Name: Mikropreparacja narządu szkliwa z siekacza żuchwy szczurów narażonych na działanie toksyn środowiskowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Poznaj metodę mikropreparacji narządu szkliwa szczura w celu badania aktywności ameloblastów podczas formowania szkliwa. Technika umożliwia separację nabłonka zębowego na różnych etapach różnicowania komórkowego, co ułatwia analizę patologii szkliwa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Uniwersytet Paris-Diderot, Francuski Narodowy Instytut Zdrowia i Badań Medycznych (INSERM) oraz Francuski Instytut Badań Onodontologicznych (IFRO).

Wszystkie zwierzęta użyte w niniejszym badaniu były utrzymywane zgodnie z wytycznymi francuskiego Ministerstwa Rolnictwa dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych (A-75-06-12).
1. Narażenie zwierząt na substancje toksyczne
<ol>
	<li>Przed wykonaniem tego protokołu należy uzyskać niezbędną zgodę instytucjonalną i upewnić się, że przestrzegasz wszystkich wytycznych dotyczących opieki nad zwierzętami.</li>
	<li>Zastosowanie projektu protokołu badawczego umożliwiającego utworzenie różnych grup doświadczalnych w celu zbadania wpływu badanej cząsteczki (cząsteczek) na etap wydzielania ameloblastów i etap dojrzewania ameloblastów. W tym przypadku utworzono cztery grupy samców szczurów rasy Wistar w zależności od ich ekspozycji na fluor (NaF) w połączeniu lub nie z BPA (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1A)2. Wszystkie zwierzęta zostały zaobserwowane i poddane sekcji w 65 dniu (<silna klasa="xfig">Ryc. 1B).</li>
</ol>
2. Sekcja żuchwy od dorosłych szczurów
<ol>
	<li>Eutanazja szczurów przez uduszenie CO2 , opcjonalnie po której następuje dekapitacja głowy od reszty ciała. Wystaw szczury na działanie CO2 przez 5 minut w dedykowanym pudełku16.</li>
	<li>Usuń całą skórę z dolnych warg za pomocą skalpela #11, aby uzyskać łatwy dostęp do dolnych siekaczy.</li>
	<li>Tym samym skalpelem wykonaj nacięcie między dwoma dolnymi siekaczami z lekkim naciskiem, a żuchwa zostanie podzielona na dwie połowy.</li>
	<li>Przetnij staw skroniowo-żuchwowy skalpelem, aby odłączyć szczękę, i przytrzymaj półżuchwę delikatną pęsetą.</li>
	<li>Przetnij otaczające tkanki miękkie skalpelem i usuń wszystkie mięśnie, ścięgna i więzadła za pomocą skrobaka, aż kość będzie całkowicie czysta.</li>
</ol>
3. Izolacja siekacza class<="xref">17,18
<ol>
	<li>Ostrożnie ogol kość, umieszczając ostrze równolegle do głównej osi podłużnej siekacza. Zacznij od grzbietu kostnego w pobliżu końców siekacza (koniec proksymalny) aż do końca siekacza w pobliżu pętli szyjnej. Ruch nacięcia przebiega od kierunku bliższego do dalszego.</li>
	<li>Wykonaj pierwsze cięcie dystalnie do pętli szyjnej za pomocą skalpela, aby usunąć gonion półżuchwy i umożliwić łatwe zdjęcie siekacza bez uszkadzania pętli szyjnej lub etapu wydzielniczego ameloblastów (czerwona linia w <silna klasa = "xfig">Ryc. 2).</li>
	<li>Wykonaj drugie cięcie poniżej drugiego zęba trzonowego i włóż skalpel między kość a przyśrodkową powierzchnię siekacza. Kiedy cała kość podstawna zostanie podniesiona, obróć siekacz na zewnątrz i ostrożnie go zdejmij, aby uniknąć uszkodzenia tkanki szkliwa narządu, używając cienkiej pęsety.</li>
</ol>
4. Mikropreparacja narządu szkliwa pod soczewką lornetkową
<ol>
	<li>Upuść 200 μl buforu fosforanowo-solnego (PBS 1X) na siekacz za pomocą pipety. Weź siekacz cienkim pęsetą z powierzchnią wargową skierowaną do góry. Zrób znak skalpela między bezbarwną a pomarańczową częścią tkanki. Znak ten odpowiada znajdującej się pod spodem białej plamie, którą można później zaobserwować (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Zeskrobać za pomocą koparki lub równoważnego narzędzia powierzchnię komórki od śladu skalpela do wierzchołkowego końca odpowiadającego ameloblastom w stadium wydzielania (bezbarwnym) oraz od śladu skalpela do końca siekacza w przypadku ameloblastów w fazie dojrzewania (pomarańczowy).</li>
	<li>Usuń 2-milimetrową tkankę odpowiadającą etapowi przejścia, jak opisano wcześniej19. Nie otwieraj siekacza podczas preparacji narządu szkliwa, aby uniknąć zanieczyszczenia mezenchymą.</li>
	<li>Przeciąć pętlę szyjną znajdującą się bezpośrednio w wierzchołkowej części siekacza (<silna klasa="xfig">Rysunek 2), jak opisano wcześniej20.</li>
	<li>Zbierz go w 10% roztworze formaliny lub roztworze do lizy w celu dalszych badań (patrz tabela materiałów).</li>
</ol>
5. Pobranie oddzielonych tkanek narządów szkliwa do dalszych badań
<ol>
	<li>Upuść 200 μl buforu PBS 1X na siekacz.</li>
	<li>Za pomocą ostrza skalpela #11 ostrożnie odłączaj komórki nabłonka zębów stopniowo w buforze, osobno dla każdego etapu za pomocą wykonanego wcześniej śladu skalpela.</li>
	<li>W przypadku ekstrakcji RNA komórek i białek należy umieścić tkankę w roztworze do lizy, który umożliwia ekstrakcję zarówno białek, jak i RNA (patrz Tabela materiałów). 
	UWAGA: Przygotuj wysokiej jakości RNA, obracając koparkę tkankową w probówce, a następnie mieląc komórki aż do uzyskania jednorodnej mieszaniny. Mieszanina jest gotowa do ekstrakcji RNA i białek zgodnie z procedurą producenta, która została wcześniej opisana2,8,17. Zazwyczaj dla każdego preparatu uzyskuje się około 5-10 μg całkowitego RNA i 150 μg białek ogółem.</li>
	<li>W przypadku analiz histologicznych, immunohistochemii (IHC) i hybrydyzacji in situ (ISH) należy umieścić warstwę komórkową w 10% formalinie na 2 godziny, a następnie przechowywać w temperaturze 4 °C w PBS 1X. Tkanka może być następnie zanurzona w wosku/parafinie lub tkance OCT w celu zamrożonych skrawków.</li>
	<li>W przypadku ekstrakcji EMP weź siekacz za pomocą cienkiej pęsety. Po krótkiej ekspozycji na powietrze (lekkie odwodnienie) wokół środkowej części wargowej powierzchni siekacza widoczna będzie biała plama, która reprezentuje inicjację mineralizacji szkliwa. Ta biała plama odpowiada etapowi przejściowemu/wczesnemu dojrzewaniu ameloblastów, więc użyj jej jako wskaźnika do ekstrakcji EMPs21.</li>
</ol>

<ol><li>Jedeon, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enamel+defects+reflect+perinatal+exposure+to+bisphenol+A%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Enamel defects reflect perinatal exposure to bisphenol A.</a> Am J Pathol. 183, 108-118 (2013).</li>
<li>Jedeon, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+Exposure+to+Bisphenol+a+Exacerbates+Dental+Fluorosis+in+Growing+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Chronic Exposure to Bisphenol a Exacerbates Dental Fluorosis in Growing Rats.</a> J Bone Miner Res. 31, 1955-1966 (2016).</li>
<li>Alaluusua, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+dental+aberrations+after+the+dioxin+accident+in+Seveso%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Developmental dental aberrations after the dioxin accident in Seveso.</a> Environ Health Perspect. 112, 1313-1318 (2004).</li>
<li>Chapple, I. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+lifestyle%2C+behaviour+or+systemic+diseases+with+dental+caries+and+periodontal+diseases%3A+consensus+report+of+group+2+of+the+joint+EFP%2FORCA+workshop+on+the+boundaries+between+caries+and+periodontal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Interaction of lifestyle, behaviour or systemic diseases with dental caries and periodontal diseases: consensus report of group 2 of the joint EFP/ORCA workshop on the boundaries between caries and periodontal diseases.</a> J Clin Periodontol. 44, S39-S51 (2017).</li>
<li>Nanci, A. Enamel: Composition, Formation, and Structure. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNanci%2C+A+%22Ten+Cate%27s+Oral+Histology+Development%2C+Structure%2C+and+Function%22">Ten Cate's Oral Histology Development, Structure, and Function</a>. , 8th ed, Elsevier mosby. 122-164 (2012).</li>
<li>Leite, G. A., Sawan, R. M., Teofilo, J. M., Porto, I. M., Sousa, F. B., Gerlach, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+lead+exacerbates+dental+fluorosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Oral+Biol%22%5BJournal%5D)">Exposure to lead exacerbates dental fluorosis.</a> Arch Oral Biol. 56, 695-702 (2011).</li>
<li>Jedeon, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enamel+hypomineralization+due+to+endocrine+disruptors%5BTitle%5D)+AND+%22Connect+Tiss+Res%22%5BJournal%5D)">Enamel hypomineralization due to endocrine disruptors.</a> Connect Tiss Res. 55, 1-5 (2014).</li>
<li>Jedeon, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androgen+receptor+involvement+in+rat+amelogenesis%3A+an+additional+way+for+endocrine+disrupting+chemicals+to+affect+enamel+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Androgen receptor involvement in rat amelogenesis: an additional way for endocrine disrupting chemicals to affect enamel synthesis.</a> Endocrinology. 157, 4287-4296 (2016).</li>
<li>Weerheijm, K. L., Jalevik, B., Alaluusua, S. <a target="_blank" href="https://www.karger.com/Article/Abstract/47479">Molar-incisor hypomineralisation.</a> Caries Res. 35, 390-391 (2001).</li>
<li>Jälevik, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+Diagnosis+of+Molar-Incisor-+Hypomineralisation+%28MIH%29%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Arch+Paediatr+Dent%22%5BJournal%5D)">Prevalence and Diagnosis of Molar-Incisor- Hypomineralisation (MIH): A systematic review.</a> Eur Arch Paediatr Dent. 11, 59-64 (2010).</li>
<li>Alaluusua, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aetiology+of+Molar-Incisor+Hypomineralisation%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Arch+Paediatr+Dent%22%5BJournal%5D)">Aetiology of Molar-Incisor Hypomineralisation: A systematic review.</a> Eur Arch Paediatr Dent. 11, 53-58 (2010).</li>
<li>Jedeon, K., Berdal, A., Babajko, S. The tooth, target organ of Bisphenol A, could be used as a biomarker of exposure to this agent. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJedeon%2C+K+%22Bisphenol+A%3A+Sources%2C+Risks+of+Environmental+Exposure+and+Human+Health+Effects%22">Bisphenol A: Sources, Risks of Environmental Exposure and Human Health Effects</a>. Gibert, Y. , Nova Science Publishers. 205-225 (2015).</li>
<li>Fejerskov, O., Larsen, M. J., Richards, A., Baelum, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dental+tissue+effects+of+fluoride%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">Dental tissue effects of fluoride.</a> Adv Dent Res. 8, 15-31 (1994).</li>
<li>Robinson, C., Connell, S., Kirkham, J., Brookes, S. J., Shore, R. C., Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+fluoride+on+the+developing+tooth%5BTitle%5D)+AND+%22Caries+Res%22%5BJournal%5D)">The effect of fluoride on the developing tooth.</a> Caries Res. 38, 268-276 (2004).</li>
<li>Sahlberg, C., Pavlic, A., Ess, A., Lukinmaa, P. L., Salmela, E., Alaluusua, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+effect+of+amoxicillin+and+sodium+fluoride+on+the+structure+of+developing+mouse+enamel+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Oral+Biol%22%5BJournal%5D)">Combined effect of amoxicillin and sodium fluoride on the structure of developing mouse enamel in vitro.</a> Arch Oral Biol. 58, 1155-1164 (2013).</li>
<li>Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Euthanasia+of+neonatal+rats+with+carbon+dioxide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Euthanasia of neonatal rats with carbon dioxide.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 48, 23-27 (2009).</li>
<li>Hiller, C. R., Robinson, C., Weatherell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variations+in+the+composition+of+developing+rat+incisor+enamel%5BTitle%5D)+AND+%22Calcif+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Variations in the composition of developing rat incisor enamel.</a> Calcif Tissue Res. 18, 1-12 (1975).</li>
<li>Robinson, C., Kirkham, J., Nutman, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+enamel+formation+and+eruption+rate+in+rat+mandibular+incisors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Relationship between enamel formation and eruption rate in rat mandibular incisors.</a> Cell Tissue Res. 254, 655-658 (1988).</li>
<li>Smith, C. E., Nanci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+sampling+the+stages+of+amelogenesis+on+mandibular+rat+incisors+using+the+molars+as+a+reference+for+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">A method for sampling the stages of amelogenesis on mandibular rat incisors using the molars as a reference for dissection.</a> Anat Rec. 225, 257-266 (1989).</li>
<li>Chavez, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+dental+epithelial+stem+cells+from+the+adult+mouse+incisor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of dental epithelial stem cells from the adult mouse incisor.</a> J Vis Exp. (87), (2014).</li>
<li>Brookes, S. J., Kingswell, N. J., Barron, M. J., Dixon, M. J., Kirkham, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+the+32-kDa+fragment+the+functional+enamelin+unit+in+all+species%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Oral+Sci%22%5BJournal%5D)">Is the 32-kDa fragment the functional enamelin unit in all species?</a> Eur J Oral Sci. 119, 345-350 (2011).</li>
<li>Babajko, S., Jedeon, K., Houari, S., Loiodice, S., Berdal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Steroid+Axis%2C+a+New+Paradigm+for+Molar+Incisor+Hypomineralization+%28MIH%29%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Disruption of Steroid Axis, a New Paradigm for Molar Incisor Hypomineralization (MIH).</a> Front Physiol. 8, 343(2017).</li>
<li>Houari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asporin+and+the+mineralization+process+in+fluoride-treated+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Min+Res%22%5BJournal%5D)">Asporin and the mineralization process in fluoride-treated rats.</a> J Bone Min Res. 29, 1446-1455 (2014).</li>
<li>Denbesten, P., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+fluoride+toxicity%3A+dental+fluorosis%5BTitle%5D)+AND+%22Monographs+in+oral+science%22%5BJournal%5D)">Chronic fluoride toxicity: dental fluorosis.</a> Monographs in oral science. 22, 81-96 (2011).</li>
<li>Kirkham, J., Robinson, C., Phull, J. K., Shore, R. C., Moxham, B. J., Berkovitz, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+rate+of+eruption+on+periodontal+ligament+glycosylaminoglycan+content+and+enamel+formation+in+the+rat+incisor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">The effect of rate of eruption on periodontal ligament glycosylaminoglycan content and enamel formation in the rat incisor.</a> Cell Tissue Res. 274, 413-419 (1993).</li>
<li>Lacruz, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+candidate+genes+involved+in+mineralization+of+dental+enamel+by+genome-wide+transcript+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Identification of novel candidate genes involved in mineralization of dental enamel by genome-wide transcript profiling.</a> J Cell Physiol. 227, 2264-2275 (2012).</li>
<li>Wen, X., Paine, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+deposition+and+ferritin+heavy+chain+%28Fth%29+localization+in+rodent+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+research+notes%22%5BJournal%5D)">Iron deposition and ferritin heavy chain (Fth) localization in rodent teeth.</a> BMC research notes. 6, 1(2013).</li>
<li>Houari, S., Loiodice, S., Jedeon, K., Berdal, A., Babajko, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Steroid+Receptors+in+Ameloblasts+during+Amelogenesis+in+Rat+Incisors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Expression of Steroid Receptors in Ameloblasts during Amelogenesis in Rat Incisors.</a> Front Physiol. 7, 503(2016).</li>
<li>Kawano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+dental+epithelial+cell+line+%28HAT-7%29+and+the+cell+differentiation+dependent+on+Notch+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Connect+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Establishment of dental epithelial cell line (HAT-7) and the cell differentiation dependent on Notch signaling pathway.</a> Connect Tissue Res. 43, 409-412 (2002).</li>
<li>Zhou, Y. L., Snead, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+CCAAT%2Fenhancer-binding+protein+alpha+as+a+transactivator+of+the+mouse+amelogenin+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of CCAAT/enhancer-binding protein alpha as a transactivator of the mouse amelogenin gene.</a> J Biol Chem. 275, 12273-12280 (2000).</li>
<li>Nakata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+spontaneously+immortalized+mouse+ameloblast-lineage+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a spontaneously immortalized mouse ameloblast-lineage cell line.</a> Biochem Biophys Res Commun. 308, 834-839 (2003).</li>
<li>Harada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+ameloblastoma+cell+line%2C+AM-1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+oral+pathology+%26+medicine%3A+official+publication+of+the+International+Association+of+Oral+Pathologists+and+the+American+Academy+of+Oral+Pathology%22%5BJournal%5D)">Establishment of ameloblastoma cell line, AM-1.</a> Journal of oral pathology & medicine: official publication of the International Association of Oral Pathologists and the American Academy of Oral Pathology. 27, 207-212 (1998).</li>
<li>Jussila, M., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+networks+regulating+tooth+organogenesis+and+regeneration%2C+and+the+specification+of+dental+mesenchymal+and+epithelial+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Signaling networks regulating tooth organogenesis and regeneration, and the specification of dental mesenchymal and epithelial cell lineages.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, a008425(2012).</li>
<li>Tucker, A., Sharpe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cutting-edge+of+mammalian+development%3B+how+the+embryo+makes+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The cutting-edge of mammalian development; how the embryo makes teeth.</a> Nat Rev Genet. 5, 499-508 (2004).</li>
<li>Vos, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Years+lived+with+disability+%28YLDs%29+for+1160+sequelae+of+289+diseases+and+injuries+1990-2010%3A+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2010%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Years lived with disability (YLDs) for 1160 sequelae of 289 diseases and injuries 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010.</a> Lancet. 380, 2163-2196 (2012).</li>
<li>Marcenes, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+burden+of+oral+conditions+in+1990-2010%3A+a+systematic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">Global burden of oral conditions in 1990-2010: a systematic analysis.</a> J Dent Res. 92, 592-597 (2013).</li>
<li>National Institute of Dental and Craniofacial Research. Dental Caries (Tooth Decay) in Adults (Age 20 to 64). , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.nidcr.nih.gov/DataStatistics/FindDataByTopic/DentalCaries/DentalCariesAdults20to64.htm">https://www.nidcr.nih.gov/DataStatistics/FindDataByTopic/DentalCaries/DentalCariesAdults20to64.htm</a> (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Zmieniona aktywność ameloblastów i/lub zaburzone procesy proliferacji, różnicowania i dojrzewania ameloblastów prowadzą do nieodwracalnych wad szkliwa, a z kolei charakterystyka wad szkliwa może pomóc w zrozumieniu zmienionej aktywności ameloblastów podczas amelogenezy. Tym samym badania na izolowanym narządzie szkliwa są wyznacznikiem zdarzeń patologicznych prowadzących do wad szkliwa niezależnie od ich pochodzenia, środowiskowego czy genetycznego.
Technika ta została pierwotnie opisana przez...

Wiele rozwojowych wad szkliwa może wynikać z narażenia na toksyny środowiskowe i/lub niewłaściwego stylu życia1,2,3,4. Charakterystyka zdarzeń zakłócających i cząsteczek amelogenezy przy użyciu obecnie opisanej procedury będzie promować wykorzystanie powstałych defektów szkliwa jako wczesnych markerów narażenia na kilka substancji toksycznych i może pomóc w odtworzeniu historii zdrowia każdej pacjentki w okresie okołoporodowym, kiedy szkliwo jest syntetyzowane1,2. Syntezę szkliwa można podzielić na cztery główne etapy w zależności od aktywności ameloblastów5. Pierwszy etap przegrupowuje proliferację komórek prekursorowych i pre-ameloblastów. W drugim etapie zróżnicowane ameloblasty wydzielają białka macierzy szkliwa (EMP), głównie amelogeninę, szkliwo i ameloblastynę, które decydują o grubości końcowego szkliwa. Tak więc każde zakłócenie syntezy EMP prowadzi do ilościowych defektów szkliwa. Po osadzeniu się pełnej grubości szkliwa rozpoczyna się etap dojrzewania. Na tym etapie wzrost krystalitu apatytu pod względem szerokości i grubości pozwala szkliwu osiągnąć najwyższy współczynnik mineralizacji występujący w tkance biologicznej, wynoszący do 96% masy. Zdarzenia zakłócające, które zachodzą na etapie dojrzewania, prowadzą do jakościowych wad szkliwa. Wreszcie ameloblasty wchodzą w fazę pomaturalną, zwaną również pigmentacją u gryzoni, i ulegają apoptozie podczas wyrzynania się zębów, co sprawia, że ubytki szkliwa (jeśli występują) są nieodwracalne i nieodwracalne, a zatem wady zapewniają potencjalną retrospektywną rejestrację stresów ameloblastowych. U gryzoni amelogeneza przebiega zgodnie z podobną sekwencją zdarzeń, ze szczególnym wyjątkiem, że ich siekacze stale rosną, co czyni je odpowiednim modelem do badania ogólnego procesu amelogenezy. Tak więc każde zakłócenie amelogenezy powoduje zmiany jakości i/lub ilości szkliwa, w zależności od okna czasowego zdarzenia zakłócającego. W tym sensie wykazano, że narażenie na dioksyny, ołów i substancje chemiczne zaburzające gospodarkę hormonalną (EDC), takie jak bisfenol A (BPA), genisteina i winklozolina, generują hipomineralizację szkliwa1,2,3,6,7,8. Na siekaczach szczurów narażonych na niską dawkę BPA w okresie płodowym i w pierwszym miesiącu po urodzeniu zidentyfikowano asymetryczne><, białe, nieprzezroczyste plamki. Te wady szkliwa u szczurów oraz hipomineralizacja ludzkich siekaczy trzonowych (MIH) mają podobne cechy kliniczne, strukturalne i biochemiczne. MIH to niedawno opisana patologia szkliwa zębów, której etiologia nadal pozostaje niejasna9,10 pomimo hipotezy o wielu czynnikach przyczynowych9,10,11,12.
Innym ważnym patologiem hipomineralizacji szkliwa spowodowanym czynnikami środowiskowymi jest fluoroza zębów (DF), która jest konsekwencją nadmiernego wchłaniania fluoru (>0.1 mg/kg/dzień)13,14. Głównym źródłem fluoru jest woda pitna, która jest albo uzupełniona, albo naturalnie wzbogacona w fluor. Fluor jest również często przepisywany w celu zapobiegania próchnicy, ale dawka profilaktyczna jest tylko o 50% niższa niż toksyczna (≤0,05 mg/kg/dzień). MIH i DF, dwie częste patologie wynikające z narażenia na czynniki środowiskowe, mogą wykazywać wspólne cechy, które należy scharakteryzować ze względu na nasilenie hipomineralizującego działania fluoru w połączeniu z innymi substancjami toksycznymi, takimi jak EDCs2 lub amoksycylina15.
Mikropreparacja szczurzego narządu szkliwa zawierającego ameloblasty na różnych etapach różnicowania pomoże zrozumieć mechanizm działania cząsteczek zdolnych do zakłócania aktywności ameloblastów i powodowania diagnozy wad szkliwa po wyrzynaniu się zębów. Innymi słowy, charakterystyka zmian ekspresji genów szkliwa i składu matrycy szkliwa spowodowanych toksynami środowiskowymi pozwala na odtworzenie historii narażenia na substancje toksyczne i ułatwia monitorowanie bezpieczeństwa środowiskowego dla zdrowia publicznego.

<table><tbody><tr><td>Bisfenol A</td><td>Sigma Aldrich, Saint Louis MO</td><td>239658</td><td></td></tr><tr><td>formalina 10%</td><td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO</td><td>HT5012</td><td></td></tr><tr><td>Tri-Reagent</td><td>Euromedex, Francja</td><td>TR118</td><td></td></tr><tr><td>RLT buffer</td><td>Qiagen, Les Ulis, Francja</td><td>74126</td><td>RNeasy Protect Mini Kit</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko receptorowi androgenowemu</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)</td><td>sc-816</td><td>królicze przeciwciało poliklonalne</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>EUOMEDEX</td><td>ET330. A</td><td></td></tr><tr><td>Fluorek sodu (NaF)</td><td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO</td><td>S-1504</td><td></td></tr><tr><td>paraplast regularne</td><td>mikrosystemy Leica, Nanterre cedex,&nbsp; Francja</td><td>39601006</td><td>nazywana was/parafin w tkance tekstowej</td></tr><tr><td>OCT</td><td>VWR, Fontenay-sous-Bois, Francja</td><td>411243</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki Extra Fine Bonn - proste/8.5 cm</td><td>PHYMEP , Paryż, Francja</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Rękojeść do ostrzy skalpela - 12.5 cm</td><td>PHYMEP, Paryż, Francja</td><td>10035-12</td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywione ostrze skalpela</td><td>PHYMEP , Paryż, Francja</td><td>10035-20</td><td></td></tr><tr><td>Nóż preparacyjny - cienka/prosta końcówka</td><td>PHYMEP , Paryż, Francja</td><td>10055-12</td><td></td></tr><tr><td>Nóż okrągły</td><td>PHYMEP, Paryż, Francja</td><td>10059-15</td><td></td></tr><tr><td>ostrzy skalpela n&deg; 11 Swann-Morton</td><td>VWR, Fontenay-sous-Bois, Francja</td><td>233-0024</td><td></td></tr> soczewka <tr><td>lornetkowa</td><td>Leica biosystems, Nanterre cedex,&nbsp; Francja</td><td>MZFLIII</td><td></td></tr></tbody></table>

mikropreparacja narządu szkliwa z siekacza żuchwy szczurów narażonych na działanie toksyn środowiskowych

Micro-dissection of Enamel Organ from Mandibular Incisor of Rats Exposed to Environmental Toxicants

Wady szkliwa wynikające z warunków środowiskowych i stylu życia stanowią problem zdrowia publicznego ze względu na ich częste występowanie. Wady te wynikają ze zmienionej aktywności komórek odpowiedzialnych za syntezę szkliwa zwanych ameloblastami, które są obecne w narządzie szkliwa. Podczas amelogenezy ameloblasty podążają za określoną i precyzyjną sekwencją zdarzeń proliferacji, różnicowania i śmierci. Szczur z ciągle rosnącymi siekaczami jest odpowiednim modelem eksperymentalnym do badania aktywności ameloblastów i etapów różnicowania w stanach fizjologicznych i patologicznych. Tutaj opisujemy niezawodną i spójną metodę mikropreparacji narządu szkliwa szczurów narażonych na działanie toksyn środowiskowych. Mikrowycięty nabłonek zębów zawiera ameloblasty w fazie wydzielania i dojrzewania, które mogą być wykorzystywane do eksperymentów jakościowych, takich jak testy immunohistochemiczne i hybrydyzacja in situ, a także do analiz ilościowych, takich jak RT-qPCR, sekwencjonowanie RNA i Western blot.

Wiele defektów szkliwa, takich jak fluorosis zębów12,13, może wynikać z warunków środowiskowych spowodowanych nadmiernym wchłanianiem fluorków lub hipomineralizacją szkliwa podobną do MIH w wyniku ekspozycji na niektóre EDCs1,7,22. Te rozwojowe defekty szkliwa można odtworzyć eksperymentalnie u szczurów (Rycina 1</str...

Zrozumienie powstawania szkliwa i możliwych zmian wymaga zbadania aktywności ameloblastów. W tym miejscu opisano wiarygodną i spójną metodę mikropreparacji narządów szkliwa zawierających ameloblasty w fazie sekrecji i dojrzewania, które mogą być wykorzystane do dalszych ilościowych i jakościowych procedur eksperymentalnych.

Mikropreparacja narządu szkliwa z siekacza żuchwy szczurów narażonych na działanie toksyn środowiskowych

Enamel defects resulting from environmental conditions and ways of life are public health concerns because of their high prevalence. These defects result ...

Ogólnym celem tej procedury jest mikropreparacja narządu szkliwa szczura i oddzielenie nabłonka zębowego zgodnie z głównymi etapami różnicowania komórek podczas syntezy szkliwa. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu patologii szkliwa, takich jak fluoroza zębów, hiperemelizacja siekaczy trzonowców i dziedziczna geneza szkliwa imperfectum. Główną zaletą tej techniki jest możliwość dalszej analizy komórek zębowych za pomocą eksperymentów ilościowych, takich jak immunohistochemia, bez żadnych wcześniejszych zabiegów, a także wynikających z tego badań, takich jak Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w molekularną mechanizację endogennych i egzogennych cząsteczek zdolnych do zakłócenia hemogenezy.Po eutanazji szczura doświadczalnego usuń całą skórę z dolnych warg za pomocą skalpela numer 11, aby uzyskać łatwy dostęp do dolnych siekaczy. Następnie tym samym skalpelem wykonaj nacięcie między dwoma dolnymi siekaczami. Wywierając lekki nacisk, żuchwa podzieli się na dwie połowy.Następnie przetnij skalpelem staw skroniowo-żuchwowy, aby odłączyć szczękę, trzymając półżuchwę cienkim pęsetą. Następnie przetnij otaczające tkanki miękkie skalpelem i usuń wszystkie mięśnie, ścięgna i więzadła za pomocą skrobaka, aż kość będzie całkowicie czysta. Aby odizolować siekacz, ostrożnie ogol kość, umieszczając ostrze równolegle do głównej osi podłużnej siekacza.Rozpocznij golenie od grzbietu kostnego, w pobliżu końców siekacza i pracuj w kierunku drugiego końca siekacza, w pobliżu pętli szyjki macicy. Następnie wykonaj nacięcie skalpelem, dystalnie do pętli szyjnej, aby usunąć gonion półżuchwy, ułatwiając w ten sposób usunięcie siekacza bez uszkadzania pętli szyjnej lub etapu wydzielniczego ameloblastów. Następnie wykonaj drugie cięcie poniżej drugiego zęba trzonowego i włóż skalpel między kość a przyśrodkową powierzchnię siekacza.Kiedy cała kość podstawna zostanie podniesiona, obróć siekacz na zewnątrz i ostrożnie usuń go za pomocą cienkiej pęsety, aby uniknąć uszkodzenia tkanki szkliwa narządu. Teraz cały siekacz jest izolowany. W celu rozwarstwienia przykryj siekacz 200 mikrolitrami PBS w 60-milimetrowym naczyniu lub talerzu.Aby rozpocząć, przetnij pętlę szyjną, znajdującą się bezpośrednio w wierzchołkowej części siekacza, jak opisano wcześniej. Następnie chwyć siekacz cienką pęsetą, powierzchnią wargową do góry i zrób ślad skalpela na końcu bezbarwnej części tkanki. Ten znak odpowiada znajdującej się pod spodem białej plamce, którą będzie można zaobserwować później.Teraz użyj koparki lub równoważnego narzędzia, aby zeskrobać powierzchnię komórki od znaku do końca wierzchołkowego, co odpowiada bezbarwnym ameloblastom w fazie wydzielania. Następnie wykonaj ślad skalpela na początku pomarańczowej części, odpowiadający ameloblastom na etapie dojrzewania i zeskrob ze śladu skalpela do czubka siekacza. Teraz usuń dwa milimetry tkanki, które odpowiadają ameloblastom w stadium przejściowym.Nie otwieraj siekacza podczas sekcji narządu szkliwa, ponieważ spowoduje to zanieczyszczenie wypreparowanych tkanek mezenchymą. Na koniec przechowuj tkanki w 10% formalinie lub roztworze do lizy w celu dalszych badań. W celu ekstrakcji białka macierzy szkliwa należy na krótko wyjąć siekacz z roztworu, aż wokół środkowej części powierzchni wargowej stanie się widoczna biała plama.To miejsce reprezentuje inicjację mineralizacji szkliwa i odpowiada przejściu do ameloblastów we wczesnym stadium. Odetnij ten obszar tkanki i traktuj go w razie potrzeby. Jeśli usunięta tkanka jest przeznaczona do ekstrakcji komórkowego RNA i białek, użyj komercyjnego zestawu do przeprowadzenia ekstrakcji.Przenieś usuniętą tkankę do roztworu do lizy i zmiel ją na jednorodną mieszaninę. Do analiz histologicznych, immunohistochemii i hybrydyzacji NC2 należy umieścić pobraną tkankę w 10% formalinie na dwie godziny w temperaturze pokojowej. Następnie przenieś tkankę do PBS i przechowuj ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Później tkanka może być zanurzona w wosku, parafinie lub tkance OCT. Utworzono cztery grupy samców szczurów białoogonowych w zależności od ich ekspozycji na fluor w połączeniu lub nie z BPA. Wszystkie zwierzęta obserwowano i poddano sekcji w 65 dniu, zgodnie z opisem.Jakość mikrowypreparowanych tkanek szkliwa sprawdzono za pomocą barwienia trichromem Massona. Obserwacje mikroskopowe wykazują typowe komórki nabłonka szkliwa i ameloblast palocyd. Brak zanieczyszczenia mezenchymalnego został potwierdzony przez brak zielonego zabarwienia kolagenu.Ameloblasty w fazie wydzielania wyrażają emalinę. W fazie dojrzewania ameloblasty wyrażają kalikinę cztery, a także zawierają wysoki poziom feratyny, co daje im zdolność do magazynowania dużych ilości żelaza odpowiedzialnego za pomarańczowy kolor szkliwa. Te RNA są preferencyjnie wyrażane przez ameloblasty, a nie przez komórki mezenchymelu.Z kolei kolagen jeden jest wyrażany przez komórki mezenchymelu, a nie ameloblasty. Następnie wykorzystano immunohistochemię do oceny czterech specyficznych białek w ameloblastach w fazie wydzielania lub dojrzewania. Na przykład receptor androgenowy, widoczny na zielono, jest specyficznie zlokalizowany w ameloblastach w fazie dojrzewania.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić mikropreparację narządu szkliwa gryzoni w celu pomyślnego oddzielenia ameloblastów na etapie wydzielania i dojrzewania. Takie podejście jest bardzo przydatne w zrozumieniu mechanizmów kluczowych czynników in vivo odpowiedzialnych za patologiczne i fizjologiczne choroby szkliwa.

micro-dissection-enamel-organ-from-mandibular-incisor-rats-exposed-to

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ciągle rosnący siekacz myszy dostarcza modelu do badania odnawiania tkanek zębowych z komórek macierzystych nabłonka zębów (DESCs). Przedstawiono solidny system do konsekwentnego i niezawodnego pozyskiwania tych komórek z siekacza i namnażania ich in vitro.

Izolacja i hodowla komórek macierzystych nabłonka zębów z siekacza dorosłej myszy

Tutaj prezentujemy protokół miejscowego wywoływania wierzchołkowego zapalenia przyzębia u myszy. Pokazujemy, jak wywiercić otwór w zębie myszy i odsłonić jego miazgę, aby wywołać miejscowy stan zapalny. Przedstawiono również metody analityczne mające na celu zbadanie charakteru tego zapalenia, takie jak mikrotomografia komputerowa i histologia.

Wywoływanie wierzchołkowego zapalenia przyzębia u myszy

Metoda hodowli narządów typu Trowella została wykorzystana do rozwikłania skomplikowanych sieci sygnałowych, które regulują rozwój zębów, a ostatnio do badania regulacji związanych z komórkami macierzystymi stale rosnącego siekacza myszy. Fluorescencyjne modele zwierzęce i metody obrazowania na żywo ułatwiają dogłębną analizę komórek macierzystych zębów i ich specyficznego mikrośrodowiska niszowego.

Zastosowanie hodowli narządów typu Trowell do badania regulacji komórek macierzystych zęba

Obecny protokół przedstawia szybką, efektywną i delikatną metodę izolowania pojedynczych komórek odpowiednich do analizy sekwencyjnego RNA pojedynczej komórki z ciągle rosnących siekaczy, mysich zębów trzonowych i ludzkich zębów.

Szybka izolacja pojedynczych komórek z zębów myszy i ludzi

Siekacz myszy zawiera cenne komórki zachowujące etykietę w swojej niszy komórek macierzystych. Dysponujemy nowatorskim sposobem na bezstronne wykrywanie i ilościowe określanie komórek zachowujących etykiety; W naszym badaniu wykorzystano znakowanie EdU i podejście do rekonstrukcji 3D po oczyszczeniu żuchwy z materiału PEGASOS.

Wykrywanie i oznaczanie ilościowe komórek zatrzymujących znaczniki w siekaczach myszy przy użyciu podejścia do rekonstrukcji 3D po oczyszczeniu tkanek

Obrazowanie na żywo ex vivo to potężna technika badania dynamicznych procesów ruchów komórkowych i interakcji w żywych tkankach. W tym miejscu przedstawiamy protokół, który implementuje mikroskopię dwufotonową do śledzenia na żywo komórek nabłonka zębów w hodowanych całych siekaczach dorosłych myszy.

Wykorzystanie obrazowania na żywo ex vivo do badania podziałów i ruchów komórek podczas odnawiania zębów myszy

Mikrotwardość jest właściwością mechaniczną i parametrem informacyjnym do oceny patofizjologii tkanek twardych. Tutaj demonstrujemy znormalizowany protokół (przygotowanie próbki, polerowanie, płaska powierzchnia i miejsca wgłębień) do analizy mikrotwardości kości zębów i wyrostka zębodołowego w modelach chorób jamy ustnej gryzoni, a mianowicie fluorozy zębów i resorpcji kości przyzębia wywołanej ligaturą.

Pomiary mikrotwardości kości zęba i wyrostka zębodołowego w modelach chorób jamy ustnej gryzoni

Celem niniejszego protokołu jest zapewnienie standaryzowanego podejścia do ilościowej oceny integralności bariery nabłonkowej dziąseł u myszy poprzez miejscowe nałożenie fluoroforowo oznaczonych dektranów o różnej wielkości cząsteczkowої na powierzchnię dziąseł in vivo, z późniejszym obrazowaniem ex vivo za pomocą systemu mikroskopu jednofotonowego.

Ocena funkcjonalności bariery nabłonkowej dziąseł mysich za pomocą fluorescencyjnych znaczników

Eksperymentalne badania na zwierzętach odgrywają kluczową rolę w rozwoju klinicznej praktyki transplantacyjnej. Ortotopowy model przeszczepiania wątroby u świń (OLTx) jest bardzo zbliżony do warunków panujących u ludzi i jest często stosowany w badaniach klinicznych. Poniższy protokół zawiera wszystkie informacje dotyczące wiarygodnego modelu OLTx świni przy użyciu aktywnej zastawki porto-caval-szyjnej.

Technika pozyskiwania wątroby świń i przeszczepu ortotopowego z wykorzystaniem aktywnej zastawki Porto-Caval

Ten artykuł opisuje pomiar funkcji lewej komory myszy za pomocą analizy ciśnienia/objętości przy różnych częstościach akcji serca.

Cewnikowanie serca u myszy w celu pomiaru zależności objętości ciśnienia: badanie efektu Bowditcha

Poznaj metodę mikropreparacji narządu szkliwa szczura w celu badania aktywności ameloblastów podczas formowania szkliwa. Technika umożliwia separację nabłonka zębowego na różnych etapach różnicowania komórkowego, co ułatwia analizę patologii szkliwa.

Mikropreparacja narządu szkliwa z siekacza żuchwy szczurów narażonych na działanie toksyn środowiskowych

Przeglądaj więcej filmów