Name: Protokół przetrzymywania w laboratoriach turkusowych ryb (Nothobranchius furzeri) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Poznaj protokół hodowli turkusowych ryb Nothobranchius furzeri w warunkach laboratoryjnych do badań nad starzeniem. Ta metoda umożliwia wydajne prowadzenie kolonii i analizę procesów starzenia u kręgowców.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Alessandro Cellerino, Tyrone'owi Genade, Anne Brunet, Sabrinie Sharp, Mickie Powell, Simone Keil, Yumi Kim, Patrickowi Smithowi, Kai Matharowi i wszystkim członkom laboratorium Valenzano w Instytucie Biologii Starzenia im. Maxa Plancka za przyczynienie się do różnych aspektów obecnego protokołu hodowli karpiów na przestrzeni lat.

<ol><li>Valenzano, D. R., Aboobaker, A., Seluanov, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-canonical+aging+model+systems+and+why+we+need+them%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Non-canonical aging model systems and why we need them.</a> EMBO J. 36 (8), 959-963 (2017).</li>
<li>Harel, I., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+African+Turquoise+Killifish%3A+A+Model+for+Exploring+Vertebrate+Aging+and+Diseases+in+the+Fast+Lane%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">The African Turquoise Killifish: A Model for Exploring Vertebrate Aging and Diseases in the Fast Lane.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 80, 275-279 (2015).</li>
<li>Smith, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+life+span+by+the+gut+microbiota+in+the+short-lived+African+turquoise+killifish%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Regulation of life span by the gut microbiota in the short-lived African turquoise killifish.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Cellerino, A., Valenzano, D. R., Reichard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+bush+to+the+bench%3A+the+annual+Nothobranchius+fishes+as+a+new+model+system+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Rev+Camb+Philos+Soc%22%5BJournal%5D)">From the bush to the bench: the annual Nothobranchius fishes as a new model system in biology.</a> Biol Rev Camb Philos Soc. 91 (2), 511-533 (2016).</li>
<li>Kim, Y., Nam, H. G., Valenzano, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+short-lived+African+turquoise+killifish%3A+an+emerging+experimental+model+for+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">The short-lived African turquoise killifish: an emerging experimental model for ageing.</a> Dis Model Mech. 9 (2), 115-129 (2016).</li>
<li>Blazek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeated+intraspecific+divergence+in+life+span+and+aging+of+African+annual+fishes+along+an+aridity+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">Repeated intraspecific divergence in life span and aging of African annual fishes along an aridity gradient.</a> Evolution. 71 (2), 386-402 (2017).</li>
<li>Terzibasi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+differences+in+aging+phenotype+between+strains+of+the+short-lived+annual+fish+Nothobranchius+furzeri%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Large differences in aging phenotype between strains of the short-lived annual fish Nothobranchius furzeri.</a> PLoS One. 3 (12), e3866(2008).</li>
<li>Kirschner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+quantitative+trait+loci+controlling+lifespan+in+the+short-lived+fish+Nothobranchius+furzeri--a+new+vertebrate+model+for+age+research%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping of quantitative trait loci controlling lifespan in the short-lived fish Nothobranchius furzeri--a new vertebrate model for age research.</a> Aging Cell. 11 (2), 252-261 (2012).</li>
<li>Valenzano, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+loci+associated+with+tail+color+and+sex+determination+in+the+short-lived+fish+Nothobranchius+furzeri%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mapping loci associated with tail color and sex determination in the short-lived fish Nothobranchius furzeri.</a> Genetics. 183 (4), 1385-1395 (2009).</li>
<li>Reichwald, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+Sex+Chromosome+Evolution+and+Aging+from+the+Genome+of+a+Short-Lived+Fish%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insights into Sex Chromosome Evolution and Aging from the Genome of a Short-Lived Fish.</a> Cell. 163 (6), 1527-1538 (2015).</li>
<li>Valenzano, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+African+Turquoise+Killifish+Genome+Provides+Insights+into+Evolution+and+Genetic+Architecture+of+Lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The African Turquoise Killifish Genome Provides Insights into Evolution and Genetic Architecture of Lifespan.</a> Cell. 163 (6), 1539-1554 (2015).</li>
<li>Harel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+platform+for+rapid+exploration+of+aging+and+diseases+in+a+naturally+short-lived+vertebrate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A platform for rapid exploration of aging and diseases in a naturally short-lived vertebrate.</a> Cell. 160 (5), 1013-1026 (2015).</li>
<li>Valenzano, D. R., Sharp, S., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-Mediated+Transgenesis+in+the+Short-Lived+African+Killifish+Nothobranchius+furzeri%2C+a+Vertebrate+Model+for+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Transposon-Mediated Transgenesis in the Short-Lived African Killifish Nothobranchius furzeri, a Vertebrate Model for Aging.</a> G3. 1 (7), Bethesda. 531-538 (2011).</li>
<li>Harel, I., Valenzano, D. R., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genome+engineering+approaches+for+the+short-lived+African+turquoise+killifish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Efficient genome engineering approaches for the short-lived African turquoise killifish.</a> Nat Protoc. 11 (10), 2010-2028 (2016).</li>
<li>Polacik, M., Blazek, R., Reichard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+breeding+of+the+short-lived+annual+killifish+Nothobranchius+furzeri%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Laboratory breeding of the short-lived annual killifish Nothobranchius furzeri.</a> Nat Protoc. 11 (8), 1396-1413 (2016).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> J Vis Exp. (69), e4196(2012).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych i niefinansowych.

Opisujemy protokół hodowli laboratoryjnej turkusowych karpiów, w tym pobieranie zarodków, inkubację, a także trzymanie, rozmnażanie i karmienie dorosłych ryb. Nasz protokół jest specjalnie skierowany do laboratoriów, które prowadzą badania skoncentrowane na dorosłych rybach, w szczególności do badań eksperymentalnych nad starzeniem się i długością życia. Turkusowe karpiowate mogą być hodowane na standardowym obiekcie danio pręgowanego; Jednak ważne aspekty hodowli karpiów różnią się od standardowej pielęgnacji danio pręgowanego16. Dostosowania te obejmują wczesne przejście z diety opartej wyłącznie na krewetkach solankowych do diety uzupełnionej bogatymi w białko robakami krwionośnymi, a także określone etapy inkubacji zarodków, składające się z etapu inkubacji płynnej i suchej.
Krytyczne kroki w ramach protokołu obejmują transport zarodków w zakresie temperatur 8 - 30 °C. W przypadku hodowli płodność zależy od częstotliwości karmienia i jakości pokarmu; Dlatego zalecamy co najmniej dwa karmienia dziennie na zbiornik hodowlany w celu zwiększenia wydajności zarodków (patrz punkt 5.6.). Podczas wybielania zarodków nie należy przedłużać inkubacji zarodków w roztworze wybielającym. Może to spowodować uszkodzenie kosmówki jajowej i zwiększoną śmiertelność zarodków. Podczas inkubacji zarodków z błękitem metylenowym nie należy przedłużać inkubacji zarodków gotowych do wylęgu dłużej niż 2 tygodnie, ponieważ ich żywotność zostanie drastycznie zmniejszona. W przypadku wylęgu turkusowych karpiów niska temperatura roztworu kwasu humusowego poprawia wylęganie, a całkowite zanurzenie zarodków w roztworze umożliwia zsynchronizowane wylęganie. Niewystarczające napowietrzenie podczas inkubacji powoduje, że narybek nie jest w stanie napełnić pęcherza gazowego (fenotyp "suwaka brzusznego", patrz uwagi w sekcji 5.1).
Ograniczenie protokołu hodowlanego obejmuje stosowanie podłoża piaskowego, które stanowi wyzwanie dla scentralizowanych systemów filtracji i powinno zostać zastąpione alternatywnymi metodami w przyszłości. Możliwą alternatywą może być wykorzystanie zbiorników hodowlanych danio pręgowanego. Bielenie zarodków może spowodować poważne zmiany fizykochemiczne w kosmówce jaja, które mogą skutkować zmienioną fizjologią kosmówki i sukcesem wylęgowym. Stała ekspozycja zarodków na błękit metylenowy może wywołać długotrwałe zmiany w fizjologii dorosłych ryb. Hodowla dorosłych ryb w indywidualnych zbiornikach w celu przeprowadzenia badań kohortowych dotyczących przetrwania może negatywnie wpłynąć na zachowanie i zdrowie ryb. Jednak trzymanie grupowe w celu przeżycia badań kohortowych dodaje znaczące czynniki zakłócające ze względu na ustanowienie dominacji społecznej i terytoriów męskich, co prowadzi do ścisłych hierarchii społecznych. Dlatego uważamy, że izolacja samców ryb do badań nad przeżywalnością jest rozsądnym kompromisem. Karmienie laboratoryjnych kolonii karpiów żywym pokarmem z niekontrolowanych źródeł zwiększa ryzyko zewnętrznych zanieczyszczeń pasożytami i potencjalnie chorobotwórczymi zbiorowiskami drobnoustrojów. W przyszłości należy opracować doraźną sterylną paszę dla ryb.
Przyszłe ulepszenia tego protokołu będą koncentrować się na kontrolowanej, nieżywej diecie, która nadal prowadzi do osiągnięcia dojrzałości płciowej w ciągu 3-4 tygodni. Podsumowując, nasz protokół zapewnia dostęp do turkusowej hodowli laboratoryjnej karpiów dla szerokiej społeczności naukowej.

Biorąc pod uwagę ich krótką długość życia i szybki cykl życia, turkusowe karpiówki szybko rosną jako obiecujący nowy organizm modelowy w biologii1,2,3. Gatunek ten charakteryzuje się unikalnym cyklem życiowym teleostu, składającym się z diapauzy embrionalnej, szybkiego dojrzewania płciowego i przedłużonego etapu życia poreprodukcyjnego4,5. Ostatnie prace przyczyniły się do wyjaśnienia biologii tego gatunku zarówno w niewoli, jak i na wolności6,7. Turkusowe karpiowate żyją w sezonowych zbiornikach słodkowodnych, które tworzą się w porze deszczowej na afrykańskiej sawannie w Zimbabwe i Mozambiku. W porze suchej zarodki przeżywają w suchym błocie przy braku wody dzięki odpornemu na stres etapowi życia zwanemu diapauzą.
Mapy genetyczne dla tego gatunku zostały wygenerowane8,9, a ostatnio ich genom został zsekwencjonowany i złożony10,11. Opracowano kilka wsobnych szczepów ryb laboratoryjnych, a transgeneza i edycja genomu za pomocą CRISPR/Cas9 stały się dostępne dla tego gatunku, de facto promując turkusową karpię jako konkurencyjny laboratoryjny organizm modelowy kręgowców12,13,14.
Chociaż protokół laboratoryjny został już opublikowany dla tego gatunku15, w obecnym protokole opracowujemy obszerną listę eksperymentalnych wytycznych laboratoryjnych, które są specjalnie ukierunkowane na badania nad starzeniem się i przeżywalnością. Niniejszy protokół umożliwia naukowcom zaznajomionym już z hodowlą danio pręgowanego i medaka zapoznanie się z hodowlą turkusowych ryb karpiowatych poprzez przyjęcie minimalnej liczby kluczowych zmian. Jednocześnie protokół ten zapewnia naukowcom bez wcześniejszego doświadczenia w hodowli ryb niezbędne narzędzia do wyhodowania kwitnącej kolonii turkusowych karpiów.

<table><tbody><tr><td>Roztwór buforowy do kalibracji sondy pH=7,0</td><td>Roth</td><td>A518.1</td><td>1L roztwór buforowy pH=7,0 do kalibracji elektrody pH systemu wodnego</td></tr><tr><td>Roztwór buforowy do kalibracji sondy pH=4,0</td><td>Roth</td><td>P712.1</td><td>1L roztwór buforowy pH=4,0 do kalibracji elektrody pH systemu wodnego</td></tr><tr><td>Wzorzec przewodności</td><td>VWR</td><td>83607.260</td><td>500 mL Wzorzec przewodności 1,413 uS/cm do kalibracji układu wodnego Elektroda konduktometryczna</td></tr><tr><td>Easy Strips Test 6w1</td><td>JBL</td><td>2533900</td><td>Paski testowe do oznaczania wartości chloru w wodzie systemowej</td></tr><tr><td>Test amoniaku</td><td>JBL</td><td>2536500</td><td>Test do oznaczania zawartości amoniaku w wodzie systemowej Sól z</td></tr><tr><td>Morza</td><td></td><td>Czerwonego Wiadro</td><td>22 kg</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>VWR</td><td>27780.360</td><td></td></tr><tr><td>Kwas humusowy</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>53680-50G</td><td></td></tr><tr><td>Nowa butelka HUFA Artemia</td><td>ZM Systems UK</td><td>75g</td><td></td></tr><tr><td>Błękit metylenowy</td><td>Roth</td><td>AE64.1</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór nadtlenku wodoru</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>31642-1L</td><td>30% (w/w)</td></tr><tr><td>Włókno kokosowe</td><td>Dragon</td><td>ZCS010</td><td></td></tr><tr><td>Papier Whatman</td><td>GE healthcare</td><td>3030-690</td><td></td></tr><tr><td>Czysty etanol</td><td>VWR</td><td>20821.467</td><td>100%</td></tr> <tr><td>piasek kwarcowy</td><td>lokalny sklep zoologiczny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jaja artemii Premium Grade</td><td>Sanders</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bloodworm</td><td>lokalny dystrybutor</td><td></td><td>Poseidon Aquakultur Niemcy</td></tr><tr><td>mieszanka roztworów dNTPs</td><td>Biolabs</td><td>N04472</td><td>10mM</td></tr><tr><td>Taq DNA polimeraza</td><td>Invitrogen</td><td>18038-042</td><td>5U/uL</td></tr><tr><td>PCR 10x Bufor</td><td>Invitrogen</td><td>18038-042</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Invitrogen</td><td>18038-042</td><td>50mM</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>S8045-500g</td><td>50mM</td></tr><tr><td>Tris-HCl, pH=8,0 roztwór</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>T2694-1L</td><td>1M</td></tr><tr><td>HCl 37%</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>H1758-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Akwarium</td><td>Objętość akwadryzacji</td><td></td><td>: 0,8 l, 2,8 l, 9,5 l; wyposażony w przegrody, siatkę do smażenia i pokrywki</td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna</td><td>VWR</td><td>89032-100</td><td>model 5000</td></tr><tr><td>Inkubator mikrobiologiczny</td><td>Thermo Scientific, Heratherm</td><td>50125882</td><td>model IMC18; do przechowywania zarodków w fazie ciekłej, ustawione na t=27-28&deg; C</td></tr><tr><td>Inkubator chłodzący</td><td>Binder</td><td>9020-0209</td><td>model KT115; dla zarodków do przechowywania w fazie stałej, ustawione na t=27-28&deg; C</td></tr><tr><td>Inkubator wylęgowy</td><td>Thermo Scientific, Heratherm</td><td>51028114</td><td>model OGS180; dla wylęgu zarodków, ustawione na t=27-28&deg; C</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica</td><td></td><td>model M80</td></tr><tr><td>Hodowlane skrzynki do piasku/wylęgu</td><td>Roth</td><td>1598.1</td><td>1000 ml</td></tr><tr><td>szalka</td><td>Petriego Sarstedt</td><td>82.1473</td><td>92x16mm</td></tr><tr><td>50 ml Rurka stożkowa</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Rurka stożkowa</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.002</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowa plastikowa pipeta Pasteura</td><td>Roth</td><td>EA71.1</td><td>2 ml; W przypadku karmienia ryb z dżdżownicami lub selekcji zarodków odetnij końcówkę, aby otworzyć Pipeta serologiczna o średnicy 3-4 mm</td></tr><tr><td></td><td>Sarstedt</td><td>86.1689.001</td><td>50mL</td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4100-000V0</td><td>10mL</td></tr><tr><td>Sitko</td><td></td><td></td> metalowe <td>rozdrobnienie < 1mm; do pobierania zarodków</td></tr><tr><td>Pęseta</td><td>Dumont</td><td>0508-5/45-PO</td><td>typ 5/45; do transferu zarodków</td></tr><tr><td>25 L Wylęgarnia krewetek solankowych</td><td>Aquaneering</td><td>ZHBS25</td><td>główny klujnik</td></tr><tr><td>500 ml Wylęgarnia krewetek solankowych</td><td>JBL</td><td>6106100</td><td>model Artemio 1; zapasowy wylęgarnia</td></tr><tr><td>Siatki rybackie o wąskich oczkach</td><td>JBL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zlewka piaskowa</td><td>VWR</td><td>BURK7102-5000</td><td>5000mL</td></tr><tr><td>Zlewka do separacji krewetek solankowych</td><td>VWR</td><td>BURK7102-2000</td><td>2000mL</td></tr><tr><td>Plastikowa torba na zamek błyskawiczny</td><td>Roth</td><td>P279.2</td><td>do przechowywania martwych ryb</td></tr><tr><td>Pipetboy</td><td>Integra</td><td>155000</td><td>model Pipetboy acu2</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>P-Lab</td><td>P701605</td><td></td></tr><tr><td>Rura przewodząca powietrze</td><td>www.zajac.de</td><td>AQ380</td><td>4-6 mm średnica</td></tr><tr><td>1 L Butelka szklana</td><td>VWR</td><td>215-1595</td><td></td></tr><tr><td>2 L Butelka szklana</td><td>VWR</td><td>215-1596</td><td></td></tr><tr><td>500 ml Butelka do wyciskania</td><td>Roth</td><td>K665.1</td><td>do karmienia ryb krewetkami solankowymi</td></tr><tr><td>120-&#956; m sitko do krewetek solankowych</td><td>Florida Aqua Farms</td><td>BB-PC2</td><td>do zbierania krewetek solankowych/ochotek</td></tr><tr><td>Wykończenie skarpet filtracyjnych</td><td>Aquaneering</td><td>MFVB025C</td><td>25-&#956; m</td></tr><tr><td>Centralny system</td><td></td><td></td> filtracji w pomieszczeniach dla ryb <td>Aquaneering, Techniplast, Siedliska wodne, Aqua Schwarz</td></tr></tbody></table>

protokół przetrzymywania w laboratoriach turkusowych ryb (nothobranchius furzeri)

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish (Nothobranchius furzeri)

Rozwój praktyk hodowlanych u niemodelowych ryb laboratoryjnych wykorzystywanych do celów eksperymentalnych przyniósł znaczne korzyści z ustanowienia referencyjnych systemów modeli ryb, takich jak danio pręgowany i medaka. W ostatnich latach pojawiająca się ryba – turkusowa karpia (Nothobranchius furzeri) – została zaadoptowana przez coraz większą liczbę grup badawczych w dziedzinie biologii starzenia się i ekologii. Gatunek ten, żyjący w niewoli od 4 do 8 miesięcy, jest najkrócej żyjącym kręgowcem hodowanym w niewoli i pozwala społeczności naukowej na przetestowanie – w krótkim czasie – eksperymentalnych interwencji, które mogą prowadzić do zmian w tempie starzenia się i średniej długości życia. Biorąc pod uwagę unikalną biologię tego gatunku, charakteryzującą się diapauzą embrionalną, gwałtownym dojrzewaniem płciowym, wyraźnym morfologicznym i behawioralnym dymorfizmem płciowym - oraz ich stosunkowo krótką długością dorosłego życia - pilnie potrzebne są doraźne praktyki hodowlane. Protokół ten informuje o zestawie kluczowych środków hodowlanych, które umożliwiają optymalną opiekę laboratoryjną nad turkusowymi karpiami, umożliwiając społeczności naukowej przyjęcie tego gatunku jako potężnego modelu zwierząt laboratoryjnych.

Prawidłowa hodowla kilifish turkusowych skutkuje medianą przeżywalności wynoszącą od 12 do 18 tygodni w szczepie GRZ (np. Rycina 4A). Zmienność mediany przeżywalności zależy od diety, częstotliwości karmienia oraz warunków temperatury w zbiornikach. Niewłaściwa hodowla prowadzi do powstania krzywych przeżywalności wykazujących zwiększoną śmiertelność wczesną oraz powtarzające się, nagłe spadki przeżywalności w czasie, charakteryzujące się kilkoma punktami przegięcia (Rycina 4B).
<img alt="Rycina 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57073/57073fig1.jpg" /> 
Rycina 1: Reprezentatywne stadia rozwoju embrionalnego z odpowiednim podłożem inkubacyjnym. (A) Świeżo zebrane embriony, inkubowane w roztworze błękitu metylenowego w inkubatorze w temperaturze 28 °C. (B) Embriony gotowe do przeniesienia na podłoże stałe, albo papier filtracyjny, albo włókno kokosowe. (C) Embriony gotowe do wyklucia, wykazujące typowe złote tęczówki. Pasek skali odpowiada 1 mm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57073/57073fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57073/57073fig2.jpg" /> 
Rysunek 2: Etapy rozwoju killifish turkusowego po wykluciu. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57073/57073fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57073/57073fig3.jpg" /> 
Rycina 3: Reprezentatywna etykieta identyfikacyjna ryb od etapu 3 w górę. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57073/57073fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57073/57073fig4.jpg" /> 
Rycina 4: Reprezentatywna krzywa przeżywalności 70 samców killifish turkusowego. (A) Typowa krzywa przeżywalności dla killifish turkusowego hodowanego w warunkach laboratoryjnych. (B) Porównanie krzywych przeżywalności uzyskanych od ryb hodowanych w optymalnych warunkach (kolor czarny) oraz w złych warunkach hodowlanych (kolor czerwony i niebieski). Przerywana czerwona linia pozioma oznacza 50% przeżywalność, przecinając krzywą przeżywalności w punkcie mediany długości życia (zaznaczonej na osi x). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57073/57073fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Identyfikator</td>
			<td colspan="2">Starter forward</td>
			<td colspan="2">Starter odwrotny</td>
			<td>Zakres wielkości (bp)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*NfuSU0007</td>
			<td colspan="2">GGCTAAGCCTTGCTGACAGA</td>
			<td colspan="2">CAGGGAGCTGAAAACCTCAG</td>
			<td>166 - 214</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*NfuSU0010</td>
			<td colspan="2">CGCAGTCTGATCAAATCGTGT</td>
			<td colspan="2">TGTTTGAAGGTTCACATTCATTATC</td>
			<td>220 - 272</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NfuSU0016</td>
			<td colspan="2">CATGGCTAAACCGTGATGAA</td>
			<td colspan="2">GAAGGACGCCAGCTATGAAG</td>
			<td>209 - 240</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NfuSU0022</td>
			<td colspan="2">AACACAGCTCTCGTAAGGAGGTA</td>
			<td colspan="2">TTCAGACTTGTCTTACTACCATGTTT</td>
			<td>198 - 238</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NfuSU0027</td>
			<td colspan="2">TCCAGCTGAATCGGTAATGA</td>
			<td colspan="2">AAACTCGAGGGTGCAATCTG</td>
			<td>164 - 226</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NfuSU0049</td>
			<td colspan="2">CTGGACAAAGTGCCAATCAC</td>
			<td colspan="2">CTCCCACAGTCCCAAAACAT</td>
			<td>196 - 197</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NfuSU0050</td>
			<td colspan="2">CCAGAATGAACAATACTCAGATCAA</td>
			<td colspan="2">GCAGCTTAGTTTAATGATATCACAATG</td>
			<td>252 - 295</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NfuSU0060</td>
			<td colspan="2">CTAGCCACTCCCCTGGTTTA</td>
			<td colspan="2">CCGTCACGATGTGCTGATAC</td>
			<td>216 - 248</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NfuFLI0030</td>
			<td colspan="2">CAGAAGCTAAAGGCCAGACG</td>
			<td colspan="2">GGGAAACAATAGGGAACCAC</td>
			<td>174 - 205</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*NfuFLI0091</td>
			<td colspan="2">ACGCTGACTCTACCCAGTC</td>
			<td colspan="2">CTGCCTGCTACTGACAATG</td>
			<td>355 - 373</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="6">*- markery determinacji płci</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Startery do genotypowania w celu identyfikacji szczepów.

Pomieszczenia laboratoryjne turkusowych ryb mogą być skalowane do hodowli i efektywnego hodowania tysięcy pojedynczych ryb w centralnym systemie filtracji wody, wykorzystując tę samą infrastrukturę, która jest używana w standardowych obiektach dla danio pręgowanego. Poniżej przedstawiamy listę ustandaryzowanych procedur, które pozwalają na efektywną hodowlę karpiów.

Protokół przetrzymywania w laboratoriach turkusowych ryb (Nothobranchius furzeri)

The development of husbandry practices in non-model laboratory fish used for experimental purposes has greatly benefited from the establishment of ...

Ogólnym celem tego protokołu jest pomyślne wyhodowanie kolonii laboratoryjnej turkusowych karpiowatych w celu badania starzenia się i chorób związanych z wiekiem w szybki i wysokoprzepustowy sposób. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie starzenia się, takie jak to, czy mutacje pojedynczych genów lub interwencje środowiskowe mogą modulować proces starzenia się u gatunków kręgowców. Główną zaletą tej techniki jest to, że postępując zgodnie z naszymi podstawowymi protokołami, kilka laboratoriów może teraz przeprowadzać eksperymenty z użyciem turkusowych karli.Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały problemy, ponieważ hodowla karpiów ma pewne unikalne cechy. Na przykład zarodki są hodowane na suchym podłożu przed wykluciem, co bardzo różni się od kanonicznych modeli ryb, takich jak danio pręgowany. Na początek ustaw 9,5-litrowe zbiorniki hodowlane, każdy z pięciotygodniowym samcem i dwiema sześcio- lub siedmiotygodniowymi samicami.Następnie napełnij plastikowy pojemnik autoklawowanym piaskiem o głębokości około dwóch do trzech centymetrów i umieść piaskownicę na środku zbiornika hodowlanego. Pozwól turkusowym karpiom rozmnażać się w sposób ciągły i zbieraj zarodki raz w tygodniu w celu inkubacji zarodków. Aby zebrać zarodki w jednym stadium komórkowym do wykorzystania do wstrzykiwania i generowania linii transgenicznych, należy założyć zbiornik hodowlany z jednym samcem i dwiema samicami ryb, jak właśnie pokazano.Dwa dni przed pobraniem zarodków przenieś samca do indywidualnego zbiornika i utrzymuj go w kontakcie wzrokowym z dorosłymi samicami. W dniu zbioru dodaj samca i piaskownicę do zbiornika hodowlanego i pozwól rybom na tarło przez dwie godziny. Po tarle i wyjęciu piaskownicy ze zbiornika, opróżnij piaskownicę do sitka i użyj wody systemowej do jej wypłukania.Następnie częściowo zanurz sitko w wodzie systemowej i delikatnie nim zamieszaj, aby zarodki zgrupowały się w środku. Za pomocą dwumililitrowej pipety Pasteura zbierz zarodki i przenieś je na 90-milimetrową szalkę Petriego z około 40 mililitrami wody systemowej. Pod mikroskopem świetlnym zbadaj zarodki na szalce Petriego i usuń te, które mają pękniętą kosmówkę i oznaki uszkodzenia.Po wybieleniu zarodków zgodnie z protokołem tekstowym należy sprawdzić i usunąć wszelkie martwe zarodki, które byłyby zabarwione na niebiesko. Po dopuszczeniu zarodków do inkubacji w świeżym roztworze błękitu metylenowego należy sprawdzić, czy rozwinięte zarodki mają widoczne czarne oczy. Następnie za pomocą jednorazowej pipety Pasteura lub cienkiej zakrzywionej pęsety przenieś zarodki na płytkę z bibuły filtracyjnej.Zachowaj wszelkie nierozwinięte zarodki w błękicie metylenowym i monitoruj je codziennie. Gdy pojawią się czarne oczy, przenieś je na podłoże z podłożem stałym. Za pomocą kleszczy rozłóż zarodki w odległości około pięciu milimetrów od siebie, do 100 zarodków na 90-milimetrową płytkę.Następnie użyj parafiny, aby uszczelnić naczynie i inkubować zarodki w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez dwa do trzech tygodni, aż w pełni rozwiną złote tęczówki i będą gotowe do wyklucia. W przypadku długotrwałego przechowywania do jednego roku, po inkubacji w roztworze błękitu metylenowego przez trzy dni, przenieść zarodki na płytki z podłożem stałym, jak właśnie pokazano, i inkubować je w temperaturze 17 stopni Celsjusza. Aby wykluć rybę, użyj cienkiej zakrzywionej pęsety, aby ostrożnie przenieść od 50 do 100 rozwiniętych zarodków do pudełka wylęgowego i całkowicie zanurzyć je w roztworze kwasu humusowego nie głębiej niż dwa centymetry w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Kluczowym krokiem w tym protokole jest wylęganie zarodków karpiów, co osiąga się poprzez przeniesienie zarodków inkubowanych na suchym podłożu do roztworu wylęgowego zawierającego kwas humusowy z wystarczającym napowietrzeniem. Przykryj pudełko wylęgowe pokrywką i inkubuj w temperaturze 28 stopni Celsjusza w inkubatorze wylęgowym. Aby zapewnić wystarczające napowietrzenie, podłącz skrzynkę do źródła powietrza z rurką.Aby utrzymać odpowiednią jakość wody w komorze wylęgowej, raz dziennie od dnia następującego po wykluciu należy uzupełniać skrzynkę w stosunku jeden do jednego autoklawowanej wody systemowej, utrzymując końcową głębokość dwóch centymetrów. Przenieś niewyklute zarodki z powrotem na stałe podłoże i spróbuj wykluć się tydzień później. Aby wyhodować młode i dorosłe ryby w pięć dni po wykluciu, przenieś młode osobniki do systemu recyrkulacji wody za pomocą jednorazowych plastikowych pipet lub plastikowej łyżki, aby ostrożnie przenieść pięć młodych osobników na zbiornik o pojemności 0,8 litra wyposażony w sito do narybku o średnicy 400 mikrometrów.W wieku 14 dni przenieś młode ryby do zbiornika o pojemności 2,8 litra wyposażonego w sito do smażenia o średnicy 850 mikrometrów. Od tego momentu należy oznaczyć każdy zbiornik identyfikatorem ryby. W przypadku testów przetrwania, każdą rybę należy indywidualnie przechowywać w jednym zbiorniku. Ryby hodowane do testów przetrwania są również indywidualnie trzymane w zbiorniku o pojemności 2,8 litra.Przez następne siedem dni karm młode osobniki dwa razy dziennie pięcioma mililitrami krewetek solankowych uzupełnionych jednym do trzech żywych robaków krwionośnych. W wieku czterech tygodni karm każdą rybę dwa razy dziennie krewetkami solankowymi i jednym mililitrem robaków krwionośnych. Na tym etapie upewnij się, że ryba osiągnęła pełną dojrzałość płciową, sprawdzając obecność dużych płetw grzbietowych, odbytowych i ogonowych z oznakami ubarwienia u samców i okrągłych brzuchów pełnych jaj u samic.Pokazana tutaj jest reprezentatywna krzywa przeżywalności dla 70 samców turkusowych karpiów. Właściwa hodowla skutkuje medianą przeżycia w zakresie od 12 do 28 tygodni w odmianie GRZ. Różnice w medianie przeżycia zależą od diety, częstotliwości karmienia i warunków temperatury w pomieszczeniach inwentarskich.Krzywa przeżywalności ryb hodowanych w warunkach złej hodowli ujawnia wzrost wczesnej śmiertelności i powtarzające się nagłe spadki przeżywalności w czasie w porównaniu z rybami hodowanymi w optymalnych warunkach hodowli. Przestrzegając tego protokołu, ważne jest, aby ściśle monitorować stan wody i nadmiar pokarmu ze świeżo wyklutego narybku, ponieważ ważne jest, aby były one utrzymywane w czystym środowisku. Po jej opracowaniu technika ta utorowała naukowcom drogę do zbadania eksperymentalnych manipulacji u turkusowych karpiów, w tym transgenezy, edycji genomu i manipulacji dietetycznych.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skutecznie hodować turkusowe karpiówki w laboratorium i używać tego modelu do zbadania biologii starzenia się najkrócej żyjących kręgowców, które można hodować w niewoli.

a-protocol-for-laboratory-housing-turquoise-killifish-nothobranchius

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy protokół opisuje regularną konserwację i pielęgnację w celu utrzymania optymalnych warunków chowu danio pręgowanych. Film przedstawia procedurę konserwacji systemu, bieżącego utrzymania, karmienia, rozrodu oraz hodowli larw danio pręgowanych.

Regularna pielęgnacja i konserwacja laboratorium rybek danio (Danio rerio): wprowadzenie

Obiekt dla danio pręgowanego nadający się do hodowli i badań in vivo jest zbudowany w łatwy i niedrogi sposób. Konserwacja jest minimalna. To miejsce jest idealne do angażowania studentów i niezależnych badań.

Budowa niedrogiego i łatwego w budowie obiektu do połowu danio pręgowanego

To badanie obejmuje metody mające na celu ujawnienie wpływu na modelowego gospodarza ryb po zmianie składu społeczności mikrobiomu skóry i jelit przez antybiotyk.

Badanie fenotypów gospodarza w Gambusia affinis po leczeniu antybiotykami

Ten protokół opisuje użycie wymazów z miski olejowej i analizy osadu w systemach danio pręgowanego, co prowadzi do zwiększenia wykrywalności w porównaniu do samego użycia wartowników do wykrywania patogenów, takich jak Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. i Pseudocapillaria tomentosa. Zaproponowano również system monitorowania jaj P. tomentosa w kwarantannie.

Badania przesiewowe środowiskowe Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. i Pseudocapillaria tomentosa w systemach danio pręgowanego

W tym protokole, fluorescencyjnie znakowane T. cruzi zostały wstrzyknięte do przezroczystych larw danio pręgowanego, a ruchliwość pasożyta zaobserwowano in vivo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z użyciem arkusza świetlnego.

Ustanowienie larw danio pręgowanego jako modelu zwierzęcego do badania ruchliwości Trypanosoma cruzi in vivo

W tej pracy opisujemy ostry, przewlekły i wielopokoleniowy test biologiczny, aby zbadać wpływ pojedynczych i połączonych stresorów na turkusową karpię Nothobranchius furzeri. Protokół ten ma na celu badanie cech historii życia (śmiertelność, wzrost, płodność, waga) i krytycznego maksimum termicznego.

Protokół badania ostrej i przewlekłej ekotoksyczności turkusowej Killifish Nothobranchius furzeri

W tym protokole pokazujemy, jak hodować dorosłe osobniki Astyanax mexicanus, hodować larwy i przeprowadzać immunohistochemię na rybach po larwie, aby porównać fenotypy morfotypów powierzchniowych i jaskiniowych.

Hodowla meksykańskiego Tetra Astyanax mexicanus w celu analizy fenotypów postlarwalnych i immunohistochemii całego wierzchowca

Podstawowym aspektem oceny dobrostanu zwierząt w niewoli jest pytanie, czy zwierzęta mają to, czego chcą. W tym miejscu przedstawiamy protokół określający preferencje mieszkaniowe u danio pręgowanego (Danio rerio) w odniesieniu do obecności/braku wzbogacenia środowiska i dostępu do płynącej wody.

Ustandaryzowany protokół testowania preferencji w celu oceny dobrostanu ryb

Tutaj prezentujemy protokół izolowania jąder z mózgów krótkotrwałego modelu kręgowców Nothobranchius furzeri do dalszych zastosowań, takich jak sekwencjonowanie RNA pojedynczego jądra lub test pojedynczego jądra dla chromatyny dostępnej dla transpozazy z sekwencjonowaniem (ATAC-seq).

Delikatna izolacja jąder od tkanki mózgowej dorosłego afrykańskiego turkusowego Killifisha, naturalnie krótkotrwały model do badań nad starzeniem się

Przedstawiamy tutaj nowy, łatwy w budowie i nisko kosztowy protokół dotyczący obiegowego hodowania rybki labiryntowej.

System do hodowania ryb cebra z recyrkulacją wody

Poznaj protokół hodowli turkusowych ryb Nothobranchius furzeri w warunkach laboratoryjnych do badań nad starzeniem. Ta metoda umożliwia wydajne prowadzenie kolonii i analizę procesów starzenia u kręgowców.

Protokół przetrzymywania w laboratoriach turkusowych ryb (Nothobranchius furzeri)

Przeglądaj więcej filmów