS dostarcza cennych informacji o rozkładzie wielkości cząstek podczas krystalizacji.
Cel badania
- Zaprezentowanie zautomatyzowanego, interaktywnego podejścia do krystalizacji białek z wykorzystaniem monitorowania w czasie rzeczywistym.
- Umożliwienie precyzyjnej kontroli nad etapami nukleacji i wzrostu kryształów.
- Ułatwienie otrzymywania zarówno dużych kryształów, jak i mikrokryształów do różnych zastosowań analitycznych.
Zastosowane Metody
- Przygotowanie przefiltrowanych roztworów tatranianu sodu i wody do użycia jako czynnika wytrącającego oraz rozpuszczalnika.
- Zautomatyzowane dodawanie białka, czynnika wytrącającego i wody przy użyciu programowalnych pomp wewnątrz komory z kontrolowanymi warunkami środowiskowymi.
- Monitorowanie w czasie rzeczywistym kropli krystalizacyjnej za pomocą kamery CCD i metody DLS in situ.
- Zautomatyzowane etapy odparowywania wody, dodawania czynnika wytrącającego i rozcieńczania próbki w celu manipulowania przesyceniem i nukleacją.
- Pozyskiwanie danych dotyczących masy kropli, stężenia białka i czynnika wytrącającego oraz rozkładu wielkości cząstek w trakcie całego eksperymentu.
Główne wyniki
- DLS w czasie rzeczywistym oraz obrazowanie umożliwiły precyzyjną identyfikację zdarzeń nukleacji i etapów wzrostu kryształów.
- Zautomatyzowana kontrola pozwoliła na otrzymanie zarówno dużych kryształów białka, jak i licznych mikrokryształów.
- Wykresy rozkładu promieni ujawniły przejście od białka monomerowego do jąder kondensacji, nanokryształów i mikrokryształów.
- Metoda ta dostarczyła informacji na temat dwuetapowej teorii nukleacji, przy czym DLS wykazało podwójny rozkład wielkości cząstek przed wzrostem kryształów.
Wnioski
- Zautomatyzowane urządzenie do krystalizacji stanowi niezawodną platformę do kontrolowanej krystalizacji białek.
- Monitorowanie in situ za pomocą DLS jest kluczowe dla optymalizacji nukleacji i wzrostu kryształów, co umożliwia otrzymywanie kryształów o określonej wielkości.
- Podejście to wspiera dalsze zastosowania, takie jak cryo-EM i dyfrakcja elektronów dla kryształów submikrometrowych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zautomatyzowana krystalizacja białek z wykorzystaniem dynamicznego rozpraszania światła (DLS) in situ umożliwia precyzyjną kontrolę nukleacji i wzrostu kryształów w czasie rzeczywistym, bezpośrednio rozwiązując kluczowy problem w biologii strukturalnej oraz badaniach nad nowymi lekami biofarmaceutycznymi. Możliwość ta zwiększa pewność przewidywania uzyskania kryształów o określonych wymiarach, wspierając zarówno wysokorozdzielcze wyznaczanie struktur, jak i analityczne etapy dalszego przetwarzania próbek. Integracja monitorowania ilościowego z automatyzacją sprawia, że podejście to stanowi uniwersalną platformę dla wczesnych etapów odkrywania, przesiewania oraz translacyjnych procesów badawczych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia analizę w czasie rzeczywistym zdarzeń nukleacji oraz mechanizmów wzrostu kryształów.
- Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez otrzymywanie kryształów odpowiednich do różnorodnych analiz strukturalnych.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego dzięki ilościowemu monitorowaniu przejść fazowych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane kryształy białek do dalszego przesiewania i analiz biofizycznych.
- Standaryzuje warunki krystalizacji, poprawiając powtarzalność i skalowalność w ramach eksperymentów.
- Dostarcza ilościowe wyniki DLS w celu rzetelnego opracowania testów i oceny związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dostosowuje produkcję kryształów do wymagań zaawansowanych technik obrazowania i dyfrakcji.
- Zapewnia ciągłość przejścia od krystalizacji na etapie odkrywania do przedklinicznej walidacji strukturalnej.
- Wspiera postępy z uwzględnieniem analizy ryzyka poprzez dostarczanie wysokiej jakości kryształów do badań translacyjnych.
Integracja potoków i przepływów pracy
Ta zautomatyzowana platforma do krystalizacji i DLS integruje procesy od wczesnego etapu odkrywania, poprzez identyfikację związków wiodących, aż po badania przedkliniczne, wspierając iteracyjne testowanie hipotez oraz walidację strukturalną.
- Biologia odkrywcza: Ilościowy monitoring DLS wyjaśnia czas nukleacji i ścieżki wzrostu, redukując niejednoznaczność mechanistyczną.
- Przesiewanie: Zautomatyzowane, powtarzalne przepływy pracy zapewniają gotowość testu i umożliwiają wysokoprzepustową produkcję kryształów.
- Analityka: Pomiar rozmiaru, stężenia i masy cząstek w czasie rzeczywistym dostarcza danych umożliwiających porównanie warunków.
- Badania translacyjne: Pozwala na otrzymanie kryształów kompatybilnych z cryo-EM, dyfrakcją elektronów i dyfrakcją neutronów, co wspiera walidację biomarkerów i celów terapeutycznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Funkcje automatyzacji i monitorowania platformy umożliwiają szerokie zastosowanie w odniesieniu do różnych białek docelowych i zespołów projektowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność w procesach tworzenia i wzrostu kryształów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzowane, skalowalne i powtarzalne przepływy pracy w krystalizacji.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac oraz efektywność kapitałową dzięki umożliwieniu szybkiej optymalizacji opartej na danych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów odkrywczych opartych na strukturach.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w pracy z białkami, obsłudze DLS oraz w protokołach krystalizacji.
- Wymaga dostępu do zautomatyzowanej aparatury do krystalizacji oraz infrastruktury analitycznej w czasie rzeczywistym.
- Wymaga standaryzacji parametrów eksperymentalnych i interpretacji danych pomiędzy zespołami.
- Metoda jest adaptowalna do różnych białek docelowych i warunków krystalizacji poprzez optymalizację protokołu.
- Niezawodność wyników zależy od precyzyjnego wyrównania i kalibracji systemów DLS oraz obrazowania.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
0:56
Parameters, Solution Setup, and Micro-dosage Systems Adjustment
2:42
Seeing a Thaumatin Drop in the Experimental Chamber and in Situ Measurements
4:48
Sample Evaporation, Precipitant Addition, and Tracking the Evolution of the Crystallization Droplet Over Time
6:12
Recovery of Crystallization Droplet
7:09
Results: Formation of Protein Microcrystals from T. daniellii Thaumatin
7:57
Conclusion
