Name: Frakcjonowanie w celu rozdzielenia rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych gatunków huntingtyny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Poznaj metodę frakcjonowania białka huntingtyny w mózgu myszy i kulturach komórkowych. Technika umożliwia izolację i analizę ilościową rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych gatunków białkowych, wspierając badania homeostazy białek w chorobie Huntingtona oraz innych chorobach neurodegeneracyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez NIH (RO1-NS090390). Chcielibyśmy również podziękować dr Joan Steffan za pomoc techniczną i dyskusję podczas opracowywania tego testu.

Oświadczenie o etyce zwierząt - Eksperymenty zostały przeprowadzone w ścisłej zgodności z Przewodnikiem Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych National Institutes of Health oraz zatwierdzonym protokołem badań na zwierzętach przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) na Uniwersytecie Kalifornijskim w Irvine, instytucji akredytowanej przez AAALAC. Dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować cierpienie zwierząt.
1. Przygotowanie do lizy
<ol>
	<li>Przygotować "rozpuszczalny" bufor do lizy (10 mM Tris pH 7,4, 1% Triton-X 100, 150 mM NaCl, 10% glicerol) i sterylny filtr przez filtr 0,22 μm.
	<ol>
		<li>Aby uzyskać działający "rozpuszczalny" bufor do lizy, odmierz N-etylomaleimid (NEM) i dokładnie rozpuść w 100 mM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF) rozpuszczonego w 100% EtOH. 
		UWAGA: Inhibitory buforu do lizy: (i) 20 mM N-etylomaleimidu (NEM); (ii) 0,2 mM PMSF; (iii) 1 mM ortowananadu sodu (Na3VO4); (iv) 1 μg/ml leupeptyny; (v) 1 μg/ml aprotyniny; (vi) 20 mM fluorek sodu (NaF). 
		UWAGA: Noś maskę na twarz podczas pracy z NEM przez cały czas trwania protokołu. Działający bufor do lizy musi być świeży, aby zapewnić aktywne inhibitory.</li>
		<li>W przypadku rozpuszczalnego buforu do lizy z inhibitorami proteazy należy dodać inhibitory w następującej kolejności: fluorek sodu (NaF), do objętości z buforem do lizy na zimno, ortowananadan sodu (Na3VO4), aprotynina i leupeptyna.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku "nierozpuszczalnego" buforu do lizy uzupełnij do 4% SDS, dodając 500 μl 20% SDS do 2 ml "rozpuszczalnego" buforu do lizy. Pozostawić w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: SDS wytrąca się, gdy jest przechowywany w temperaturze 4 °C; Utrzymuj to w temperaturze pokojowej. Końcowy skład buforu do lizy: 10 mM Tris (pH 7,4); 1% Triton X-100; 150 mM NaCl; 10% glicerolu; 4% SDS (tylko nierozpuszczalne).</li>
</ol>
2. Protokół frakcjonowania rozpuszczalnego/nierozpuszczalnego
UWAGA: Zobacz schemat Rysunek 1.
<ol>
	<li>Oznacz dwa zestawy probówek dla każdej próbki: "Rozpuszczalny" i "Nierozpuszczalny".</li>
	<li>Dodać X-μl lodowatego rozpuszczalnego buforu do lizy uzupełnionego inhibitorami proteazy (patrz 1.1.1) do tkanki. 
	UWAGA: X = objętość różni się w zależności od ilości tkanki; Patrz tabela 1.</li>
	<li>W przypadku tkanki mózgowej myszy (tj. prążkowia) zanurz powoli 30 razy w szklanym wykieliszku o pojemności 1 ml i odpipetuj do probówki oznaczonej jako "Nierozpuszczalne" (przechowywać na lodzie). 
	UWAGA: Należy uważać, aby nie naruszyć powierzchni cieczy po rozpoczęciu zanurzania, ponieważ utworzą się pęcherzyki, które mogą spowodować niepełną homogenizację.</li>
	<li>W przypadku komórek (np. HeLa, HEK293T), przepłucz ogniwa raz zimnym, 1x PBS. Usunąć PBS i nałożyć minimalną objętość buforu do lizy na komórki i podnieść za pomocą skrobaka do komórek. 
	UWAGA: W przypadku powyższych linii komórkowych komórki zostały posiane w proporcji 5 x 105 komórek na płytkę 6-dołkową i wyhodowane do prawie konfluencji. Jedna studzienka jest porównywalna z objętościami używanymi do prążkowia myszy.</li>
	<li>Przenieść homogenat lub lizat komórkowy do oznakowanych, "nierozpuszczalnych" probówek i lizować na lodzie 1 godzinę (Rozpocznij zegar po przetworzeniu ostatniej probówki). 
	UWAGA: W przypadku lizatów komórkowych należy kilkakrotnie rozcierać, aby rozbić grudki komórek przed rozpoczęciem inkubacji. Unikaj tworzenia się pęcherzyków. Krótko pulsuj wirowo każdą próbkę przez 1 s w połowie lizy.</li>
	<li>Odwirować próbki w temperaturze 4 °C przy 15 000 x g przez 20 minut.</li>
	<li>Odzyskać supernatant jako frakcję "rozpuszczalną".
	<ol>
		<li>Usuń pipetą, uważając, aby nie naruszyć warstwy granulek/mętnej warstwy, ponieważ spowoduje to zanieczyszczenie frakcji. Odpipetować frakcję rozpuszczalną do probówki z etykietą "Rozpuszczalne". Trzymaj na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przepłukać osad 500 μl buforu do lizy (x2) i odwirować w temperaturze 4 °C przy 15 000 x g przez 5 minut po każdym płukaniu; nie ma nic złego w tym, że część mętnej warstwy zostanie odpipetowana.</li>
	<li>Po końcowym umyciu usuń CAŁY pozostały bufor do płukania, pozostawiając tylko granulkę chusteczek. 
	UWAGA: Od tego momentu nierozpuszczalne próbki należy teraz przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zawiesić osad za pomocą buforu do lizy X-μL uzupełnionego 4% SDS (objętość można regulować w zależności od wielkości osadu; patrz Tabela 1).</li>
	<li>Sonikuj każdą próbkę przez 30 s w temperaturze pokojowej za pomocą sonografu sonicznego (125 watów, 20 kHz, impuls, amplituda 40%, patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Gotować próbki (gotowanie walcowania) przez 30 minut; Odwirować krótko (15 s) przy 6 000 x g, aby nie stracić żadnej próbki.</li>
	<li>Wykonać test białka DC (kompatybilny z detergentem) (patrz tabela materiałów) lub test białka Lowry'ego w celu zmierzenia stężenia białka (zalecane rozpoczęte rozcieńczenia 1/5 próbki w odpowiednim buforze do lizy dla hodowli komórkowej i 1/10 dla lizatów tkankowych). 
	UWAGA: Stężenia białek będą musiały być odczytywane za pomocą testu DC lub Lowry'ego ze względu na wysokie stężenie detergentu.</li>
	<li>Porcjuj próbki na partie o objętości 50 μl, aby uniknąć problemów z zamrażaniem i rozmrażaniem. 
	UWAGA: Protokół można w tym miejscu wstrzymać przed dalszą analizą biochemiczną, przechowując obie frakcje w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
3. Western Blot i kwantyfikacja
<ol>
	<li>Wykonaj western blot, jak podano w innym miejscu1,13 rozcieńczając 30 μg próbki 1:1 w buforze ładującym (1,6x barwnik ładujący, 1x redukujący). 
	UWAGA: 30 μg białka na frakcję jest wystarczające, ale można je dostosować w celu uzyskania optymalnej rozdzielczości. Do frakcji nierozpuszczalnej należy stosować 3 - 8% żeli poliakrylamidowych Tris-Acetate. Do frakcji rozpuszczalnej zalecane są 4 - 12% żeli Bis-Tris.</li>
	<li>Gotować próbki (gotowanie walcowania) przez 5 minut. Krótko odwirować (15 s) przy 6 000 x g w celu pobrania próbki.</li>
	<li>Analizuj frakcje za pomocą SDS-PAGE i western blot, zgodnie z protokołem producenta dla próbek zredukowanych. 
	UWAGA: Frakcja nierozpuszczalna najlepiej rozpuszcza się po przeniesieniu na membranę nitrocelulozową 0,45 μM. Do frakcji rozpuszczalnej można użyć nitrocelulozy 0,45 lub 0,2 μM, w zależności od wielkości białka będącego przedmiotem zainteresowania. W celu uzyskania najlepszego transferu materiałów HMW może być wymagana pewna optymalizacja.</li>
	<li>Błona barwiąca z barwieniem całych białek (np. MEMcode, patrz tabela materiałów) w celu wizualizacji efektywności ładowania białka. 
	UWAGA: Western blot można analizować za pomocą średniej intensywności pikseli. Frakcje rozpuszczalne można znormalizować do białka gospodarstwa domowego, które najlepiej nadaje się do systemu eksperymentalnego. Frakcję nierozpuszczalną jako względną obfitość białka zweryfikowano za pomocą odwracalnego barwienia białek lub normalizacji histonu 3 na oddzielnym blot.</li>
</ol>

<ol><li>Ochaba, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIAS1+Regulates+Mutant+Huntingtin+Accumulation+and+Huntington%27s+Disease-Associated+Phenotypes+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">PIAS1 Regulates Mutant Huntingtin Accumulation and Huntington's Disease-Associated Phenotypes In Vivo.</a> Neuron. 90 (3), 507-520 (2016).</li>
<li>La Spada, A. R., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeat+expansion+disease%3A+progress+and+puzzles+in+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Repeat expansion disease: progress and puzzles in disease pathogenesis.</a> Nat Rev Genet. 11 (4), 247-258 (2010).</li>
<li>Reiner, A., Dragatsis, I., Dietrich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+and+neuropathology+of+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Genetics and neuropathology of Huntington's disease.</a> Int Rev Neurobiol. 98, 325-372 (2011).</li>
<li>The Huntington's Disease Collaborative Research Group. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+gene+containing+a+trinucleotide+repeat+that+is+expanded+and+unstable+on+Huntington%27s+disease+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes.</a> Cell. 72 (6), 971-983 (1993).</li>
<li>Sassone, J., Colciago, C., Cislaghi, G., Silani, V., Ciammola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington%27s+disease%3A+the+current+state+of+research+with+peripheral+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Huntington's disease: the current state of research with peripheral tissues.</a> Exp Neurol. 219 (2), 385-397 (2009).</li>
<li>Weydt, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermoregulatory+and+metabolic+defects+in+Huntington%27s+disease+transgenic+mice+implicate+PGC-1alpha+in+Huntington%27s+disease+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Thermoregulatory and metabolic defects in Huntington's disease transgenic mice implicate PGC-1alpha in Huntington's disease neurodegeneration.</a> Cell Metab. 4 (5), 349-362 (2006).</li>
<li>Schulte, J., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biological+function+of+the+Huntingtin+protein+and+its+relevance+to+Huntington%27s+Disease+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Trends+Neurol%22%5BJournal%5D)">The biological function of the Huntingtin protein and its relevance to Huntington's Disease pathology.</a> Curr Trends Neurol. 5, 65-78 (2011).</li>
<li>Gipson, T. A., Neueder, A., Wexler, N. S., Bates, G. P., Housman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrantly+spliced+HTT%2C+a+new+player+in+Huntington%27s+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Aberrantly spliced HTT, a new player in Huntington's disease pathogenesis.</a> RNA Biol. 10 (11), 1647-1652 (2013).</li>
<li>Neueder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenic+exon+1+HTT+protein+is+produced+by+incomplete+splicing+in+Huntington%27s+disease+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The pathogenic exon 1 HTT protein is produced by incomplete splicing in Huntington's disease patients.</a> Sci Rep. 7 (1), 1307(2017).</li>
<li>Arndt, J. R., Chaibva, M., Legleiter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+the+first+17+amino+acids+of+huntingtin+in+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomol+Concepts%22%5BJournal%5D)">The emerging role of the first 17 amino acids of huntingtin in Huntington's disease.</a> Biomol Concepts. 6 (1), 33-46 (2015).</li>
<li>Saudou, F., Finkbeiner, S., Devys, D., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+acts+in+the+nucleus+to+induce+apoptosis+but+death+does+not+correlate+with+the+formation+of+intranuclear+inclusions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Huntingtin acts in the nucleus to induce apoptosis but death does not correlate with the formation of intranuclear inclusions.</a> Cell. 95 (1), 55-66 (1998).</li>
<li>Kim, S., Kim, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+Approaches+for+Inhibition+of+Protein+Aggregation+in+Huntington%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic Approaches for Inhibition of Protein Aggregation in Huntington's Disease.</a> Exp Neurobiol. 23 (1), 36-44 (2014).</li>
<li>O'Rourke, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO-2+and+PIAS1+modulate+insoluble+mutant+huntingtin+protein+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">SUMO-2 and PIAS1 modulate insoluble mutant huntingtin protein accumulation.</a> Cell Rep. 4 (2), 362-375 (2013).</li>
<li>Shibata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+intracellular+accumulation+of+mutant+Huntingtin+by+Beclin+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of intracellular accumulation of mutant Huntingtin by Beclin 1.</a> J Biol Chem. 281 (20), 14474-14485 (2006).</li>
<li>Apostol, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-based+assay+for+aggregation+inhibitors+as+therapeutics+of+polyglutamine-repeat+disease+and+validation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A cell-based assay for aggregation inhibitors as therapeutics of polyglutamine-repeat disease and validation in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5950-5955 (2003).</li>
<li>Wanker, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+filter+assay+for+detection+of+amyloid-like+polyglutamine-containing+protein+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Membrane filter assay for detection of amyloid-like polyglutamine-containing protein aggregates.</a> Methods Enzymol. 309, 375-386 (1999).</li>
<li>Sontag, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Mutant+Huntingtin+Aggregation+Conformers+and+Modulation+of+SDS-Soluble+Fibrillar+Oligomers+by+Small+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Huntingtons+Dis%22%5BJournal%5D)">Detection of Mutant Huntingtin Aggregation Conformers and Modulation of SDS-Soluble Fibrillar Oligomers by Small Molecules.</a> J Huntingtons Dis. 1 (1), 119-132 (2012).</li>
<li>Grima, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+Huntingtin+Disrupts+the+Nuclear+Pore+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mutant Huntingtin Disrupts the Nuclear Pore Complex.</a> Neuron. 94 (1), 93-107 (2017).</li>
<li>Sontag, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylene+blue+modulates+huntingtin+aggregation+intermediates+and+is+protective+in+Huntington%27s+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Methylene blue modulates huntingtin aggregation intermediates and is protective in Huntington's disease models.</a> J Neurosci. 32 (32), 11109-11119 (2012).</li>
<li>Trushina, E., Rana, S., McMurray, C. T., Hua, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tricyclic+pyrone+compounds+prevent+aggregation+and+reverse+cellular+phenotypes+caused+by+expression+of+mutant+huntingtin+protein+in+striatal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tricyclic pyrone compounds prevent aggregation and reverse cellular phenotypes caused by expression of mutant huntingtin protein in striatal neurons.</a> BMC Neurosci. 10, 73(2009).</li>
<li>Shahmoradian, S. H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23853712">TRiC's tricks inhibit huntingtin aggregation.</a> Elife. 2, e00710(2013).</li>
<li>Kim, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteasome+inhibition+induces+alpha-synuclein+SUMOylation+and+aggregate+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">Proteasome inhibition induces alpha-synuclein SUMOylation and aggregate formation.</a> J Neurol Sci. 307 (1-2), 157-161 (2011).</li>
<li>Goldberg, N. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Neural+Progenitor+Transplantation+Rescues+Behavior+and+Reduces+alpha-Synuclein+in+a+Transgenic+Model+of+Dementia+with+Lewy+Bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Human Neural Progenitor Transplantation Rescues Behavior and Reduces alpha-Synuclein in a Transgenic Model of Dementia with Lewy Bodies.</a> Stem Cells Transl Med. 6 (6), 1477-1490 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W przypadku powyższych protokołów potrzebne są pewne środki ostrożności, aby zapewnić spójne i ilościowe wyniki. Po pierwsze, mHTT w obu frakcjach będzie spontanicznie tworzyć agregaty w czasie po wielu cyklach zamrażania i rozmrażania, szczególnie w wysokim stężeniu. W związku z tym bardzo ważne jest zamrożenie podwielokrotności preparatów białkowych i rozmrożenie tylko potrzebnej objętości przed uruchomieniem testu, jak opisano w powyższym protokole. Ponadto, jeśli frakcja nierozpuszczalna daje biały osad po rozmrożeni...

Zakłócenie sieci kontroli jakości białek, które zapewniają prawidłowe fałdowanie i degradację białek komórkowych, jest prawdopodobnie kluczowe dla patologii w chorobie Alzheimera (AD), chorobie Parkinsona (PD), chorobie Huntingtona (HD) i innych zaburzeniach związanych z "nieprawidłowym fałdowaniem białek"2,3. Szczegółowe zrozumienie komponentów sieci proteostazy i ich wkładu w patologię ma zatem kluczowe znaczenie dla opracowania ulepszonych interwencji terapeutycznych. Choroba Huntingtona jest spowodowana nieprawidłowym rozszerzaniem się powtórzeń CAG w obrębie genu HD, co skutkuje rozszerzonym odcinkiem poliglutaminy (polyQ) w białku huntingtyny (HTT)4. Stałą patologiczną cechą patogenezy HD jest wynikające z tego nieprawidłowe fałdowanie, akumulacja i agregacja HTT w obszarach mózgu i tkankach obwodowych, co wykazano, że zakłóca na kilka sposobów normalną homeostazę i funkcję komórek5,6. Podczas gdy HTT jest powszechnie eksprymowany, średnie neurony kolczaste w prążkowiu są selektywnie wrażliwe i najbardziej jawnie dotknięte zauważalnym zanikiem kory mózgowej związanym również z patogenezą HD.
Tworzenie agregatów HTT w mózgu pacjentów z HD i modelach zwierzęcych zazwyczaj służyło jako wskaźnik progresji choroby i dominująco-ujemnego przyrostu funkcji dla mHTT7. Chociaż dokładne mechanizmy, za pomocą których nieprawidłowe fałdowanie i agregacja białek mogą przyczyniać się do toksyczności indukowanej przez mHTT, pozostają niejasne, powstawanie tych inkluzji w mózgach pacjentów z HD i różnych modelach zwierzęcych jest cechą niezmienniczą i nieuniknioną. Inkluzje wydają się składać głównie z nagromadzonych fragmentów HTT zawierających N-końcowy ekspandowany polyQ, co wskazuje, że proteoliza i przetwarzanie pełnej długości HTT, a także alternatywne splicing8,9 mogą odgrywać ważną rolę w patogenezie HD. N-końcowe fragmenty HTT mogą stanowić patologiczną formę HTT, która może szybko agregować, nukleować i przyspieszać lub propagować proces agregacji10.
Jednak obecność tych inkluzji niekoniecznie koreluje z toksycznością wywołaną przez HTT lub śmiercią komórki11. Zaproponowano, aby HTT został poddany procesowi agregacji od rozpuszczalnego monomeru przez rozpuszczalne gatunki oligomeryczne i włókienka β-arkuszowe do nierozpuszczalnych agregatów i inkluzji12. Oddzielenie tych różnych gatunków białek za pomocą standardowych testów biochemicznych było wyzwaniem w tej dziedzinie ze względu na ich stabilność w buforze do lizy o niskiej zawartości detergentów i trudności w wizualizacji przy użyciu standardowych testów biochemicznych. W związku z tym względy metodologiczne mają kluczowe znaczenie dla wykrywania stopnia i wzorca skumulowanego i zagregowanego mHTT.
Przedstawiony tutaj protokół dostarcza metody wizualizacji kilku produktów pośrednich HTT, w szczególności tworzenia nierozpuszczalnego gatunku HMW HTT, który wydaje się ściśle śledzić patogenezę HD i postęp choroby1,13,14. Zdolność do rozpoznawania i śledzenia wielu gatunków mHTT zapewnia naukowcom biochemiczne narzędzie do badania patogenezy choroby i oceny potencjalnych interwencji terapeutycznych poprzez ich modulację i wpływ na patogenezę choroby.

<table><tbody><tr><td>Sterylny filtr</td><td>Millipore</td><td>SCGP505RE</td><td>Zakrętka, sterylny filtr próżniowy</td></tr><tr><td>1 ml Młynek do tkanek, Dounce</td><td>Wheaton</td><td>357538</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>Model Q125</td><td></td></tr><tr><td>DC Test białka</td><td>Biorad</td><td>5000111</td><td>Porównywalny z testem Lowry'ego</td></tr><tr><td>Roztwór buforowy Tris 1M</td><td>Alfa Aesar</td><td>J60636</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl 5M roztwór</td><td>Teknova</td><td>S0251</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>20% roztwór SDS</td><td>Teknova</td><td>S0295</td><td></td></tr><tr><td>N-etylomaleimid</td><td>Sigma</td><td>E1271</td><td></td></tr><tr><td>Fluorek fenylometylosulfonu</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td>utwórz 100mM roztwór podstawowy w 100% EtOH, przechowywać w 4&deg; C</td></tr><tr><td>Ortowanadan sodu</td><td>Sigma</td><td>S6508</td><td>Stwórz 0,5 M roztwór podstawowy w wodzie</td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td>Stwórz 10 mg / ml roztworu podstawowego w wodzie</td></tr><tr><td>Aprotynina</td><td>Sigma</td><td>A1153</td><td>Stwórz 10 mg / ml roztworu podstawowego w wodzie</td></tr><tr><td>Fluorek sodu</td><td>Sigma</td><td>S4504</td><td>Utwórz 500 mM roztwór podstawowy w wodzie</td></tr><tr><td>Anti-HTT</td><td>Millipore</td><td>MAB5492</td><td>Użyj 1:1000 dla western blot, 1:500 dla testu opóźnienia filtra</td></tr><tr><td>Anti-GAPDH</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-56875</td><td>Użyj 1:1000 dla rozpuszczalnego western blot</td></tr></tbody></table>

frakcjonowanie w celu rozdzielenia rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych gatunków huntingtyny

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

Nagromadzenie nieprawidłowo sfałdowanych białek jest kluczowe dla patologii w chorobie Huntingtona (HD) i wielu innych zaburzeniach neurodegeneracyjnych. W szczególności, kluczową cechą patologiczną choroby Huntingtona jest nieprawidłowa akumulacja zmutowanego białka HTT (mHTT) w kompleksy o wysokiej masie cząsteczkowej i wewnątrzkomórkowe ciała inkluzyjne złożone z fragmentów i innych białek. Konwencjonalne metody pomiaru i zrozumienia udziału różnych form agregatów zawierających mHTT obejmują mikroskopię fluorescencyjną, analizę western blot i testy pułapek filtracyjnych. 
Jednak większość z tych metod jest specyficzna dla konformacji, a zatem może nie rozwiązać pełnego stanu strumienia białka mHTT ze względu na złożoną naturę łącznej rozpuszczalności i rozdzielczości.
Do identyfikacji zagregowanych mHTT oraz różnych zmodyfikowanych form i kompleksów, separacja i solubilizacja agregatów i fragmentów komórkowych jest obowiązkowa. Tutaj opisujemy metodę izolacji i wizualizacji rozpuszczalnych mHTT, monomerów, oligomerów, fragmentów i nierozpuszczalnych gatunków mHTT o dużej masie cząsteczkowej (HMW). HMW mHTT śledzi postęp choroby, odpowiada odczytom zachowania myszy i jest korzystnie modulowany przez pewne interwencje terapeutyczne1. Podejście to może być stosowane w przypadku mózgu myszy, tkanek obwodowych i hodowli komórkowych, ale może być dostosowane do innych systemów modelowych lub kontekstów chorobowych.

Rozdział rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych lizatów komórkowych po frakcjonowaniu można wykryć za pomocą analizy western i testów retardacji na filtrach (Rysunek 2). Przykładowo, komórki HEK293T zostały transfektowane przy użyciu odczynnika do transfekcji (np. lipofectamine 2000) cDNA kodującym ekson 1 HTT zawierający 97 powtórzeń glutaminy15 oraz następujący po nim region bogaty w poliprolinę, a następnie pozostawiono komór...

Opisano metodę frakcjonowania nierozpuszczalnych i rozpuszczalnych gatunków zmutowanej huntingtyny z hodowli mózgów i komórek myszy. Opisana metoda jest przydatna do charakterystyki i kwantyfikacji strumienia białka huntingtyny oraz pomaga w analizie homeostazy białek w patogenezie choroby i w obecności zaburzeń

Frakcjonowanie w celu rozdzielenia rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych gatunków huntingtyny

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

Ogólnym celem tej procedury jest opisanie użytecznego narzędzia do wizualizacji, charakterystyki i kwantyfikacji strumienia białka huntingtyny do analizy homeostazy białek w modelowych systemach choroby Huntingtona. Metoda ta może pomóc nam zrozumieć pytania dotyczące homeostazy białek i chorób neurodegeneracyjnych, takie jak zrozumienie wpływu niektórych interwencji terapeutycznych na patogenezę choroby. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala badaczom na wyizolowanie i rozdzielenie nierozpuszczalnych gatunków białek do analizy ilościowej.Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat zmian biochemicznych zachodzących w patogenezie choroby Huntingtona, może być również stosowana w innych chorobach związanych z nieprawidłowym fałdowaniem białek, takich jak choroba Parkinsona i Alzheimera. Aby rozpocząć tę procedurę, należy oznaczyć dwa zestawy probówek dla każdej próbki jako rozpuszczalne i nierozpuszczalne. Przygotować bufor do lizy bezpośrednio przed lizą próbki w probówce rozpuszczalnej, dodając odpowiednią ilość inhibitorów.Następnie dodaj do tkanki lodowaty rozpuszczalny bufor do lizy uzupełniony inhibitorami proteazy. W przypadku tkanki mózgowej myszy powoli odskakuj 30 razy w szklanym doczaczu o pojemności jednego mililitra. Należy uważać, aby nie złamać powierzchni cieczy, ponieważ utworzą się pęcherzyki, które mogą spowodować niepełną homogenizację.Następnie odpipetować go do nierozpuszczalnej probówki na lodzie. W przypadku linii komórkowych komórki zostały posiane w proporcji od pięciu do 10 do piątych komórek na każdej sześciodołkowej płytce i wyhodowane do prawie konfluencji. Następnie przepłucz komórki raz zimnym 1X PBS i usuń go.Następnie nałóż minimalną objętość buforu do lizy na komórki i podnieś je za pomocą skrobaka do komórek. Następnie przenieś homogenat lub lizat komórkowy do oznakowanej nierozpuszczalnej probówki i liza na lodzie przez godzinę. W przypadku lizatów komórkowych należy kilkakrotnie rozcierać, aby rozbić grudki komórek przed rozpoczęciem inkubacji i uniknąć tworzenia pęcherzyków.Krótko pulsuj wir każdej próbki przez jedną sekundę w połowie lizy. Następnie odwirować próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy 15 000 x g przez 20 minut. Następnie usunąć supernatant.Uważaj, aby nie naruszyć osadu lub mętnej warstwy, ponieważ spowoduje to zanieczyszczenie frakcji. Odpipetować supernatant w postaci frakcji rozpuszczalnej do probówki znakowanej rozpuszczalnym i trzymać na lodzie. Kluczowe znaczenie ma śledzenie rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych do lizy.Zamiana lub umieszczenie nierozpuszczalnego buforu lub próbek na lodzie będzie miało negatywny wpływ na wynik protokołu. Przemyć osad 500 mikrolitrami buforu do lizy i odwirować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy 15 000 x g przez pięć minut. Powtórz pranie jeszcze raz.Następnie usuń cały pozostały bufor do płukania, pozostawiając tylko osad tkanki. Następnie ponownie zawiesić osad za pomocą buforu do lizy uzupełnionego o 4%SDS. Poddaj każdą próbkę sonikacji przez 30 sekund w temperaturze pokojowej za pomocą sonografu sondowego.Sonikowanie małych objętości przez długi czas jest technicznie trudne. Uważaj, aby nie stracić próbki przez emulgowanie lub rozpylanie podczas wykonywania tego kroku. Następnie gotuj próbki przez 30 minut.Następnie odwirować je krótko w temperaturze 6 000 x g. Następnie wykonaj test białka kompatybilny z detergentem lub test białka Lowry'ego, aby zmierzyć stężenie białka. Następnie podziel próbki na partie o objętości 50 mikrolitrów, aby uniknąć problemów z zamarzaniem/rozmrażaniem.Na tym etapie należy wykonać western blot, rozcieńczając 30 mikrogramów próbki w stosunku jeden do jednego w buforze ładującym. Gotować próbki przez pięć minut i krótko je odwirować w temperaturze 6 000 x g. Następnie przeanalizuj ułamki według strony SDS i western blot.Zabarwić błonę barwnikiem z całych białek, aby uwidocznić wydajność ładowania białka. Oto rozpuszczalne i nierozpuszczalne frakcje z lizatów komórkowych HEK 293T rozdzielonych odpowiednio na żelach 4-12% Bis-Tris i 3-8% Tris-Acetate. Frakcja rozpuszczalna znormalizowana do kontroli obciążenia GAPDH wykazuje fluktuację zmutowanego monomeru rozpuszczalnego w eksonie huntingtyny 1 w oparciu o ekspozycję na inhibitor proteazy MG132.Frakcja nierozpuszczalna pokazuje, że nagromadzone gatunki zmutowanej huntingtyny o dużej masie cząsteczkowej są również modulowane przez leczenie MG132. A oto próbki rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych frakcji z lizatów komórkowych HeLA przy użyciu analizy western blot i opóźnienia filtra. Dane pokazują, że obecność nadmiernie eksprymowanej izoformy SUMO zwiększa zarówno mutanta o wysokiej masie cząsteczkowej, jak i fibrylarnie nierozpuszczalnego mutanta huntingtyny we frakcji nierozpuszczalnej.Rysunek ten pokazuje regulację akumulacji zmutowanej huntingtyny o wysokiej masie cząsteczkowej po modulowaniu potencjalnej terapii w nierozpuszczalnym frakcjonowaniu z komórek HeLa nad ekspresją eksonu 97Q huntingtyny 1. Cel terapeutyczny PIAS1 został wyciszony za pomocą siRNA w kierunku PIAS1 lub poddany nadmiernej ekspresji. Nierozpuszczalne frakcje z prążkowia myszy potraktowanego mikroRNA przeciwko PIAS1 i rozdzielonego na 3-8% żelach stronniczych Tris-Acetate wykazują modulację nierozpuszczalnej huntingtyny o wysokiej masie cząsteczkowej.Nie zapominaj, że praca z NEM może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tego protokołu należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie maski na twarz. Po opanowaniu tę technikę od lizatu do końca frakcjonowania można wykonać w ciągu około trzech do czterech godzin, w zależności od liczby próbek. Należy przeznaczyć dodatkową godzinę na kwantyfikację białka i podanie.Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak elektroforeza w żelu agarozowym lub opóźnienie filtra, w celu wykrycia odpowiednio rozpuszczalnych oligomerów lub nierozpuszczalnych włókienek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować i rozwiązywać nierozpuszczalne, nieprawidłowo sfałdowane białka do analizy ilościowej.

fractionation-for-resolution-soluble-insoluble-huntingtin

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W niniejszej pracy opisujemy protokół oczyszczania wysoce aktywnego białka Hsp104, heksamerycznego białka AAA+ z drożdży, które sprzęga hydrolizę ATP z disagregacją białek. Schemat ten wykorzystuje konstrukt z oznakowaniem His6 do oczyszczania powinowactwa z E. coli, a następnie chromatografię wymiany anionowej, usunięcie znacznika His6 za pomocą proteazy TEV oraz chromatografię wykluczania cząsteczkowego.

Oczyszczanie Hsp104, białkowej dysagregazy

Ten film demonstruje protokół izolacji włókienek amyloidu z ekstraktu tkanki mózgowej myszy za pomocą wirowania gradientu gęstości i trawienia białek nieamyloidowych.

Izolacja włókien amyloidowych z ekstraktu z tkanki mózgowej

Tutaj prezentujemy protokół frakcjonowania błony mózgowej, który stanowi solidną procedurę izolowania białek należących do różnych przedziałów synaptycznych.

Frakcjonowanie błony mózgowej: podejście ex vivo do oceny lokalizacji białek subsynaptycznych

Opisany jest skrócony protokół frakcjonowania do wzbogacania nierozpuszczalnych w detergentach agregatów białkowych z ludzkiego mózgu pośmiertnego.

Wzbogacanie nierozpuszczalnych w detergentach agregatów białkowych z ludzkiego mózgu pośmiertnego

Przedstawiono procedurę ponownego fałdowania domeny wiążącej ligand peryplazmatyczny dCACHE chemoreceptora Campylobacter jejuni Tlp3 z ciał inkluzyjnych i oczyszczania w celu uzyskania miligramowych ilości białka.

Metoda skutecznego ponownego fałdowania i oczyszczania domeny wiążącej ligand chemoreceptora

Tutaj prezentujemy solidny i zoptymalizowany protokół produkcji miligramowych ilości natywnych, bezznacznikowych monomerów i włókienek eksonu1 białka huntingtyny (Httex1) w oparciu o przejściową fuzję małego modyfikatora związanego z ubikwityną (SUMO).

Generowanie natywnego, nieznakowanego monomeru i włókien eksonu huntingtyny1 przy użyciu strategii fuzji SUMO

Ekspresja i oczyszczanie białek zawierających hydrolazę hydrolazy fumaryloacetooctanu jest opisane przykładami (ekspresja w E. coli, FPLC). Oczyszczone białka są używane do krystalizacji i produkcji przeciwciał oraz wykorzystywane do testów enzymatycznych. Przedstawiono wybrane testy fotometryczne w celu wykazania wielofunkcyjności FAHD1 jako dekarboksylazy szczawiooctanu i hydrolazy acylopirogronianowej.

Ekspresja, oczyszczanie, krystalizacja i oznaczanie enzymatyczne białek zawierających hydrolazę hydrolazy fumaryloacetooctanu

Prezentujemy technikę szybkiej stabilizacji kompleksów translacyjnych (biosyntezy białek) za pomocą sieciowania formaldehydem w żywych komórkach drożdży i ssaków. Podejście to umożliwia analizę przejściowych produktów pośrednich i dynamicznych interakcji RNA-białko. Usieciowane kompleksy mogą być wykorzystywane w wielu dalszych zastosowaniach, takich jak metody profilowania oparte na głębokim sekwencjonowaniu, mikroskopia i spektrometria mas.

Szybkie utrwalanie in vivo i izolacja kompleksów translacyjnych z komórek eukariotycznych

Zapewniamy skalowalne protokoły obejmujące projektowanie konstrukcji, transfekcję przejściową oraz ekspresję i oczyszczanie pełnowymiarowych wariantów ludzkiego białka huntingtyny w komórkach HEK293.

Wydajna i skalowalna produkcja pełnowymiarowych wariantów ludzkiej huntingtyny w komórkach ssaków przy użyciu systemu ekspresji przejściowej

Ten protokół opisuje, jak ekstrahować białko 1 zawierające hydrolazę hydrolazy fumaryloacetooctanu (FAHD1) z nerki świni i wątroby myszy. Wymienione metody mogą być dostosowane do innych białek będących przedmiotem zainteresowania i zmodyfikowane dla innych tkanek.

Ekstrakcja i oczyszczanie białka FAHD1 z nerki świń i wątroby myszy

Ten protokół przedstawia solidną, szczegółową metodę uzyskiwania wysoce czystych synaptosomów, pęcherzyków synaptycznych i innych frakcji synaptycznych z mózgu myszy. Metoda ta umożliwia ocenę procesów synaptycznych, w tym analizę biochemiczną lokalizacji i funkcji białek z rozdzielczością kompartmentową.

Frakcjonowanie subkomórkowe w celu wyizolowania składników synaptycznych z mózgu myszy

Poznaj metodę frakcjonowania białka huntingtyny w mózgu myszy i kulturach komórkowych. Technika umożliwia izolację i analizę ilościową rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych gatunków białkowych, wspierając badania homeostazy białek w chorobie Huntingtona oraz innych chorobach neurodegeneracyjnych.

Frakcjonowanie w celu rozdzielenia rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych gatunków huntingtyny

Przeglądaj więcej filmów