Name: Ekstrakcja hemocytów z larw Drosophila melanogaster do infekcji mikrobiologicznej i analizy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Poznaj ekstrakcję hemocytów z larw Drosophila melanogaster do infekcji mikrobiologicznej i analizy. Ta metoda umożliwia wizualizację inwazji patogenów z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej i rekonstrukcji 3D.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni doktorowi Robertowi Heinzenowi za dostarczenie zapasów Coxiella burnetii wykazującej ekspresję mCherry. Dziękujemy dr Luisowi Teixeirze za dostarczenie opalizującego wirusa bezkręgowców 6 oraz Bloomington Stock Center za dostarczenie stad much. Ten projekt został częściowo sfinansowany przez grant NIH R00 AI106963 (dla A.G.G.) i Washington State University.

1. Zakażenie ex vivo
<ol>
	<li>Pożywki i sprzęt
	<ol>
		<li>W warunkach sterylnych przygotować świeżą Muszka owocówka pożywka do izolacji hemocytów (DHIM) zawierająca 75% pożywki Schneidera Muszka owocówka pożywka z 25% płodową surowicą bydlęcą (FBS), którą należy wysterylizować przez filtrację.</li>
		<li>Ułóż 2–3 kawałki folii parafinowej o wymiarach 10 cm x 10 cm warstwowo pod stereomikroskopem.</li>
		<li>Przygotować kapilarę szklaną. Ustawić grzałkę wyciągacza kapilar na 55% mocy maksymalnej. Wyciągnąć rurkę kapilarną do uzyskania ostrego wierzchołka o długości około 10 µm.</li>
		<li>Wypełnij kapilarę olejem mineralnym.</li>
		<li>Zamontuj wypełnioną kapilarę w nanowtryskiwaczu (Rysunek 1A), a następnie otworzyć końcówkę stopionej kapilary, odłamując ją pęsetą (Rysunek 1B). Średnica zewnętrzna końcówki powinna wynosić 100 µm dla łatwego poboru hemocytów.</li>
		<li>Wypchnąć z końcówki kapilary jak największą ilość oleju, a następnie napełnić ją medium DHIM. Aby ułatwić wizualizację granicy między pobraną hemolimfą a olejem, należy pozostawić pęcherzyk powietrza między olejem a DHIM (Rycina 1B').</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja hemolimfy
	<ol>
		<li>Wybierz 3rd stadium larwalne Muszka owocówka larwy z wewnętrznej ścianki fiolek z pożywką delikatnie za pomocą pincety i przenieść je do 100 µm cedzak (Rysunek 1C). 3rd Larwy pierwszego stadium rozwojowego pojawiają się od 3 do 6 dni po zniesieniu zapłodnionych jaj przez dorosłą samicę. 
		UWAGA: W eksperymentach tych wykorzystano genotyp w1118;P{w+mC=Hml-GAL4.Δ}2,P{w+mC=UAS-2xEGFP}AH2, ponieważ hemocyty tych zwierząt wykazują ekspresję ulepszonego zielonego białka fluorescencyjnego (EGFP), co ułatwia identyfikację komórek za pomocą mikroskopii.</li>
		<li>Wlej 5 ml sterylnej wody na larwy i potrząsaj sitkiem przez 5 s. Umieść sitko na ręczniku papierowym, aby usunąć nadmiar wody (Rysunek 1C').</li>
		<li>Przenieś larwy do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Znieczul je za pomocą CO22 gaz przez 5 s (Rycina 1D).</li>
		<li>Umieść larwy na folii parafinowej pod stereomikroskopem, stroną grzbietową do góry (Rysunek 2A).</li>
		<li>Należy delikatnie przyłożyć szklaną kapilarę do tylnej części ciała larwy, aby ją unieruchomić, a następnie za pomocą pęsety z cienkimi końcówkami rozciąć tylną część kutykuli (Rycina 2B).</li>
		<li>Pozostawić hemolimfę, aby spłynęła na folię parafinową (Rycina 2C).</li>
		<li>Przygotować pulę hemolimfy zawierającą hemocyty z 20–50 larw jednocześnie na folii parafinowej.</li>
		<li>Pobrać połączoną hemolimfę za pomocą kapilary szklanej nanoiniektora (Rycina 2D). 
		UWAGA: Powinno być około 10-20 µL hemolimfy.</li>
		<li>Wypchnij hemolimfę do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 500 µL DHIM (Rycina 2E).</li>
		<li>Powtórzyć kroki 1.2.4) – 1.2.9) dla każdej partii larw.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oblicz liczbę hemocytów.
	<ol>
		<li>Pipeta 5 µL roztworu błękitu trypanu o stężeniu 0,4% do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 0,6 ml w celu zabarwienia martwych komórek. Delikatnie wymieszać DHIM i hemocyty w probówce 1,5 ml za pomocą pipety, a następnie przenieść 5 µL DHIM, w tym hemocytów, do probówki do mikrowirówki o pojemności 0,6 ml i delikatnie wymieszać.</li>
		<li>Pipeta 10 µL komórek z mieszaniny błękitu trypanu i hemocytów w stosunku 1:1 do komory licznikowej.</li>
		<li>Należy policzyć liczbę żywych hemocytów, które nie zostały zabarwione błękitem trypanu, w każdym z 4 pól narożnych komory Goryeva i obliczyć stężenie hemocytów na mililitr, korzystając z wzoru: 
		<img alt="Wzór na zliczanie komórek, równanie: (a+b+c+d)/2 × 10⁴, obliczenia z zakresu biologii matematycznej." src="/files/ftp_upload/57077/57077eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"> 
		gdzie X oznacza stężenie żywych hemocytów na mililitr; a, b, c i d to liczba żywych komórek (oznaczona metodą wykluczania błękitu trypanu) w każdym z 4 policzonych pól komory countingowej. Dzielenie całkowitej liczby policzonych komórek przez 2 wynika z rozcieńczenia komórek błękitem trypanu w stosunku 1:1. Komórki zabarwione błękitem trypanu uznaje się za martwe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ex vivo Infekcje
	<ol>
		<li>Określ liczbę dołków, w których zostaną wysiane komórki, na podstawie punktów czasowych oraz liczby powtórzeń biologicznych wymaganych dla każdego eksperymentu. 5,0×104 Hemocyty są pożądane do oczyszczania RNA i białek po zakażeniu.</li>
		<li>Oblicz objętość roztworu zapasowego patogenu, którą należy rozcieńczyć w DHIM w celu przeprowadzenia infekcji, korzystając z następującego wzoru: 
		<img alt="Równanie miana patogenu, schemat formuły obliczania ładunku wirusowego, MOI, liczba hemocytów na dołek." src="/files/ftp_upload/57077/57077eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 2"> 
		gdzie wielokrotność infekcji (MOI) to pożądana liczba wirusów lub bakterii przypadająca na jedną komórkę. 
		UWAGA: Stosowana MOI zależy od konkretnego eksperymentu i przeprowadzanych analiz. W tym przypadku zastosowano 10 ekwiwalentów genomu (GE)/komórkę. C. burnetii, 10 JCF/komórkę Listerialub 1 TCID50użyto komórki IIV6.</li>
		<li>Przygotuj 500 µL pożywki dla patogenu do każdej studni płytki 24-dołkowej poprzez dodanie odpowiedniej objętości DHIM do objętości wirusa lub bakterii w probówce.</li>
		<li>Umieść okrągłe szkiełko nakrywkowe o średnicy 12 mm (grubość nr 1) w dołku płytki 24-dołkowej.</li>
		<li>Rozdziel DHIM wraz z hemocytami do dołków płytki 24-dołkowej.</li>
		<li>Dodaj 500 µL pożywki z patogenem do hemocytów w dołku.</li>
		<li>Wiruj płytkę z prędkością 1 000 x g przez 5 min.</li>
		<li>Inkubować płytkę przez 1 h w temperaturze 28 °CCo 15 min należy delikatnie przechylać płytkę ręcznie z tyłu do przodu, a następnie z lewej do prawej strony przez 5 s.</li>
		<li>Po 1 h etapu inwazji/przylegania (krok 1.4.8), delikatnie odpipetuj pożywkę z patogenem, przemyj hemocyty świeżym DHIM, a następnie ponownie napełnij naczynie tym medium 500 µL świeżego DHIM.</li>
		<li>Inkubować zainfekowane hemocyty przez wybrany czas. W tych eksperymentach, C. burnetii-lub zainfekowane IIV6 hemocyty inkubuje się przez 24 h, a ListeriaZainfekowane hemocyty inkubuje się przez 1, 2 lub 4 h.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. In vivo zakażenie
<ol>
	<li>Infekcja
	<ol>
		<li>Ogrzewać płytkę agarową z sokiem owocowym dla Drosophila w temperaturze pokojowej przez 15 min. Płytki przygotowuje się zgodnie z wcześniejszym opisem20.
		<ol>
			<li>Dodać 30 g agaru do 700 mL wody i autoklawować przez 40 min.</li>
			<li>Rozpuścić 0,5 g metyloparabenu w 10 mL absolutnego etanolu.</li>
			<li>Dodać roztwór metyloparabenu do 300 mL koncentratu soku owocowego.</li>
			<li>Szybko wymieszać koncentrat soku z autoklawowanym roztworem agaru i rozlać po 5 mL do szalek Petriego o wymiarach 10 × 35 mm.</li>
			<li>Po schłodzeniu płytek przez 15 min przechowywać je w temperaturze 4 °C.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotować larwy trzeciego stadium (3rd instar) zgodnie z krokami 1.2.1) – 1.2.3).</li>
		<li>Nanieść pastę drożdżową na płytkę agarową. Wykonać w agarze płytki płytkie nacięcie, do którego larwy mogą migrować, aby uniknąć wysychania (Rysunek 3A). Zamocować ostrą igłę wolframową o średnicy 0,001 mm w pęsecie za pomocą folii parafinowej (Rysunek 3B, C).</li>
		<li>Nanieść pipetą 50 µL wysokotytrowej zawiesiny C. burnetii exprimującej mCherry (5,95×109 GE/mL) na folię parafinową pod mikroskopem stereoskopowym i umieścić larwy w kropli bakterii.</li>
		<li>Umieścić larwy w kropli bakterii. Nakłuć larwy igłą wolframową (Rysunek 3D). Przenieść larwy na płytkę agarową (Rysunek 3E).</li>
		<li>Przenieść pozostałe medium z patogenem na płytkę agarową i szczelnie zamknąć płytkę folią parafinową.</li>
		<li>Utrzymywać larwy na płytce w wilgotnym powietrzu do pożądanego czasu po infekcji (Rysunek 3F). W tym doświadczeniu larwy zainfekowane C. burnetii pozostają na płytce przez 24 h.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja hemolimfy i wysiew hemocytów
	<ol>
		<li>Przygotować medium i sprzęt zgodnie z krokiem 1.1).</li>
		<li>Umieścić okrągłe szkiełko nakrywkowe o średnicy 12 mm (grubość nr 1) w dołku płytki 24-dołkowej. Nanieść pipetą 500 µL DHIM do dołka.</li>
		<li>Wyekstrahować hemolimfę z zainfekowanych larw zgodnie z krokami 1.2.4) – 1.2.8).</li>
		<li>Wprowadzić hemolimfę do dołka zgodnie z krokiem 2.2.2).</li>
		<li>Powtórzyć kroki 2.2.3) i 2.2.4) dla wielu partii larw.</li>
		<li>Wirować płytkę przy 1 000 ×g przez 5 min.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Wizualizacja
<ol>
	<li>Fiksacja i barwienie
	<ol>
		<li>Po osadzeniu hemocytów na okrągłym szkiełku nakrywkowym w dołku, ostrożnie usuń medium z każdego dołka.</li>
		<li>Do każdego dołka z osadzonymi hemocytami ostrożnie dodaj 200 µL 4% paraformaldehydu (PFA). Inkubuj hemocyty przez 20 min w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Usuń 4% PFA i do każdego dołka ostrożnie dodaj 200 µL PBS zawierającego 0,1% Triton X-100 i 1% albuminy surowicy wołowej (BSA). Inkubuj hemocyty przez 10 min w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Usuń PBS i do każdego dołka ostrożnie dodaj 200 µL 1× 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI). Inkubuj hemocyty przez 10 min w ciemności w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Usuń roztwór DAPI i do każdego dołka ostrożnie dodaj PBS. Inkubuj hemocyty przez 5 min w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Nanieś 10 µL medium montażowego zapobiegającego blaknięciu na szklany preparat mikroskopowy.</li>
		<li>Po usunięciu PBS z każdego dołka wyjmij szkiełko nakrywkowe z płytki 24-dołkowej za pomocą pęsety z cienkimi końcówkami. Ostrożnie połóż szkiełko nakrywkowe na medium montażowym na szkiełku preparatu, stroną z hemocytami do dołu.</li>
		<li>Pozostaw preparat do wyschnięcia w ciemności przez noc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie konfokalne
	<ol>
		<li>Skonfiguruj mikroskop konfokalny do obrazowania trzech kolorów: DAPI, EGFP i mCherry. Użyj następujących ustawień: wzbudzenie (ex) DAPI 405 nm, emisja (em) 415-480 nm; EGFP ex 488 nm, em 493-564 nm; mCherry ex 587 nm, em 597-700 nm.</li>
		<li>Umieść próbkę w mikroskopie i ustaw ostrość, korzystając z obiektywu 63X o aperturze numerycznej (NA) 1,4. Zlokalizuj w polu widzenia pożądane hemocyty do obrazowania.</li>
		<li>Dostosuj moc lasera i wzmocnienie detektora, aby uzyskać odpowiednią ekspozycję próbki. Sprawdź wiele płaszczyzn z, aby upewnić się, że poziom ekspozycji jest odpowiedni dla całej grubości próbki.</li>
		<li>Wyznacz górną i dolną pozycję na osi z dla całej komórki hemocytu. Ustaw te pozycje jako punkty początkowy i końcowy dla sekcjonowania w osi z.</li>
		<li>Używaj zoomu skanowania wyłącznie do obrazowania obszaru zawierającego hemocyt. Często stosuje się powiększenie 3X.</li>
		<li>Zbierz serię obrazów z odpowiednią rozdzielczością, np. 1024 x 1024 piksele w płaszczyźnie x-y oraz z odstępem 0,3 µm w wymiarze z.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rekonstrukcja modelu 3D 
	UWAGA: Dostępne jest oprogramowanie open source, które wykonuje wiele z opisanych poniżej funkcji rekonstrukcji modelu 3D.
	<ol>
		<li>Zaimportuj plik z serią obrazów z sekcji z do oprogramowania powiązanego z mikroskopem konfokalnym w celu rekonstrukcji modelu 3D.</li>
		<li>Wybierz komórkę wykazującą ko-lokalizację jąder zabarwionych DAPI oraz C. burnetii wykazującego ekspresję mCherry w hemocycie wykazującym ekspresję EGFP. Przytnij serię obrazów tak, aby zawierała tylko jedną komórkę.</li>
		<li>Wybierz opcję 3D Viewer, która rekonstruuje model 3D przy użyciu wbudowanego algorytmu oprogramowania. Wybierz pożądany typ reprezentacji 3D spośród opcji Blend, Surface i Mixed. W tej metodzie hemocyty, jądra i C. burnetii są przedstawione za pomocą modeli powierzchniowych.</li>
		<li>Obserwuj zrekonstruowaną w 3D komórkę z różnych pozycji, przytrzymując przycisk myszy i przeciągając kursor po ekranie. Dostosuj orientację komórki i pozycję modelowanego źródła światła, aby zoptymalizować obraz. Do optymalizacji obrazu dostępne są również opcje Opacity, Minimum and Maximum Threshold, Specular, Ambient, Shineness oraz Gamma.</li>
		<li>Wykonaj przekroje przez model, korzystając z poleceń clipping i sectioning, aby zwizualizować zawartość wnętrza hemocytu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Zastosowanie w analizie genów i/lub białek
<ol>
	<li>Po zakażeniu IIV6 oraz Listeria należy poddać komórki lizie w celu przeprowadzenia późniejszej analizy qRT-PCR lub Western blot, zgodnie z wcześniejszym opisem21 oraz instrukcjami producenta. 
	UWAGA: Listę starterów do qRT-PCR oraz przeciwciał do Western blot można znaleźć w Tabeli materiałów.</li>
	<li>Produkty PCR należy przeanalizować za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, zgodnie z wcześniejszym opisem22, aby upewnić się, że produkt amplifikacji ma odpowiednią długość.</li>
</ol>

<ol><li>Hoffmann, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+response+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The immune response of Drosophila.</a> Nature. 426 (6962), 33-38 (2003).</li>
<li>Regan, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steroid+hormone+signaling+is+essential+to+regulate+innate+immune+cells+and+fight+bacterial+infection+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Steroid hormone signaling is essential to regulate innate immune cells and fight bacterial infection in Drosophila.</a> PLoS Pathog. 9 (10), 1003720(2013).</li>
<li>Yano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagic+control+of+listeria+through+intracellular+innate+immune+recognition+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Autophagic control of listeria through intracellular innate immune recognition in Drosophila.</a> Nat Immunol. 9 (8), 908-916 (2008).</li>
<li>Bastos, R. G., Howard, Z. P., Hiroyasu, A., Goodman, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+and+Bacterial+Factors+Control+Susceptibility+of+Drosophila+melanogaster+to+Coxiella+burnetii+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Host and Bacterial Factors Control Susceptibility of Drosophila melanogaster to Coxiella burnetii Infection.</a> Infect Immun. 85 (7), (2017).</li>
<li>Kacsoh, B. Z., Schlenke, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+hemocyte+load+is+associated+with+increased+resistance+against+parasitoids+in+Drosophila+suzukii%2C+a+relative+of+D.+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High hemocyte load is associated with increased resistance against parasitoids in Drosophila suzukii, a relative of D. melanogaster.</a> PLoS One. 7 (4), 34721(2012).</li>
<li>Tsuzuki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switching+between+humoral+and+cellular+immune+responses+in+Drosophila.+is+guided+by+the+cytokine+GBP%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Switching between humoral and cellular immune responses in Drosophila. is guided by the cytokine GBP.</a> Nat Commun. 5, 4628(2014).</li>
<li>Kurucz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+Drosophila.+hemocyte+subsets+by+cell-type+specific+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biol+Hung%22%5BJournal%5D)">Definition of Drosophila. hemocyte subsets by cell-type specific antigens.</a> Acta Biol Hung. 58, Suppl 95-111 (2007).</li>
<li>Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+study+Drosophila+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods to study Drosophila immunity.</a> Methods. 68 (1), 116-128 (2014).</li>
<li>Arefin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+Hemocytes+Induces+a+Shift+in+Effector+Mechanisms+in+the+Drosophila.+Immune+System+and+Leads+to+a+Pro-Inflammatory+State%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in Hemocytes Induces a Shift in Effector Mechanisms in the Drosophila. Immune System and Leads to a Pro-Inflammatory State.</a> PLoS One. 10 (8), 0136593(2015).</li>
<li>Rus, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+pattern+of+Filamin-240+in+Drosophila+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expr+Patterns%22%5BJournal%5D)">Expression pattern of Filamin-240 in Drosophila blood cells.</a> Gene Expr Patterns. 6 (8), 928-934 (2006).</li>
<li>Kurucz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemese%2C+a+hemocyte-specific+transmembrane+protein%2C+affects+the+cellular+immune+response+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila.</a> P Natl Acad Sci USA. 100 (5), 2622-2627 (2003).</li>
<li>Markus, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sessile+hemocytes+as+a+hematopoietic+compartment+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster.</a> P Natl Acad Sci USA. 106 (12), 4805-4809 (2009).</li>
<li>Bretscher, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nimrod+transmembrane+receptor+Eater+is+required+for+hemocyte+attachment+to+the+sessile+compartment+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">The Nimrod transmembrane receptor Eater is required for hemocyte attachment to the sessile compartment in Drosophila melanogaster.</a> Biol Open. 4 (3), 355-363 (2015).</li>
<li>Zettervall, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+directed+screen+for+genes+involved+in+Drosophila+blood+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A directed screen for genes involved in Drosophila blood cell activation.</a> P Natl Acad Sci USA. 101 (39), 14192-14197 (2004).</li>
<li>Flynt, A., Liu, N., Martin, R., Lai, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dicing+of+viral+replication+intermediates+during+silencing+of+latent+Drosophila+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Dicing of viral replication intermediates during silencing of latent Drosophila viruses.</a> P Natl Acad Sci USA. 106 (13), 5270-5275 (2009).</li>
<li>Jovel, J., Schneemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+Drosophila+cells+persistently+infected+with+Flock+House+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of Drosophila cells persistently infected with Flock House virus.</a> Virology. 419 (1), 43-53 (2011).</li>
<li>Stoepler, T. M., Castillo, J. C., Lill, J. T., Eleftherianos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+protocol+for+extracting+hemocytes+from+wild+caterpillars%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A simple protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars.</a> J Vis Exp. (69), e4173(2012).</li>
<li>Sampson, C. J., Williams, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+ex+vivo+incubation+of+Drosophila+primary+post-embryonic+haemocytes+for+real-time+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Protocol for ex vivo incubation of Drosophila primary post-embryonic haemocytes for real-time analyses.</a> Methods Mol Biol. 827, 359-367 (2012).</li>
<li>Nehme, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+bacterial+intestinal+infections+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">A model of bacterial intestinal infections in Drosophila melanogaster.</a> PLoS Pathog. 3 (11), 173(2007).</li>
<li>Drosophila fruit juice egg plates. <a target="_blank" href="http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full?text_only=true">Cold Spring Harbor Protocols</a>. (9), pdb.rec11113 (2007).</li>
<li>Ahlers, L. R., Bastos, R. G., Hiroyasu, A., Goodman, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invertebrate+Iridescent+Virus+6%2C+a+DNA+Virus%2C+Stimulates+a+Mammalian+Innate+Immune+Response+through+RIG-I-Like+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Invertebrate Iridescent Virus 6, a DNA Virus, Stimulates a Mammalian Innate Immune Response through RIG-I-Like Receptors.</a> PLoS One. 11 (11), 0166088(2016).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li>
<li>Petraki, S., Alexander, B., Bruckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+Blood+Cell+Populations+of+the+Drosophila+melanogaster+Larva%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva.</a> J Vis Exp. (105), (2015).</li>
<li>Figliozzi, R. W., Chen, F., Chi, A., Hsia, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+inverse+Poisson+distribution+to+calculate+multiplicity+of+infection+and+viral+replication+by+a+high-throughput+fluorescent+imaging+system%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+Sin%22%5BJournal%5D)">Using the inverse Poisson distribution to calculate multiplicity of infection and viral replication by a high-throughput fluorescent imaging system.</a> Virol Sin. 31 (2), 180-183 (2016).</li>
<li>Rizki, T. M., Rizki, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamellocyte+differentiation+in+Drosophila.+larvae+parasitized+by+Leptopilina%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Comp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lamellocyte differentiation in Drosophila. larvae parasitized by Leptopilina.</a> Dev Comp Immunol. 16 (2-3), 103-110 (1992).</li>
<li>Markus, R., Kurucz, E., Rus, F., Ando, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterile+wounding+is+a+minimal+and+sufficient+trigger+for+a+cellular+immune+response+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">Sterile wounding is a minimal and sufficient trigger for a cellular immune response in Drosophila melanogaster.</a> Immunol Lett. 101 (1), 108-111 (2005).</li>
<li>McCormack, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforin-2+Protects+Host+Cells+and+Mice+by+Restricting+the+Vacuole+to+Cytosol+Transitioning+of+a+Bacterial+Pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen.</a> Infect Immun. 84 (4), 1083-1091 (2016).</li>
<li>Ozgen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+characterization+of+a+recombinant+invertebrate+iridovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">Construction and characterization of a recombinant invertebrate iridovirus.</a> Virus Res. 189, 286-292 (2014).</li>
<li>Jakob, N. J., Muller, K., Bahr, U., Darai, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+first+complete+DNA+sequence+of+an+invertebrate+iridovirus%3A+coding+strategy+of+the+genome+of+Chilo+iridescent+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Analysis of the first complete DNA sequence of an invertebrate iridovirus: coding strategy of the genome of Chilo iridescent virus.</a> Virology. 286 (1), 182-196 (2001).</li>
<li>Ghigo, E., Colombo, M. I., Heinzen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Coxiella+burnetii+parasitophorous+vacuole%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">The Coxiella burnetii parasitophorous vacuole.</a> Adv Exp Med Biol. 984, 141-169 (2012).</li>
<li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+prophenoloxidases+respond+inconsistently+to+Cu2%2B+and+have+different+activity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Comp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster prophenoloxidases respond inconsistently to Cu2+ and have different activity in vitro.</a> Dev Comp Immunol. 36 (3), 619-628 (2012).</li>
<li>De Gregorio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immune-responsive+Serpin+regulates+the+melanization+cascade+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">An immune-responsive Serpin regulates the melanization cascade in Drosophila.</a> Dev Cell. 3 (4), 581-592 (2002).</li>
<li>Kari, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+raspberry+Gene+Is+Involved+in+the+Regulation+of+the+Cellular+Immune+Response+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The raspberry Gene Is Involved in the Regulation of the Cellular Immune Response in Drosophila melanogaster.</a> PLoS One. 11 (3), 0150910(2016).</li>
<li>Wu, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+single-cell+RNA-sequencing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of single-cell RNA-sequencing methods.</a> Nat Methods. 11 (1), 41-46 (2014).</li>
<li>Buettner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+analysis+of+cell-to-cell+heterogeneity+in+single-cell+RNA-sequencing+data+reveals+hidden+subpopulations+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single-cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells.</a> Nat Biotechnol. 33 (2), 155-160 (2015).</li>
<li>Nevil, M., Bondra, E. R., Schulz, K. N., Kaplan, T., Harrison, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+Binding+of+the+Conserved+Transcription+Factor+Grainy+Head+to+its+Target+Genes+Throughout+Drosophila+melanogaster+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Stable Binding of the Conserved Transcription Factor Grainy Head to its Target Genes Throughout Drosophila melanogaster Development.</a> Genetics. 205 (2), 605-620 (2017).</li>
<li>Yang, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomes+of+lineage-specific+Drosophila+neuroblasts+profiled+by+genetic+targeting+and+robotic+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Transcriptomes of lineage-specific Drosophila neuroblasts profiled by genetic targeting and robotic sorting.</a> Development. 143 (3), 411-421 (2016).</li>
<li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+Immune+Circuits+by+Linking+CRISPR-Pooled+Screens+with+Single-Cell+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dissecting Immune Circuits by Linking CRISPR-Pooled Screens with Single-Cell RNA-Seq.</a> Cell. 167 (7), 1883-1896 (2016).</li>
<li>Karaiskos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+embryo+at+single-cell+transcriptome+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Drosophila embryo at single-cell transcriptome resolution.</a> Science. 358 (6360), 194-199 (2017).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób dochodzi do zakażenia komórek gospodarza, ważne jest wyjaśnienie lokalizacji patogenu w komórkach, zwłaszcza podczas eksperymentów na wcześniej nietestowanych kombinacjach patogenów i typów komórek4. Podczas gdy badanie kaskady odpowiedzi komórkowej po infekcji może wskazywać na produktywną inwazję patogenu, połączenie obrazowania i danych odpowiedzi komórkowej jest niezbędne do wykazania inwazji patogenu i infekcji. Podczas gdy doniesienia pokazujące obrazy 2D ...

Drosophila melanogaster to dobrze znany organizm modelowy do badania odporności wrodzonej1. Podczas wrodzonej odpowiedzi immunologicznej hemocyty odgrywają ważną rolę w odpowiedzi na prowokację patogenem. Hemocyty mają kluczowe znaczenie dla hermetyzacji pasożytów, a także pełnią ważną funkcję w zwalczaniu patogenu poprzez działanie fagocytarne podczas infekcji grzybiczych, wirusowych i bakteryjnych2,3.
Aby jak najlepiej zrozumieć wrodzoną odpowiedź immunologiczną gospodarza na patogenną infekcję bakteryjną, ważne jest wizualizację, w jaki sposób patogen atakuje komórki gospodarza podczas infekcji. Ta wizualizacja przyczynia się do zrozumienia mechanizmu inwazji. Wraz ze szczegółami dotyczącymi lokalizacji wewnątrzkomórkowej patogenu i odpowiedzi komórkowej, dane te mogą dostarczyć wskazówek na temat odpowiedzi gospodarza na infekcję i organelli komórkowych, z którymi mikrob wchodzi w interakcje. W związku z tym rekonstrukcja modelu 3D po obrazowaniu za pomocą mikroskopii może być pomocna w określeniu dokładnej lokalizacji patogenów w komórkach gospodarza. W tym badaniu zobrazowaliśmy inwazję Coxiella burnetii (C. burnetii), czynnika wywołującego gorączkę Q, chorobę odzwierzęcą, która stanowi poważne zagrożenie zarówno dla zdrowia ludzi, jak i zwierząt, do pierwotnych hemocytów Drosophila. Niedawno wykazano, że Drosophila są podatne na szczep klonu 4 C. burnetii na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 Nine Mile phase II (NMII) i że szczep ten jest w stanie replikować się w Drosophila4, co wskazuje, że Drosophila może być wykorzystana jako organizm modelowy do badania patogenezy C. burnetii.
Poprzednie badania wykorzystywały hemocyty do badania wrodzonej odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Hemocyty zostały użyte do obserwacji morfologicznych5,6,7, analiza morfometryczna2,8, analiza fagocytozy2,3, qRT-PCR2,9, immunoprecypitacja10,11, analiza immunofluorescencyjna10,12, immunostaining13, immunoblotting3,10,11 oraz immunohistochemistry9,14. Chociaż komórki Drosophila S2 są również dostępne do różnych eksperymentów in vitro, nieśmiertelność i potencjalna wcześniej istniejąca infekcja wirusowa zmieniają ich zachowanie15,16. Wykorzystanie komórek pierwotnych w przeciwieństwie do unieśmiertelnionej linii komórkowej, takiej jak komórki S2, pozwala na badanie wrodzonych funkcji immunologicznych w systemie bardziej reprezentatywnym dla całego organizmu. Ponadto zakażenie hemocytów in vivo, przed ekstrakcją, pozwala komórkom na interakcję z innymi białkami i tkankami gospodarza, co ma przewagę nad ekstrakcją hemocytów przed zakażeniem ex vivo. Zastosowano wiele różnych metod, aby uzyskać wystarczającą liczbę hemocytów w krótkim czasie, aby utrzymać hemocyty przy życiu8,17,18,19.
W tym badaniu prezentujemy metodę ekstrakcji hemocytów z larw Drosophila w trzecim stadium rozwojowym pod kątem patogennej infekcji mikrobiologicznej C. burnetii, Listeria monocytogenes (Listeria) lub Bezkręgowca opalizującego wirusa 6 (IIV6). Opisujemy metody leczenia zakażeń hemocytami zarówno in vivo, jak i ex vivo. Hemocyty zakażone in vivo i ex vivo zwizualizowano za pomocą mikroskopii konfokalnej i wykorzystano do budowy modeli 3D inwazji C. burnetii. Dodatkowo, korzystając z protokołu ekstrakcji, hemocyty zakażone ex vivo wykorzystano do testów ekspresji genów i białek. W szczególności, aby zbadać zakres zakażenia IIV6 i Listerią, wyizolowano z komórek całkowite RNA lub białko do analizy qRT-PCR lub Western blot. Podsumowując, protokół zapewnia metody szybkiego zbierania dużej liczby hemocytów z larw w trzecim stadium rozwojowym oraz dowody na to, że hemocyty pierwotne, zakażone in vivo lub ex vivo, są odpowiednią platformą do badań nad infekcjami patogenami mikrobiologicznymi i odpowiednich analiz dalszych, takich jak mikroskopia, transkryptomika i proteomika.

<table><tbody><tr><td>Schneider's Drosophila Medium&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>21720024</td><td>1.1.1), 2.1.2)</td></tr><tr><td>Fetal byd' Serum</td><td>GE Healthcare Life Sciences&nbsp; (HyClone)</td><td>SH30070.03HI</td><td>1.1.1), 2.1.2)</td></tr><tr><td>Filtr (0.22 &mikro; L)</td> <td>RESTEK</td><td>26158</td><td>1.1.1)</td></tr> <tr><td>Sitko (100 &mikro; m)</td> <td>Greiner bio-one</td><td>542000</td><td>1.2.1), 2)</td></tr> <tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Amscope</td><td>SM-1BSZ-L6W</td><td>1.2), 2)</td></tr> <tr><td>Szklana kapilara</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-171-4</td><td>1.1), 1.2), 2)</td></tr> <tr><td>Ściągacz kapilarny</td><td>Narishige International USA, Inc.</td><td>PC-10</td><td>1.1.3)</td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Snow River Products</td><td></td><td>1.1.4)</td></tr><tr><td>Nanowtryskiwacz</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-204</td><td>1.1), 1.2), 2.2)</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>VWR</td><td>82027-402</td><td>1.1.5), 1.2), 2), 3.1.7)</td></tr><tr><td>CO2 aparatura do dostarczania</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-122BC</td><td>1.2), 2)</td></tr> <tr><td>Trypan Blue</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>15250061</td><td>1.3)</td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Hausser Scientific</td><td>3100</td><td>1.3)</td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka</td><td>Greiner bio-one</td><td>662160</td><td>1.4), 2.2)</td></tr><tr><td>Coxiella burnetii - mCherry</td><td>Dr. Heinzen, R.</td><td></td><td>1.4), 2.2)</td></tr> <tr><td>Drosophila talerze soków owocowych</td> Protokoły <td></td><td>Cold Spring Harbor</td><td>2.1)</td></tr><tr><td>http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full Bioodczynniki Agar Fisher</td><td>BP1423-500</td><td>2.1.1.1)</td><td></td></tr> <tr><td>Metyloparaben</td><td>Amresco</td><td>0572-500G</td><td>2.1.1.2)</td></tr> <tr><td>Absolutny etanol</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP2818-500</td><td>2.1.1.2)</td></tr><tr><td>Mrożony koncentrat 100% soku winogronowego Welch, 340 ml</td><td>Amazon</td><td>B0025UJVGM</td><td>2.1.1.3)</td></tr> <tr><td>Szalki Petriego, 10 x 35 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100A</td><td>2.1.1.4)</td></tr> <tr><td>Szklana osłona mikroskopu</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-80</td><td>1.4.4), 2.2.2)</td></tr> <tr><td>Drożdże, suszone piekarze Active</td><td>MP Biomedicals</td><td>0210140001</td><td>2.1) Dodaj 2 części wody do 1 część drożdży (v/v)</td></tr><tr><td>Igła wolframowa</td><td>Fine Science Tools</td><td>10130-20</td><td>2.1)</td></tr><tr><td>Kleszcze trzymające</td><td>VWR</td><td>HS8313</td><td>2.1)</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Fisher Scientific</td><td>FLO4042-500</td><td>3.1.3)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td>3.1.3)</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9706-100</td><td>3.1.3)</td></tr> <tr><td>4',6-diamidino-2-fenyloindol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62247</td><td>3.1.4)</td></tr> <tr><td>Środek montażowy zapobiegający blaknięciu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td>3.1.6)</td></tr> <tr><td>Konfokalny mikroskop</td> skaningowy <td>Leica</td><td>TCS SP8-X z białym światłem</td><td>3.2)</td></tr> <tr><td>Oprogramowanie do rekonstrukcji obrazowania 3D</td><td>Leica</td><td>LASX z modułem</td> <td>wizualizacji 3D3.3)</td></tr> <tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-552-3</td><td>3.1.6)</td></tr> <tr><td>Wirus opalizujący bezkręgowców 6 (IIV6)</td> <td>Dr. Teixeria, L.</td><td></td><td>4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008)</td></tr><tr><td>Listeria monocytogenes</td><td>ATCC</td><td>szczep: 10403S</td><td>4) Listeria monocytogenes szczep 10403S (Bishop i Hinrichs, 1987) był uprawiany w bulionie Difco Brain-heart infusion (BHI) (BD Biosciences) zawierającym 50 &mikro; g/ml streptomycyny w stężeniu 30 stopni C.</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Thermo Fisher Scientific(Invitrogen)</td><td>18068015</td><td>Degradacja gDNA</td></tr><tr><td>Zestaw do syntezy cDNA</td><td>Bio-Rad</td><td>1708891</td><td>synteza cDNA</td></tr><tr><td>IIV6_193R_F</td><td>IDT</td><td></td><td>qRT-PCR, 5'- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3'IIV6_193R_R</td></tr> <tr><td></td><td>IDT</td><td></td><td>qRT-PCR, 5'- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3'RpII_qRTPCR_fwd</td></tr> <tr><td></td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td>qRT-PCR, 5'- GAA GCG TTT CTC CAA ACG -AG</td></tr> RpII_qRTPCR_rev <tr><td></td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td>qRT-PCR, 5'- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG</td></tr><tr><td>SYBR Zielony odczynnik qRT-PCR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K0251, K0252, K0253</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>System PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4351107, oprogramowanie 7500 v2.0</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Listeria monocytogenes</td><td>abcam</td><td>ab35132</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Przeciwciało antyaktynowe wytwarzane u królika</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A2066</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>IgG anty-królicze (H+L), koniugat HRP</td><td>Promega</td><td>W4011</td><td>Western blot</td></tr></tbody></table>

ekstrakcja hemocytów z larw drosophila melanogaster do infekcji mikrobiologicznej i analizy

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

Podczas patogennej infekcji Drosophila melanogaster, hemocyty odgrywają ważną rolę w odpowiedzi immunologicznej podczas całej infekcji. W związku z tym celem tego protokołu jest opracowanie metody wizualizacji inwazji patogenu w specyficznym przedziale immunologicznym much, a mianowicie hemocytach. Korzystając z przedstawionej tutaj metody, w ciągu 30 minut można uzyskać do 3 × 106 żywych hemocytów z 200 larw Drosophila w trzecim stadium rozwojowym w przypadku infekcji ex vivo. Alternatywnie, hemocyty mogą być zakażone in vivo poprzez wstrzyknięcie larw w 3.stadium rozwojowym, a następnie ekstrakcję hemocytów do 24 godzin po zakażeniu. Te zainfekowane komórki pierwotne zostały utrwalone, wybarwione i zobrazowane za pomocą mikroskopii konfokalnej. Następnie na podstawie obrazów wygenerowano reprezentacje 3D, aby ostatecznie pokazać inwazję patogenów. Dodatkowo można uzyskać wysokiej jakości RNA do qRT-PCR w celu wykrycia mRNA patogenu po zakażeniu, a z tych komórek można wyekstrahować wystarczającą ilość białka do analizy Western blot. Podsumowując, przedstawiamy metodę definitywnego uzgadniania inwazji patogenu i potwierdzenia infekcji przy użyciu typów patogenów bakteryjnych i wirusowych oraz skuteczną metodę ekstrakcji hemocytów w celu uzyskania wystarczającej ilości żywych hemocytów z larw Drosophila do eksperymentów z infekcjami ex vivo i in vivo.

Aby pobrać żywe hemocyty do ex vivo zakażenie, do 3×106 hemocyty wyizolowano z 200 Muszka owocówka 3rd larwy w stadium X. W celu opracowania naszej metody przetestowano szereg różnych technik. Pojedyncza sekcja larwy zajmowała do 1,5 h, a metodą tą uzyskiwano średnio ok. 8000 komórek18, z których większość nie przeżyła do końca etapu zbierania. Następnie podjęto próbę pobrania hemolimfy zawierającej hemocyty od 20 larw jednoc...

Ta metoda pokazuje, jak wizualizować inwazję patogenów na komórki owadów za pomocą trójwymiarowych (3D) modeli. Hemocyty larw Drosophila były zakażone patogenami wirusowymi lub bakteryjnymi, zarówno ex vivo, jak i in vivo. Zainfekowane hemocyty zostały następnie utrwalone i wybarwione w celu obrazowania za pomocą mikroskopu konfokalnego, a następnie rekonstrukcji komórkowej 3D.

Ekstrakcja hemocytów z larw Drosophila melanogaster do infekcji mikrobiologicznej i analizy

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the ...

Technika ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie infekcji komórkowych i mikrobiologii, takie jak to, w jaki sposób hemocyty przyczyniają się do ogólnej odpowiedzi immunologicznej u muszek owocowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją wykonać w laboratorium, przy użyciu wcześniej zakażonych larw. Alternatywnie, hemocyty z niezakażonych larw mogą być używane do infekcji ex vivo.Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy obrazowania są trudne do nauczenia się ze względu na złożoność mikroskopu konfokalnego i możliwości rekonstrukcji modelu 3D. Aby rozpocząć protokół, ułóż dwa do trzech kawałków filmu parafinowego o wymiarach dziesięć centymetrów na dziesięć centymetrów pod mikroskopem stereoskopowym. Następnie przygotuj szklaną kapilarę, ustawiając kapilarny grzejnik biegunowy na 55% maksimum.Przymocuj rurkę kapilarną do ostrego punktu o długości około dziesięciu mikrometrów. Zasyp kapilary olejem mineralnym. Zamontuj napełnioną rurkę kapilarną na nanowtryskiwaczu.I otwórz stopioną końcówkę rurki kapilarnej, odrywając końcówkę kleszczami. Wylej jak najwięcej oleju z końcówki rurki kapilarnej, a następnie napełnij rurkę pożywką izolującą hemocyty drozofilii lub DHIM. Aby ułatwić wizualizację granicy oleju hemolimpańskiego, dołącz pęcherzyk powietrza między olejem a DHIM.Za pomocą kleszczy delikatnie wybierz dziesięć larw Drosophila w trzecim stadium z wewnętrznej ścianki fiolek z jedzeniem i umieść je w sitku o średnicy 100 mikrometrów. Wlej pięć mililitrów sterylnej wody na larwy i potrząsaj sitkiem przez pięć sekund. Umieść sitko na chusteczce roboczej, aby usunąć nadmiar wody.Przenieś larwy do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej, znieczulaj je gazem CO2 przez pięć sekund. Następnie umieść larwy na folii parafinowej pod mikroskopem stereoskopowym, stroną grzbietową skierowaną do góry. Umieść szklaną kapilarnę lekko na tylnym ciele larwy, aby utrzymać ją na miejscu, i rozerwij tylny naskórek za pomocą drobno zakończonych kleszczy.Pozwól, aby hemolimfa spłynęła na folię parafinową. Zrób kałużę hemolimfy, w tym hemocyty, od 20 do 50 larw na raz na folii parafinowej. Użyj szklanej kapilary na nanowtryskiwaczu, aby pobrać zebraną hemolimfę.Wyrzuć hemolimfę do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej 500 mikrolitrów DHIM. Umieść pastę drożdżową na talerzu agarowym z sokiem winogronowym. Wykonaj drobne nacięcie w agarze w miejscu, w którym larwy mogą migrować, aby uniknąć wysuszenia.Zamontuj spiczastą igłę wolframową o średnicy 0,001 milimetra z kleszczami przytrzymującymi za pomocą folii parafinowej. Odpipetować 50 mikrolitrów wysokiego miana, C.Burnetii wykazującego ekspresję mCherry na folię parafinową pod mikroskopem stereoskopowym i umieścić larwy w kałuży bakterii. Nakłuj larwy igłą wolframową.Przenieś larwy na płytkę agarową. Przenieś pozostałą pożywkę patogenną na płytkę agarową i uszczelnij płytkę folią parafinową. Trzymaj larwy na talerzu w wilgotnym powietrzu do pożądanego czasu po infekcji.Pozostaw larwy zakażone C.Burnetii na talerzu na 24 godziny. Umieść 12-milimetrową okrągłą szklankę nakrywkową w dołku na 24-dołkowej płytce. Odpipetować 500 mikrolitrów DHIM do studzienki.Wydobyj i pobierz hemolimfę z wcześniej zainfekowanych larw, a następnie wyrzuć hemolimfę do studni. Odwirować płytkę o sile 1000 G przez pięć minut. Skonfiguruj mikroskop konfokalny do trójkolorowego obrazowania DAPI, EGFP i mCherry.Umieść próbkę pod mikroskopem i ustaw ostrość na próbce za pomocą obiektywu z aperturą numeryczną 63x 1,4. Zlokalizuj żądane hemocyty w polu widzenia do obrazowania. Następnie dostosuj moc lasera i wzmocnienia detektora, aby uzyskać odpowiednią ekspozycję próbki.Sprawdź wiele płaszczyzn Z, aby upewnić się, że poziom ekspozycji jest odpowiedni dla całej grubości próbki. Następnie znajdź górną i dolną pozycję na osi Z całego hemocytu. Ustaw te pozycje jako pozycje początkowe i końcowe dla przekroju Z.Użyj zoomu skanowania, aby zobrazować obszar zawierający hemocyt. Zbierz serię obrazów w odpowiedniej rozdzielczości, na przykład 1024 na 1024 piksele w płaszczyźnie X, Y i odstępy 0,3 mikrometra w wymiarze Z. Zaimportuj plik serii obrazów z przekrojem Z do oprogramowania powiązanego z mikroskopem konfokalnym w celu rekonstrukcji modelu 3D.Wybierz kolokalizację komórek wybarwionych jądrami wybarwionymi DAPI i C.Burnetii wykazującym ekspresję mCherry w hemocycie eksprymującym EGFP. Przytnij serię obrazów tak, aby zawierała tylko pojedynczą komórkę. Wybierz opcję Przeglądarka 3D, która rekonstruuje model 3D przy użyciu wstępnie spakowanego algorytmu oprogramowania.Wybierz żądany typ obrazowania dla reprezentacji 3D spośród opcji mieszania, powierzchni i mieszanych. W tej metodzie hemocyty, jądra i C.Burnetii są pokazane za pomocą modeli powierzchniowych. Obserwuj zrekonstruowaną komórkę 3D z różnych pozycji oglądania, przytrzymując przycisk myszy i przeciągając kursor po ekranie.Dostosuj orientację komórki i położenie modelowanego źródła światła, aby zoptymalizować obraz. Na koniec wykonaj przekroje poprzeczne przez model za pomocą poleceń przycinania i przekroju, aby zobrazować wewnętrzną zawartość hemocytu. Wizualizacja wyekstrahowanych żywych hemocytów eksprymujących EGFP pod kontrolą sterownika hemolektyny z wielu obrazów pokazuje, że większość komórek DAPI-dodatnich jest również EGFP-dodatnich.Przekroje hemocytów zakażonych Coxiella Burnetii potwierdzają obecność bakterii eksprymujących mCherry we wnętrzu komórki. Obrazy zostały zrekonstruowane w modele 3D i zaobserwowaliśmy, że hemocyty zakażone in vivo wykazywały większe rozszerzenia cytoplazmatyczne i były bardziej płaskie w naturze. Podczas gdy hemocyty zakażone ex vivo były bardziej kuliste.Przekroje obu modeli potwierdzają obecność Coxielli wyrażającej mCherry we wnętrzu komórki. Wyekstrahowane hemocyty zostały zakażone IIV6 i poddane analizie qRT PCR, która wykazała znacznie wyższe poziomy transkryptu IIV6-193R między pozorowanymi i zakażonymi IIV6 komórkami. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby wszystkie podłoża przygotować z wyprzedzeniem i zrównoważyć je do temperatury pokojowej, aby komórki nie były zbyt długo pozbawione odpowiednich składników odżywczych.Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak poszukiwanie RNA pojedynczej komórki, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak ogólna odpowiedź gospodarza na infekcję. Po opracowaniu technika ta pomaga naukowcom zajmującym się immunologią i mikrobiologią badać inwazję patogenów i reakcje gospodarza u muszek owocowych lub innych zwierząt z otwartymi układami krążenia.

extraction-hemocytes-from-drosophila-melanogaster-larvae-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Drosophila hemocyty rozprzestrzeniają się po całym rozwijającym się embrionie. Niniejszy protokół demonstruje sposób montowania i obrazowania tych migracji z wykorzystaniem embrionów z hemocytami znakowanymi fluorescencyjnie.

Obrazowanie na żywo migracji hemocytów embrionalnych Drosophila melanogaster

Molimimfa Drosophila służy zarówno jako krew, jak i płyn śródmiąższowy, krążąc po całym ciele podczas stadium larwy i dorosłego osobnika. Ten film opisuje protokół pobierania larw hemolimfy w celu ilościowego określenia krążących komórek.

Przerwanie naskórka: metoda zbierania hemolimfy z larw Drosophila

Źródło: Hiroyasu, A., D i in., Ekstrakcja hemocytów z larw Drosophila melanogaster do zakażeń drobnoustrojowych i analiza. J. Vis. Exp. (2018)Ten film pokazuje procedurę wywoływania infekcji bakteryjnej u larw Drosophila poprzez umieszczenie ich w kropli bakteryjnej i nakłucie igłą wolframową. Larwy są następnie wysiadane na rowkowatej, bogatej w składniki odżywcze płytce agarowej w celu badania interakcji żywiciel-patogen.

Ustanowienie infekcji bakteryjnej u larw Drosophila

Źródło: Hiroyasu, A. i inni. Ekstrakcja hemocytów z larw Drosophila melanogaster do zakażeń drobnoustrojowych i analiza. J. Vis. Exp. (2018)Ten film prezentuje wysokorozdzielcze obrazowanie konfokalne hemocytów Drosophila melanogaster zakażonych Coxiella burnetii , aby zobrazować lokalizację patogenów w 3D, umożliwiając szczegółową analizę dynamiki infekcji wewnątrzkomórkowej i interakcji gospodarz-patogen.

Wysokorozdzielcze obrazowanie konfokalne hemocytów Drosophila zakażonych patogenami

Ten film demonstruje test zaburzeń hemocytów, oceniając ponowne przyleganie hemocytów do kieszeni krwiotwórczych larw Drosophila. Zakłócenia mechaniczne uwalniają rezydujące hemocyty, podnosząc liczbę krążących hemocytów. Po wyzdrowieniu potwierdza się ponowne przyleganie rezydentnych hemocytów, co ilustruje odwracalność.

Test zaburzeń hemocytów w celu oceny readhezji hemocytów do kieszonek krwiotwórczych

Drosophila melanogaster to wybitny organizm modelowy do badania wrodzonego układu odpornościowego oraz fizjologicznych konsekwencji infekcji i chorób. Protokół ten opisuje, w jaki sposób dostarczyć D. melanogaster solidne i ilościowo powtarzalne infekcje bakteryjne, a następnie jak zmierzyć nasilenie infekcji i określić ilościowo odpowiedź immunologiczną gospodarza.

Ogólnoustrojowe infekcje bakteryjne i fenotypy obrony immunologicznej u Drosophila melanogaster

Krwinki Drosophila, czyli hemocyty, krążą między miejscami rezydentnymi a krążeniem.  U larwy hemocyty rezydentne (siedzące) lokalizują się w mikrośrodowiskach indukcyjnych, kieszeniach krwiotwórczych, podczas gdy krążące hemocyty poruszają się swobodnie w hemolimfie. Celem tego protokołu jest standaryzowana izolacja i kwantyfikacja tych dwóch, behawioralnie odrębnych, ale wymiennych populacji hemocytów.

Oznaczanie populacji krwinek larwy Drosophila melanogaster

Drosophila i systemy krwiotwórcze ssaków mają wiele wspólnych cech, co czyni Drosophila atrakcyjnym modelem genetycznym do badania hematopoezy. Tutaj pokazujemy rozwarstwienie i montaż głównego larwalnego narządu krwiotwórczego do immunohistochemii. Opisano również metody oznaczania różnych larwalnych przedziałów krwiotwórczych, w tym krążących hemocytów i siedzących komórek krystalicznych.

Metody badania gruczołu limfatycznego i hemocytów u larw Drosophila

Ten protokół opisuje test fagocytozy in vivo u dorosłych Drosophila melanogaster w celu ilościowego określenia rozpoznawania fagocytów i usuwania infekcji mikrobiologicznych.

Ocena komórkowej odpowiedzi immunologicznej muszki owocowej, Drosophila melanogaster, przy użyciu testu fagocytozy in vivo

Ten protokół opisuje test in vivo fagocytozy używany do oceny i ilościowego określenia zdolności młodych i starszych hemocytów Drosophila melanogaster do fagocytozy bakterii.

Ocena specyficznej dla wieku zdolności fagocytarnej dorosłych hemocytów Drosophila melanogaster za pomocą testu fagocytozy in vivo

Dorosłe muchy Drosophila melanogaster były szeroko wykorzystywane jako organizmy modelowe do badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw wrodzonych odpowiedzi immunologicznych gospodarza i strategii infekcji mikrobiologicznej. Aby promować stadium larwy D. melanogaster jako dodatkowy lub alternatywny system modelowy, opisano technikę iniekcji larw.

Drosophila melanogaster (Drosophila melanogaster) Protokół wstrzyknięcia larw

Poznaj ekstrakcję hemocytów z larw Drosophila melanogaster do infekcji mikrobiologicznej i analizy. Ta metoda umożliwia wizualizację inwazji patogenów z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej i rekonstrukcji 3D.

Ekstrakcja hemocytów z larw Drosophila melanogaster do infekcji mikrobiologicznej i analizy

Przeglądaj więcej filmów