Frakcjonowanie w celu rozdzielenia rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych gatunków huntingtyny
27 lutego 2018
Opisano metodę frakcjonowania nierozpuszczalnych i rozpuszczalnych gatunków zmutowanej huntingtyny z hodowli mózgów i komórek myszy. Opisana metoda jest przydatna do charakterystyki i kwantyfikacji strumienia białka huntingtyny oraz pomaga w analizie homeostazy białek w patogenezie choroby i w obecności zaburzeń
Ogólnym celem tej procedury jest opisanie użytecznego narzędzia do wizualizacji, charakterystyki i kwantyfikacji strumienia białka huntingtyny do analizy homeostazy białek w modelowych systemach choroby Huntingtona. Metoda ta może pomóc nam zrozumieć pytania dotyczące homeostazy białek i chorób neurodegeneracyjnych, takie jak zrozumienie wpływu niektórych interwencji terapeutycznych na patogenezę choroby. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala badaczom na wyizolowanie i rozdzielenie nierozpuszczalnych gatunków białek do analizy ilościowej.
Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat zmian biochemicznych zachodzących w patogenezie choroby Huntingtona, może być również stosowana w innych chorobach związanych z nieprawidłowym fałdowaniem białek, takich jak choroba Parkinsona i Alzheimera. Aby rozpocząć tę procedurę, należy oznaczyć dwa zestawy probówek dla każdej próbki jako rozpuszczalne i nierozpuszczalne. Przygotować bufor do lizy bezpośrednio przed lizą próbki w probówce rozpuszczalnej, dodając odpowiednią ilość inhibitorów.
Następnie dodaj do tkanki lodowaty rozpuszczalny bufor do lizy uzupełniony inhibitorami proteazy. W przypadku tkanki mózgowej myszy powoli odskakuj 30 razy w szklanym doczaczu o pojemności jednego mililitra. Należy uważać, aby nie złamać powierzchni cieczy, ponieważ utworzą się pęcherzyki, które mogą spowodować niepełną homogenizację.
Następnie odpipetować go do nierozpuszczalnej probówki na lodzie. W przypadku linii komórkowych komórki zostały posiane w proporcji od pięciu do 10 do piątych komórek na każdej sześciodołkowej płytce i wyhodowane do prawie konfluencji. Następnie przepłucz komórki raz zimnym 1X PBS i usuń go.
Następnie nałóż minimalną objętość buforu do lizy na komórki i podnieś je za pomocą skrobaka do komórek. Następnie przenieś homogenat lub lizat komórkowy do oznakowanej nierozpuszczalnej probówki i liza na lodzie przez godzinę. W przypadku lizatów komórkowych należy kilkakrotnie rozcierać, aby rozbić grudki komórek przed rozpoczęciem inkubacji i uniknąć tworzenia pęcherzyków.
Krótko pulsuj wir każdej próbki przez jedną sekundę w połowie lizy. Następnie odwirować próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy 15 000 x g przez 20 minut. Następnie usunąć supernatant.
Uważaj, aby nie naruszyć osadu lub mętnej warstwy, ponieważ spowoduje to zanieczyszczenie frakcji. Odpipetować supernatant w postaci frakcji rozpuszczalnej do probówki znakowanej rozpuszczalnym i trzymać na lodzie. Kluczowe znaczenie ma śledzenie rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych do lizy
.Zamiana lub umieszczenie nierozpuszczalnego buforu lub próbek na lodzie będzie miało negatywny wpływ na wynik protokołu. Przemyć osad 500 mikrolitrami buforu do lizy i odwirować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy 15 000 x g przez pięć minut. Powtórz pranie jeszcze raz.
Następnie usuń cały pozostały bufor do płukania, pozostawiając tylko osad tkanki. Następnie ponownie zawiesić osad za pomocą buforu do lizy uzupełnionego o 4%SDS. Poddaj każdą próbkę sonikacji przez 30 sekund w temperaturze pokojowej za pomocą sonografu sondowego.
Sonikowanie małych objętości przez długi czas jest technicznie trudne. Uważaj, aby nie stracić próbki przez emulgowanie lub rozpylanie podczas wykonywania tego kroku. Następnie gotuj próbki przez 30 minut.
Następnie odwirować je krótko w temperaturze 6 000 x g. Następnie wykonaj test białka kompatybilny z detergentem lub test białka Lowry'ego, aby zmierzyć stężenie białka. Następnie podziel próbki na partie o objętości 50 mikrolitrów, aby uniknąć problemów z zamarzaniem/rozmrażaniem.
Na tym etapie należy wykonać western blot, rozcieńczając 30 mikrogramów próbki w stosunku jeden do jednego w buforze ładującym. Gotować próbki przez pięć minut i krótko je odwirować w temperaturze 6 000 x g. Następnie przeanalizuj ułamki według strony SDS i western blot.
Zabarwić błonę barwnikiem z całych białek, aby uwidocznić wydajność ładowania białka. Oto rozpuszczalne i nierozpuszczalne frakcje z lizatów komórkowych HEK 293T rozdzielonych odpowiednio na żelach 4-12% Bis-Tris i 3-8% Tris-Acetate. Frakcja rozpuszczalna znormalizowana do kontroli obciążenia GAPDH wykazuje fluktuację zmutowanego monomeru rozpuszczalnego w eksonie huntingtyny 1 w oparciu o ekspozycję na inhibitor proteazy MG132.
Frakcja nierozpuszczalna pokazuje, że nagromadzone gatunki zmutowanej huntingtyny o dużej masie cząsteczkowej są również modulowane przez leczenie MG132. A oto próbki rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych frakcji z lizatów komórkowych HeLA przy użyciu analizy western blot i opóźnienia filtra. Dane pokazują, że obecność nadmiernie eksprymowanej izoformy SUMO zwiększa zarówno mutanta o wysokiej masie cząsteczkowej, jak i fibrylarnie nierozpuszczalnego mutanta huntingtyny we frakcji nierozpuszczalnej.
Rysunek ten pokazuje regulację akumulacji zmutowanej huntingtyny o wysokiej masie cząsteczkowej po modulowaniu potencjalnej terapii w nierozpuszczalnym frakcjonowaniu z komórek HeLa nad ekspresją eksonu 97Q huntingtyny 1. Cel terapeutyczny PIAS1 został wyciszony za pomocą siRNA w kierunku PIAS1 lub poddany nadmiernej ekspresji. Nierozpuszczalne frakcje z prążkowia myszy potraktowanego mikroRNA przeciwko PIAS1 i rozdzielonego na 3-8% żelach stronniczych Tris-Acetate wykazują modulację nierozpuszczalnej huntingtyny o wysokiej masie cząsteczkowej.
Nie zapominaj, że praca z NEM może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tego protokołu należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie maski na twarz. Po opanowaniu tę technikę od lizatu do końca frakcjonowania można wykonać w ciągu około trzech do czterech godzin, w zależności od liczby próbek. Należy przeznaczyć dodatkową godzinę na kwantyfikację białka i podanie.
Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak elektroforeza w żelu agarozowym lub opóźnienie filtra, w celu wykrycia odpowiednio rozpuszczalnych oligomerów lub nierozpuszczalnych włókienek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować i rozwiązywać nierozpuszczalne, nieprawidłowo sfałdowane białka do analizy ilościowej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje metodę frakcjonowania nierozpuszczalnych i rozpuszczalnych form zmutowanej huntingtiny z mózgu myszy oraz hodowli komórkowych. Technika ta wspomaga charakteryzację i kwantyfikację przepływu białka huntingtiny, przyczyniając się do analizy homeostazy białek w chorobie Huntingtona oraz innych zaburzeniach neurodegeneracyjnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biochemia
- Choroby neurodegeneracyjne
Wstęp
- Białko huntingtyna bierze udział w patogenezie choroby Huntingtona.
- Zrozumienie homeostazy białek jest kluczowe dla patogenezy tej choroby.
- Nieprawidłowe fałdowanie białek jest wspólną cechą wielu chorób neurodegeneracyjnych.
- Niniejszą metodę można również zastosować do badania choroby Parkinsona i choroby Alzheimera.
Cel badania
- Aby dostarczyć narzędzia do wizualizacji i kwantyfikacji przepływu białka huntingtyny.
- Aby przeanalizować homeostazę białek w modelowych systemach choroby Huntingtona.
- Aby ocenić wpływ interwencji terapeutycznych na postęp choroby.
Zastosowane metody
- Izolacja rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych frakcji białkowych.
- Przygotowanie buforu do lizy z odpowiednimi inhibitorami.
- Ilościowa analiza przepływu białek.
- Zastosowanie metody w różnych modelach chorób neurodegeneracyjnych.
Główne wyniki
- Metoda ta pozwala na skuteczną izolację form białka huntingtyny.
- Analiza ilościowa dostarcza informacji na temat homeostazy białek.
- Otrzymane wyniki przyczyniają się do zrozumienia mechanizmów choroby.
- Technika ta wykazuje potencjał do szerszego zastosowania w chorobach wynikających z błędnego zwijania białek.
Wnioski
- Ta metoda jest cennym narzędziem w badaniu choroby Huntingtona.
- Pozwala ona na lepsze zrozumienie dynamiki białek w procesach neurodegeneracji.
- Przyszłe zastosowania mogą objąć inne powiązane schorzenia.
Najczęściej zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
Metoda ta umożliwia zespołom badawczym z sektora biofarmaceutycznego ilościowe rozróżnienie rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych form zmutowanej huntingtiny, zapewniając wgląd w mechanizmy homeostazy białek w modelach choroby Huntingtona. Poprzez izolację istotnych dla przebiegu choroby agregatów o wysokiej masie cząsteczkowej, które korelują z odczytami fenotypowymi i modulacją terapeutyczną, podejście to wspiera walidację celów oraz ograniczanie ryzyka strategii modulujących HTT. Oferuje ono możliwość przełożenia procesu roboczego na hodowle komórkowe, tkanki oraz inne konteksty chorób neurodegeneracyjnych, zwiększając pewność prognostyczną na wczesnym etapie odkrywania leków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie przepływu zmutowanych form białka HTT w celu wyjaśnienia mechanizmów patogennych i walidacji HTT jako celu terapeutycznego.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ilościowe odczyty pul rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych form HTT w celu oceny stopnia oddziaływania na cel oraz modulacji szlaków.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów z portfela poprzez powiązanie zmian biochemicznych w formach HTT z progresją choroby i odpowiedzią terapeutyczną.
Przesiew i opracowanie testu
- Gotowość do analizy: Pozwala na otrzymanie ustandaryzowanych frakcji rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych, odpowiednich do dalszych analiz metodą western blot, retardacji na filtrze lub detekcji oligomerów.
- Wynik ilościowy: Umożliwia precyzyjny pomiar stężenia form HTT za pomocą testów białkowych kompatybilnych z detergentami, co wspiera analizy zależności dawka-odpowiedź oraz analizy przebiegu czasowego.
- Powtarzalność: Zdefiniowane etapy lizy, wirowania i przemywania zapewniają spójne frakcjonowanie w różnych typach próbek, co ułatwia transfer analiz i zastosowania międzyfunkcyjne.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Izoluje wysokocząsteczkowe formy HTT, które korelują z zachowaniem myszy i są modulowane przez interwencje terapeutyczne, co umożliwia powiązanie fenotypu z mechanizmem działania.
- Ciągłość translacyjna: Wspiera przejście z modeli in vitro do walidacji w tkankach, uzgadniając wyniki odkryć z przedklinicznymi ocenami skuteczności.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Pozwala ustalić, czy interwencje wpływają na rozpuszczalne monomery, oligomery czy nierozpuszczalne agregaty, co zmniejsza niejednoznaczność w określaniu mechanizmu działania.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w początkowy etap procesu odkrywania leków, umożliwiając testowanie hipotez dotyczących strategii ukierunkowanych na białko HTT przed identyfikacją wiodącego związku i walidacją przedkliniczną, poprzez dostarczenie ilościowych odczytów homeostazy białek w oparciu o frakcjonowanie.
- Biologia odkrywcza: Wspiera badanie mechanizmów przetwarzania, agregacji i szlaków usuwania HTT w modelach chorób.
- Przesiewanie: Pozwala na przygotowanie biochemicznie zdefiniowanych frakcji do wiarygodnego przesiewania związków pod kątem rozpuszczalnych lub nierozpuszczalnych form HTT.
- Analityka: Dostarcza ilościowych danych o stężeniu białka oraz wyników western blot w celu porównania poziomów form HTT w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy frakcjonowanie HTT z poziomu komórkowego i tkankowego z odczytami behawioralnymi i patologicznymi w modelach przedklinicznych.
- Zastosowania w badaniach: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do badania błędnego zwinięcia białek w modelach choroby Huntingtona, Parkinsona i Alzheimera.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność co do celu terapeutycznego poprzez określenie specyficznych dla gatunku wkładów białka HTT w patogenezę i odpowiedź terapeutyczną.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki zestandaryzowanym procedurom lizy, frakcjonowania i kwantyfikacji białek.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez powiązanie modulacji celu z mierzalnymi zmianami w agregatach HTT istotnych dla przebiegu choroby.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów obniżających poziom HTT lub modulujących agregację, skorygowaną o ryzyko, w oparciu o redukcję form nierozpuszczalnych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu biochemii białek, technik frakcjonowania oraz analizy western blot.
- Konieczny jest dostęp do wirówki, sonikatora oraz odpowiednich odczynników, w tym SDS i inhibitorów proteaz.
- Niezbędne jest stosowanie ustandaryzowanych protokołów we wszystkich zespołach, aby zapobiec krzyżowemu zanieczyszczeniu buforami i zapewnić czystość frakcji.
- Przy skalowaniu między modelami należy uwzględnić zmienność wydajności homogenizacji tkanek oraz wydajności sonikacji.
- Ograniczeniem jest konieczność ostrożnego obchodzenia się z próbkami, aby uniknąć ich utraty podczas etapów sonikacji i resuspensji, szczególnie w przypadku małych objętości.
