Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) modyfikacji histonów z Saccharomyces cerevisiae

Ogólnym celem tego protokołu immunoprecypacji chromatyny jest określenie obfitości i lokalizacji modyfikacji histonów w określonych regionach w całym pączkującym genomie drożdży. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące regulacji chromatyny, takie jak to, w jaki sposób modyfikacje histonów są powiązane z kontrolą ekspresji genów i jak te modyfikacje zmieniają się w odpowiedzi na różne warunki środowiskowe. Niezwykle wszechstronny protokół, który może być używany do badania wielu różnych modyfikacji histonów i wielu szczepów E w tym samym czasie.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w modyfikacje histonów, można ją również zastosować do badania innych białek wiążących chromatynę za pomocą znaczników epitopowych lub dostępnych przeciwciał. Rozpocznij tę procedurę od wyhodowania komórek drożdży, zaszczep 10 mililitrów pożywki YPD pojedynczą kolonią każdego odpowiedniego szczepu i hoduj ją w temperaturze 30 stopni Celsjusza w inkubatorze z wytrząsaniem przy 220 obr./min przez noc. Następnego dnia po zmierzeniu gęstości optycznej kultury przy 600 nanometrach lub OD600, rozcieńczyć kulturę do OD600 w proporcji 0,2 na 100 ml YPD w nowej kolbie.

Hoduj komórki w temperaturze 30 stopni Celsjusza w inkubatorze z wytrząsaniem z prędkością 220 obr./min, aż osiągną połowę fazy logarytmicznej. Gdy kultury osiągną środkową fazę logarytmiczną, dodaj 2,7 mililitra 37% formaldehydu bezpośrednio do pożywki w każdej kolbie, aby uzyskać końcowe stężenie 1% formaldehydu. Przenieść kolby do wytrząsarki o temperaturze pokojowej i wstrząsać z prędkością 50 obr./min przez 15 minut.

Dodaj pięć mililitrów glicyny o stężeniu 2,5 molowym do pożywki i kontynuuj wytrząsanie z prędkością 50 obr./min w temperaturze pokojowej przez pięć minut, aby ugasić formaldehyd. Następnie odwiruj komórki i umyj je zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Usuń supernatant po ostatnim wirowaniu i przystąp do wytwarzania lizatów drożdżowych.

Ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze zimnego wytrącania aminokwasów chromatyny lub buforu ChIP Lysis z 1 milimolowym PMSF i rozcieńczeniem 1:1000 koktajlu inhibitora proteazy drożdżowej. Przenieś zawiesinę do rurki z nakrętką o pojemności 2,0 mililitra zawierającej 200 mikrolitrów szklanych kulek. Przenieś komórki do aparatu do ubijania kulek w celu szybkiego mieszania w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Ubijaj koraliki przez 30 sekund i lód przez minutę. Uderz koralikami w sumie sześć razy, utrzymując komórki na lodzie przez co najmniej jedną minutę między każdymi 30-sekundowymi uderzeniami. Za pomocą końcówki ładującej żel przenieś lizat do 1,5 mililitrowej tubki.

Odwirować lizat w temperaturze 15,500 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 250 mikrolitrach buforu do wytrawiania nukleazy mikrokokowej, delikatnie pipetując w górę iw dół. Dodaj 2,5 mikrolitra nukleazy mikrokokowej do każdej reakcji.

Delikatnie wymieszaj, odwracając cztery do sześciu razy i natychmiast inkubuj w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut. Po 20 minutach zatrzymaj reakcję, umieszczając probówki na lodzie, dodając pięć mililitrów 0,5 molowego EDTA, aby uzyskać końcowe stężenie 10 milimolowych EDTA i delikatnie mieszając przez inwersję. Wirować w temperaturze 15, 500 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut.

Następnie przenieś każdy supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Aby uzyskać najbardziej spójne wyniki, ważne jest, aby upewnić się, że w każdym wytrącaniu aminokwasów stosuje się to samo stężenie białka. W zależności od liczby wytrąceń aminokwasów lub reakcji IP, należy przygotować główną mieszankę każdej frakcji chromatyny uwolnionej przez nukleazę mikrokokową i buforu do lizy ChIP i przydzielić jeden mililitr zawierający 50 mikrogramów białka całkowitego do poszczególnych probówek.

Usuń 100 mikrolitrów z każdej mieszanki IP, aby przetworzyć ją jako próbkę wejściową. Zamroź próbki wejściowe w temperaturze 20 stopni Celsjusza do późniejszego wykorzystania. Ważne jest również, aby upewnić się, że do każdej immunoprecypitacji używana jest taka sama ilość kulek związanych z przeciwciałem.

Używając końcówki do pipet z szeroką płytką, dodaj 20 mikrolitrów kulek białka magnetycznego AG, wstępnie związanych przeciwciałem do każdej próbki IP. Obracaj próbki z prędkością ośmiu obrotów na minutę w czterech stopniach Celsjusza przez trzy godziny. Kiedy IP jest gotowy, umieść rurki w stojaku magnetycznym i pozwól, aby koraliki zebrały się z boku rurki.

Użyć pipety, aby usunąć supernatant. Dodaj jeden mililitr buforu do lizy ChIP do kulek i obracaj z prędkością ośmiu obrotów na minutę w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Następnie umieść probówki na stojaku magnetycznym i usuń supernatant.

W ten sposób umyj koraliki kolejno następującymi we wskazanej liczbie razy. Bufor do lizy ChIP, bufor do płukania o wysokiej zawartości soli, bufor do płukania LiCl/detergentu i TE. Przy ostatnim praniu TE użyj 0,5 mililitra TE, aby przenieść większość koralików do nowej tuby, a następnie użyj kolejnych 0,5 mililitra TE, aby umyć rurkę i przenieść pozostałe kulki. Dodaj 250 mikrolitrów świeżo przygotowanego buforu elucyjnego ChIP do każdej probówki i krótko zmieszaj roztwór.

Obracać próbki z prędkością ośmiu obrotów na minutę w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Umieść rurki w stojaku magnetycznym. Ostrożnie przenieść supernatant do nowej probówki i unikać kulek.

Dodaj kolejne 250 mikrolitrów buforu elucyjnego ChIP do kulek. Obracać próbki z prędkością ośmiu obrotów na minutę w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Ostrożnie i bez naruszania kulek przenieść supernatant do probówki zawierającej pierwszą elucję.

Rozmrozić pobrane wcześniej próbki wejściowe i dodać 400 mikrolitrów buforu elucyjnego ChIP do każdej próbki wejściowej. Aby odwrócić wiązania krzyżowe DNA białek, dodaj zarówno do próbek wejściowych, jak i IP, 20 mikrolitrów pięciu molowych chlorków sodu, pięć mikrolitrów glikogenu i 12,5 mikrolitrów proteinazy K. Dobrze wymieszaj, odwracając lub przesuwając probówki. Próbki inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 65 stopni Celsjusza przez noc.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować główną mieszankę QPCR dla każdego zestawu starterów, łącząc odpowiednie objętości mieszanki QPCR, startera do przodu i startera odwrotnego. Wykonaj główne mieszanki DNA dla każdej próbki DNA, w której jedna reakcja zawiera 0,5 mikrolitra DNA i 4,0 mikrolitra wody wolnej od nukleaz Dodaj 5,5 mikrolitra odpowiedniej mieszanki wzorcowej startera do każdej studzienki w 384-dołkowej płytce QPCR. Obracaj płytkę z 200 g w temperaturze pokojowej przez jedną minutę.

Następnie dodaj 4,5 mikrolitra odpowiedniej głównej mieszanki DNA do każdej studzienki. Zamknij płytkę i wiruj w temperaturze 200 g w temperaturze pokojowej przez jedną minutę. Wykonaj QPCR przy użyciu systemu QPCR w czasie rzeczywistym w następujących warunkach: 95 stopni Celsjusza przez trzy minuty, 40 cykli 95 stopni Celsjusza przez 10 sekund i 55 stopni Celsjusza przez 30 sekund oraz krzywa topnienia od 65 stopni Celsjusza do 95 stopni Celsjusza z przyrostem 0,5 stopnia Celsjusza przez pięć sekund.

Jednym z kluczowych elementów tego protokołu jest optymalizacja stężenia nukleazy mikrokokowej wykorzystywanej do trawienia chromatyny na rozpuszczalne fragmenty. Ten przykład wynikający z elektroforezy DNA wyizolowanego w żelu agarozowym po trawieniu osadu chromatyny z różnymi ilościami nukleazy mikrokokowej pokazuje, że 2,5 mikrolitra enzymu w dawce 20 jednostek na mikrolitr wytwarzało głównie mononukleosomy. W tym reprezentatywnym eksperymencie ChIP wykorzystano przeciwciała przeciwko markerowi metylowemu histonu H3K4me2 i histonowi H3 w komórkach nokautujących typu dzikiego i set1.

Komórki nokautujące Set1 nie mają metylotransferazy, która katalizuje znak Słupki wskazują względne wzbogacenie H3K4me2 przy wskazanym niskim sci. Szczep typu dzikiego wykazał wyraźne wzbogacenie w H3K4me2 na pięciu głównych końcach dwóch genów, o których wiadomo, że są bezpośrednimi celami zestawu 1, PMA1 i ERG11, podczas gdy w komórkach nokautujących zestawu 1 nie zaobserwowano żadnego sygnału. Zgodnie z oczekiwaniami, nie stwierdzono wzbogacenia znaku H3K4me2 w TEL07L, stwierdzono również, że ekspresja SPR3 jest regulowana przez set1, ale wyniki te wskazują, że regulacja prawdopodobnie nastąpi za pomocą innego mechanizmu niż w PMA1 lub ERG11.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu czterech dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o dokładnym przetestowaniu użytego przeciwciała pod kątem swoistości z odpowiednimi kontrolami. Jeśli to możliwe, w QPCR należy zbadać zarówno dodatnie, jak i ujemne regiony kontrolne.

Po tej procedurze można również wykonać inne metody, takie jak sekwencjonowanie GP, w celu określenia genomu poprzez dystrybucję modyfikacji histonów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak konsekwentnie wykrywać poziomy różnych modyfikacji histonów w unikalnych regionach genomu za pomocą dobrze kontrolowanych eksperymentów.