Protokół przetrzymywania w laboratoriach turkusowych ryb (Nothobranchius furzeri)

Ogólnym celem tego protokołu jest pomyślne wyhodowanie kolonii laboratoryjnej turkusowych karpiowatych w celu badania starzenia się i chorób związanych z wiekiem w szybki i wysokoprzepustowy sposób. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie starzenia się, takie jak to, czy mutacje pojedynczych genów lub interwencje środowiskowe mogą modulować proces starzenia się u gatunków kręgowców. Główną zaletą tej techniki jest to, że postępując zgodnie z naszymi podstawowymi protokołami, kilka laboratoriów może teraz przeprowadzać eksperymenty z użyciem turkusowych karli.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały problemy, ponieważ hodowla karpiów ma pewne unikalne cechy. Na przykład zarodki są hodowane na suchym podłożu przed wykluciem, co bardzo różni się od kanonicznych modeli ryb, takich jak danio pręgowany. Na początek ustaw 9,5-litrowe zbiorniki hodowlane, każdy z pięciotygodniowym samcem i dwiema sześcio- lub siedmiotygodniowymi samicami.

Następnie napełnij plastikowy pojemnik autoklawowanym piaskiem o głębokości około dwóch do trzech centymetrów i umieść piaskownicę na środku zbiornika hodowlanego. Pozwól turkusowym karpiom rozmnażać się w sposób ciągły i zbieraj zarodki raz w tygodniu w celu inkubacji zarodków. Aby zebrać zarodki w jednym stadium komórkowym do wykorzystania do wstrzykiwania i generowania linii transgenicznych, należy założyć zbiornik hodowlany z jednym samcem i dwiema samicami ryb, jak właśnie pokazano.

Dwa dni przed pobraniem zarodków przenieś samca do indywidualnego zbiornika i utrzymuj go w kontakcie wzrokowym z dorosłymi samicami. W dniu zbioru dodaj samca i piaskownicę do zbiornika hodowlanego i pozwól rybom na tarło przez dwie godziny. Po tarle i wyjęciu piaskownicy ze zbiornika, opróżnij piaskownicę do sitka i użyj wody systemowej do jej wypłukania.

Następnie częściowo zanurz sitko w wodzie systemowej i delikatnie nim zamieszaj, aby zarodki zgrupowały się w środku. Za pomocą dwumililitrowej pipety Pasteura zbierz zarodki i przenieś je na 90-milimetrową szalkę Petriego z około 40 mililitrami wody systemowej. Pod mikroskopem świetlnym zbadaj zarodki na szalce Petriego i usuń te, które mają pękniętą kosmówkę i oznaki uszkodzenia.

Po wybieleniu zarodków zgodnie z protokołem tekstowym należy sprawdzić i usunąć wszelkie martwe zarodki, które byłyby zabarwione na niebiesko. Po dopuszczeniu zarodków do inkubacji w świeżym roztworze błękitu metylenowego należy sprawdzić, czy rozwinięte zarodki mają widoczne czarne oczy. Następnie za pomocą jednorazowej pipety Pasteura lub cienkiej zakrzywionej pęsety przenieś zarodki na płytkę z bibuły filtracyjnej.

Zachowaj wszelkie nierozwinięte zarodki w błękicie metylenowym i monitoruj je codziennie. Gdy pojawią się czarne oczy, przenieś je na podłoże z podłożem stałym. Za pomocą kleszczy rozłóż zarodki w odległości około pięciu milimetrów od siebie, do 100 zarodków na 90-milimetrową płytkę.

Następnie użyj parafiny, aby uszczelnić naczynie i inkubować zarodki w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez dwa do trzech tygodni, aż w pełni rozwiną złote tęczówki i będą gotowe do wyklucia. W przypadku długotrwałego przechowywania do jednego roku, po inkubacji w roztworze błękitu metylenowego przez trzy dni, przenieść zarodki na płytki z podłożem stałym, jak właśnie pokazano, i inkubować je w temperaturze 17 stopni Celsjusza. Aby wykluć rybę, użyj cienkiej zakrzywionej pęsety, aby ostrożnie przenieść od 50 do 100 rozwiniętych zarodków do pudełka wylęgowego i całkowicie zanurzyć je w roztworze kwasu humusowego nie głębiej niż dwa centymetry w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Kluczowym krokiem w tym protokole jest wylęganie zarodków karpiów, co osiąga się poprzez przeniesienie zarodków inkubowanych na suchym podłożu do roztworu wylęgowego zawierającego kwas humusowy z wystarczającym napowietrzeniem. Przykryj pudełko wylęgowe pokrywką i inkubuj w temperaturze 28 stopni Celsjusza w inkubatorze wylęgowym. Aby zapewnić wystarczające napowietrzenie, podłącz skrzynkę do źródła powietrza z rurką.

Aby utrzymać odpowiednią jakość wody w komorze wylęgowej, raz dziennie od dnia następującego po wykluciu należy uzupełniać skrzynkę w stosunku jeden do jednego autoklawowanej wody systemowej, utrzymując końcową głębokość dwóch centymetrów. Przenieś niewyklute zarodki z powrotem na stałe podłoże i spróbuj wykluć się tydzień później. Aby wyhodować młode i dorosłe ryby w pięć dni po wykluciu, przenieś młode osobniki do systemu recyrkulacji wody za pomocą jednorazowych plastikowych pipet lub plastikowej łyżki, aby ostrożnie przenieść pięć młodych osobników na zbiornik o pojemności 0,8 litra wyposażony w sito do narybku o średnicy 400 mikrometrów.

W wieku 14 dni przenieś młode ryby do zbiornika o pojemności 2,8 litra wyposażonego w sito do smażenia o średnicy 850 mikrometrów. Od tego momentu należy oznaczyć każdy zbiornik identyfikatorem ryby. W przypadku testów przetrwania, każdą rybę należy indywidualnie przechowywać w jednym zbiorniku. Ryby hodowane do testów przetrwania są również indywidualnie trzymane w zbiorniku o pojemności 2,8 litra.

Przez następne siedem dni karm młode osobniki dwa razy dziennie pięcioma mililitrami krewetek solankowych uzupełnionych jednym do trzech żywych robaków krwionośnych. W wieku czterech tygodni karm każdą rybę dwa razy dziennie krewetkami solankowymi i jednym mililitrem robaków krwionośnych. Na tym etapie upewnij się, że ryba osiągnęła pełną dojrzałość płciową, sprawdzając obecność dużych płetw grzbietowych, odbytowych i ogonowych z oznakami ubarwienia u samców i okrągłych brzuchów pełnych jaj u samic.

Pokazana tutaj jest reprezentatywna krzywa przeżywalności dla 70 samców turkusowych karpiów. Właściwa hodowla skutkuje medianą przeżycia w zakresie od 12 do 28 tygodni w odmianie GRZ. Różnice w medianie przeżycia zależą od diety, częstotliwości karmienia i warunków temperatury w pomieszczeniach inwentarskich.

Krzywa przeżywalności ryb hodowanych w warunkach złej hodowli ujawnia wzrost wczesnej śmiertelności i powtarzające się nagłe spadki przeżywalności w czasie w porównaniu z rybami hodowanymi w optymalnych warunkach hodowli. Przestrzegając tego protokołu, ważne jest, aby ściśle monitorować stan wody i nadmiar pokarmu ze świeżo wyklutego narybku, ponieważ ważne jest, aby były one utrzymywane w czystym środowisku. Po jej opracowaniu technika ta utorowała naukowcom drogę do zbadania eksperymentalnych manipulacji u turkusowych karpiów, w tym transgenezy, edycji genomu i manipulacji dietetycznych.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skutecznie hodować turkusowe karpiówki w laboratorium i używać tego modelu do zbadania biologii starzenia się najkrócej żyjących kręgowców, które można hodować w niewoli.