Pobieranie próbek soku łyka z Brassica napus do 3D-PAGE kompleksów białkowych i rybonukleoproteinowych

Ogólnym celem tej procedury 3D-PAGE jest oddzielenie kompleksów białkowych i rybonukleoproteinowych od soku Brassica napus ploem, w połączeniu z identyfikacją odpowiednich kwasów nukleinowych i składników białkowych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biochemii i fizjologii roślin. Na przykład możesz przeanalizować skład kompleksów łyka pod wpływem stresu.

Główną zaletą tej techniki jest to, że można zbierać czysty sok z łyka i jednocześnie analizować kwasy nukleinowe, a także składniki białkowe. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat białek, białek i interakcji białkowych kwasów nukleinowych w systemie łyka rzepaku, można ją również zastosować do analizy łyka innych roślin, takich jak dyniowate, łubin i juka. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy próbowaliśmy zidentyfikować partnerów interakcji białek i RNA dla określonego białka łyka.

Najpierw kilkakrotnie nakłuj kwiatostanową łodygę ośmiotygodniowej rośliny B.napus za pomocą igły podskórnej o średnicy 0,8 milimetra. Nakłuj kilka innych łodyg kwiatostanowych na tej samej roślinie i innych roślinach, aby uzyskać wystarczającą ilość soku łyka. Zetrzyj pierwszą kroplę z każdego zranionego miejsca bibułą filtracyjną.

Po usunięciu pierwszych kropli użyj pipety, aby zebrać pozostałe krople. I przenieś je do wstępnie schłodzonej stożkowej rurki reakcyjnej o pojemności 1,5 mililitra. Następnie przechowuj zebrany wysięk w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza za pomocą systemu chłodzenia bez lodu.

Kontynuuj zbieranie kropli, aż nie zaobserwuje się dalszego tworzenia się kropli, ale nie dłużej niż godzinę. Następnie dodaj próbkę łyka do koncentratora odśrodkowego o masie cząsteczkowej odciętej 10 000 daltonów i zagęścić do około 1/6 początkowej objętości. Następnie odwirować zagęszczoną próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 20 000 g przez co najmniej 15 minut, aby usunąć cząstki pyłu.

Aby wykonać niebieską natywną PAGE, zmontuj komorę żelową. I dodaj ciemnoniebieski bufor katodowy B do połowy i umyj studzienki buforem katody. Załadować od 20 do 30 mikrogramów skoncentrowanej próbki białka na studzienkę do dostępnego na rynku żelu promieniującego Bis-Tris w co najmniej trzech egzemplarzach.

Napełnij komorę buforem katodowym i anodowym i uruchom żel w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 150 woltów, aż próbka przejdzie przez 1/3 żelu, co zajmuje od 20 do 30 minut. Wstrzymaj przebieg wymiany ciemnoniebieskiego bufora katodowego B na jasnoniebieski bufor katodowy B 1/10. Uruchom ponownie bieg i kontynuuj, aż niebieski front zacznie wymywać się z żelu, co trwa od 120 do 180 minut.

Wytnij cały pas żelu z natywnego niebieskiego żelu, a następnie przenieś na nylonową membranę przez półsuche osuszenie i zaznacz ołówkiem górną i dolną granicę żelu na membranie. Po osuszeniu umyj membranę wodą uzdatnioną przez DEPC i umieść między dwoma kawałkami bibuły filtracyjnej do wyschnięcia. Następnie należy wykonać sieciowanie UV osuszonej membrany z przyłożoną energią 120 000 mikrodżuli na centymetr kwadratowy.

Teraz wstępnie zhybrydyzuj usieciowaną membranę UV z sześcioma mililitrami buforu hybrydyzacyjnego przez 60 minut w temperaturze 68 stopni Celsjusza w piecu do hybrydyzacji. Dodaj dodatkowy jeden mililitr buforu hybrydyzacyjnego zawierającego cztery mikrolitry biotynylowanych sond 3-prime do membrany. Następnie inkubuj membranę z sondą przez noc, schładzając piec do hybrydyzacji od 68 do 37 stopni Celsjusza.

Następnego dnia przemyj membranę buforem zawierającym 2x SSC i 0,1% SDS przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby usunąć niespecyficznie związane sondy. Przeprowadzić detekcję biotynylowanych sond 3-prime na membranie za pomocą koniugatu HRP streptawidyny i luminolu jako substratu peroksydazy chrzanowej, co daje czułą reakcję chemiluminescencyjną. Wyciąć pojedyncze pasma z niebieskiego natywnego żelu.

Połącz pasma z próbek biegnących równoległymi torami w stożkowej probówce reakcyjnej o pojemności 1,5 mililitra, aby uzyskać dalsze stężenie złożonych białek. Aby przygotować żel mocznikowy 12%Tris-Tricine, wlej 10 mililitrów roztworu żelu A między dwie szklane płytki i pokryj izopropanolem. Po polimeryzacji usuń izopropanol, dodaj dwa do trzech mililitrów roztworu żelu B do żelu i włóż grzebień z 10 dołkami.

W celu zrównoważenia wyciętych kawałków żelu dodać jeden mililitr buforu do próbki 2x SDS do probówki reakcyjnej. Po inkubacji próbki przez 10 minut w temperaturze pokojowej, ogrzewać w bloku grzewczym w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez około jedną minutę. Następnie inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut.

Następnie ułóż kilka zrównoważonych kawałków żelu reprezentujących ten sam kompleks w jednej kieszeni żelowej. Po zmontowaniu komory żelowej należy przeprowadzić elektroforezę przy użyciu anodowych i katodowych o napięciu 150 woltów przez 45 do 60 minut. Po zakończeniu wytnij cały pas żelowy.

Inkubować pocięty pas żelu przez 20 minut w kwaśnym buforze. Następnie równoważ w 125 milimolowym Tris-HCL o pH 6,8 przez kolejne 20 minut. Wlej 15% roztwór żelu separacyjnego SDS zgodnie z pasem.

Gdy żel zastygnie, usuń izopropanol, dodaj trzy mililitry 4% roztworu żelu do układania w stos i włóż specjalny grzebień do żeli IPG. Po zestaleniu przenieś pas żelu równowagi na żel SDS i przykryj żel 0,5% agarozą w 1x buforze do biegania SDS uzupełnionym śladem błękitu bromofenolowego. Po zmontowaniu komory żelowej uruchom żel pod napięciem 150 woltów przez 60 minut.

Po zakończeniu wybarwić żel koloidalnym roztworem Kumasi do późniejszej analizy spektrometrii mas. Na koniec przeanalizuj widoczne plamki białkowe za pomocą spektrometrii czasu przelotu z desorpcją laserową wspomaganą matrycą. Poniżej przedstawiono reprezentatywny wynik uzyskany z czystej próbki łyka.

W próbkach niezanieczyszczonego łyka widoczne jest pasmo wieku tioredoksyny, natomiast nie obserwuje się sygnału dla RuBisCO i białka płaszcza pyłkowego. Co najmniej cztery główne prążki kompleksu białkowego stają się widoczne po BN PAGE soku łyka B.napus. Zbyt niskie lub zbyt wysokie stężenia soku łyka nie pozwalają na wyraźne rozdzielenie kompleksów.

Separacja w wysokiej rozdzielczości jest obserwowana w 3D PAGE ze względu na różne zachowania związane z migracją białek w żelach mocznikowych i SDS-PAGE. Zazwyczaj białka należące do pojedynczego kompleksu będą widoczne jako ukośna linia w poprzek żelu. Białka powyżej tej linii mają zwiększoną hydrofobowość, podczas gdy białka poniżej linii są bardziej hydrofilowe.

BN northern blot pokazuje, że specyficzne tRNA jest obecne tylko w jednym określonym kompleksie. Analiza spektrometrii mas wykazała, że kompleks ten zawiera głównie ligazy tRNA, które potwierdzają aktywność wiązania tRNA stwierdzoną przez BN northern blot. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o założeniu rękawiczek i fartucha laboratoryjnego, aby zminimalizować zanieczyszczenie karotenem, które utrudni analizę spektrometrii mas. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak zymogramy i testy enzymatyczne z pobranym sokiem łyka, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak złożone badania aktywności i hamowania. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się nauką o roślinach do badania kompleksów wielopodjednostkowych w próbkach łyka pochodzących od różnych gatunków roślin.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować sok z łyka z roślin Brassica napus oraz jak izolować i analizować białka białkowe i białkowe kompleksy kwasów nukleinowych. Nie zapominaj, że praca z SDS, akrylamidem i TMET może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak praca pod kapturem w rękawicach i fartuchu laboratoryjnym.