Name: Izolacja komórek dendrytycznych z ludzkiego żeńskiego układu rozrodczego do badań fenotypowych i funkcjonalnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: Poznaj metodę izolacji komórek dendrytycznych z ludzkiego żeńskiego układu rozrodczego do badań fenotypowych i funkcjonalnych. Technika zachowuje markery powierzchniowe i umożliwia natychmiastową analizę bez nocnej inkubacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Badanie wspierane przez granty NIH AI102838 i AI117739 (CRW). Dziękujemy Richardowi Rossollowi za pomoc techniczną. Analizę cytometrii przepływowej przeprowadzono w DartLab, wspólnym zasobie w Dartmouth, wspieranym przez (P30CA023108-37) i (P30GM103415-15).

Badania z udziałem ludzi były prowadzone zgodnie z zasadami wyrażonymi w Deklaracji Helsińskiej. Badania zostały zatwierdzone przez Dartmouth College Institutional Review Board oraz Committee for the Protection of Human Subject (CPHS). Pisemną świadomą zgodę uzyskano przed operacją od kobiet zakażonych wirusem HIV poddawanych histerektomii w Dartmouth-Hitchcock Medical Center (Liban, NH). Przeszkoleni patolodzy wybrali próbki tkanek z EM, CX i ECX, wolne od zmian patologicznych i odległe od miejsc patologii. Próbki krwi pobrano od zdrowych dawców-ochotników zrekrutowanych w Dartmouth Hitchcock Medical Center. Krwiodawcy byli anonimowi. Świeżo wyizolowane tkanki EM, CX i ECX z sali operacyjnej zostały przeniesione do Patologii w celu izolacji i klasyfikacji przed przekazaniem do naszego laboratorium w oddzielnych, sterylnych probówkach polipropylenowych.
1. Trawienie enzymatyczne tkanek
UWAGA: Używaj sterylnych materiałów i pracuj w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
<ol>
	<li>Przygotuj zmodyfikowany zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS) przy użyciu 1x HBSS z czerwienią fenolową, 100 U/ml penicyliny-streptomycyny, 0,35 g/LNaHCO3 i 20 mM HEPES.</li>
	<li>Przygotuj koktajl enzymatyczny (zmodyfikowany HBSS, 450 U/ml kolagenazy IV, 0,01% [wag./obj.] dezoksyrybonukleazy I i 2 mg/ml D-glukozy). Przepuść roztwór przez sterylny filtr 0,22 μm. Najlepiej przygotować enzym trawiący w dniu użycia, ale można go zamrozić w temperaturze -20 °C do przechowywania. Unikaj powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania.</li>
	<li>Opłucz tkankę zmodyfikowanym HBSS i umieść na szalce Petriego o wymiarach 100 x 15mm2. Dostosuj rozmiar szalki Petriego w oparciu o ilość dostępnej tkanki i objętość użytego koktajlu enzymatycznego (patrz krok 1.4.2 poniżej). 
	UWAGA: Tkanki różnią się wielkością w zależności od próbki chirurgicznej uzyskanej z patologii, w zakresie od 1 do 10 g.</li>
	<li>Obróbka fizyczna za pomocą jednorazowego skalpela i kleszczy:
	<ol>
		<li>Dodaj około 3 ml koktajlu enzymów trawiennych do tkanki, aby zapobiec wysuszeniu podczas krojenia.</li>
		<li>Użyj kleszczy, aby ustabilizować tkankę i zmielić skalpelem, aby zwiększyć powierzchnię tkanki wystawionej na działanie koktajlu enzymów trawiennych. Pokrój tkankę na małe kawałki (< 2 mm z boku). Dodać wystarczającą ilość koktajlu enzymów trawiennych, aby pokryć wszystkie kawałki tkanki (5 ml/g tkanki). Umieść pokrywkę na szalce Petriego.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 na rotatorze przy około 80 obr./min przez 45 minut. Upewnij się, że prędkość obrotowa rotatora dokładnie wymiesza koktajl enzymów trawiennych, nie rozlewając się ani nie wytwarzając pęcherzyków.</li>
		<li>Wizualizacja preparatu tkanek za pomocą mikroskopu światła odwróconego z obiektywami 4X i 10X. 
		UWAGA: Po trawieniu powinny być obecne małe fragmenty tkanek i zawiesina komórek mieszanych, w tym widoczne gruczoły nabłonkowe (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Fizyczna separacja pojedynczych komórek
<ol>
	<li>W sterylnym środowisku umieść napiętą siatkę 250 μm z uchwytem na szalce Petriego o wymiarach 150 x 15 mm2. Upewnij się, że siatka znajduje się około 0,5 cm nad powierzchnią szalki Petriego.</li>
	<li>Zwilż siatkę 2 ml zmodyfikowanego HBSS i przenieś strawioną tkankę na siatkę.</li>
	<li>Używając płaskiej powierzchni tłoka strzykawki o pojemności 10 ml, delikatnie, ale stanowczo, zmiel strawioną tkankę mieloną przez siatkę. 
	Uwaga: Zbyt agresywne mielenie uszkodzi siatkę i zwiększy śmiertelność komórek. Ten krok oddzieli komórki nabłonkowe i komórki zrębu (w tym komórki odpornościowe) od tkanki łącznej i śluzu.</li>
	<li>Po dokładnym rozproszeniu fragmentów tkanek należy podnieść siatkę i uchwyt 2-3 cm ponad szalkę Petriego i spłukać 3 ml zmodyfikowanego HBSS w celu odzyskania dodatkowych komórek.</li>
	<li>Zebrać zawiesinę komórek. Umieścić siatkę o grubości 20 μm z uchwytem na szalce Petriego i zwilżyć 2 ml zmodyfikowanego HBSS. Przelać zawiesinę komórkową przez siatkę, przytrzymując siatkę 2-3 cm powyżej szalki Petriego i spłukać 6 ml modyfikowanego HBSS. 
	UWAGA: Ten krok oddzieli arkusze nabłonka, które są zachowane na górze, od pojedynczych komórek przechodzących przez siatkę. Przepływ jest mieszaną zawiesiną komórkową, która obejmuje komórki odpornościowe i fibroblasty zrębu.</li>
	<li>Zebrać zawiesinę mieszanych komórek i odwirować przy 500 x g przez 10 minut. Zassać ciecz i ponownie zawiesić osad w 4 ml zmodyfikowanego HBSS do odwirowania w gradiacji gęstości.</li>
	<li>Zawiesinę mieszanych komórek należy nałożyć na 3 ml roztworu polisacharozy i odwirować w temperaturze pokojowej przy 500 x g przez 30 minut bez przerwy. Zebrać białą opaskę z górnej części roztworu polisacharozy i przemyć PBS. 
	UWAGA: Ta frakcja jest wzbogaconą zawiesiną komórek mieszanych, która jest bogata w komórki odpornościowe i zawiera pewne fibroblasty zrębu.</li>
</ol>
3. Usuwanie martwych komórek
UWAGA: Jeśli duży procent martwych komórek (> 20%) jest obecny we wzbogaconej zawiesinie mieszanych komórek po odwirowaniu w gradiacji gęstości, zaleca się usunięcie martwych komórek za pomocą kulek magnetycznych. Martwe komórki muszą zostać usunięte, ponieważ mogą zakłócać proces selekcji dodatnich kulek magnetycznych.
<ol>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru na mikroskopie świetlnym z obiektywem 10X. Odwirować wszystkie komórki we wzbogaconej zawiesinie komórek mieszanych (500 x g, 10 min, 4 °C). Całkowicie odessać i wyrzucić supernatant. Dodać 100 μl kulek do usuwania martwych komórek na 1 x 107 komórek (żywych i martwych), zgodnie z instrukcjami producenta. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
	<li>Umieść filtr 30 μm na kolumnie magnetycznej, nałóż zawiesinę komórek i pozwól, aby komórki oznaczone kulkami wpadły przez kolumnę magnetyczną.</li>
	<li>Przepłukać kolumnę buforem do usuwania martwych komórek zgodnie z zaleceniami (3 ml). Zebrać przepływ zawierający żywe komórki. Zakres regeneracji komórek po usunięciu martwych komórek jest przedstawiony w <silna klasa="xfig">Rysunek 1B. 
	UWAGA: Komórki te można wykorzystać do barwienia cytometrią przepływową w badaniach fenotypowych (sekcja 5) lub kontynuować izolację DC (sekcja 4).</li>
</ol>
4. Oczyszczanie DC przez pozytywny wybór koralików magnetycznych
<ol>
	<li>Po usunięciu martwych komórek (krok 3.2) należy odwirować komórki, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 80 μl buforze selekcji magnetycznej na 1 x 107 komórek (PBS, 0,5% inaktywowana termicznie ludzka surowica AB (HS), 2 mM EDTA).</li>
	<li>W celu pozytywnej selekcji populacji DC należy dodać kulki magnetyczne CD1a lub CD14 zgodnie z instrukcjami producenta (20 μL kulek magnetycznych na 1 x 107 komórek). Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4°C.</li>
	<li>Umyj komórki buforem wyboru magnetycznego, odkręć w dół i całkowicie usuń bufor. Ponownie zawiesić komórki w co najmniej 500 μl bufora selekcji magnetycznej.</li>
	<li>Przymocuj kolumnę do magnesu i dodaj filtr 30 μm na górze kolumny, aby zatrzymać wszelkie pozostałe grudki komórek. Przepłukać filtr i kolumnę magnetycznym buforem selekcyjnym zgodnie z zaleceniami.</li>
	<li>Zastosuj zawiesinę komórki do kolumny. Spłucz 3 razy buforem magnetycznym.</li>
	<li>Przenieś kolumnę do probówki o pojemności 15 ml, dodaj 5 ml buforu wyboru magnetycznego i nałóż tłok, aby uwolnić wybrane komórki z kolumny.</li>
	<li>Aby zwiększyć czystość, powtórz kroki 4.4-4.6 z odzyskanymi komórkami przy użyciu nowej kolumny. Zakres regeneracji komórek po wybraniu kulki magnetycznej jest przedstawiony w <silna klasa="xfig">Rysunek 1C.</li>
</ol>
5. Ocena czystości komórek: cytometria przepływowa i mikroskopia
<ol>
	<li>Barwienie przeciwciał w cytometrii przepływowej:
	<ol>
		<li>Zawiesić do 1 x 106 komórek w 100 μl PBS zawierającego 20% inaktywowanego termicznie HS w celu zablokowania receptorów Fc i inkubować przez 10 minut na lodzie.</li>
		<li>Dodać żądane przeciwciała znakowane fluorescencyjnie i odczynnik do identyfikacji martwych komórek (na przykład, patrz punkt 6.5). Ustaw kontrolki fluorescencji minus jeden (FMO), aby ustalić bramki, i użyj koralików kompensacyjnych, aby przygotować pojedyncze kontrole barwienia do kompensacji. Przykłady stosowanych przeciwciał podano w tabeli 1. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem.</li>
		<li>Umyj komórki 2 ml buforu do selekcji magnetycznej. 
		UWAGA: Obecność EDTA jest ważna, aby uniknąć tworzenia się zlepiania się komórek do analizy cytometrii przepływowej. Odwirować i wyrzucić supernatant.</li>
		<li>Napraw komórki, dodając 100 μl 2% roztworu paraformaldehydu na probówkę.</li>
		<li>Przeanalizuj próbki za pomocą cytometru przepływowego10,11.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zakręć kolumną (np. cytospina) i użyj barwienia Giemsy do analizy morfologii:
	<ol>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w 200 μl bufora selekcji magnetycznej.</li>
		<li>Załaduj do kolumny wirującej i wiruj przez 5 minut. Pozostaw szkiełko do całkowitego wyschnięcia.</li>
		<li>Zamocuj szkiełko przez zanurzenie w 100% metanolu na 2 minuty. Opłucz szkiełko wodą dejonizowaną i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.</li>
		<li>Wykonaj standardowe barwienie Wrights-Giemsa. Przykryj komórki Eozyną i inkubuj przez 10 minut, spłucz wodą dejonizowaną i pozostaw do wyschnięcia. Przykryj komórki barwnikiem Wrights-Geimsa, inkubuj przez 1 minutę, spłucz wodą dejonizowaną i wysusz na powietrzu.</li>
		<li>Zbadaj preparaty za pomocą odwróconego mikroskopu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A, obiektyw 40X).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Test stymulacji allogenicznej do oceny funkcji komórki DC
<ol>
	<li>Rozmrozić zamrożone komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC)
	<ol>
		<li>Ogrzać pożywkę do hodowli komórkowych z 10% HS do temperatury 37 °C.</li>
		<li>Rozmrozić PBMC, umieszczając krioprobówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż niewielka ilość zamrożonych pożywek komórkowych pozostanie w krioprobówce. W sterylnym środowisku przenieś zawartość krioprobówki do 10 ml wstępnie podgrzanej pożywki do hodowli komórkowych z 10% HS w probówce o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Wirować przy ~ 500 x g przez 7 min. Usunąć pożywkę, rozproszyć osad, ponownie zawiesić PBMC w 10 ml pożywki do hodowli komórkowych z 10% HS i odwirować komórki.</li>
		<li>Powtórz krok prania po raz trzeci. Policz komórki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Naiwny wybór limfocytów T:
	<ol>
		<li>Użyj zestawu do selekcji komórek przeciwciał magnetycznych o negatywnej selekcji, aby wyizolować naiwne limfocyty T zgodnie z protokołem producenta.</li>
		<li>Po izolacji sprawdzić czystość za pomocą przeciwciał CD45RA i CCR7. 
		UWAGA: Typowa czystość to > 99% naiwnych limfocytów T.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Naiwne barwienie barwnikiem proliferacji komórek T:
	<ol>
		<li>Przygotuj 600 μL 2x roztworu barwnika proliferacji komórek, chroniąc barwnik przed ekspozycją na światło.</li>
		<li>Umyj naiwne limfocyty T 2x za pomocą PBS. Zawieś komórki w 500 μl PBS.</li>
		<li>Delikatnie wirując komórki w komorze bezpieczeństwa biologicznego, dodaj 500 μl barwnika proliferacyjnego do naiwnych limfocytów T.</li>
		<li>Inkubować komórki przez 10 minut w temperaturze 37°C.</li>
		<li>Zatrzymaj znakowanie komórek, dodając do komórek 5 ml pożywki do hodowli komórkowych z 10% HS. Inkubować na lodzie przez 5 minut, chronić przed światłem.</li>
		<li>Odwirować komórki przy ~ 500 x g przez 7 minut, odessać pożywkę i ponownie zawiesić komórki w 4 °C pożywki do hodowli komórkowych z 10% HS. Powtórz jeszcze dwa razy, w sumie 3 prania. Pobrać podwielokrotność komórek do policzenia przed ostatnim wirowaniem. 
		UWAGA: Zazwyczaj ostateczna liczba naiwnych komórek T będzie się wahać od 5% do 15% początkowej liczby komórek PBMC.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki za pomocą pożywki do hodowli komórkowych z 10% HS przy pożądanym stężeniu komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pierwotna kohodowla komórek T allogenicznych DC:
	<ol>
		<li>Umieść izolowane DC i naiwne limfocyty T w 96-dołkowej płytce z okrągłym dnem, w stosunku 1:15 DC do limfocytów T. Upewnij się, że optymalna liczba dla DC mieści się w zakresie od 3 000 do 5 000 komórek/studzienkę.</li>
		<li>Odwirować płytkę przy ~ 500 x g przez 3 minuty, aby upewnić się, że komórki znajdują się w środku studzienki. Kontakt między komórkami jest ważny dla prawidłowego wystąpienia sygnalizacji.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 6 dni. Monitoruj skupisko komórek, które pojawiają się w studzienkach w miarę zachodzenia proliferacji, za pomocą mikroskopii (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie cytometrią przepływową w celu oceny proliferacji:
	<ol>
		<li>Po 6 dniach komórki można badać za pomocą cytometrii przepływowej. Zabarwić kokulturę do cytometrii przepływowej.</li>
		<li>Przygotować 2x roztwór żółtego barwnika żywotności (maksymalna emisja 572 nm) w PBS. 
		UWAGA: Stosowanie PBS bez surowicy jest ważne, ponieważ białka surowicy zakłócają działanie barwnika).</li>
		<li>Odwirować płytkę z komórkami o stężeniu ~ 500 x g przez 5 min.</li>
		<li>Usunąć 100 μl supernatantu. 
		UWAGA: W tym momencie należy zebrać i przechowywać supernatant do oddzielnej analizy czynników rozpuszczalnych.</li>
		<li>Przemyć komórki dwukrotnie PBS: dodać 150 μl/studzienkę PBS, odwirować przy ~ 500 x g przez 5 min, usunąć 150 μl supernatantu za pomocą pipety. Upewnij się, że w każdej studzience pozostało 50 μl supernatantu.</li>
		<li>Dodaj 50 μl 2x barwnika żywotności do każdego dołka. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut, chronić przed światłem.</li>
		<li>Podczas inkubacji należy przygotować główną mieszaninę pożądanych markerów przeciwciał. Na przykład: CD3 APC/Cy7, CD4 PE, CD8 FITC itp.</li>
		<li>Dodaj mieszaninę przeciwciał do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut, chronić przed światłem.</li>
		<li>Przemyć komórki 2x PBS + 2% HS: dodać 150 μL/studzienkę PBS + 2% HS. Wirować przy ~ 500 x g przez 5 min. Usunąć 150 μl supernatantu za pomocą pipety.</li>
		<li>Utrwal komórki, dodając 100 μl/studzienkę 2% para-formaldehydu. W razie potrzeby: przenieść komórki i pożywki do probówek do polipropylenowej cytometrii przepływowej. Probówki można przechowywać w temperaturze 4 °C i chronić przed światłem do czasu analizy metodą cytometrii przepływowej.</li>
		<li>Odczytaj probówki w cytometrze przepływowym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Wira, C. R., Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+sex+hormones+in+immune+protection+of+the+female+reproductive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of sex hormones in immune protection of the female reproductive tract.</a> Nat Rev Immunol. 15 (4), 217-230 (2015).</li>
<li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).</li>
<li>Schlitzer, A., McGovern, N., Ginhoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+and+monocyte-derived+cells%3A+Two+complementary+and+integrated+functional+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells and monocyte-derived cells: Two complementary and integrated functional systems.</a> Semin Cell Dev Biol. 41, 9-22 (2015).</li>
<li>Tagliani, E., Erlebacher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+function+at+the+maternal-fetal+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell function at the maternal-fetal interface.</a> Expert Rev Clin Immunol. 7 (5), 593-602 (2011).</li>
<li>Kaldensjo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+intraepithelial+and+stromal+Langerin+and+CCR5+positive+cells+in+the+human+endometrium%3A+potential+targets+for+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Detection of intraepithelial and stromal Langerin and CCR5 positive cells in the human endometrium: potential targets for HIV infection.</a> PLoS One. 6 (6), e21344(2011).</li>
<li>Schulke, L., Manconi, F., Markham, R., Fraser, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endometrial+dendritic+cell+populations+during+the+normal+menstrual+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Endometrial dendritic cell populations during the normal menstrual cycle.</a> Hum Reprod. 23 (7), 1574-1580 (2008).</li>
<li>Ballweber, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaginal+langerhans+cells+nonproductively+transporting+HIV-1+mediate+infection+of+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Vaginal langerhans cells nonproductively transporting HIV-1 mediate infection of T cells.</a> J Virol. 85 (24), 13443-13447 (2011).</li>
<li>Hladik, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+events+in+establishing+vaginal+entry+and+infection+by+human+immunodeficiency+virus+type-1%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Initial events in establishing vaginal entry and infection by human immunodeficiency virus type-1.</a> Immunity. 26 (2), 257-270 (2007).</li>
<li>Duluc, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+diversity+of+human+vaginal+APC+subsets+in+directing+T-cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Functional diversity of human vaginal APC subsets in directing T-cell responses.</a> Mucosal Immunol. 6 (3), 626-638 (2013).</li>
<li>Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Parks, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+flow+cytometry+data%3A+a+guide+for+the+perplexed%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed.</a> Nat Immunol. 7 (7), 681-685 (2006).</li>
<li>Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection%2C+isolation%2C+and+flow+cytometric+analysis+of+human+endocervical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li>
<li>Givan, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+leukocytes+in+the+human+female+reproductive+tract%3A+comparison+of+fallopian+tube%2C+uterus%2C+cervix%2C+and+vagina%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Reprod+Immunol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of leukocytes in the human female reproductive tract: comparison of fallopian tube, uterus, cervix, and vagina.</a> Am J Reprod Immunol. 38 (5), 350-359 (1997).</li>
<li>Rodriguez-Garcia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+from+the+human+female+reproductive+tract+rapidly+capture+and+respond+to+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells from the human female reproductive tract rapidly capture and respond to HIV.</a> Mucosal Immunol. 10 (2), 531-544 (2017).</li>
<li>Rodriguez-Garcia, M., Barr, F. D., Crist, S. G., Fahey, J. V., Wira, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotype+and+susceptibility+to+HIV+infection+of+CD4%2B+Th17+cells+in+the+human+female+reproductive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phenotype and susceptibility to HIV infection of CD4+ Th17 cells in the human female reproductive tract.</a> Mucosal Immunol. 7 (6), 1375-1385 (2014).</li>
<li>Shen, Z., Rodriguez-Garcia, M., Ochsenbauer, C., Wira, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+immune+cells+and+infection+by+HIV+in+human+ovarian+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Reprod+Immunol%22%5BJournal%5D)">Characterization of immune cells and infection by HIV in human ovarian tissues.</a> Am J Reprod Immunol. , (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Błony śluzowe DC są rzadką populacją komórek, na którą duży wpływ ma środowisko tkankowe, które zmienia ich fenotyp i funkcję po dostaniu się do tkanek3. Chociaż DC pochodzące z krwi są bardzo użytecznym modelem, nie reprezentują one w pełni różnorodności populacji DC znajdujących się w tkankach. Dlatego, aby zrozumieć unikalne cechy błony śluzowej DC, konieczna jest izolacja komórek pierwotnych z tkanek. Izolacja DC z różnych miejsc anatomicznych w FRT daje możliwość zbadania funkcji DC in vi...

FRT pełni podwójną funkcję ochrony przed patogenami, jednocześnie umożliwiając implantację i ciążę1. Aby to osiągnąć, FRT jest podzielony na przedziały, przy czym każdy obszar anatomiczny wykazuje unikalne cechy histologiczne, immunologiczne i funkcjonalne1.
DC obecne na powierzchni błony śluzowej stykają się z mikrobami w płucach, jelitach i drogach rodnych oraz zapewniają immunologiczny nadzór nad potencjalnymi patogenami2. DC mają unikalną zdolność do inicjowania naiwnych limfocytów T i wywoływania adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych3. DC w FRT są również wyspecjalizowane w tolerowaniu obcych antygenów, takich jak te znajdujące się w plemnikach i rozwijającym się płodzie, aby umożliwić udaną ciążę4. W związku z tym, w zależności od lokalizacji, fenotyp i funkcja DC będą różne. Wiadomo, że DC są pod silnym wpływem środowiska tkankowego, tak że ich liczba, fenotyp i funkcje są modyfikowane przez środowisko tkankowe, w którym się znajdują3. Dlatego, aby zrozumieć rolę, jaką FRT DC odgrywają w chorobach zakaźnych, ciąży i raku w FRT, należy zbadać rezydentne DC DC, ponieważ modele DC pochodzące z krwi są niewystarczające, aby rozwiązać złożoność regulacyjną występującą w tkankach FRT.
Charakterystyka DC rezydujących w tkance ludzkiej jest wyzwaniem ze względu na małą liczbę komórek obecnych w tkankach błony śluzowej i trudności w uzyskaniu próbek tkanek ludzkich. DC zostały przebadane w FRT przy użyciu immunohistochemistry5,6, który informuje o lokalizacji komórki w tkance, ale wyklucza badania funkcjonalne i jest ograniczony w liczbie identyfikujących markerów komórkowych, które można analizować jednocześnie. Ponadto opracowano protokoły izolacji pojedynczych komórek do analizy cytometrii przepływowej7,8,9. Niektóre z tych protokołów wykorzystują zdolność migracyjną kontrolerów domeny do izolowania tych komórek, które migrują. Metody te zwykle wymagają całonocnej inkubacji i selekcji aktywowanych DC, ale nie pozwalają na badanie DC w stanie ustalonym.
Tutaj, korzystając z próbek z histerektomii, zoptymalizowaliśmy protokół izolowania DC z różnych miejsc anatomicznych w FRT, endometrium (EM), szyjce macicy (CX) i szyjce macicy (ECX), co umożliwia zarówno analizę fenotypową, jak i funkcjonalną. Korzystając z nieproteolitycznego protokołu trawienia enzymatycznego, możemy natychmiast po trawieniu tkanek przejść do izolacji komórek i charakterystyki cytometrii przepływowej bez aktywacji komórek. Korzystając z wielokolorowej cytometrii przepływowej i dostosowując badania funkcjonalne do małej liczby komórek, możemy zidentyfikować i scharakteryzować rzadkie podzbiory DC w różnych miejscach FRT.

<table><tbody><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS)</td><td>Hyklon</td><td>SH30015.03</td><td></td></tr><tr><td>Hyklon penicyliny-streptomycyny</td><td></td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Hyclon</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza IV</td><td>Sigma</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Deoksyrybonukleaza I</td><td>Worthington Biochemiczny</td><td>LS002140</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>Sigma Aldritch</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>0,22 um Stericup 500 mL&nbsp; filtr</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>100mm x 15mm polistyrenowa szalka Petriego</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>150mm x 15mm polistyrenowa szalka Petriego</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875714</td><td></td></tr><tr><td>150mm x 25mm naczynie z polistyrenu</td><td>Corning</td><td>430599</td><td>Przetworzone naczynie</td></tr> <tr>do hodowli komórkowych<td>Inkubator izotemperaturowy</td><td>Fisher Scientific FICO3500TABB</td><td></td><td>5,0% CO2</td></tr><tr><td>American Rotator V</td><td>American DADE</td><td>R4140</td><td></td></tr><tr><td>250 um siatka nylonowa</td><td>Sefar</td><td>03-250/50</td><td></td></tr><tr><td>20 um siatka nylonowa</td><td>Sefar</td><td>03-20/14</td><td></td></tr><tr><td>Beckman GS-6R Wirówka</td><td>Beckman</td><td>358702</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 z gentamycyną L-Gln, czerwień fenolowa, 1 l</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka AB Serum</td><td>Valley Biomedical</td><td>HP1022</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1077 Sigma</td><td>Aldritch</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór buforu fosforanowego (PBS)</td><td>National Diagnostics</td><td>CL-253</td><td>pH 7,4</td></tr><tr><td>Zestaw do usuwania martwych komórek</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>Filtr wstępnej separacji (30um)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-410</td><td></td></tr><tr><td>Separator Quadro MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>MACS wielostanowiskowy</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>USB</td><td>15694</td><td></td></tr><tr><td>CD1a Mikrokulki, ludzkie</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-051-001</td><td></td></tr><tr><td>CD14 Mikrogranulki, ludzkie</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-201</td><td></td></tr><tr><td>eFluor 670 barwnik proliferacji komórek</td><td>eBiosciences</td><td>65-0840-85</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa okrągła płyta dolna</td><td>Sokół</td><td>9/8/2866</td><td></td></tr><tr><td>Zombie żółty barwnik żywotności</td><td>Biolegend</td><td>423104</td><td></td></tr><tr><td>CD3 APC/Cy7, anty-ludzki</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>25-0038-T100</td><td></td></tr><tr><td>CD4 PE, anty-ludzki</td><td>eBiosciences</td><td>12-0048-42</td><td></td></tr><tr><td>CD8a FITC, anty-ludzki</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>35-0086-T100</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy Gallios</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>B43618</td><td>10 kolorów, VBR</td></tr><tr><td>MACSquant Analyzer 10</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-343</td><td>8 kolorów, VBR</td></tr></tbody></table>

izolacja komórek dendrytycznych z ludzkiego żeńskiego układu rozrodczego do badań fenotypowych i funkcjonalnych

Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies

Charakterystyka ludzkich komórek dendrytycznych (DC) rezydujących w tkankach błony śluzowej jest trudna ze względu na trudności w pobieraniu próbek i niską liczbę DC obecnych na tkankę. Jednakże, ponieważ fenotyp i funkcja DC są modyfikowane przez środowisko tkankowe, konieczna jest analiza populacji DC rezydujących w tkankach, ponieważ DC pochodzące z krwi nie odzwierciedlają w pełni złożoności DC w tkankach. W tym miejscu przedstawiamy protokół izolacji DC z ludzkiego żeńskiego układu rozrodczego (FRT) przy użyciu próbek z histerektomii, który umożliwia zarówno analizę fenotypową, jak i funkcjonalną. Protokół składa się z trawienia tkanek w celu wytworzenia zawiesiny komórek mieszanych z pojedynczą komórką, a następnie pozytywnej selekcji kulek magnetycznych. Nasz protokół trawienia tkanek nie rozszczepia markerów powierzchniowych, co umożliwia fenotypową i funkcjonalną analizę DC w stanie ustalonym, bez nocnej inkubacji lub aktywacji komórek. Protokół ten można dostosować do izolacji innych typów komórek odpornościowych lub izolacji DC z innych tkanek.

Po trawieniu tkanki można zaobserwować uwalnianie płatów nabłonkowych i gruczołów, co przedstawiono na Rysunku 1A; jest to kontrola pozytywna wskazująca na pomyślny przebieg trawienia enzymatycznego. Liczba wszystkich odzyskanych żywych komórek oraz komórek DC na gram tkanki przedstawiona jest odpowiednio na Rysunku 1B i Rysunku 1C. Komórki odpornościowe stanowią od 5-30% komórek zrębu przed wirowani...

Opisujemy tutaj metodę izolowania i oczyszczania komórek dendrytycznych z różnych anatomicznych przedziałów w ludzkim żeńskim układzie rozrodczym w celu oceny ich cech fenotypowych i funkcjonalnych. Metodę tę można dostosować do izolowania innych komórek odpornościowych lub komórek dendrytycznych z innych tkanek błony śluzowej.

Izolacja komórek dendrytycznych z ludzkiego żeńskiego układu rozrodczego do badań fenotypowych i funkcjonalnych

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low ...

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie komórek dendrytycznych z różnych przedziałów anatomicznych w ludzkim żeńskim układzie rozrodczym w celu oceny ich cech fenotypowych i funkcjonalnych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące komórek dendrytycznych rezydujących w tkankach żeńskich narządów płciowych, takich jak anatomiczny podział na przedziały określonych podzbiorów i ich cechy funkcjonalne. Główną zaletą tej techniki jest to, że nasz protokół trawienia tkanek nie rozszczepia markerów powierzchniowych, co pozwala na natychmiastową izolację komórek dendrytycznych bez całonocnej inkubacji lub aktywacji komórek.Chociaż metoda ta została zoptymalizowana do izolowania komórek dendrytycznych z ludzkiego żeńskiego układu rozrodczego, można ją również dostosować do izolowania innych komórek odpornościowych lub komórek dendrytycznych od innych tkanek. Procedurę zademonstrują Fiona Barr i Jared Fortier, technicy z naszego laboratorium. Rozpocznij tę procedurę od przepłukania tkanki zmodyfikowanym HBSS.Umieść tkankę na szalce Petriego o wymiarach 100 na 15 milimetrów kwadratowych i dodaj około trzech mililitrów koktajlu enzymów trawiennych, aby zapobiec wysy

isolation-dendritic-cells-from-human-female-reproductive-tract-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano metodę otrzymywania wysoce oczyszczonej preparacji komórek dendrytycznych z płuc myszy. Szczególny nacisk położono na izolację podgrupy konwencjonalnych komórek dendrytycznych.

Izolacja komórek dendrytycznych z płuc myszy

W niniejszym opracowaniu szczegółowo opisano metodologię szybkiej izolacji komórek dendrytycznych (DCs) oraz makrofagów z jelit myszy. Charakterystyka fenotypowa jelitowych komórek dendrytycznych i makrofagów jest przeprowadzana za pomocą wielokolorowej analizy cytometrycznej, natomiast wzbogacanie za pomocą kulek magnetycznych z następującym po nim sortowaniem komórek jest stosowane w celu uzyskania populacji o wysokiej czystości do badań funkcjonalnych.

Izolacja i charakterystyka komórek dendrytycznych oraz makrofagów z jelit myszy

Opisano wydajną metodę izolacji limfocytów z dróg rodnych myszy. Metoda ta wykorzystuje trawienie enzymatyczne oraz separację w gradiencie Percoll w celu zapewnienia efektywnej izolacji. Technikę tę można również dostosować do zastosowania u innych...

Izolacja limfocytów z błony śluzowej dróg rodnych myszy

Rośnie zainteresowanie zrozumieniem funkcji immunologicznych określonych subpopulacji komórek w łatach Peyera (PP), głównych miejscach indukcyjnych tkanek limfatycznych związanych z jelitami.  W tym miejscu przedstawiamy równoległe protokoły przygotowania preparatów pojedynczych komórek PP do analizy cytometrii przepływowej i kriosekcji PP do barwienia immunologicznego.

Izolowanie i barwienie immunologiczne limfocytów i komórek dendrytycznych z mysich plastrów Peyera

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę izolowania komórek prezentujących antygen z ludzkiej grasicy poprzez różne etapy enzymatycznego trawienia tkanki, następnie gęstości odwirowania zawiesiny pojedynczej komórki i na końcu magnetycznego i/lub FACS sortowania interesujących populacji komórek.

Izolacja mieloidalnych komórek dendrytycznych i komórek nabłonkowych z ludzkiej grasicy

Odrębne podzbiory komórek dendrytycznych istnieją jako rzadkie populacje w narządach limfoidalnych, dlatego są trudne do wyizolowania w wystarczającej liczbie i czystości do eksperymentów immunologicznych. W tym miejscu opisujemy metodę o wysokiej skuteczności i wysokiej wydajności do izolacji wszystkich obecnie znanych głównych podzbiorów komórek dendrytycznych śledziony myszy.

Wydajna i wysokowydajna metoda izolacji podzbiorów komórek dendrytycznych myszy

To badanie porównuje dwie różne metody izolacji ludzkich monocytów w celu uzyskania in vitro komórek dendrytycznych (DC). Monocyty są selekcjonowane przez przyleganie lub ujemnie wzbogacane przez separację magnetyczną. Wydajność i żywotność monocytów wraz z żywotnością, proliferacją MDDC i ekspresją markera powierzchniowego CD11c/CD14 zostaną porównane między obiema metodami.

Charakterystyka ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów za pomocą obrazowania cytometrii przepływowej: porównanie dwóch protokołów izolacji monocytów

Opisujemy tutaj metodę izolacji w celu uzyskania ludzkich śródnabłonkowych limfocytów wewnątrzszyjkowych do analizy śródnabłonkowych limfocytów T gamma delta. Protokół ten można rozszerzyć o oczyszczanie komórek T gamma delta szyjki macicy za pomocą kulek magnetycznych lub sortowania komórek.

Izolacja i analiza cytometryczna przepływowa ludzkich komórek T gamma Delta w obrębie szyjki macicy

DC (MoDC) pochodzące z monocytów może wykrywać niewielkie ilości cząsteczek związanych z niebezpieczeństwem i dlatego jest łatwo zapoczątkowane. Przedstawiamy szczegółowy protokół izolacji MoDC z krwi i nowotworów oraz ich aktywacji za pomocą kompleksów immunologicznych, podkreślając jednocześnie kluczowe środki ostrożności, które należy wziąć pod uwagę, aby uniknąć ich przedwczesnej aktywacji.

Protokół izolacji komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów myszy i ich późniejsza aktywacja in vitro za pomocą nowotworowych kompleksów immunologicznych

Ten protokół demonstruje metodę izolacji pierwotnych ludzkich komórek dziesiętnych pobranych z błon płodowych łożysk terminowych, które mogą być używane do różnych zastosowań (np. immunocytochemia, cytometria przepływowa, itp.), mając na celu zbadanie roli różnych populacji komórek w komplikacjach ciąży.

Izolacja pierwotnych ludzkich komórek liściastych z błon płodowych łożysk donoszonych

Tutaj opisujemy warunki hodowli in vitro, izolację i zwiększoną generację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z Echinococcus granulosus. Małe pojazdy elektryczne charakteryzowały się dynamicznym rozpraszaniem światła i transmisyjną mikroskopią elektronową. Wychwyt przez komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego i ich modulację fenotypową badano za pomocą mikroskopii konfokalnej i cytometrii przepływowej.

Izolacja i wychwyt komórek dendrytycznych małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Echinococcus granulosus

Poznaj metodę izolacji komórek dendrytycznych z ludzkiego żeńskiego układu rozrodczego do badań fenotypowych i funkcjonalnych. Technika zachowuje markery powierzchniowe i umożliwia natychmiastową analizę bez nocnej inkubacji.

Izolacja komórek dendrytycznych z ludzkiego żeńskiego układu rozrodczego do badań fenotypowych i funkcjonalnych

Przeglądaj więcej filmów