Name: Test krwi do wykrywania transkryptów fuzji ROS1 i RET z krążącego kwasu rybonukleinowego przy użyciu cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Poznaj metodę wykrywania transkryptów fuzji ROS1 i RET z krążącego RNA we krwi przy użyciu cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy. Technika ta umożliwia nieinwazyjną diagnostykę onkologiczną z wysoką czułością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy naszym współpracownikom, Stephenowi Jonesowi, Ni Charrington, dr Diannie Maar i dr Samancie Cooper z Centrum Biologii Cyfrowej (Bio-Rad Inc. CA) za wsparcie w projektowaniu testów; Nezar Rghei i dr Moemen Abdalla (Norgen Biotek, Kanada) za kluczowe porady dotyczące optymalizacji protokołu ekstrakcji RNA; oraz Shannon Campbell, Scott Thurston, Jeff Fensterer, Shannon Martello i Joellyn Enos za pomoc w zakresie wymagań testowych i monitorowania komercyjnego.

Instrukcje producentów są przestrzegane dla odczynników wymienionych poniżej, chyba że opisano inaczej. Testy PCR są dostępnymi na rynku produktami przeznaczonymi do wykrywania fuzji ROS1 i RET.
1. Praca z RNA w ramach przygotowań do odwrotnej transkrypcji (RT)-dPCR: Najlepsze praktyki laboratoryjne
<ol>
	<li>Utwórz środowisko wolne od RNaz podczas pracy z RNA.
	<ol>
		<li>Używaj dostępnych w handlu sprayów przeznaczonych do inaktywacji zanieczyszczających RNaz.</li>
		<li>Używaj certyfikowanych odczynników, końcówek i probówek wolnych od RNaz. Do pipetorów należy stosować końcówki barierowe, aby zapobiec wprowadzeniu RNaz lub zanieczyszczeniu krzyżowemu próbek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zawsze noś fartuch laboratoryjny, aby zapobiec wpadaniu cząstek stałych z ubrania do próbki. Wyznacz fartuch laboratoryjny specyficzny do użycia przy przetwarzaniu RNA.</li>
	<li>Nosić rękawice, aby zapobiec zanieczyszczeniu próbki przez RNazy w skórze. Często zmieniaj rękawice. 
	nuta: Załóżmy, że powierzchnie laboratoryjne są zanieczyszczone RNazą, ponieważ są narażone na działanie środowiska. Zakłada się, że rękawice, które mają kontakt ze skórą, włosami, klamkami, uchwytami zamrażarki, długopisami/markerami itp., nie są już wolne od RNaz.</li>
	<li>Przed użyciem należy odkazić pipety, blaty stołowe, wirówki i inne powierzchnie robocze za pomocą sprayu do inaktywacji RNazy.</li>
	<li>Jeśli to możliwe, utrzymuj zestaw sprzętu do użytku tylko z RNA.</li>
	<li>Zminimalizuj zakłócenia przepływu powietrza w obszarach laboratoryjnych podczas pracy z próbkami RNA, aby zapobiec wpadaniu cząstek stałych do próbek lub zanieczyszczeniu obszaru roboczego.</li>
	<li>Oczyszczony RNA przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania próbek RNA, ponieważ może to spowodować degradację.</li>
</ol>
2. Generowanie analitycznego materiału RNA dla kontroli pozytywnych
<ol>
	<li>Zaprojektuj syntetyczne DNA przy użyciu opublikowanych sekwencji mRNA dla interesujących wariantów fuzji10.
	<ol>
		<li>Dla danego wariantu fuzji wybierz sekwencję fuzji mRNA, która obejmuje miejsce fuzji oraz wystarczającą długość flankowania z każdej strony, aby pokryć amplikon PCR.</li>
		<li>Wybierz sekwencje nukleotydowe w zakresie od 50 do 250 nt, aby naśladować rozmiar krążącego RNA wychwyconego przy użyciu osocza wzbogaconego w płytki krwi.</li>
		<li>Dodać sekwencję promotora T7 (5'-CAGAGATGCATAATACGACTCACTATAGAGA-3') do końca 5' sekwencji docelowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamów sekwencje syntetyczne jako dwuniciowe fragmenty kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA).</li>
	<li>Odtworzyć syntetyczne DNA w buforze Tris-EDTA (TE) do końcowego stężenia 10 ng/μl.</li>
	<li>Przekształć 60 ng syntetycznego DNA w RNA za pomocą transkrypcji in vitro.</li>
	<li>Oczyść transkrypty RNA za pomocą odczynnika na bazie fenolu/guanidyny12.
	<ol>
		<li>Uwzględnij DNazę I, wolną od RNazy, aby usunąć resztki matrycowego DNA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierz stężenie oczyszczonego RNA in vitro za pomocą dostępnego na rynku fluorometru z barwnikami i wzorcami specyficznymi dla RNA. Upewnij się, że RNA mieści się w zakresie akceptowalnym dla wybranych standardów. Może być konieczne rozcieńczenie.</li>
	<li>Potwierdź pomyślną transkrypcję za pomocą elektroforezy żelowej przy użyciu 2% żelu agarozowego zmieszanego z barwnikiem żelowym RNA i drabiną RNA o wysokim zasięgu, w tym zakresem rozmiarów 50 - 250 nt.
	<ol>
		<li>Załaduj 500 ng każdego RNA in vitro na żel.</li>
		<li>Uruchomić żel przy napięciu 5 V/cm.</li>
		<li>Wizualizuj pojedyncze pasma za pomocą oświetlenia i dokumentuj wyniki.</li>
		<li>Potwierdź oczekiwany rozmiar transkryptu dla każdego z wariantów fuzji (na podstawie projektu w kroku 2.1.2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Potwierdź wykrycie każdego RNA in vitro za pomocą RT-dPCR przy użyciu dopasowanego testu PCR specyficznego dla wariantu (patrz kroki 5 - 8 niniejszego protokołu).</li>
	<li>Opcjonalnie: Przygotować równomolową mieszaninę RNA in vitro, która zawiera każdy z wariantów fuzji i gen kontrolny GUSB.</li>
	<li>Jeśli wykonywany jest krok 2.9: Potwierdzić wykrycie każdego z wariantów fuzji zawartych w mieszaninie kontrolnej za pomocą dPCR przy użyciu testów PCR specyficznych dla wariantu (patrz kroki 5–8 niniejszego protokołu).</li>
	<li>Określ pożądane stężenie wejściowe dla analitycznych kontroli dodatnich, testując stężenia w zakresie od 0,25 do 2,5 fg10. Wybierz stężenie na podstawie żądanego numeru wyjściowego kopii.</li>
	<li>Po potwierdzeniu przygotować 10 μl podwielokrotności analitycznego RNA jednorazowego użytku do wykorzystania w kontroli pozytywnej (etap 4.4) i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
3. Próbki dawców
<ol>
	<li>Pobrać 10 ml próbek ludzkiej krwi pełnej do 10 ml probówek do pobierania krwi (BCT) zawierających bezkomórkowy środek konserwujący RNA. 
	nuta: Wszyscy dawcy muszą wyrazić zgodę na wykorzystanie do celów badawczych, a podczas badań nie mogą być zbierane ani wykorzystywane żadne informacje identyfikujące konkretnego dawcę.</li>
	<li>Próbki krwi pełnej należy przetwarzać w terminie określonym przez producenta BCT.</li>
	<li>Połączone normalne osocze ludzkie można nabyć ze źródła komercyjnego do wykorzystania w analitycznej kontroli dodatniej. Przygotować jednorazowe 1 ml podwielokrotności zebranego normalnego osocza ludzkiego i przechowywać w temperaturze -80 °C do użycia z kontrolą dodatnią (etap 4.4).</li>
</ol>
4. Odzyskiwanie krążącego RNA z osocza
Uwaga: Ważne jest, aby podczas tej procedury pracować szybko.
<ol>
	<li>Odwirować probówki z krwią pełną o sile 200 x g przez 20 min.</li>
	<li>Pobrać do 4 ml osocza z odwirowanej probówki do pobierania krwi za pomocą pipety serologicznej. Uważaj, aby nie naruszyć ani nie zassać warstwy kożuchowej sierści.</li>
	<li>Wyizoluj krążące RNA za pomocą dostępnego na rynku zestawu, który może wychwytywać egzosomy, płytki krwi i bezkomórkowe RNA z osocza. Wyizolować RNA z pozytywnej próbki kontrolnej obok każdej partii.</li>
	<li>Przygotować kontrolę pozytywną dla każdej partii próbek klinicznych w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Rozmrozić 1 ml zebranej normalnej porcji osocza ludzkiego (krok 3.3).</li>
		<li>Rozmrozić 10 μl analitycznej porcji RNA (krok 2.12).</li>
		<li>Przygotować kontrolę pozytywną, dodając 10 μl analitycznego RNA do normalnej próbki ludzkiego osocza po dodaniu etanolu do lizatu osocza.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Eluować próbki za pomocą 100 μl wody wolnej od nukleaz. Natychmiast przystąp do oczyszczania i koncentracji RNA.
	<ol>
		<li>Próbki mogą być przechowywane na mokrym lodzie i przykryte przez okres do jednej godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zagęścić RNA metodą kolumnową i wymyć w 9 μl wody wolnej od RNaz.
	<ol>
		<li>Przejdź natychmiast do kroku 5 lub przechowuj próbki na mokrym lodzie przez maksymalnie jedną godzinę.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Odwrotna transkrypcja RNA do cDNA
<ol>
	<li>Przekształć skoncentrowaną krążącą próbkę RNA w cDNA za pomocą dostępnego na rynku zestawu do reakcji odwrotnej transkrypcji, w tym losowych starterów (patrz tabela 1 dla składników). 
	nuta: Startery specyficzne dla genu są opcjonalne i mogą być zaprojektowane dla wariantów testowych. Startery są projektowane w oparciu o docelową sekwencję RNA. Użyj sekwencji wariantów fuzji z kroku 2.1.
	<ol>
		<li>Nie należy dołączać próbki kontrolnej z odwrotną transkryptazą ani próbki kontrolnej RNA (patrz Tabela 1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyizolować cDNA z reakcji odwrotnej transkrypcji za pomocą dostępnej na rynku kolumny wirowej koncentratora DNA. 
	nuta: Ten krok ułatwia usuwanie enzymów, starterów i wolnych trifosforanów deoksynukleotydów (dNTP).</li>
	<li>CDNA należy stosować natychmiast w reakcjach PCR lub przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
6. Cyfrowy PCR
Uwaga: Ten PCR jest specyficzny dla kropelkowego cyfrowego PCR (Zobacz Tabelę Materiałów).
<ol>
	<li>Środki ostrożności dotyczące mieszanki PCR.
	<ol>
		<li>Noś jednorazowy fartuch laboratoryjny i rękawice nitrylowe.</li>
		<li>Użyj odczynników do mieszania PCR w dedykowanym obszarze przygotowania odczynników. Nie należy dotykać cDNA w obszarze przygotowania samego odczynnika.</li>
		<li>Zakryj sondy podczas pracy, aby chronić je przed światłem. Nadmierne światło może spowodować fotobielenie barwnika fluorescencyjnego dołączonego do sondy.</li>
		<li>Mieszaniny transportowe, przykryte i chronione przed światłem, do oddzielnego obszaru przed amplifikacją przed dodaniem cDNA.</li>
		<li>Dodaj cDNA do testu, aby zmieszać z PCR w czystym kapturze PCR znajdującym się w obszarze wstępnej amplifikacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować mieszaniny PCR dla końcowej objętości reakcyjnej 20 μl zgodnie z tabelą 2.</li>
	<li>Rozprowadź mieszaniny PCR + cDNA na płytkach PCR. 
	nuta: Zaleca się stosowanie układu płyt jako prowadnicy.</li>
	<li>Przykryj płytkę za pomocą wymiennego uszczelniacza do płyt.</li>
	<li>Odwirować płytki na krótko, aby pobrać próbki z dna studzienek.</li>
	<li>Mieszaj na wytrząsarce talerzowej na niskim ustawieniu przez 10 sekund.</li>
	<li>Odwirować płytki na krótko, aby pobrać próbkę na dnie studzienki.</li>
	<li>Usuń uszczelniacz do płyt. Wykonaj generowanie kropelek do mieszaniny PCR-cDNA za pomocą ręcznego lub automatycznego systemu generowania kropel.
	<ol>
		<li>W przypadku ręcznego wytwarzania kropel należy przenieść 20 μl mieszanki PCR do dołków do pobierania próbek na kartridżu z wytwarzaniem kropel. Dodać 70 μl olejku do wytwarzania kropelek. Przykryj gumową uszczelką i przenieś wkład do ręcznego generatora kropel, aby zainicjować wytwarzanie kropli. Po wytworzeniu się kropli należy przenieść kropelki na świeżą płytkę do PCR, używając końcówek zalecanych przez producenta. Zasysać i dozować kropelki powoli, przez 5 do 6 s każda, nie dotykając otworu końcówki wkładu lub płytki kropelkowej.</li>
		<li>W celu automatycznego generowania kropel należy uszczelnić płytkę uszczelką foliową i przenieść do generatora kropel. Upewnij się, że wszystkie końcówki, wkłady i płytki są na swoim miejscu przed rozpoczęciem generowania kropel.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po wytworzeniu kropel i przeniesieniu kropelek na świeżą płytkę do PCR, należy uszczelnić płytką foliową i płytkami do cykli termicznych, korzystając z ustawień podanych w tabeli 3.</li>
	<li>Po zakończeniu pracy termocyklera odczytaj płytkę za pomocą czytnika kropelkowego. Utwórz układ tabliczek dla oprogramowania czytnika, który identyfikuje lokalizację kontrolek, próbek itp., a następnie załaduj do oprogramowania, aby rozpocząć odczyt.</li>
</ol>
7. Analiza i przegląd danych oraz generowanie wyników
<ol>
	<li>Analizuj wyniki odczytu płytek za pomocą dostępnego na rynku oprogramowania.</li>
	<li>Przejdź do menu Analizuj, aby wyświetlić dwuwymiarowe (2D) wykresy amplitudy.</li>
	<li>Oceń ogólną jakość danych, badając dane z kropli.
	<ol>
		<li>Oceń dane pod kątem łącznej liczby zaakceptowanych zdarzeń za pomocą menu Zdarzenia. Jeśli na odwiert przypada mniej niż 10 000 zdarzeń, dokładnie oceń dane pod kątem dodatkowych problemów.</li>
		<li>Sprawdź dane pod kątem nieprawidłowych amplitud fluorescencji. Znaczne różnice w amplitudzie i stężeniach między powtórzonymi próbkami wskazują na niewłaściwe obchodzenie się z próbkami lub ich mieszanie.</li>
		<li>Zanotuj skupiska kropel z wzorami rozpylania na osi 45 stopni, co wskazuje na krople niskiej jakości lub problematyczne próbki.</li>
		<li>Najpierw zbadaj dane dotyczące kontroli pozytywnej, braku odwrotnej transkryptazy (bez RT) i braku kontroli RNA (NRC). Wybierz wszystkie próbki kontrolne i zbadaj jakość klastra za pomocą wykresu 2D. Aby zapewnić prawidłowe progowanie, powinna być widoczna wyraźna separacja między skupiskami kropel.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dla każdego wariantu testu należy ustawić próg na podstawie studzienek kontrolnych.
	<ol>
		<li>Ustaw progi na wykresach 2D za pomocą narzędzia krzyżyk, aby oddzielić podwójnie ujemną populację kropel od populacji genów kontrolnych (znakowanych sondą fosforoamidynową 5'-heksachloro-fluoresceiny-CE), osi y i populacji genów wariantowych, jeśli występuje (znakowanej sondą amidytu fluoresceiny LUB sondą 6-karboksyfluoresceiny), oś x.</li>
		<li>Zsumować kopie z każdego dołka repliki dla pojedynczej próbki.</li>
		<li>Wyrażaj wyniki testu jako liczbę wykrytych kopii wariantów. 
		nuta: Aby określić analityczną wartość odcięcia dla wywołania próbki dodatniej lub ujemnej, należy przeprowadzić normalny zestaw próbek zdrowego dawcy (co najmniej 10 pojedynczych próbek) przez sfinalizowany proces i ustalić punkt odcięcia powyżej dowolnego wykrywalnego sygnału tła dla mutacji będącej przedmiotem zainteresowania. Dodatkowo ustal liczbę kopii genów kontrolnych wymaganych do wywołania wyniku dodatniego lub ujemnego. To odcięcie genu kontrolnego działa jako wewnętrzna kontrola jakości (QC) w celu oceny ilości i jakości każdej próbki RNA, która jest przetwarzana.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Weryfikacja warunków reakcji RT-dPCR za pomocą linii komórkowych (opcjonalnie)
<ol>
	<li>Aby zweryfikować wykrywanie wariantów fuzji, użyj dostępnych na rynku linii komórkowych wyrażających mRNA fuzyjne ROS1 lub RET, które są przedmiotem zainteresowania. Postępuj w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Homogenizuj zamrożone komórki w roztworze do lizy na bazie guanidyny bezpośrednio ze stanu zamrożonego. Nawet krótkie rozmrażanie przed homogenizacją może spowodować degradację i utratę RNA.</li>
		<li>Wyizoluj RNA za pomocą kolumn wirowych z membraną krzemionkową przeznaczonych do RNA.</li>
		<li>Zmierz stężenie próbek RNA za pomocą fluorometru z odczynnikami i wzorcami specyficznymi dla RNA.</li>
		<li>Rozcieńczyć wyizolowany RNA na tle RNA typu dzikiego z osocza lub innego komercyjnego źródła.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj kroki od odwrotnej transkrypcji RNA do cDNA, cyfrowego PCR oraz analizy i przeglądu danych oraz generowania wyników wymienionych w tym protokole, aby potwierdzić wykrycie pożądanego wariantu.</li>
</ol>

<ol><li>Ignatiadis, M., Lee, M., Jeffrey, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+Tumor+Cells+and+Circulating+Tumor+DNA%3A+Challenges+and+Opportunities+on+the+Path+to+Clinical+Utility%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA: Challenges and Opportunities on the Path to Clinical Utility.</a> Clin Cancer Res. 21 (21), 4786-4800 (2015).</li>
<li>Alix-Panabieres, C., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Applications+of+Circulating+Tumor+Cells+and+Circulating+Tumor+DNA+as+Liquid+Biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Clinical Applications of Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA as Liquid Biopsy.</a> Cancer Discov. , (2016).</li>
<li>Paxton, A. <a target="_blank" href="http://www.captodayonline.com/molecular-ap-testing-sync-guidelines/">Is Molecular AP testing in sync with guidelines.</a> CAP Today. , (2014).</li>
<li>Sacher, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+Validation+of+Rapid+Plasma+Genotyping+for+the+Detection+of+EGFR+and+KRAS+Mutations+in+Advanced+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Oncol%22%5BJournal%5D)">Prospective Validation of Rapid Plasma Genotyping for the Detection of EGFR and KRAS Mutations in Advanced Lung Cancer.</a> JAMA Oncol. , (2016).</li>
<li>Sozzi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+free+circulating+DNA+as+a+diagnostic+marker+in+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Quantification of free circulating DNA as a diagnostic marker in lung cancer.</a> J Clin Oncol. 21 (21), 3902-3908 (2003).</li>
<li>Oxnard, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+detection+of+response+and+resistance+in+EGFR-mutant+lung+cancer+using+quantitative+next-generation+genotyping+of+cell-free+plasma+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Noninvasive detection of response and resistance in EGFR-mutant lung cancer using quantitative next-generation genotyping of cell-free plasma DNA.</a> Clin Cancer Res. 20 (6), 1698-1705 (2014).</li>
<li>Best, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+of+Tumor-Educated+Platelets+Enables+Blood-Based+Pan-Cancer%2C+Multiclass%2C+and+Molecular+Pathway+Cancer+Diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq of Tumor-Educated Platelets Enables Blood-Based Pan-Cancer, Multiclass, and Molecular Pathway Cancer Diagnostics.</a> Cancer Cell. 28 (5), 666-676 (2015).</li>
<li>Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+exosome+cargo+from+plasma%2Fbronchoalveolar+lavage+in+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Chromosomes+Cancer%22%5BJournal%5D)">Different exosome cargo from plasma/bronchoalveolar lavage in non-small-cell lung cancer.</a> Genes Chromosomes Cancer. 53 (9), 713-724 (2014).</li>
<li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27035812">The biology and function of exosomes in cancer.</a> J Clin Invest. 126 (4), 1208-1215 (2016).</li>
<li>Mellert, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Clinical+Utility+of+a+Blood-Based+Test+Service+for+the+Rapid+Identification+of+Actionable+Mutations+in+Non-Small+Cell+Lung+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Development and Clinical Utility of a Blood-Based Test Service for the Rapid Identification of Actionable Mutations in Non-Small Cell Lung Carcinoma.</a> J Mol Diagn. 19 (3), 404-416 (2017).</li>
<li>Qin, J., Williams, T. L., Fernando, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+blood+collection+device+stabilizes+cell-free+RNA+in+blood+during+sample+shipping+and+storage%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">A novel blood collection device stabilizes cell-free RNA in blood during sample shipping and storage.</a> BMC Res Notes. 6, 380(2013).</li>
<li>Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reagent+for+the+single-step+simultaneous+isolation+of+RNA%2C+DNA+and+proteins+from+cell+and+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples.</a> Biotechniques. 15 (3), 532-537 (1993).</li>
<li>Kohno, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+ALK-RET%2C+ROS1+and+other+oncogene+fusions+in+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Lung+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Beyond ALK-RET, ROS1 and other oncogene fusions in lung cancer.</a> Transl Lung Cancer Res. 4 (2), 156-164 (2015).</li>
<li>Takeuchi, K., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22327623">ROS1 and ALK fusions in lung cancer.</a> Nat Med. 18 (3), 378-381 (2012).</li>
<li>Rimkunas, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+receptor+tyrosine+kinase+ROS1-positive+tumors+in+non-small+cell+lung+cancer%3A+identification+of+a+FIG-ROS1+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of receptor tyrosine kinase ROS1-positive tumors in non-small cell lung cancer: identification of a FIG-ROS1 fusion.</a> Clin Cancer Res. 18 (16), 4449-4457 (2012).</li>
<li>Tsuta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RET-rearranged+non-small-cell+lung+carcinoma%3A+a+clinicopathological+and+molecular+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">RET-rearranged non-small-cell lung carcinoma: a clinicopathological and molecular analysis.</a> Br J Cancer. 110 (6), 1571-1578 (2014).</li>
<li>Forbes, S. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27899578">COSMIC: somatic cancer genetics at high-resolution.</a> Nucleic Acids Res. 45 (1), 777-783 (2017).</li>
<li>Salgia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+challenges+in+non-small-cell+lung+cancer%3A+an+integrated+medicine+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Oncol%22%5BJournal%5D)">Diagnostic challenges in non-small-cell lung cancer: an integrated medicine approach.</a> Future Oncol. 11 (3), 489-500 (2015).</li>
<li>Cagle, P. T., Raparia, K., Portier, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+Biomarkers+in+Personalized+Therapy+of+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Emerging Biomarkers in Personalized Therapy of Lung Cancer.</a> Adv Exp Med Biol. 890, 25-36 (2016).</li>
<li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC17763/">Digital PCR.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li>
<li>Oxnard, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+Between+Plasma+Genotyping+and+Outcomes+of+Treatment+With+Osimertinib+%28AZD9291%29+in+Advanced+Non-Small-Cell+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Association Between Plasma Genotyping and Outcomes of Treatment With Osimertinib (AZD9291) in Advanced Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> J Clin Oncol. 34 (28), 3375-3382 (2016).</li>
<li>Reckamp, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Highly+Sensitive+and+Quantitative+Test+Platform+for+Detection+of+NSCLC+EGFR+Mutations+in+Urine+and+Plasma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thorac+Oncol%22%5BJournal%5D)">A Highly Sensitive and Quantitative Test Platform for Detection of NSCLC EGFR Mutations in Urine and Plasma.</a> J Thorac Oncol. 11 (10), 1690-1700 (2016).</li>
<li>Yanagita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+prospective+evaluation+of+circulating+tumor+cells+and+cell-free+DNA+in+EGFR+mutant+non-small+cell+lung+cancer+patients+treated+with+erlotinib+on+a+phase+II+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A prospective evaluation of circulating tumor cells and cell-free DNA in EGFR mutant non-small cell lung cancer patients treated with erlotinib on a phase II trial.</a> Clin Cancer Res. , (2016).</li>
<li>Abbosh, C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28445469">Phylogenetic ctDNA analysis depicts early-stage lung cancer evolution.</a> Nature. 545 (7655), 446-451 (2017).</li>
<li>Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reagent+for+the+single-step+simultaneous+isolation+of+RNA%2C+DNA+and+proteins+from+cell+and+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples.</a> BioTechniques. 15 (3), 532-534 (1993).</li>
</ol>

H.M., L.J., K.A. i G.A.P. są pracownikami i posiadają udziały w Biodesix, Inc. H.M., L.J. i G.A.P. są współwynalazcami wniosku patentowego złożonego przez Biodesix, obejmującego system testów diagnostycznych do wykrywania krążących wariantów genetycznych w niedrobnokomórkowym raku płuca.

Rearanżacje RET i ROS1 razem stanowią ~ 3% mutacji sterownika w populacji NSCLC18. Chociaż rzadko, wykrycie tych zmian genetycznych jest niezbędne. Pacjenci z niedrobnokomórkowym rakiem płuca z tymi zmianami mogą odnieść korzyści z celowanych terapii, które specyficznie hamują nieprawidłową aktywność kinazy wynikającą z onkobiałka13. Niektóre takie terapie są już zatwierdzone przez FDA do stosowania w NSCLC z dodatnim wynikiem ROS1, podczas gdy inne okazały się skuteczne przeciwko RET w badaniach klinicznych19.
Technologia Digital PCR zapewnia czułość, która jest idealna do zastosowań w płynnej biopsji20. Technologia ta została w znacznym stopniu przyjęta do stosowania z krążącym bezkomórkowym DNA do pomiaru mutacji nowotworowych u pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca 4,6,21,22,23. Oprócz cfDNA opracowaliśmy protokół przeznaczony do solidnego pomiaru najbardziej rozpowszechnionych wariantów fuzji u pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca z krążącego RNA guza (Figura 1A)10.
Nasz ustalony protokół pozwala na analityczne limity wykrywalności do 0,2% (rysunek 2). Chociaż RT-dPCR jest wyjątkowo specyficzny i czuły, testy są ograniczone do panelu znanych wariantów fuzji, które są wybierane i multipleksowane do wykrywania w teście PCR. W związku z tym fuzje, które mają zostać włączone do testów multipleksowych, muszą być starannie dobrane, aby zapewnić odpowiednie pokrycie w populacji pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca. Z powodzeniem zaprojektowaliśmy testy dla RET i ROS1, które jednocześnie wykrywają osiem wariantów fuzji wynikających z rearanżacji loci RET lub ROS1 i obejmują odpowiednio 99% i 88% populacji RET i ROS1 dodatnich (Figura 1B-C)17.
Końcowy przebieg testu opisany w tym badaniu obejmuje kontrole partii w celu zapewnienia spójności wyników. Kontrole te obejmują zarówno dodatni wzorzec analityczny, jak i dwie kontrole ujemne, które razem zapewniają, że w partii nie dochodzi do zanieczyszczenia lub zahamowania PCR (rysunek 3). Aby zapewnić solidność testu, przeprowadzono badanie z wykorzystaniem kontroli partii przez okres 21 dni (ryc. 3D,H). Dane te pokazują spójność procesu RNA ustalonego w ramach tego protokołu.
Dobre praktyki laboratoryjne i odpowiednie obchodzenie się z RNA są kluczowymi elementami zapewniającymi wiarygodne i dokładne wyniki. Przestrzeń laboratoryjna i sprzęt przeznaczony do stosowania z RNA, czyszczenie sprzętu po każdym użyciu, stosowanie odczynników i materiałów eksploatacyjnych wolnych od RNaz oraz stosowanie sprayu do inaktywacji RNazy w przestrzeni roboczej pomaga zmniejszyć zanieczyszczenie RNaz. Sumienne obchodzenie się z próbkami RNA przez techników, w tym dedykowany fartuch laboratoryjny, częsta zmiana rękawic, szybka praca nad procedurą ekstrakcji RNA i przechowywanie próbek na lodzie mają ogromne znaczenie dla zachowania integralności próbki. Po odwrotnej transkrypcji RNA na cDNA próbka jest w bardziej stabilnej formie, która jest mniej podatna na degradację. Oprócz praktyk wspierających integralność RNA, komponenty i próbki PCR powinny być przechowywane w oddzielnych obszarach, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu, które mogłoby prowadzić do fałszywie dodatnich wyników. Podstawowe odczynniki do PCR i przygotowanie głównych mieszanin PCR powinny być przechowywane oddzielnie od matryc PCR i należy zachować szczególną ostrożność w celu oddzielenia amplifikowanej matrycy (po PCR) od wszystkich wstępnie amplifikowanych materiałów, w tym odczynników, RNA i próbek cDNA. Wreszcie, prawidłowe wytwarzanie i obchodzenie się ze zemulgowanymi mieszaninami PCR przed amplifikacją ma kluczowe znaczenie dla utrzymania integralności kropelek i optymalnych warunków dPCR. Takie środki ostrożności mają kluczowe znaczenie podczas wykonywania tego protokołu, aby uzyskać spójne i dokładne wyniki. Wszystkie dane powinny zostać sprawdzone przez przeszkolony personel przed publikacją wyników, aby upewnić się, że wszystkie wskaźniki kontroli jakości zostały spełnione. W przypadku nieoptymalnych wyników (rysunek 4) partia musi zostać poddana przeglądowi przez personel techniczny i dyrektora laboratorium i może wymagać ponownego przetworzenia.
Wyniki RT-dPCR można uzyskać już po 24 godzinach od otrzymania próbki, a 95% wyników próbek w zestawie testowym użytym w tym badaniu (n = 984) zostało zgłoszonych lekarzowi zamawiającemu w czasie krótszym niż 72 godziny od momentu otrzymania (ryc. 5). Ten czas realizacji dostarcza lekarzom bardzo potrzebnych informacji molekularnych w ramach czasowych, które umożliwiają rozpoczęcie odpowiedniej terapii. Wyniki te są zazwyczaj dostępne wcześniej niż te uzyskane przy użyciu konwencjonalnej biopsji tkanki. Dodatkowe biomarkery dla NSCLC i innych nowotworów mogłyby zostać opracowane przy użyciu podobnych podejść opartych na krążącym RNA i skorzystałyby na tym samym krótkim czasie oczekiwania na wyniki. Na przykład pomiar transkryptu mRNA ligandu programowanej śmierci 1 (PD-L1) za pomocą RT-dPCR może dostarczyć lekarzom informacji o możliwościach immunoterapii. Rośnie również zainteresowanie przydatnością płynnej biopsji i dPCR w monitorowaniu skuteczności terapeutycznej. Wcześniejsze oznaki nawrotu nowotworu za pomocą testów genomowych dla określonych wariantów mogą pozwolić lekarzom na dostosowanie schematów leczenia, zanim u pacjentów pojawią się objawy, za pomocą standardowych środków opieki, takich jak obrazowanie24. Protokoły takie jak ten opisany w tym badaniu są idealne do monitorowania ze względu na ich nieinwazyjność, czułość, szybki czas realizacji i opłacalność. Test opisany w niniejszym dokumencie dostarcza wyniki w ciągu 72 godzin od otrzymania próbki, przy minimalnych wskaźnikach wykrywalności wyników fałszywie dodatnich, co ułatwia szybkie podejmowanie decyzji dotyczących leczenia i pozwala obejść niektóre ograniczenia występujące w przypadku testów tkankowych4.
Nasz protokół i dane wskazują na solidny system testowy do identyfikacji wariantów RNA o niskiej liczebności, a także potencjał testowania mutacji krwi w praktyce klinicznej. W przypadku pacjentów, u których nie stwierdzono mutacji powodującej podjęcie działań za pomocą szybkich, celowanych metod biopsji płynnej, takich jak ta, dodanie bardziej obszernych testów genomu i proteomu zarówno z tkanek, jak i krwi może dostarczyć jeszcze szerszych informacji klinicznych wspierających planowanie leczenia.

Do 25% pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca (NSCLC) może nie mieć wystarczającej ilości tkanki do badania w momencie diagnozy. Nawet w przypadkach, gdy tkanka jest dostępna, może nie być wystarczająca do wykonania zalecanych testów molekularnych1,2. W przypadkach, gdy tkanka z biopsji jest wystarczająca do profilowania molekularnego, pacjenci mogą być zmuszeni do oczekiwania na wyniki przez kilka tygodni lub dłużej lub rozpoczęcia leczenia bez wyników molekularnych3,4. Jednak niezwykle ważne jest, aby dostępna była pouczająca diagnostyka molekularna, biorąc pod uwagę pojawienie się wielu ukierunkowanych opcji leczenia u pacjentów, u których zdiagnozowano niedrobnokomórkowy rak płuca. Badanie krążącego DNA wolnego od komórek (cfDNA) z płynnej biopsji jest rozwiązaniem wyzwań związanych z tradycyjnym testowaniem tkanek4,5,6. Obecne opcje testowania mutacji w NSCLC przy użyciu cfDNA i podobnego przepływu pracy opartego na dPCR w celu szybkiego generowania wyników obejmują mutacje uwrażliwiające na receptor naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) ΔE746-A750 i L858R, mutację oporności na EGFR T790M, warianty protoonkogenu KRAS (KRAS) oraz wariant protoonkogenu B-Raf (BRAF) V600E. Chociaż nie jest tak szeroko stosowany w tej dziedzinie, krążący informacyjny RNA (mRNA) pochodzący z nowotworu wyizolowany z płynnej biopsji może również dostarczyć ważnych informacji klinicznych7,8,9. Wcześniej opracowaliśmy i opisaliśmy metody multipleksowanego wykrywania wariantów fuzji kinazy tyrozynowej receptora szkarłupni z mikrotubulami, takich jak 4-anaplastyczny receptor chłoniaka tyrozynowego (EML4-ALK) z osocza krwi10. W tym badaniu rozszerzyliśmy te metody, aby uwzględnić cele multipleksowanego RNA wyższego rzędu dla ROS1 i RET, obejmujące osiem wariantów fuzji w każdym teście. Celem było opracowanie szybkiej, czułej, specyficznej i powtarzalnej techniki wykrywania tych wariantów fuzji z osocza pacjentów, u których wcześniej zdiagnozowano niedrobnokomórkowy rak płuca.
Proces testowy jest inicjowany w gabinecie lekarskim za pomocą probówek do pobierania krwi stabilizujących RNA11. Probówki te zawierają środek konserwujący komórki, a także inhibitory RNazy. Próbki są wysyłane priorytetowo z dnia na dzień do scentralizowanego laboratorium (Clinical Laboratory) akredytowanego przez College of American Pathologists (CAP) / certyfikowanego przez Clinical Laboratory Improvement Amendments (CLIA) w celu przetworzenia przez kompetentny personel. Po otrzymaniu przez laboratorium kliniczne, każdy etap przetwarzania jest przeprowadzany zgodnie z zatwierdzonymi standardowymi procedurami operacyjnymi (SOP). Krew pełna jest odwirowywana w celu odzyskania osocza, które jest następnie wykorzystywane do izolowania krążącego RNA, które jest wolne we krwi lub w otaczających ugrupowaniach, takich jak egzosomy i płytki krwi7,8,9. Aby wyizolować RNA z tych przedziałów, wybraliśmy system do odzyskiwania RNA na podstawie porównań kilku metod ekstrakcji. Wyizolowane RNA jest zagęszczane i poddawane odwrotnej transkrypcji do cDNA. Podczas optymalizacji metody syntezy cDNA oceniono kilka enzymów odwrotnej transkryptazy i starterów specyficznych dla genów w celu maksymalizacji docelowej konwersji transkryptu ROS1 i RET10. Ma to kluczowe znaczenie dla krążących transkryptów o niskiej liczebności, takich jak warianty fuzji pochodzące z nowotworu. Na koniec zoptymalizowaliśmy stężenia startera i sondy dPCR, aby umożliwić multipleksowane wykrywanie wariantów fuzji RET lub ROS1 oraz genu kontrolnego, glukuronidazy-β (GUSB). Następnie połączyliśmy najlepsze warunki z każdego z badań optymalizacyjnych w ostateczny zablokowany protokół przed przeprowadzeniem analitycznych badań walidacyjnych opisanych w tym raporcie. Protokół ten i wyniki stanowią podstawę dla szybkiego i czułego przepływu pracy w rutynowym wykrywaniu rzadkich wariantów fuzji w obiegu.

test krwi do wykrywania transkryptów fuzji ros1 i ret z krążącego kwasu rybonukleinowego przy użyciu cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy

A Blood-based Test for the Detection of ROS1 and RET Fusion Transcripts from Circulating Ribonucleic Acid Using Digital Polymerase Chain Reaction

Opracowaliśmy nowatorskie metody izolacji i charakterystyki krążącego kwasu rybonukleinowego (cRNA) pochodzenia nowotworowego do płynnej biopsji krwi. Skuteczne wykrywanie cRNA odzyskanego z krwi stanowi rozwiązanie krytycznej, niezaspokojonej potrzeby w diagnostyce klinicznej. Test rozpoczyna się od pobrania krwi pełnej do probówek do pobierania krwi zawierających konserwanty stabilizujące cRNA. Bezkomórkowy, egzosomalny i związany z płytkami krwi RNA jest izolowany z osocza w tym systemie testowym. cRNA jest poddawane odwrotnej transkrypcji na komplementarne DNA (cDNA) i amplifikowane za pomocą cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy (dPCR). Próbki są oceniane zarówno pod kątem docelowego biomarkera, jak i genu kontrolnego. Walidacja testów obejmowała badania granic wykrywalności, dokładności i odporności na próbkach analitycznych. Metoda opracowana w wyniku tych badań w sposób powtarzalny wykrywa wiele wariantów fuzji dla ROS1 (protoonkogen C-Ros 1; 8 wariantów) i RET (przegrupowany podczas transfekcji protoonkogen; 8 wariantów). Przebieg przetwarzania próbek został zoptymalizowany tak, aby wyniki testów mogły być konsekwentnie generowane w ciągu 72 godzin od otrzymania próbki.

Niniejszy protokół opisuje system testowy opracowany do wykrywania wariantów fuzji RNA, przeznaczony do pomiaru mutacji sterujących w osoczu pacjentów z NSCLC (Rysunek 1A). Zidentyfikowano produkty fuzji mRNA wynikające z ekspresji najczęstszych rearanżacji RET i ROS1 w populacji pacjentów z NSCLC13,14,15,16,17. Następnie zaprojektowano multipleksowe testy PCR w celu wykrycia ośmiu najczęstszych wariantów transkrypcyjnych dla każdego celu w NSCLC w ramach jednej reakcji. Najczęstsze translokacje w locus ROS1 generują połączenia z 5' fragmentami genów CD74, SDC4, SLC34A2, EZR lub TPM3 (Rysunek 1B). Najczęstsze translokacje w locus RET prowadzą do sąsiedztwa z KIF5B, dla którego test obejmuje sześć złączy eksonowych. Dodatkowe objęte testem partnerzy RET obejmują CCDC6 oraz TRIM33 (Rysunek 1C). Łącznie testy obejmują około 88% zmian w ROS1 i 99% zmian w RET znanych z występowania w populacji pacjentów z NSCLC17.
Specyficzność komponentów testu oceniono w pierwszej kolejności przy użyciu ośmiu pojedynczych RNA in vitro zawierających sekwencje mRNA dla transkryptów fuzyjnych objętych multipleksowymi testami ROS1 lub RET. Każdy rodzaj RNA przetestowano w odniesieniu do każdego pojedynczego testu wariantu wchodzącego w skład wersji multipleksowej. Nie stwierdzono reakcji krzyżowej tych testów, co wykazało 100% specyficzności analitycznej w ramach zaprojektowanych testów multipleksowych (dane nie zostały przedstawione). Aby wyznaczyć dolną granicę wykrywalności protokołu testowego, całkowite RNA pochodzące z linii komórkowych wykazujących wariant fuzyjny uwzględniony w teście zmieszano z tłem normalnego RNA w stężeniach 5%, 1%, 0,2% i 0,04%. Multipleksowe testy PCR wariantów RET i ROS1 wykryły wariant fuzyjny w stężeniu nawet 0,2% (Rysunek 2A-B). Dodatkowo, preparat zawierający 5% RNA pochodzącego z linii komórkowej off-target (wykazującej transkrypt fuzyjny EML4-ALK) nie został wykryty w multipleksowych testach ROS1 i RET, co dodatkowo potwierdziło specyficzność (Rysunek 2A-B).
Badanie precyzji procesu RT-dPCR przeprowadzono dla ROS1 oraz RET. Materiał kontrolny do analizy, składający się z ekimolarnych RNA in vitro, przetwarzano w trzech stężeniach (wysokim, średnim i niskim) poprzez odwrotną transkrypcję i dPCR w trzech różnych powtórzeniach w ciągu jednego dnia (precyzja wewnątrzdzienna), przez trzy kolejne dni (precyzja między-dzienna) oraz z udziałem dwóch operatorów (precyzja międzyoperatorska). Wyniki badania precyzji wykazały dokładne wykrywanie zarówno analizowanego transkryptu fuzyjnego, jak i genu kontrolnego GUSB, który jest uwzględniony jako wewnętrzny wskaźnik kontroli jakości (Ryc. 2C-D).
Oprócz wewnętrznej kontroli GUSB, każda partia próbek klinicznych była analizowana z zestawem kontroli partii. Kontrola pozytywna została opracowana z mieszaniny analitycznego RNA in vitro, reprezentującego każdy z wariantów fuzji testowanych w RT-dPCR, a także analitycznego RNA in vitro dla GUSB. RNA to było dodawane (spiked) do lizatu normalnej ludzkiej osocza podczas ekstrakcji RNA i przetwarzane wraz z próbkami klinicznymi przez cały protokół. Kontrola bez odwrotnej transkrypcji (No RT) stanowiła kontrolę negatywną w celu potwierdzenia braku materiału zanieczyszczającego w procesie ekstrakcji RNA oraz wykazania specyficzności starterów względem RNA. Kontrolę No RT przygotowano z tego samego materiału co kontrolę pozytywną, jednak nie zawarto w niej enzymu w reakcji syntezy cDNA. Kontrola bez RNA (NRC) jest kontrolą negatywną potwierdzającą brak zanieczyszczających transkryptów w komponentach reakcji odwrotnej transkrypcji. Kontrolę tę wprowadzono do procesu na etapie syntezy cDNA, dodając do reakcji wodę zamiast matrycy RNA. Aby wyniki były dokładne, kontrole No RT i NRC muszą być negatywne w obu kanałach. Tabela 1 zawiera wykaz komponentów reakcji odwrotnej transkrypcji dla każdej kontroli. Przykłady wykresów 2D dla każdej z tych kontroli przedstawiono dla testów multipleksowych ROS1 (Rycina 3 A-C) oraz RET (Rycina 3 E-G). Warianty fuzji wykrywano za pomocą sondy fluorescein amidite (FAM) i są one reprezentowane na osi y, natomiast gen kontrolny GUSB wykrywano za pomocą sondy 5'-hexachloro-fluorescein-CE phosphoramidite (HEX), która znajduje się na osi x. Kontrole partii były oceniane przez okres 21 dni w celu określenia odporności testu. Krople pozytywne pod kątem fuzji oraz krople genu kontrolnego GUSB obserwowano dla ROS1 i RET we wszystkich 21 uruchomieniach przeprowadzonych w trakcie badania (Rycina 3D,H). Wszystkie kontrole negatywne (No RT i NRC) dały wyniki negatywne przez cały okres 21 dni (dane nie pokazano).
Umiejętność rozwiązywania problemów jest krytycznym elementem każdego protokołu testowego wykonywanego w warunkach laboratorium klinicznego. Przedstawiamy tutaj rzeczywiste przykłady suboptymalnych wyników uzyskanych przy użyciu protokołu RT-dPCR. Pierwszym z nich jest przykład wykresu 2D demonstrujący znaczenie kontroli bez odwrotnej transkryptazy (Rysunek 4A). W tym przykładzie obecne były krople pozytywne dla mutacji, mimo braku konwersji do cDNA z powodu braku enzymu. Wynik ten był prawdopodobnie spowodowany amplifikacją niespecyficznego genomowego DNA przez primery dPCR. W takim przypadku zaprojektowanie testu obejmującego intron zapobiegnie amplifikacji DNA genomowego. Alternatywnie można użyć enzymu DNazy wolnej od RNaz w celu wyeliminowania zanieczyszczającego DNA, jednak nie jest to zalecane przy detekcji rzadkich celów, ponieważ podczas inkubacji z enzymem może dojść do częściowej degradacji RNA. Kolejny przykład wykresu 2D przedstawia NRC z kroplami pozytywnymi w obu kanałach (Rysunek 4B). Wskazuje to na zanieczyszczenie na którymś etapie przygotowania RT-dPCR. W takim przypadku zaleca się utylizację wszelkich potencjalnie zanieczyszczonych odczynników użytych w badaniu, dokładną dekontaminację całego sprzętu i ponowne wykonanie testu ze świeżymi komponentami reakcyjnymi. Trzeci przykład wykresu 2D przedstawia rozproszenie kropel wzdłuż linii 45° (Rysunek 4C). Jest to często spowodowane ścinaniem i łączeniem się kropel. Ostrożna manipulacja kroplami przed cyklem termicznym jest niezbędna, ponieważ krople są podatne na uszkodzenia. Zalecamy stosowanie zautomatyzowanego generowania kropel, jeśli jest ono dostępne. Przy przenoszeniu kropel generowanych ręcznie należy upewnić się, że wybrano zalecane końcówki o szerokim otworze i stosuje się staranną technikę pipetowania. Przenoszenie kropel wymaga powolnego aspirowania i dozowania, z których każde powinno trwać 5-6 s; kluczowe jest, aby otwór końcówki pipety nie dotykał kartridża z kroplami ani dołka. Podczas dozowania należy trzymać końcówkę pipety na poziomie cieczy i powoli ją unosić w miarę dozowania kropel (patrz wideo w celu demonstracji). Ostatni przykład wykresu 2D demonstruje brak separacji między populacjami kropel pozytywnych i negatywnych (Rysunek 4D). Może to mieć kilka przyczyn. Silne inhibitory PCR, takie jak detergenty stosowane w buforach lizujących, oraz nadmiar silnie zdegradowanego DNA mogą powodować utratę separacji. W takim przypadku należy rozważyć dodanie etapu oczyszczania między syntezą cDNA a dPCR (tak jak opisano w kroku 5 niniejszego protokołu). Wreszcie, brak separacji może być również wynikiem suboptymalnych warunków amplifikacji, dlatego należy rozważyć optymalizację etapu PCR.
Dane przedstawione na Rysunku 5 reprezentują czasy realizacji badań dla 984 rzeczywistych próbek pacjentów i demonstrują szybkość tego przepływu pracy testowej. Wyniki raportowano lekarzowi prowadzącemu już w ciągu 48 godzin (79% przypadków) od otrzymania próbki, a w 95% przypadków w ciągu 72 godzin. Podsumowując, zastosowanie probówek do pobierania krwi stabilizujących krążące RNA, zoptymalizowanych procedur ekstrakcji RNA z krwi oraz analizy RT-dPCR przeprowadzonej zgodnie z zoptymalizowanym protokołem z odpowiednimi kontrolami wewnętrznymi i seryjnymi może zapewnić szybki system testowy do dokładnego wykrywania wariantów fuzji RNA istotnych w NSCLC.
<img alt="Schemat metody ddPCR, obejmujący separację osocza, cDNA, generowanie kropelek oraz tabele częstości mutacji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57079/57079fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przegląd etapów przetwarzania próbek krwi w celu wykrycia wariantów fuzji z wykorzystaniem testów swoistych dla najczęstszych wariantów RET i ROS1 w NSCLC. (A) Badanie próbki rozpoczyna się od pobrania krwi pełnej i wysłania probówki BCT w zestawie do pobierania materiału do laboratorium klinicznego. Krążące RNA jest odzyskiwane z wielu źródeł w osoczu wzbogaconym w płytki krwi, poddawane odwrotnej transkrypcji z zastosowaniem starterów specyficznych dla genów, a następnie oczyszczane do wykorzystania w dPCR. Próbki są przetwarzane przy użyciu systemu komercyjnego, który obejmuje generowanie kropelek (emulsję), amplifikację oraz zliczanie kropelek. Dane są analizowane przy użyciu komercyjnego oprogramowania. Wyniki testów są następnie dokumentowane i raportowane lekarzowi zlecającemu badanie. Proces jest zaprojektowany tak, aby przebiegał w czasie 72 godzin od momentu otrzymania próbki do wydania wyniku. W testach multipleksowych objęto osiem wariantów dla (B) ROS1 oraz (C) RET. Adaptacja ze strony internetowej Biodesix za zgodą autora. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57079/57079fig1v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykresy słupkowe liczby kopii ROS1 i RET, wykresy rozrzutu; niezawodność detekcji RNA, powtarzalność wewnątrz- i między-dniowa, spójność operatorów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57079/57079fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Walidacja analityczna. Linie komórkowe wykazujące ekspresję fuzji (A) SDC4-ROS1 oraz (B) CCDC6-RET rozcieńczono w tle całkowitego ludzkiego RNA typu dzikiego (WT RNA). Dla każdego wariantu fuzji granica detekcji została ustalona na poziomie 0,2% częstości wariantu, stosując zdefiniowane kryteria dla każdego testu wariantu. Wszystkie próbki powyżej tego progu zawierały również co najmniej 21 kopii genu kontrolnego. W celu wykazania swoistości testu przebadano standard 5% EML4-ALK (ALK) w tle RNA typu dzikiego, co potwierdzono wynikiem negatywnym. Analityczne multipleksowe standardy RNA zmierzono w stężeniach wysokim, średnim i niskim dla (C) ROS1 oraz (D) RET. Precyzję oceniano w trzech seriach w tym samym dniu (powtarzalność wewnątrz-dniowa), w trzech seriach w trzech kolejnych dniach (powtarzalność między-dniowa) oraz z udziałem dwóch niezależnych operatorów (powtarzalność między-operatorska). Przedstawiono średnie liczby kopii oraz odchylenia standardowe. Adaptacja ze strony internetowej firmy Biodesix za zgodą autora. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57079/57079fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza ekspresji genów ROS1 i RET; wykresy rozproszenia, wykresy liniowe, normalizacja GUSB w ciągu 21 dni." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57079/57079fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Przykłady kontroli przetwarzania serii oraz dane dotyczące powtarzalności. Wykres 2D wyników dPCR dla multipleksowego testu ROS1 dla (A) kontroli pozytywnej, (B) kontroli bez odwrotnej transkryptazy oraz (C) kontroli bez matrycy RNA. (D) Kontrole przeprowadzano przez 21 kolejnych dni (z wyłączeniem weekendów i świąt). Średnia liczba kopii +/- odchylenie standardowe dla kontroli pozytywnej ROS1 wynosiła 439 +/- 141. W każdym dniu przeprowadzano również kontrole bez odwrotnej transkryptazy oraz bez matrycy, które wszystkie okazały się negatywne (dane nie przedstawiono). Wykres 2D wyników dPCR dla multipleksowego testu RET dla (E) kontroli pozytywnej, (F) kontroli bez odwrotnej transkryptazy oraz (G) kontroli bez matrycy RNA. (H) Kontrole przeprowadzano przez 21 kolejnych dni (z wyłączeniem weekendów i świąt). Średnia liczba kopii +/- odchylenie standardowe dla kontroli pozytywnej RET wynosiła 586 +/- 182. Nie przedstawiono kontroli bez odwrotnej transkryptazy oraz bez matrycy, które również przeprowadzano każdego dnia i które były negatywne. Zaadaptowano ze strony internetowej firmy Biodesix za zgodą właściciela. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57079/57079fig3large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Wykresy analizy cytometrii przepływowej; wyniki kanału wariantu i kontroli; porównanie eksperymentów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57079/57079fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Rozwiązywanie problemów w RT-dPCR. Wykresy 2D przedstawiające suboptymalne wyniki dPCR uzyskane w przypadku (A) kontaminacji w kontroli bez odwrotnej transkryptazy, (B) kontaminacji w kontroli bez RNA, (C) ścinania i łączenia się kropli oraz (D) słabo zoptymalizowanych warunków PCR lub inhibicji PCR. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57079/57079fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres kołowy przedstawiający procentowy rozkład przedziałów czasowych: 24–48, 48–72 oraz powyżej 72 godzin." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57079/57079fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rysunek 5Czas realizacji (TAT). Czas oczekiwania (TAT, w godzinach) zestawiono dla testów z zapytaniem o wariant RNA (n = 984). Dane nie obejmują weekendów, dni świątecznych oraz próbek wstrzymanych do &gt;24 h ze względu na niepełne informacje kliniczne w formularzach zleceń badań laboratoryjnych. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57079/57079fig5large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Tabela reakcji odwrotnej transkrypcji; kontrole: pozytywna, bez RT, bez RNA; składniki: startery, RNA." src="/files/ftp_upload/57079/57079table1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Tabela 1"> 
Tabela 1: Przygotowanie odczynników do odwrotnej transkrypcji dla kontrol procesowych.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Komponent</td>
			<td>Objętość</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x dPCR supermix do sond 
			(bez 2’-deoksyurydyny 5’-trifosforanu)</td>
			<td>10 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zestaw 20 wariantów starterów/sond docelowych 
			 (startery 450 nmol/L, sonda FAM 250 nmol/L)</td>
			<td>1 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zestaw starterów/sond dla celu kontrolnego 20x 
			(startery 450 nmol/L, sonda HEX 250 nmol/L)</td>
			<td>1 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>woda wolna od nukleaz</td>
			<td>1 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA</td>
			<td>7 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Przygotowanie master mixu do dPCR.
<table border="1" fo:display-align="center" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Krok cyklu</td>
			<td>Temperatura</td>
			<td>Czas</td>
			<td># Cykle</td>
			<td>Szybkość narastania temperatury</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aktywacja enzymu</td>
			<td>95 °C</td>
			<td>10 min</td>
			<td>1</td>
			<td rowspan="4">~2 oC/s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denaturacja</td>
			<td>94 °C</td>
			<td>30 s</td>
			<td rowspan="2">40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przyłączanie/elongacja</td>
			<td>55 °C</td>
			<td>1 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dezaktywacja enzymu</td>
			<td>98 °C</td>
			<td>10 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odczekać (opcjonalnie)</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>nieskończony</td>
			<td>1</td>
			<td>~1 oC/s</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Warunki cyklu termicznego.

Wykrywanie krążącego kwasu rybonukleinowego (cRNA) we krwi jest niezaspokojoną potrzebą w diagnostyce klinicznej. W tym miejscu opisujemy metody charakteryzujące cRNA od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca przy użyciu czułej i specyficznej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy. Testy spełniają wymagania projektowe, aby wykryć warianty fuzji w ciągu 72 godzin.

Test krwi do wykrywania transkryptów fuzji ROS1 i RET z krążącego kwasu rybonukleinowego przy użyciu cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy

We have developed novel methods for the isolation and characterization of tumor-derived circulating ribonucleic acid (cRNA) for blood-based liquid biopsy. ...

Ogólnym celem tej procedury jest izolacja i scharakteryzowanie za pomocą kropelkowego cyfrowego PCR krążącego kwasu rybonukleinowego pochodzącego z guza z próbek krwi pełnej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie diagnostyki onkologicznej. Na przykład, jak wykrywać transcypacje fuzji genów pochodzących z nowotworu z krążących próbek RNA i krwi.Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje wysoce zoptymalizowane metody stabilizacji, ekstrakcji i wykrywania wariantów RNA obecnych w próbkach krwi o niskiej częstotliwości. Badania krwi są uzupełnieniem tradycyjnych biopsji tkanek z korzyścią wynikającą z zastosowania minimalnie inwazyjnej techniki, która może zapewnić szybkie wyniki. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat klinicznie istotnych mutacji i NSCLC, może być również stosowana w innych systemach, w których potrzebna jest dostępna i szybka identyfikacja krążących cząsteczek RNA we krwi pełnej.Krążące RNA do reakcji odwrotnej transkrypcji jest izolowane z próbek krwi od dawców, jak opisano w protokole tekstowym. Przekształć skoncentrowaną krążącą próbkę RNA w cDNA za pomocą dostępnego na rynku zestawu do reakcji odwrotnej transkrypcji, w tym losowych starterów. Dołączyć próbkę kontrolną bez odwrotnej transcypazy i próbkę kontrolną bez RNA.Po zakończeniu reakcji odwrotnej transkrypcji wyizolować cDNA z mieszaniny reakcyjnej za pomocą dostępnej na rynku kolumny spinowej koncentratora DNA. Ten etap ułatwia usuwanie enzymów, starterów i wolnych trifosforanów deoksynukleotydów. Jeśli cDNA nie zostanie natychmiast wykorzystane w reakcjach PCR, przechowuj je w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza.Podczas wykonywania tej procedury należy nosić fartuch laboratoryjny i rękawice nitrylowe oraz dedykowane miejsce do przygotowywania odczynników. Zakryj sondy, aby chronić je przed światłem, ponieważ kolejne światło może wybielić barwnik fluorescencyjny przymocowany do sondy. Najpierw przygotuj mieszaniny PCR dla końcowej objętości reakcji 20 mikrolitrów, jak wskazano w tej tabeli, ale jeszcze bez dodawania cDNA.Następnie przetransportuj mieszanki, przykryte i zabezpieczone przed światłem, do czystego okapu PCR, znajdującego się w oddzielnym obszarze wstępnego amplifikacji. Rozprowadź mieszanki na płytce PCR. Dodaj cDNA do badania do mieszaniny PCR.Przykryj płytkę wymiennym uszczelniaczem do płyt. Krótko odwirować płytki, aby zebrać próbki na dnie studzienek. Mieszaj na shakerze talerzowym, na małym ogniu przez 10 sekund.Ponownie krótko odwirować płytki, aby zebrać próbki na dnie studzienki. Usuń uszczelniacz do płyt przed wykonaniem ręcznego generowania kropel. Ważne jest, aby zminimalizować pęcherzyki w końcówce pipety podczas ładowania próbek, a następnie powoli przenosić kropelki z wkładu na płytkę, aby zapobiec uszkodzeniu kropel.Ostrożnie przenieść 20 mikrolitrów mieszanki PCR do dołków na próbki we wkładzie do wytwarzania kropel. Dodaj 70 mikrolitrów oleju do wytwarzania kropli. Przykryj gumową uszczelką i przenieś wkład do ręcznego generatora kropel, aby zainicjować wytwarzanie kropel.Po wytworzeniu kropli użyj końcówek zalecanych przez producenta, aby przenieść kropelki na świeżą płytkę PCR. Zasysać i dozować kropelki powoli, przez 5 do 6 sekund każda, nie dotykając końcem końcówki wkładu lub płytki kropelki. Uszczelnij płytkę za pomocą zgrzewarki do płyt foliowych.Wykonaj PCR w termocyklerze, korzystając z następujących ustawień. Po zakończeniu pracy termocyklera odczytaj płytkę za pomocą czytnika kropelkowego. Utwórz układ tablicy dla oprogramowania czytnika, który identyfikuje lokalizację kontrolek i próbek, a następnie załaduj do oprogramowania, aby rozpocząć odczyt.Wyniki odczytu płytki są analizowane za pomocą dostępnego na rynku oprogramowania. Zacznij od przejścia do menu analizy, aby wyświetlić wykresy amplitudy 2-wymiarowej lub 2D. Oceń ogólną jakość danych, badając dane z kropli.Korzystając z menu zdarzeń, oceń dane pod kątem łącznej liczby zaakceptowanych zdarzeń. Na jeden odwiert powinno przypadać ponad 10 000 zdarzeń. Jeśli nie, dane muszą zostać dokładnie ocenione pod kątem dodatkowych problemów.Następnie sprawdź dane pod kątem odrażających amplitud fluorescencji. Znaczne różnice w amplitudzie i stężeniach między powtórzonymi próbkami wskazują na niewłaściwe obchodzenie się z próbkami lub ich mieszanie. Zwróć uwagę na skupiska kropel z wzorami rozpylania na osi 45 stopni, co wskazuje na niską jakość kropel lub problematyczne próbki.Najpierw zbadaj dane pod kątem kontroli pozytywnej, bez kontroli odwrotnej transkryptazy i bez kontroli RNA. Wybierz wszystkie próbki kontrolne i zbadaj jakość klastra za pomocą wykresu 2D w celu prawidłowego progowania, powinna być widoczna wyraźna separacja między klastrami kropel. Dla każdego wariantu testu należy ustawić próg na podstawie studzienek kontrolnych.Ustaw progi na wykresach 2D za pomocą narzędzi krzyża nitkowego, aby oddzielić podwójnie ujemną populację kropel od populacji genów kontrolnych na osi x i populacji genów wariantowych, jeśli występują, na osi y. Kilka kopii z każdej studni replikanta dla pojedynczej próbki. Na koniec wyraź wyniki testu jako liczbę wykrytych kopii wariantów.Wykorzystując linie komórkowe, wyrażające fuzję SDC4-ROS1 i fuzję CCDC6-RET, rozcieńczone w tle całkowitego ludzkiego RNA typu dzikiego, granica wykrywalności ustalona na poziomie 0,2 procent częstości występowania wariantu dla każdego wariantu fuzji. Nie wykryto preparatu RNA pochodzącego z docelowej linii komórkowej o 5 procent, co świadczy o swoistości testu. Analityczne wzorce multipleksowego RNA mierzono w wysokich, średnich i niskich stężeniach w trzech seriach tego samego dnia.Trzy przejazdy w ciągu trzech kolejnych dni i z dwoma niezależnymi operatorami. Wyniki wskazują na dokładne wykrywanie zarówno transkryptu fuzyjnego, który jest przedmiotem zainteresowania, jak i genu kontroli wewnętrznej GUSB. Każdy bach próbek klinicznych przeprowadzono również z kontrolą pozytywną, kontrolą bez odwrotnej transkryptazy i kontrolą bez matrycy RNA.Warianty fuzji są reprezentowane wzdłuż osi y, podczas gdy GUSB znajduje się na osi x. Gdy kontrole partii oceniano w ciągu 21 dni, zaobserwowano krople dodatnie w wyniku fuzji i kropelki genu kontrolnego GUSB dla ROS1 i RET we wszystkich seriach. Reprezentatywne wyniki poniżej optymalnych wyników są pokazane, gdy występuje zanieczyszczenie w ramach kontroli bez odwrotnej transkryptazy, zanieczyszczenie w ramach kontroli bez RNA, dzielenie i koalescencja kropelek oraz słabo zoptymalizowane warunki PCR lub hamowanie PCR.Po opanowaniu cały ten protokół można wykonać w około 12 godzin. Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby stosować najlepsze praktyki dotyczące obchodzenia się z próbkami RNA i krwi ludzkiej. Po wyizolowaniu RNA można zastosować inne metody, takie jak sekwencjonowanie nowej generacji, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak identyfikacja nowych wariantów fuzji.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować krążące RNA z pełnej krwi i osocza, a następnie przetworzyć odzyskane RNA w celu zidentyfikowania rzadkich wariantów w krążeniu, takich jak RET i ROS1. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę do wykrywania klinicznie możliwych do działania mutacji z krwi pełnej. Rozszerzyliśmy te metody, aby zbadać nadmiernie wyrażone transkrypty w obiegu.

a-blood-based-test-for-detection-ros1-ret-fusion-transcripts-from

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

W tym filmie prezentujemy krok po kroku procedurę generowania emulgowanych nanokropelek do wykrywania docelowych kwasów nukleinowych za pomocą cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy lub dPCR.

Kropelkowa cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy: metoda generowania reakcji PCR nanokropelkowych w celu wykrywania rzadkich mutacji nowotworowych

Ten film demonstruje cyfrowy PCR oparty na chipie — odmianę techniki cyfrowego PCR, która jest przydatna w wykrywaniu rzadkich wariantów transkryptu. Reakcja PCR jest podzielona na komory nanofluidycznego chipa, z których każdy działa jak niezależna reakcja. Detekcja sygnałów fluorescencyjnych z komór ze wzmocnionymi celami potwierdza obecność w próbce rzadkich wariantów transkryptu.

Cyfrowy PCR oparty na chipie do wykrywania rzadkich wariantów transkryptu za pomocą chipa nanofluidycznego

Celem tej publikacji jest wizualizacja i dyskusja na temat etapów działania protokołu Enhanced Northern Blot na RNA ekstrahowanym z zarodków, komórek i tkanek Drosophila melanogaster. Protokół ten jest szczególnie przydatny do skutecznego wykrywania małych gatunków RNA.

Ulepszone wykrywanie małych gatunków RNA w Northern Blot u Drosophila melanogaster

Celem tego filmu jest pokazanie, jak przeprowadzić automatyczną ekstrakcję DNA z referencyjnych linii komórkowych z parafiną (FFPE) utrwaloną w formalinie (FFPE) oraz cyfrową analizę PCR kropelkowego (ddPCR) w celu wykrycia rzadkich mutacji w warunkach klinicznych. Wykrywanie mutacji w próbkach FFPE pokazuje kliniczną przydatność ddPCR w próbkach FFPE.

Wykorzystanie cyfrowej reakcji kropelkowej PCR do wykrywania mutacji BRAF V600E w standardowych referencyjnych liniach komórkowych zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie

Opisana jest czuła i dokładna metoda kwantyfikacji mikroRNA bez komórek przy użyciu chemii opartej na barwniku i technologii kropelkowej cyfrowego PCR.

Kwantyfikacja krążącego mikroRNA przy użyciu chemii barwnika wiążącego DNA i kropelkowego cyfrowego PCR

Rękopis opisuje cyfrowy test PCR oparty na chipie, który wykrywa rzadki wariant transkryptu CDH1 (CDH1a) w świeżo zamrożonych tkankach normalnych i nowotworowych pobranych od pacjentów z rakiem żołądka.

Wykrywanie rzadkiego wariantu transkryptu CDH1 w świeżo mrożonych tkankach raka żołądka za pomocą cyfrowego PCR opartego na chipie

Krążące mikroRNA okazały się obiecujące jako biomarkery chorób sercowo-naczyniowych i ostrych zawałów mięśnia sercowego. W tym badaniu opisujemy protokół ekstrakcji miRNA, odwrotnej transkrypcji i cyfrowego PCR w celu bezwzględnej kwantyfikacji miRNA w surowicy pacjentów z chorobami sercowo-naczyniowymi.

Cyfrowy PCR do ilościowego oznaczania krążących mikroRNA w ostrym zawale mięśnia sercowego i chorobach sercowo-naczyniowych

Tutaj prezentujemy protokół do dokładnego ilościowego oznaczania wielu zmian genetycznych regionu docelowego w jednej reakcji za pomocą drop-off ddPCR i unikalnej pary sond hydrolizy.

Cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy z pojedynczą kroplą do kompleksowego i jednoczesnego wykrywania mutacji w obszarach hotspotów

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania mutacji somatycznych nowotworu w krążącym DNA obecnym w płynach biologicznych pacjenta (biofluidach). Nasza metoda oparta na kropelkowej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy (dPCR) umożliwia ilościowe określenie częstości alleli mutacji nowotworowych (MAF), ułatwiając minimalnie inwazyjne uzupełnienie diagnozy i czasowego monitorowania odpowiedzi guza.

Wykrywanie i monitorowanie krążącego DNA związanego z nowotworem w płynach biologicznych pacjenta

Przedstawiamy protokół ilustrujący izolację rzadkich komórek rakowych z przygotowanej próbki zawierającej pełną krew i wzbogaconą w komórki raka płuca. Protokół wykorzystuje półautomatyczną platformę do izolacji komórek bez znaków. Wzbogacone komórki są następnie analizowane pod kątem mutacji receptora czynnika wzrostu naskórka za pomocą kroplowej cyfrowej PCR.

Profilowanie mutacji DNA receptoray czynnika wzrostu naskórka w rzadkich krążących komórkach z wykorzystaniem systemu izolacji komórek i dropletowej cyfrowej PCR

Poznaj metodę wykrywania transkryptów fuzji ROS1 i RET z krążącego RNA we krwi przy użyciu cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy. Technika ta umożliwia nieinwazyjną diagnostykę onkologiczną z wysoką czułością.

Test krwi do wykrywania transkryptów fuzji ROS1 i RET z krążącego kwasu rybonukleinowego przy użyciu cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy (Wideo) | JoVE Journal

Test krwi do wykrywania transkryptów fuzji ROS1 i RET z krążącego kwasu rybonukleinowego przy użyciu cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy

Przeglądaj więcej filmów