Izolacja komórek dendrytycznych z ludzkiego żeńskiego układu rozrodczego do badań fenotypowych i funkcjonalnych

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie komórek dendrytycznych z różnych przedziałów anatomicznych w ludzkim żeńskim układzie rozrodczym w celu oceny ich cech fenotypowych i funkcjonalnych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące komórek dendrytycznych rezydujących w tkankach żeńskich narządów płciowych, takich jak anatomiczny podział na przedziały określonych podzbiorów i ich cechy funkcjonalne. Główną zaletą tej techniki jest to, że nasz protokół trawienia tkanek nie rozszczepia markerów powierzchniowych, co pozwala na natychmiastową izolację komórek dendrytycznych bez całonocnej inkubacji lub aktywacji komórek.

Chociaż metoda ta została zoptymalizowana do izolowania komórek dendrytycznych z ludzkiego żeńskiego układu rozrodczego, można ją również dostosować do izolowania innych komórek odpornościowych lub komórek dendrytycznych od innych tkanek. Procedurę zademonstrują Fiona Barr i Jared Fortier, technicy z naszego laboratorium. Rozpocznij tę procedurę od przepłukania tkanki zmodyfikowanym HBSS.

Umieść tkankę na szalce Petriego o wymiarach 100 na 15 milimetrów kwadratowych i dodaj około trzech mililitrów koktajlu enzymów trawiennych, aby zapobiec wysychaniu tkanki. Używając kleszczy do stabilizacji tkanki, zmiel ją skalpelem, aby zwiększyć powierzchnię tkanki wystawionej na działanie koktajlu enzymów trawiennych. Pokrój tkankę na małe kawałki.

Dodaj wystarczającą ilość koktajlu enzymów trawiennych, aby pokryć wszystkie kawałki tkanki i przykryj pokrywką szalkę Petriego. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla na rotatorze z prędkością około 80 obr./min przez 45 minut. Upewnij się, że prędkość rotatora dokładnie miesza koktajl enzymów trawiennych bez rozlewania lub wytwarzania pęcherzyków.

Po 45 minutach zwizualizuj preparat tkankowy za pomocą mikroskopu światła odwróconego z obiektywami 4X i 10X. Udane trawienie enzymatyczne powinno uwolnić arkusze i gruczoły nabłonkowe, jak pokazano na tym reprezentatywnym obrazie. Wykonaj separację pojedynczych komórek w sterylnym środowisku.

Najpierw umieść napiętą siatkę o długości 250 mikrometrów z uchwytem na szalce Petriego o wymiarach 150 na 15 milimetrów kwadratowych i upewnij się, że siatka znajduje się około 0,5 centymetra nad powierzchnią szalki Petriego. Następnie zwilż siatkę dwoma mililitrami zmodyfikowanego HBSS i przenieś strawioną tkankę na siatkę. Używając płaskiej powierzchni 10-mililitrowego tłoka strzykawki, delikatnie, ale stanowczo zmiel strawioną tkankę mieloną przez siatkę.

Gdy fragmenty tkanek zostaną dokładnie rozproszone, podnieś siatkę i uchwyt dwa do trzech centymetrów ponad szalkę Petriego i spłucz trzema mililitrami zmodyfikowanego HBSS w celu odzyskania dodatkowych komórek. Przenieś zawiesinę komórek do 50-mililitrowej stożkowej probówki. Umieść siatkę o długości 20 mikrometrów z uchwytem około dwóch do trzech centymetrów nad nową szalką Petriego i zwilż dwoma mililitrami zmodyfikowanego HBSS.

Przepuść zawiesinę komórkową przez siatkę i spłucz sześcioma mililitrami zmodyfikowanego HBSS. Zebrać zawiesinę mieszanych komórek i odwirować 500 razy g przez 10 minut. Odessać ciecz i ponownie zawiesić osad w czterech mililitrach zmodyfikowanego HBSS.

Zawiesinę mieszanych komórek należy nałożyć na trzy mililitry roztworu polisacharozy w celu odwirowania w gradiacji gęstości. Wirować w temperaturze pokojowej 500 razy g przez 30 minut bez przerwy. Zbierz białą opaskę z górnej części roztworu polisacharozy i przemyj PBS.

Po zebraniu wzbogaconej zawiesiny komórek mieszanych należy policzyć komórki za pomocą hemocytometru pod mikroskopem świetlnym z obiektywem 10X. Obracaj wszystkie komórki w zawiesinie komórek przez 10 minut. Całkowicie odessać i wyrzucić supernatant.

Następnie dodaj kulki do usuwania martwych komórek i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Po 15 minutach umieść filtr o długości 30 mikrometrów na górze kolumny, aby zatrzymać wszelkie pozostałe resztki tkanek lub agregaty komórkowe. Przepłukać filtr i kolumnę buforem do usuwania martwych komórek.

Następnie nałóż zawiesinę komórek i pozwól komórkom oznaczonym koralikami przepłynąć przez kolumnę magnetyczną. Przepłukać kolumnę czterema mililitrami buforu do usuwania martwych komórek. Zebrać przepływ zawierający żywe komórki.

Po usunięciu martwych komórek odwiruj komórki w dół. Usuń supernatant i ponownie zawieś osad komórek w buforze wyboru magnetycznego, 80 mikrolitrów buforu na jeden razy 10 na siedem komórek. W celu pozytywnej selekcji populacji komórek dendrytycznych dodaj kulki magnetyczne CD1a lub CD14 i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut.

Umyj komórki buforem wyboru magnetycznego, odwiruj, całkowicie usuń bufor i ponownie zawieś komórki w co najmniej 500 mikrolitrach bufora wyboru magnetycznego. Przymocuj kolumnę do magnesu i dodaj 30-mikrometrowy filtr na górze kolumny, aby zatrzymać wszelkie pozostałe resztki tkanek lub agregaty komórek. Przepłukać filtr i kolumnę magnetycznym buforem selekcyjnym.

Zastosuj zawiesinę komórki do kolumny. Spłucz trzykrotnie trzema mililitrami magnetycznego bufora selekcyjnego. Przenieś kolumnę do 15-mililitrowej probówki.

Dodaj pięć mililitrów bufora wyboru magnetycznego i zastosuj tłok, aby zwolnić wybrane komórki z kolumny. Aby zwiększyć czystość, powtórz etapy oczyszczania z odzyskanymi komórkami przy użyciu nowej kolumny. Następnie oceń czystość komórek za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Przed rozpoczęciem tego testu naiwne limfocyty T są izolowane z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej za pomocą dostępnego na rynku zestawu. Umyj naiwne limfocyty T dwukrotnie za pomocą PBS. Ponownie zawiesić komórki w 500 mikrolitrach PBS.

Reszta protokołu jest wykonywana w ciemności. Delikatnie wirując komórki w komorze bezpieczeństwa biologicznego, dodaj do komórek 500 mikrolitrów 2X roztworu barwnika proliferacji komórek. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut.

Zatrzymaj znakowanie komórek, dodając do komórek pięć mililitrów pożywki do hodowli komórkowej z 10% ludzką surowicą AB. Inkubować na lodzie przez pięć minut, chroniąc przed światłem. Odwirować komórki z prędkością około 500 razy g przez siedem minut.

Odessać pożywkę i ponownie zawiesić komórki w pięciu mililitrach pożywki do hodowli komórkowych z 10% ludzką surowicą AB. Przed ostatnim wirowaniem należy pobrać porcję komórek do policzenia. Po trzecim myciu ponownie zawieś komórki w pożywce do hodowli komórkowych z 10% ludzką surowicą AB o pożądanym stężeniu komórek.

Aby rozpocząć allogeniczną kohodowlę naiwnych komórek T komórek dendrytycznych, umieść izolowane komórki dendrytyczne i naiwne limfocyty T na 96-dołkowej płytce o okrągłym dnie w stosunku od jednego do 15 komórek dendrytycznych do limfocytów T. Odwiruj płytkę około 500 razy g przez trzy minuty, aby upewnić się, że komórki znajdują się w środku studzienki. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez sześć dni.

Monitoruj komórki za pomocą mikroskopii. Po sześciu dniach oceń proliferację komórek za pomocą cytometrii przepływowej, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Ten wykres pokazuje zakres całkowitej liczby żywotnych komórek odzyskanych po przetworzeniu tkanek i usunięciu martwych komórek w każdym kobiecym przedziale dróg rodnych, endometrium, endomacicy i ectocervix.

Następnie pokazano liczbę żywotnych komórek dendrytycznych odzyskanych na gram tkanki po izolacji kulek magnetycznych. Morfologię dendrytyczną izolowanych komórek określono za pomocą mikroskopii po barwieniu metodą Giemsa. Ekspresję markerów fenotypowych przed i po izolacji kulek określono za pomocą cytometrii przepływowej.

Po izolacji kulek CD1a-dodatnich i CD14-dodatnich czystość wahała się od 85 do 92%Przeprowadzono test stymulacji allogenicznej w celu oceny funkcjonalności komórek dendrytycznych. Tworzenie się klastrów limfocytów T podczas proliferacji zostało potwierdzone przez barwienie barwnikiem proliferacji. Proliferację określono następnie ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej.

Pokazano tutaj strategię bramkowania w celu identyfikacji różnych komórek dendrytycznych w zawiesinie komórek mieszanych. Każda bramkowana populacja na wielokolorowych wykresach jest pokazana w następnym panelu. Zgodnie ze strategią bramkowania identyfikowane są określone podzbiory komórek dendrytycznych.

Oczekuje się niskiej liczby komórek, ponieważ tkankowe komórki dendrytyczne są rzadkimi populacjami. Po opanowaniu izolację komórek dendrytycznych z tkanek można wykonać w ciągu czterech do pięciu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak enzymatycznie trawić i przetwarzać tkanki w celu wytworzenia pojedynczej zawiesiny komórek mieszanych i przeprowadzenia selekcji kulek magnetycznych komórek dendrytycznych w celu dalszej charakterystyki.