Pełnopolowa optyczna mikroskopia koherentna do histologicznej analizy cech zrębu w przeszczepach rogówki
21 października 2022
Opisujemy użycie pełnej koherentnej mikroskopii optycznej jako metody wysokiej jakości oceny zrębu dawcy rogówki. Protokół ten może być stosowany do identyfikacji cech wskazujących na zdrowie lub chorobę i ma na celu poprawę badań przesiewowych i selekcji tkanek dawcy, a tym samym wyników keratoplastyki.
Metoda ta może poprawić badania przesiewowe i selekcję tkanek dawcy rogówki w bankach oczu, poprawić wyniki przeszczepu rogówki. Główną zaletą tej techniki jest możliwość oceny w wysokiej rozdzielczości oraz to, że rogówka pozostaje zanurzona w zamkniętej komorze wypełnionej nośnikiem pamięci przez cały czas akwizycji obrazu, co zmniejsza potencjalne ryzyko zanieczyszczenia. Procedurę zademonstruje Maelle Vilbert, doktorantka z naszego laboratorium.
Na początek umieść rogówkę zanurzoną w podłożu do przechowywania w uchwycie na próbkę nabłonkiem skierowanym do góry. Umieść czyste szkiełko nakrywkowe z krzemionki dostarczone z uchwytem na próbkę na wierzchu rogówki. Następnie zamknij uchwyt, delikatnie obracając jego podstawę, aż próbka zostanie lekko spłaszczona i unieruchomiona pod szkiełkiem nakrywkowym, zapewniając stosunkowo równą powierzchnię obrazowania.
Podejmij środki ostrożności, aby uniknąć pęcherzyków powietrza. Nałóż grubą warstwę żelu okulistycznego lub optycznego na szkiełko nakrywkowe jako medium zanurzeniowe. Zainicjuj urządzenie, włączając wyłącznik zasilania z tyłu urządzenia.
Świecenie się zielonej diody LED z przodu urządzenia wskazuje, że zasilanie jest włączone. Upewnij się, że stolik do obrazowania jest czysty, z wyjątkiem ruchomej tacy. Następnie kliknij OK w oprogramowaniu do akwizycji, aby zainicjować silniki po wyświetleniu monitu.
Aby skonfigurować urządzenie, należy wprowadzić identyfikator próbki w wyznaczonym i obowiązkowym polu. Opcjonalnie wprowadź przykładowy opis i opis badania. Następnie kliknij przycisk Uzyskaj obraz makra, aby utworzyć migawkę próbki, która może być później używana do celów pozycjonowania bocznego i nawigacji.
Po spełnieniu oczekiwań zweryfikuj obraz po wyświetleniu monitu, klikając przycisk Tak. Po czym urządzenie przesunie tacę na próbki pod obiektyw i wykona automatyczną regulację. Przed kontynuowaniem upewnij się, że obiektyw mikroskopu jest dobrze zanurzony w żelu optycznym.
Przygotuj akwizycję, przechodząc do karty Eksploruj. Przed uzyskaniem stosu obrazów przejdź do środka rogówki za pomocą joysticka lub ręcznego wyboru na ekranie. Zmieniaj głębokość obrazowania poprzez obracanie joysticka, regulację suwaka lub ręczne wprowadzanie danych z klawiatury w graficznym interfejsie użytkownika.
Następnie dostosuj wartość uśrednienia do 40, aby uzyskać optymalne obrazowanie rogówki. Wprowadź wartość powierzchni rogówki lub lokalizację pierwszego obrazu w polu głębi. Następnie wybierz kartę Pobierz, aby pobrać obrazy.
Wybierz i ustaw odstępy między warstwami odpowiadające rozdzielczości osiowej urządzenia. Wprowadź wartość grubości rogówki w polu Liczba plasterków. Przejrzyj parametry i czas akwizycji.
A gdy będziesz zadowolony, naciśnij OK, aby uruchomić przejęcie. Podczas akwizycji należy unikać kontaktu ze stołem, na którym ustawiony jest mikroskop. Aby ocenić grubość warstwy zrębu i Bowmana, zmierz odległości przekrojów rogówki.
Na przykład dodaj pięć równomiernie rozmieszczonych punktów w poprzek przekroju poprzecznego, zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Narysuj linię między dwoma punktami o znanej odległości zgodnie z domyślnym polem widzenia. Następnie przejdź do zakładki Analiza i wybierz opcję Ustaw skalę.
Wprowadź znaną odległość i jednostkę długości w odpowiednich polach. Ustaw na 1024 piksele lub 780 mikrometrów i kliknij przycisk OK. Narysuj linię między dwoma punktami o nieznanej odległości i odczytaj długość lub odległość zmierzoną bezpośrednio z paska stanu. Zapisać średnią i współczynnik zmienności.
Kliknij kartę Obraz i wybierz opcję Reslice Z w obszarze Stosy, aby określić gęstość keratynocytów. Spowoduje to zsumowanie obrazów zrębu en face w grupach po siedem, aby uzyskać warstwy o porównywalnej grubości. W celu dalszej analizy uwzględnij wszystkie dostępne wycinki en face dla najbardziej przedniego zrębu, 15 obrazów dla zrębu przedniego, pięć obrazów dla zrębu środkowego i pięć obrazów dla zrębu tylnego.
Na każdym obrazie przybliżonym wybierz obszar zainteresowania o wymiarach 300 na 300 mikrometrów. Aby poprawić wizualizację jądra, odwróć obraz za pomocą opcji Odwróć na karcie Edycja. Dostosuj kontrast i jasność, klikając kartę Obraz i przechodząc do opcji Jasność-Kontrast.
Aby ręcznie policzyć jądra komórek, przejdź do Wtyczki i przejdź do Licznik komórek na karcie Analizuj. Naciśnij Inicjuj, a następnie wybierz typ licznika. Następnie policz jądra komórkowe, klikając ciemne owalne elementy na odwróconym obrazie, biorąc pod uwagę te, które lądują na obramowaniu obrazu tylko dla dwóch z czterech stron obrazu.
Wyselekcjonowana rogówka ludzkiego dawcy była spuchnięta po przechowywaniu w pożywce do hodowli narządów, co dawało patofizjologiczny model obrzęku rogówki i uniemożliwiało uzyskanie obrazu na całej grubości rogówki ze względu na ograniczoną głębokość penetracji. Przeniesienie do pożywki do hodowli narządów uzupełnionej dekstryną zmniejszyło obrzęk i spowodowało uzyskanie rogówki dawcy o normalnej grubości. Chore rogówki rozpoznano po zmianach morfologicznych i typowych cechach zrębu, w tym zmniejszeniu zmiennej grubości zrębu lub warstwy Bowmana.
Ocena gęstości keratynocytów i odbicia zrębu dodatkowo pomogła w analizie histologicznej i różnicowaniu prawidłowych i patologicznych tkanek rogówki za pomocą pełnopolowej optycznej mikroskopii koherentnej, co wykracza poza możliwości klinicznych systemów optycznej koherentnej tomografii. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić jakościową i ilościową analizę histologiczną zrębu rogówki, co pozwala na odróżnienie choroby od normalnych tkanek rogówki człowieka.
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje zastosowanie pełnopolowej mikroskopii optycznej koherencyjnej do oceny jakości zrębu rogówki dawcy. Metoda ta ma na celu usprawnienie przesiewu tkanek dawców, co przyczynia się do poprawy wyników keratoplastyki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikroskopia optycznej koherencji
- Ocena stanu zdrowia rogówki
- Transplantacja tkanek
Wstęp
- Jakość tkanki rogówki od dawcy jest kluczowa dla powodzenia transplantacji.
- Obecne metody mogą nie zapewniać wystarczającej szczegółowości niezbędnej do oceny.
- Techniki obrazowania o wysokiej rozdzielczości mogą poprawić możliwości diagnostyczne.
- Pełnopolowa mikroskopia optyczna koherencyjna oferuje zalety w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
Cel badania
- W celu usprawnienia procesu przesiewowego i selekcji tkanek rogówki od dawców.
- W celu zapewnienia wysokorozdzielczej oceny stanu zdrowia rogówki.
- W celu odróżnienia prawidłowych tkanek rogówki od tkanek chorobowych.
Zastosowane metody
- Rogówka jest zanurzona w medium do przechowywania podczas obrazowania.
- Zastosowanie żelu optycznego jako medium imersyjnego w celu poprawy jakości obrazowania.
- Akwizycja obrazów obejmuje ustawienie parametrów głębokości oraz odstępów między przekrojami.
- Analiza gęstości keratynocytów i odblaskowości zrębu w celu oceny histologicznej.
Główne wyniki
- Metoda ta umożliwia analizę jakościową i ilościową tkanek rogówki.
- Skutecznie rozróżnia ona prawidłowy stan rogówki od stanów patologicznych.
- Możliwa jest ocena grubości zrębu oraz gęstości keratynocytów.
- Wykazano zdolność do identyfikacji zmian morfologicznych wskazujących na chorobę.
Wnioski
- Pełnopolowa mikroskopia optycznej koherencji jest cennym narzędziem w ocenie rogówki.
- Technika ta usprawnia selekcję tkanek donora do transplantacji.
- Umożliwia ona uzyskanie informacji o stanie zdrowia rogówki, które nie są dostępne przy zastosowaniu standardowych metod.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ocena jakości zrębu w dawczych przeszczepach rogówki jest kluczowa dla zmniejszenia odsetka niepowodzeń przeszczepów w procedurach keratoplastyki. Pełnoobszarowa mikroskopia optyczna z koherencją pozwala na wysokorozdzielcze, nieinwazyjne obrazowanie 3D zrębu rogówki, dostarczając ilościowych wskaźników, takich jak grubość zrębu i gęstość keratynocytów. Możliwość ta wspiera lepszy dobór tkanek dawczych w bankach tkanek oka poprzez identyfikację cech patologicznych, które mogłyby pogorszyć wyniki transplantacji.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie mikrostruktury zrębu w celu wyjaśnienia mechanizmów patogennych w modelach chorób rogówki.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalne, bezznakowe obrazowanie świeżej lub utrwalonej tkanki ex vivo bez konieczności jej sekcjonowania lub barwienia.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Umożliwia przygotowanie zwalidowanego zrębu rogówki do dalszych etapów przepływu pracy w zakresie screeningu biomarkerów i fenotypów.
- Wartość operacyjna: Wspiera standaryzację testów poprzez ilościowe obrazowanie en face oraz regulowaną odległość między przekrojami, co zapewnia spójną analizę zrębu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Umożliwia analizę cech zrębu zbliżoną do badań histologicznych w celu odróżnienia tkanki zdrowej od chorobowej, co wspiera walidację modeli przedklinicznych.
- Wartość operacyjna: Oferuje nieniszczącą metodę podłużnej oceny zrębu w systemach hodowli organów.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta integruje się z procesami badawczymi, dostarczając ilościowych odczytów ze stromy, które stanowią podstawę do decyzji o kontynuacji lub przerwaniu procedury w ramach oceny tkanki rogówki przed transplantacją.
- Biologia odkryć: Umożliwia pomiar grubości zrębu i gęstości keratynocytów w celu oceny stanu tkanek i progresji choroby.
- Screening: Zapewnia powtarzalne, wysokorozdzielcze obrazowanie 3D architektury zrębu do standaryzowanej oceny tkanek dawców.
- Analityka: Generuje dane ilościowe, w tym refleksyjność zrębu i intensywność obrazu en face, do analizy porównawczej w różnych stanach.
- Badania translacyjne: Wspiera ciągłość procesu od screeningu dawców do przeszczepu klinicznego poprzez identyfikację cech zrębu pozwalających przewidzieć sukces przeszczepu.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę obrazowania do oceny zrębu rogówki w wielu partiach tkanek dawców i modelach chorób.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność prognostyczną w ocenie stanu zdrowia zrębu dzięki ilościowej analizie przypominającej histologię.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność i standaryzację dzięki imersji w zamkniętej komorze oraz konsekwentnemu stosowaniu żelu optycznego.
- Wartość strategiczna: Redukuje ryzyko biologiczne na późnych etapach poprzez usprawnienie selekcji tkanek dawców i zmniejszenie częstotliwości odrzutów przeszczepów.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację przeszczepów rogówki z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o wskaźniki jakości zrębu.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikroskopii optycznej oraz oprogramowania do analizy obrazu w celu pomiaru grubości zrębu i gęstości keratynocytów.
- Zależy od zastosowania systemu pełnopolowej optycznej mikroskopii koherencyjnej z możliwością imersji w żelu optycznym.
- Wymaga standaryzacji parametrów obrazowania, takich jak odstępy między przekrojami, wartość uśredniania oraz rozmiar obszaru zainteresowania.
- Wiąże się z koniecznością uwzględnienia adaptacji do zmiennej grubości rogówki i stanów obrzęku w hodowli organowej.
- Ograniczone przez głębokość penetracji w tkankach silnie obrzękniętych, co wymaga wstępnego przygotowania w celu zmniejszenia obrzęku dla oceny pełnej grubości.
Najczęściej zadawane pytania (FAQ) dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:47
Sample Preparation
1:31
FF‐OCM Initialization, Setup, and Image Acquisition
3:48
Image Analysis: Qualitative and Quantitative Assessment of Stromal Morphology and Features
6:08
Results: Qualitative and Quantitative Assessment of Corneal Donor Stroma
7:21
Conclusion
