Test krwi do wykrywania transkryptów fuzji ROS1 i RET z krążącego kwasu rybonukleinowego przy użyciu cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy

Ogólnym celem tej procedury jest izolacja i scharakteryzowanie za pomocą kropelkowego cyfrowego PCR krążącego kwasu rybonukleinowego pochodzącego z guza z próbek krwi pełnej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie diagnostyki onkologicznej. Na przykład, jak wykrywać transcypacje fuzji genów pochodzących z nowotworu z krążących próbek RNA i krwi.

Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje wysoce zoptymalizowane metody stabilizacji, ekstrakcji i wykrywania wariantów RNA obecnych w próbkach krwi o niskiej częstotliwości. Badania krwi są uzupełnieniem tradycyjnych biopsji tkanek z korzyścią wynikającą z zastosowania minimalnie inwazyjnej techniki, która może zapewnić szybkie wyniki. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat klinicznie istotnych mutacji i NSCLC, może być również stosowana w innych systemach, w których potrzebna jest dostępna i szybka identyfikacja krążących cząsteczek RNA we krwi pełnej.

Krążące RNA do reakcji odwrotnej transkrypcji jest izolowane z próbek krwi od dawców, jak opisano w protokole tekstowym. Przekształć skoncentrowaną krążącą próbkę RNA w cDNA za pomocą dostępnego na rynku zestawu do reakcji odwrotnej transkrypcji, w tym losowych starterów. Dołączyć próbkę kontrolną bez odwrotnej transcypazy i próbkę kontrolną bez RNA.

Po zakończeniu reakcji odwrotnej transkrypcji wyizolować cDNA z mieszaniny reakcyjnej za pomocą dostępnej na rynku kolumny spinowej koncentratora DNA. Ten etap ułatwia usuwanie enzymów, starterów i wolnych trifosforanów deoksynukleotydów. Jeśli cDNA nie zostanie natychmiast wykorzystane w reakcjach PCR, przechowuj je w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza.

Podczas wykonywania tej procedury należy nosić fartuch laboratoryjny i rękawice nitrylowe oraz dedykowane miejsce do przygotowywania odczynników. Zakryj sondy, aby chronić je przed światłem, ponieważ kolejne światło może wybielić barwnik fluorescencyjny przymocowany do sondy. Najpierw przygotuj mieszaniny PCR dla końcowej objętości reakcji 20 mikrolitrów, jak wskazano w tej tabeli, ale jeszcze bez dodawania cDNA.

Następnie przetransportuj mieszanki, przykryte i zabezpieczone przed światłem, do czystego okapu PCR, znajdującego się w oddzielnym obszarze wstępnego amplifikacji. Rozprowadź mieszanki na płytce PCR. Dodaj cDNA do badania do mieszaniny PCR.

Przykryj płytkę wymiennym uszczelniaczem do płyt. Krótko odwirować płytki, aby zebrać próbki na dnie studzienek. Mieszaj na shakerze talerzowym, na małym ogniu przez 10 sekund.

Ponownie krótko odwirować płytki, aby zebrać próbki na dnie studzienki. Usuń uszczelniacz do płyt przed wykonaniem ręcznego generowania kropel. Ważne jest, aby zminimalizować pęcherzyki w końcówce pipety podczas ładowania próbek, a następnie powoli przenosić kropelki z wkładu na płytkę, aby zapobiec uszkodzeniu kropel.

Ostrożnie przenieść 20 mikrolitrów mieszanki PCR do dołków na próbki we wkładzie do wytwarzania kropel. Dodaj 70 mikrolitrów oleju do wytwarzania kropli. Przykryj gumową uszczelką i przenieś wkład do ręcznego generatora kropel, aby zainicjować wytwarzanie kropel.

Po wytworzeniu kropli użyj końcówek zalecanych przez producenta, aby przenieść kropelki na świeżą płytkę PCR. Zasysać i dozować kropelki powoli, przez 5 do 6 sekund każda, nie dotykając końcem końcówki wkładu lub płytki kropelki. Uszczelnij płytkę za pomocą zgrzewarki do płyt foliowych.

Wykonaj PCR w termocyklerze, korzystając z następujących ustawień. Po zakończeniu pracy termocyklera odczytaj płytkę za pomocą czytnika kropelkowego. Utwórz układ tablicy dla oprogramowania czytnika, który identyfikuje lokalizację kontrolek i próbek, a następnie załaduj do oprogramowania, aby rozpocząć odczyt.

Wyniki odczytu płytki są analizowane za pomocą dostępnego na rynku oprogramowania. Zacznij od przejścia do menu analizy, aby wyświetlić wykresy amplitudy 2-wymiarowej lub 2D. Oceń ogólną jakość danych, badając dane z kropli.

Korzystając z menu zdarzeń, oceń dane pod kątem łącznej liczby zaakceptowanych zdarzeń. Na jeden odwiert powinno przypadać ponad 10 000 zdarzeń. Jeśli nie, dane muszą zostać dokładnie ocenione pod kątem dodatkowych problemów.

Następnie sprawdź dane pod kątem odrażających amplitud fluorescencji. Znaczne różnice w amplitudzie i stężeniach między powtórzonymi próbkami wskazują na niewłaściwe obchodzenie się z próbkami lub ich mieszanie. Zwróć uwagę na skupiska kropel z wzorami rozpylania na osi 45 stopni, co wskazuje na niską jakość kropel lub problematyczne próbki.

Najpierw zbadaj dane pod kątem kontroli pozytywnej, bez kontroli odwrotnej transkryptazy i bez kontroli RNA. Wybierz wszystkie próbki kontrolne i zbadaj jakość klastra za pomocą wykresu 2D w celu prawidłowego progowania, powinna być widoczna wyraźna separacja między klastrami kropel. Dla każdego wariantu testu należy ustawić próg na podstawie studzienek kontrolnych.

Ustaw progi na wykresach 2D za pomocą narzędzi krzyża nitkowego, aby oddzielić podwójnie ujemną populację kropel od populacji genów kontrolnych na osi x i populacji genów wariantowych, jeśli występują, na osi y. Kilka kopii z każdej studni replikanta dla pojedynczej próbki. Na koniec wyraź wyniki testu jako liczbę wykrytych kopii wariantów.

Wykorzystując linie komórkowe, wyrażające fuzję SDC4-ROS1 i fuzję CCDC6-RET, rozcieńczone w tle całkowitego ludzkiego RNA typu dzikiego, granica wykrywalności ustalona na poziomie 0,2 procent częstości występowania wariantu dla każdego wariantu fuzji. Nie wykryto preparatu RNA pochodzącego z docelowej linii komórkowej o 5 procent, co świadczy o swoistości testu. Analityczne wzorce multipleksowego RNA mierzono w wysokich, średnich i niskich stężeniach w trzech seriach tego samego dnia.

Trzy przejazdy w ciągu trzech kolejnych dni i z dwoma niezależnymi operatorami. Wyniki wskazują na dokładne wykrywanie zarówno transkryptu fuzyjnego, który jest przedmiotem zainteresowania, jak i genu kontroli wewnętrznej GUSB. Każdy bach próbek klinicznych przeprowadzono również z kontrolą pozytywną, kontrolą bez odwrotnej transkryptazy i kontrolą bez matrycy RNA.

Warianty fuzji są reprezentowane wzdłuż osi y, podczas gdy GUSB znajduje się na osi x. Gdy kontrole partii oceniano w ciągu 21 dni, zaobserwowano krople dodatnie w wyniku fuzji i kropelki genu kontrolnego GUSB dla ROS1 i RET we wszystkich seriach. Reprezentatywne wyniki poniżej optymalnych wyników są pokazane, gdy występuje zanieczyszczenie w ramach kontroli bez odwrotnej transkryptazy, zanieczyszczenie w ramach kontroli bez RNA, dzielenie i koalescencja kropelek oraz słabo zoptymalizowane warunki PCR lub hamowanie PCR.

Po opanowaniu cały ten protokół można wykonać w około 12 godzin. Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby stosować najlepsze praktyki dotyczące obchodzenia się z próbkami RNA i krwi ludzkiej. Po wyizolowaniu RNA można zastosować inne metody, takie jak sekwencjonowanie nowej generacji, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak identyfikacja nowych wariantów fuzji.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować krążące RNA z pełnej krwi i osocza, a następnie przetworzyć odzyskane RNA w celu zidentyfikowania rzadkich wariantów w krążeniu, takich jak RET i ROS1. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę do wykrywania klinicznie możliwych do działania mutacji z krwi pełnej. Rozszerzyliśmy te metody, aby zbadać nadmiernie wyrażone transkrypty w obiegu.