Obrazowanie pośrednich włókien i mikrotubul za pomocą 2-wymiarowej bezpośredniej stochastycznej mikroskopii rekonstrukcji optycznej

Ogólnym celem tej metodologii jest stworzenie optymalnych warunków eksperymentalnych od przygotowania próbki po akwizycję i rekonstrukcję obrazu w celu wykonania dwukolorowego obrazowania D-STORM 2D mikrotubul i włókien pośrednich w komórkach stałych. Metoda ta może pomóc w scharakteryzowaniu fizycznych interakcji między gęstymi i złożonymi sieciami cytoszkieletu, takimi jak włókna pośrednie i mikrotubule. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na obserwację struktur komórkowych, które nie są rozdzielone za pomocą konwencjonalnej mikroskopii fluorescencyjnej.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ kontrola przygotowania próbek i pozyskiwania danych łączących szaty ma kluczowe znaczenie w celu ograniczenia generowania artefaktów. Po wyhodowaniu komórek U373 zgodnie z protokołem tekstowym, napraw komórki, najpierw używając PBS, aby je raz umyć. Następnie usuń PBS i dodaj jeden mililitr na studzienkę podgrzanego roztworu do utrwalania ekstrakcyjnego.

Inkubuj komórki w temperaturze pokojowej przez 60 sekund. Następnie usuń roztwór i dodaj jeden mililitr na studzienkę świeżo przygotowanego i podgrzanego 4% PFA rozcieńczonego w buforze cytoszkieletu. Umieścić 12-dołkową płytkę z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 10 minut.

Następnie usuń PFA i dodaj trzy mililitry PBS na studzienkę. Użyj PBS, aby dwukrotnie umyć komórki. Następnie usunąć PBS i dodać świeżo przygotowany 10-milimolowy borowodorek sodu rozcieńczony w PBS w celu wygaszenia autofluorescencji z aldehydu glutarowego.

Inkubuj komórki w temperaturze pokojowej przez siedem minut i przenieś odzyskany borowodorek sodu do specjalnego pojemnika. Użyj PBS, aby umyć studzienki trzy razy przez pięć minut każda. Następnie usuń PSB i dodaj 5%BSA w PBS jako rozwiązanie blokujące.

Po barwieniu immunologicznym próbek i przygotowaniu roztworów w zgodnie z protokołem tekstowym, zamontuj szkiełko nakrywkowe zawierające znakowane komórki na magnetycznym uchwycie na próbkę. I dodaj bufor obrazowania, aby całkowicie wypełnić komorę. Nałóż pokrywę i upewnij się, że między buforem obrazowania a pokrywą nie ma pęcherzyków powietrza.

Używając etanolu absolutnego, oczyść spód próbki i sprawdź, czy nie ma wycieków. Następnie, jeśli to konieczne, użyj smaru, aby prawidłowo uszczelnić uchwyt próbki. Aby przeprowadzić obrazowanie, włącz mikroskop i oprogramowanie do akwizycji.

Ustaw parametry akwizycji zgodnie z protokołem tekstowym, korzystając ze 100-krotnego obiektywu NA 1.46, 1,6-krotnego obiektywu Optivar i trybu TIRF UHP. Utwórz ścieżkę 647, aby zobrazować włókna wimentyny oznaczone za pomocą Alexa Fluor 647. Wybierz linie laserowe 405 i 642 nanometry oraz filtr emisji LP 655.

Następnie utwórz ścieżkę 555, aby zobrazować mikrotubule oznaczone za pomocą Alexa Fluor 555. Wybierz linie laserowe o długości fali 561, 488 i 405 nanometrów, aby zobrazować fluorofory i filtr emisyjny BP 570 do 650. Następnie dodaj olej do obiektywu i umieść próbkę na soczewce.

Następnie wybierz zakładkę lokalizacji i otwórz przesłonę świetlówki. Znajdź ostrość i użyj okularu, aby wyszukać komórki do zobrazowania. Następnie użyj joysticka, aby ustawić komórki na środku pola.

Kliknij zakładkę pozyskiwania, aby powrócić do trybu pozyskiwania. Następnie wybierz ścieżkę 647 i ustaw moc lasera 642 na 0,2%, a moc lasera 405 na minimalną wartość. Ustaw czas naświetlania na 50 milisekund, a wzmocnienie na 50.

Następnie wybierz tryb ciągłej akwizycji, aby obserwować komórkę na ekranie. Upewnij się, że w polu widzenia znajduje się co najmniej jeden koralik fluorescencyjny. Użyj trybu automatycznego skalowania dla wyświetlania i dostosuj ostrość.

Następnie wykonaj szerokokątny obraz epifluorescencji sieci wimentyny, klikając snap i zapisz obraz. Aby sprawdzić podświetlenie TIRF, kliknij TIRF, naciśnij ciągły, dostosuj parametry akwizycji, aby uzyskać jednorodne pole oświetlenia. Następnie naciśnij snap i zapisz obraz.

Sprawdź ścieżkę 555. Usuń zaznaczenie ścieżki 647 i wybierz ścieżkę 555. Wykonaj obraz epifluorescencji sieci mikrotubul i zapisz go.

Następnie zrób zdjęcie TIRF i zapisz je. Teraz sprawdź tor 647. Odznacz ścieżkę 555 i wybierz ścieżkę 647.

Ustaw wzmocnienie na zero, a czas ekspozycji na 10 milisekund. Następnie naciśnij ciągły. Ustaw moc lasera 642 nm na 100%, aby przepompować większość barwników Alexa 647 do stanu ciemnego.

Gdy fluorofory zaczną migać, zwiększ ekspozycję do 15 milisekund, a wzmocnienie do 300. Użyj trybu wskaźnika zasięgu, aby sprawdzić, czy sygnały pojedynczej cząsteczki nie nasycają kamery, jak wskazuje kolor czerwony. W takim przypadku zmniejszaj wzmocnienie, aż nasycenie zniknie.

Koraliki pozostaną nasycone na początku przejęcia. Naciśnij stop, aby przerwać obserwację komórki. Rozwiń narzędzie do przetwarzania online i kliknij przycisk PALM przetwarzania online, aby wyświetlić obraz STORM podczas akwizycji.

Użyj dziewięciu dla maksymalnego rozmiaru maski i sześciu dla szczytowej intensywności dla szumu. Teraz naciśnij rozpocznij akwizycję. Podczas akwizycji ponownie skoncentruj się na komórce, jeśli to konieczne.

Dostosuj czas ekspozycji i ostatecznie włącz linię laserową 405 nanometrów, zaczynając od 0,001%, aby utrzymać średnią gęstość fluoroforów z minimalną odległością jednego mikrometra między pojedynczymi cząsteczkami. Upewnij się, że szczyt precyzji lokalizacji na histogramie poniżej zrekonstruowanego obrazu jest wyśrodkowany wokół lub poniżej 10 nanometrów. Naciśnij przycisk Stop, aby zakończyć film, gdy zostanie osiągniętych ponad milion lokalizacji.

Zapisz nieprzetworzone dane z akwizycji STORM w formacie CHI. Następnie w narzędziu kanałów zaznacz ścieżkę 555, odznacz ścieżkę 647 i wybierz ścieżkę 555. Następnie naciśnij przycisk ciągły.

Ustaw czas naświetlania na 30 milisekund, a wzmocnienie na zero. Następnie ustaw lasery 488 i 561 na 100%, aby przepompować barwniki Alexa 555 do stanu ciemnego. Użyj trybu oświetlenia HILO.

Gdy fluorofory się wyczerpią, naciśnij stop. Ustaw wzmocnienie na 250 i zmniejsz laser 488 do 50%Użyj wskaźnika zasięgu, aby sprawdzić, czy pojedyncze cząsteczki nie nasycają kamery. W takim przypadku zmniejsz wzmocnienie.

Teraz naciśnij rozpocznij akwizycję. Podczas akwizycji stopniowo zwiększaj wzmocnienie, aby osiągnąć granicę nasycenia. Zwiększaj krok po kroku moc lasera 405 nanometrów, aby aktywować cząsteczki i osiągnąć średnią gęstość w polu widzenia.

Zmniejsz moc lasera 488 nanometrów do 30%, gdy laser 405 wynosi około 15%, a następnie stopniowo zmniejszaj 488, zwiększając moc lasera 405, aby mrugać cząsteczki tak szybko, jak to możliwe i o średniej gęstości. Linia laserowa 488 sprzężona z laserem wzbudzającym 561 o maksymalnej intensywności zwiększa zarówno szybkość włączania, jak i wyłączania fluoroforów, podczas gdy linia laserowa 405 zwiększa tylko szybkość włączania. Przerwij akwizycję, gdy zostanie osiągniętych 500 000 lub więcej lokalizacji lub gdy nie ma już mrugających cząsteczek.

Następnie zapisz nieprzetworzone dane z akwizycji STORM w formacie CZI. Aby przeprowadzić rekonstrukcję obrazu za pomocą narzędzia PAL-Drift, należy wybrać typ korekcji oparty na modelu z automatycznymi segmentami o maksymalnym rozmiarze ośmiu. Naciśnij przycisk Apply kilka razy z rzędu, aż dryft zostanie skorygowany.

Ta poprawka oparta na modelu stosuje algorytm oparty na analizie korelacji krzyżowej, który koryguje dryft. Korzystając z narzędzi filtrujących PAL, popraw wygląd obrazu STORM, wybierając tylko te cząsteczki, które były najlepiej zlokalizowane. Na przykład ogranicz precyzję lokalizacji do 30 nanometrów, a PSF do 120 do 180 nanometrów.

Za pomocą narzędzia PAL-Render użyj rozdzielczości pikseli 5 lub 10 nanometrów i parametrów zgodnie z protokołem tekstowym. Wybierz opcję renderuj automatyczny zakres dynamiczny HR z wartością 95% i renderuj automatyczny zakres dynamiczny SWF z wartością 90%. Następnie wybierz najlepszą jakość renderowania.

W menu PALM na karcie przetwarzania wybierz opcję Konwersja PALM. Naciśnij przycisk wybierz, a następnie zastosuj. Na koniec zapisz utworzony obraz w formacie LSM, a nie CZI.

Ten rysunek przedstawia typowy przykład obrazu D-STORM filamentów wimentyny znakowanych immunologicznie za pomocą Alexa 647. Wzrost rozdzielczości można wyraźnie zaobserwować po porównaniu z obrazem uzyskanym za pomocą standardowego mikroskopu szerokokątnego. Profile intensywności fluorescencji przedstawione na tym wykresie pokazują, że obrazowanie mikroskopowe w super rozdzielczości pozwala na rozdzielczość wiązek wimentyny.

Rozdzielczość D-STORM jest wystarczająca do zliczenia liczby filamentów obecnych w wiązkach. Pokazano tutaj typowy przykład dwukolorowego obrazowania D-STORM sieci wimentyny i mikrotubul znakowanych immunologicznie odpowiednio za pomocą Alexa 647 i Alexa 555. Dobre obrazy vimentin powinny mieć co najmniej 5 000 lokalizacji na mikrometr kwadratowy i 2 500 na mikrometr kwadratowy dla mikrotubul.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech dni, jeśli działa prawidłowo. Podejmując próbę wykonania tej procedury, ważne jest, aby dostosować metody utrwalania i parametryzacji do białka, które miałoby być zobrazowane. Na przykład utrwalanie tylko aldehydem glutarowym daje słabe wyniki dla włókien pośrednich, ale jest najlepsze dla utrwalania mikrotubul.

Należy pamiętać, aby używać świeżo przygotowanych próbek i roztworów, zwłaszcza MEA, których pH należy dokładnie dostosować. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią komórki do zbadania morfologii nanoskopowych struktur komórkowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować próbkę, akwizycję obrazu i rekonstrukcję dwukolorowych obrazów 2D D-STORM pośrednich filamentów i mikrotubul.

Nie zapominaj, że praca z niektórymi roztworami, zwłaszcza PFA, NABH4 może być niezwykle niebezpieczna, a środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek, praca pod maską chemiczną i używanie określonych pojemników, powinny być zawsze podejmowane podczas wykonywania tej procedury.