Name: Pełnopolowa optyczna mikroskopia koherentna do histologicznej analizy cech zrębu w przeszczepach rogówki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Poznaj pełnopolową optyczną mikroskopię koherentną do analizy zrębu rogówki dawcy. Ta metoda umożliwia jakościową i ilościową ocenę tkanek, poprawiając selekcję przeszczepów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca otrzymała dofinansowanie z Agence Nationale de Recherche (ANR), w ramach grantu PRTS (Projet de Recherche Translationelle en Santé) nr ANR-13-PRTS-0009 (V.B.) oraz z programu Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji w ramach umowy o grant nr 709104 (K.I.) Marie Skłodowska-Curie. Autorzy dziękują Céline de Sousa za pomoc w liczeniu komórek i przetwarzaniu histologicznym.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały przeprowadzone zgodnie z założeniami Deklaracji Helsińskiej i przestrzegały międzynarodowych wymagań etycznych dotyczących tkanek ludzkich. Było to prospektywne obserwacyjne badanie kliniczno-kontrolne. Uzyskano świadomą zgodę pacjentów. Nie wprowadzono żadnych modyfikacji do francuskich standardów leczenia ani obserwacji. Uzyskano zgodę Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej (IRB) od Komitetu Ochrony Pacjentów, Ile-de-France V (14944).
1. Wybór i przygotowanie tkanek
<ol>
	<li>Wybierz rogówkę dawcy.
	<ol>
		<li>Przenieś rogówki dawcy przechowywane w pożywce do hodowli narządów26 do pożywki do hodowli narządów uzupełnionej dekstranem na 3 dni, aby umożliwić deturgescencję27 przed obrazowaniem FF-OCM28 (patrz Tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj próbki.
	<ol>
		<li>Umieścić rogówkę, zanurzoną w podłożu do przechowywania, w uchwycie na próbkę nabłonkiem skierowanym do góry.</li>
		<li>Umieść czyste szkiełko nakrywkowe z krzemionki (dostarczone z uchwytem próbki) na rogówce i zamknij uchwyt, delikatnie obracając jego podstawę, aż próbka zostanie lekko spłaszczona i unieruchomiona pod szkiełkiem nakrywkowym, zapewniając stosunkowo równą powierzchnię obrazowania. Podejmij środki ostrożności, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Nałóż grubą warstwę żelu okulistycznego lub optycznego na szkiełko nakrywkowe jako medium zanurzeniowe.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Inicjalizacja, konfiguracja i akwizycja obrazu FF-OCM
<ol>
	<li>Zainicjuj urządzenie.
	<ol>
		<li>Włącz urządzenie, naciskając wyłącznik zasilania z tyłu urządzenia; świecenie się zielonej diody LED z przodu urządzenia wskazuje, że zasilanie jest włączone.</li>
		<li>Włącz dedykowany komputer i halogenowe źródło światła, naciskając wyłącznik zasilania z przodu.</li>
		<li>Uruchom oprogramowanie do akwizycji (patrz Spis materiałów), klikając dwukrotnie skrót na pulpicie.</li>
		<li>Upewnij się, że stolik do obrazowania jest czysty, z wyjątkiem ruchomej tacy. Następnie kliknij "OK", aby zainicjować silniki po wyświetleniu monitu.</li>
		<li>Wyciągnij tackę i włóż uchwyt na próbkę do dedykowanego pojemnika, a następnie delikatnie popchnij tackę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skonfiguruj urządzenie.
	<ol>
		<li>W wyznaczonym i obowiązkowym polu należy wpisać "identyfikator próbki"; opcjonalnie można wpisać "opis próbki" i/lub "opis badania".</li>
		<li>Kliknij "Uzyskaj obraz makro", gdy będziesz gotowy, aby utworzyć migawkę próbki, którą można później wykorzystać do pozycjonowania bocznego i nawigacji; po spełnieniu oczekiwań, zatwierdź obraz po wyświetleniu monitu, klikając "Tak", po czym urządzenie przesunie tacę na próbkę pod obiektyw i wykona automatyczną regulację.</li>
		<li>Przed kontynuowaniem upewnij się, że obiektyw mikroskopu jest dobrze zanurzony w żelu optycznym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zdobądź stosy.
	<ol>
		<li>Wybierz zakładkę "Eksploruj", aby przygotować przejęcie.
		<ol>
			<li>Przed uzyskaniem stosu obrazów przejdź do środka rogówki, poprzez przesunięcie joysticka lub ręczny wybór na ekranie (to znaczy klikając i przeciągając czerwony kwadrat na uzyskanym obrazie makro w żądane miejsce).</li>
			<li>Zmieniaj głębokość obrazowania poprzez obracanie joysticka, regulację suwaka lub ręczne wprowadzanie danych z klawiatury w graficznym interfejsie użytkownika (GUI) i dostosuj wartość uśredniania (uśrednienie 40 jest ogólnie zalecane w celu optymalnego obrazowania rogówki). 
			UWAGA: Ma to na celu określenie grubości próbki rogówki i uśrednienia niezbędnego do zobrazowania całej grubości rogówki, przy jednoczesnym odnotowywaniu w głębi pierwszego i ostatniego obrazu. Dolna powierzchnia szkiełka nakrywkowego tworzy równoległe prążki interferencyjne, które są widoczne na obrazie tomograficznym (po prawej stronie graficznego interfejsu użytkownika), co ułatwia zlokalizowanie powierzchni rogówki.</li>
			<li>Wprowadź wartość powierzchni rogówki lub lokalizację pierwszego obrazu w głębi w polu "Głębokość".</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wybierz zakładkę "Nabierz", aby pobrać obrazy.
		<ol>
			<li>Wybierz "Odstępy między plasterkami" (domyślne i zalecane ustawienie to 1 μm, odpowiadające rozdzielczości osiowej urządzenia) i wprowadź odpowiednią wartość grubości rogówki w polu "Liczba plastrów".</li>
			<li>Przejrzyj parametry i czas akwizycji, a gdy będziesz zadowolony, naciśnij "OK", aby rozpocząć akwizycję.</li>
			<li>Podczas akwizycji należy unikać kontaktu ze stołem, na którym umieszczony jest FF-OCM.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Zarządzanie pozyskanymi obrazami
<ol>
	<li>Przeglądaj i eksportuj obrazy.
	<ol>
		<li>Uruchom oprogramowanie do przeglądania FF-OCM (patrz Spis materiałów), klikając dwukrotnie skrót na pulpicie; pozyskane obrazy (identyfikowane przez identyfikator próbki) pojawiają się na liście "Badania lokalne".</li>
		<li>Wybierz badanie z odpowiednim identyfikatorem próbki, które zawiera zarówno obraz makro, jak i uzyskany stos obrazów, a następnie "wyeksportuj" ten ostatni, klikając prawym przyciskiem myszy serię obrazów i wybierając format "DICOM", aby zachować surowe dane pikseli i metadane do dalszej analizy.</li>
		<li>Wyświetlaj stosy obrazów 3D w widokach en face i przekrojowych za pomocą trybu rekonstrukcji wielopłaszczyznowej (MPR), klikając dwukrotnie serię obrazów; poruszaj się po obrazach (np. za pomocą przewijania kółka myszy lub regulacji suwaka) i wybierz reprezentatywne widoki en face i przekroje poprzeczne każdego stosu.</li>
		<li>Wyeksportuj wybrane widoki, klikając ikonę w prawym dolnym rogu okna, używając formatu "DICOM".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Importowanie obrazów.
	<ol>
		<li>Otwórz oprogramowanie do przetwarzania obrazów (patrz Spis materiałów), klikając dwukrotnie skrót na pulpicie i przejdź do "Bio-Formats" "Importer" w sekcji "Wtyczki", aby zaimportować obrazy DICOM; upewnij się, że w oknie "Opcje importu bioformatów" jest zaznaczona opcja "Grupuj pliki o podobnych nazwach".</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza obrazu: jakościowa i ilościowa ocena morfologii i cech zrębu
<ol>
	<li>Oceń grubość warstwy zrębu i Bowmana.
	<ol>
		<li>Ręczne pomiary odległości na przekrojach rogówki, na przykład w pięciu równomiernie rozmieszczonych punktach w przekroju poprzecznym25.
		<ol>
			<li>Narysuj linię między dwoma punktami o znanej odległości (np. od lewej do prawej od całego obrazu, czyli zgodnie z domyślnym polem widzenia, 1,024 pikseli lub 780 μm), przejdź do "Analizuj" i wybierz "Ustaw skalę", a następnie wprowadź "Znana odległość" i "Jednostka długości" w odpowiednich polach i kliknij "OK".</li>
			<li>Narysuj linię między dwoma punktami o nieznanej odległości; odczytaj długość lub odległość mierzoną bezpośrednio od paska stanu.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zapisać średnią i współczynnik zmienności (COV). Grubość warstwy Bowmana mniejsza niż 6,5 μm i COV większy niż 18,6% były związane z nieprawidłowym zrębem rogówki25.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ gęstość keratocytów.
	<ol>
		<li>Zgodnie z konwencją mikroskopii konfokalnej: sumuj obrazy zrębu en face w grupach po 7, aby uzyskać plastry o porównywalnej grubości. W tym celu przejdź do zakładki "Obraz" i wybierz "Pokrój ponownie Z" w sekcji "Stosy".</li>
		<li>Weź pod uwagę różną (malejącą) gęstość komórek podczas progresji przez zrąb24,25. W tym celu można uznać, że zrąb składa się z 4 regionów w zależności od głębokości: (1) bardzo przedniego zrębu poniżej warstwy Bowmana, czyli 2% całej grubości zrębu; Pozostały zrąb (czyli 98% całej grubości zrębu), z trzema strefami o identycznej grubości: (2) zrębem przednim, (3) zrębem środkowym i (4) zrębem tylnym.</li>
		<li>W celu dalszej analizy uwzględnij wszystkie dostępne wycinki en face dla zrębu przedniego, 15 obrazów dla zrębu przedniego, 5 obrazów dla zrębu środkowego, a także 5 obrazów dla zrębu tylnego (gdzie liczba obrazów na region wymagana do wiarygodnego zliczenia została określona przez analizę krokową29).</li>
		<li>Na każdym obrazie en face wybierz obszar zainteresowania o wymiarach 300 μm x 300 μm. Aby poprawić wizualizację jądra, odwróć obraz za pomocą opcji "Odwróć" w zakładce "Edycja" i dostosuj kontrast i jasność. W przypadku tych ostatnich przejdź do "Obraz" i przejdź do "Jasność/Kontrast" w sekcji "Analizuj".</li>
		<li>Ręcznie policz jądra komórkowe, używając na przykład funkcji "licznik komórek"25. W tym celu przejdź do "Wtyczki" i przejdź do "Licznik komórek" w sekcji "Analizuj". Naciśnij "inicjalizuj", a następnie wybierz typ licznika. Następnie zacznij liczyć jądra komórki, klikając ciemne owalne cechy na odwróconym obrazie, biorąc pod uwagę te, które lądują na obramowaniu obrazu tylko dla dwóch z czterech stron obrazu25.</li>
		<li>Zapisz gęstość komórek pod względem gęstości powierzchniowej, czyli w komórkach/mm² (podziel liczbę komórek zliczonych przez 0,09, aby przeliczyć z komórek/90 000 μm² na komórki/mm²), zgodnie z konwencją mikroskopii konfokalnej, w której wykazano, że gęstość keratocytów jest niższa u pacjentów (np. ze stożkiem rogówki) niż u zdrowych osób i jest skorelowana z ciężkością choroby25. 
UWAGA: Konieczne są dalsze badania kliniczne w celu ustalenia, czy minimalny próg gęstości keratocytów jest wymagany do uzyskania idealnie czystego przeszczepu rogówki po przeszczepie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oceń współczynnik odbicia zrębu.
	<ol>
		<li>Generuj profile średniej intensywności głębokości stosów obrazów zrębowych, korzystając na przykład z funkcji "Profil osi Z" i/lub niestandardowego oprogramowania25,30,31. 
		UWAGA: W rzeczywistości są to profile głębokości amplitudy, ponieważ FF-OCM mierzy amplitudę światła wstecznie rozproszonego przez próbkę, a nie jego intensywność.  
		<ol>
			<li>Oblicz średni poziom szarości dla każdego stosu na powierzchni.</li>
			<li>Odejmij minimalną wartość szarości i znormalizuj przez maksymalną wartość szarości.</li>
			<li>Wyświetlanie w skali logarytmicznej w funkcji głębokości zrębu (% grubości zrębu).</li>
			<li>Przybliż wynikowy profil logarytmiczny za pomocą linii regresji liniowej, która minimalizuje sumę reszt kwadratowych (dopasowanie metodą najmniejszych kwadratów).</li>
			<li>Zapisz wartość R-kwadrat (R²) jako miarę liniowości. Wartości poniżej 0,94 mogą wskazywać na patologię rogówki25. 
			UWAGA: Aby odróżnić nieadekwatność liniowego modelu regresji logarytmicznej (lub modelu rozpadu monowykładniczego) spowodowaną obecnością patologii od zwykłego szumu pomiarowego, można przeprowadzić analizę sygnału za pomocą wnioskowania bayesowskiego31. Również w rogówkach z liniowymi logarytmicznymi (lub monowykładniczymi) profilami głębokości zrębu (np. reprezentowanymi przez wartości R-kwadrat30 lub Birge ratios31 close to 1), obliczenie średniej ścieżki wolnej od fotonów na podstawie szybkości zaniku sygnału może być wykorzystane do dalszego ilościowego określenia stopnia przezroczystości31.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oceń widoczność innych cech zrębu i wskaźników choroby.
	<ol>
		<li>Sprawdź, czy nie ma blizn, tkanki zwłóknieniowej, jezior lub rozstępów Vogta.</li>
		<li>Oceń średnią grubość nerwów w zrębie, jeśli jest wystarczająco widoczna do pomiaru24.
		<ol>
			<li>Wybierz jeden obraz en face, na którym nerw zrębowy jest najbardziej widoczny (zwykle w środkowej części zrębu).</li>
			<li>Zmierz grubość nerwu, na przykład w pięciu punktach24, a następnie oblicz średnią i odchylenie standardowe. Grubość nerwu powyżej 9 μm może być dodatkowym wskaźnikiem patologii, takim jak stożek rogówki24.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Pascolini, D., Mariotti, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+estimates+of+visual+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Global estimates of visual impairment.</a> Br J Ophthalmol. 96, 614-618 (2010).</li>
<li>Shimazaki, J., Shimmura, S., Ishioka, M., Tsubota, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Randomized+clinical+trial+of+deep+lamellar+keratoplasty+vs+penetrating+keratoplasty%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Randomized clinical trial of deep lamellar keratoplasty vs penetrating keratoplasty.</a> Am J Ophthalmol. 134, 159-165 (2002).</li>
<li>Tsubota, K., Kaido, M., Monden, Y., Satake, Y., Bissen-Miyajima, H., Shimazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+surgical+technique+for+deep+lamellar+keratoplasty+with+single+running+suture+adjustment%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">A new surgical technique for deep lamellar keratoplasty with single running suture adjustment.</a> Am J Ophthalmol. 126, 1-8 (1998).</li>
<li>Busin, M., Zambianchi, L., Arffa, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microkeratome-assisted+lamellar+keratoplasty+for+the+surgical+treatment+of+keratoconus%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Microkeratome-assisted lamellar keratoplasty for the surgical treatment of keratoconus.</a> Ophthalmology. 112, 987-997 (2005).</li>
<li>Amayem, A. F., Anwar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+lamellar+keratoplasty+in+keratoconus%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Fluid lamellar keratoplasty in keratoconus.</a> Ophthalmology. 107, 76-79 (2000).</li>
<li>Borderie, V. M., Guilbert, E., Touzeau, O., Laroche, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graft+rejection+and+graft+failure+after+anterior+lamellar+versus+penetrating+keratoplasty%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Graft rejection and graft failure after anterior lamellar versus penetrating keratoplasty.</a> Am J Ophthalmol. 151, 1024-1029 (2011).</li>
<li>Borderie, V. M., Sandali, O., Bullet, J., Gaujoux, T., Touzeau, O., Laroche, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+results+of+deep+anterior+lamellar+versus+penetrating+keratoplasty%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Long-term results of deep anterior lamellar versus penetrating keratoplasty.</a> Ophthalmology. 119, 249-255 (2012).</li>
<li>Koo, T. S., Finkelstein, E., Tan, D., Mehta, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incremental+cost-utility+analysis+of+deep+anterior+lamellar+keratoplasty+compared+with+penetrating+keratoplasty+for+the+treatment+of+keratoconus%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Incremental cost-utility analysis of deep anterior lamellar keratoplasty compared with penetrating keratoplasty for the treatment of keratoconus.</a> Am J Ophthalmol. 152, 40-47 (2011).</li>
<li>Bahar, I., Kaiserman, I., Srinivasan, S., Ya-Ping, J., Slomovic, A. R., Rootman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+different+techniques+of+corneal+transplantation+for+keratoconus%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Comparison of three different techniques of corneal transplantation for keratoconus.</a> Am J Ophthalmol. 146, 905-912 (2008).</li>
<li>Bahar, I., Kaiserman, I., Srinivasan, S., Ya-Ping, J., Slomovic, A. R., Rootman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longterm+results+of+deep+anterior+lamellar+keratoplasty+for+the+treatment+of+keratoconus%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Longterm results of deep anterior lamellar keratoplasty for the treatment of keratoconus.</a> Am J Ophthalmol. 151, 760-767 (2011).</li>
<li>Cheng, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+loss+and+visual+outcome+of+deep+anterior+lamellar+keratoplasty+versus+penetrating+keratoplasty%3A+a+randomized+multicenter+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell loss and visual outcome of deep anterior lamellar keratoplasty versus penetrating keratoplasty: a randomized multicenter clinical trial.</a> Ophthalmology. 118, 302-309 (2011).</li>
<li>Borderie, V. M., Sandali, O., Bullet, J., Guilbert, E., Goldschmidt, P., Laroche, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+tissue+selection+for+anterior+lamellar+keratoplasty%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Donor tissue selection for anterior lamellar keratoplasty.</a> Cornea. 32, 1105-1109 (2013).</li>
<li>Borderie, V., Martinache, C., Sabolic, V., Touzeau, O., Laroche, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+microscopic+evaluation+of+human+donor+corneal+stroma+during+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmol+Scand%22%5BJournal%5D)">Light microscopic evaluation of human donor corneal stroma during organ culture.</a> Acta Ophthalmol Scand. 76, 154-157 (1998).</li>
<li>Bald, M. R., Stoeger, C., Galloway, J., Tang, M., Holiman, J., Huang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fourier-domain+optical+coherence+tomography+to+evaluate+anterior+stromal+opacities+in+donor+corneas%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ophthalmol.+2013%22%5BJournal%5D)">Use of fourier-domain optical coherence tomography to evaluate anterior stromal opacities in donor corneas.</a> J Ophthalmol. 2013. 397680, (2013).</li>
<li>Huang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical coherence tomography.</a> Science. 254, 1178-1181 (1991).</li>
<li>Swanson, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+retinal+imaging+by+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Lett%22%5BJournal%5D)">In vivo retinal imaging by optical coherence tomography.</a> Opt Lett. 18, 1864-1866 (1993).</li>
<li>Izatt, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micrometer-scale+resolution+imaging+of+the+anterior+eye+in+vivo+with+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Micrometer-scale resolution imaging of the anterior eye in vivo with optical coherence tomography.</a> Arch Ophthalmol. 112, 1584-1589 (1994).</li>
<li>Stave, J., Zinser, G., Grummer, G., Guthoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+Heidelberg+retinal+tomograph+HRT.+Initial+results+of+in+vivo+presentation+of+corneal+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmologe%22%5BJournal%5D)">Modified Heidelberg retinal tomograph HRT. Initial results of in vivo presentation of corneal structures.</a> Ophthalmologe. 99, 276-280 (2002).</li>
<li>Beaurepaire, E., Boccara, A. C., Lebec, M., Blanchot, L., Saint-Jalmes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-field+optical+coherence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Lett%22%5BJournal%5D)">Full-field optical coherence microscopy.</a> Opt Lett. 23, 244-246 (1998).</li>
<li>Dubois, A., Vabre, L., Boccara, A. C., Beaurepaire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+full-field+optical+coherence+tomography+with+a+Linnik+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Opt%22%5BJournal%5D)">High-resolution full-field optical coherence tomography with a Linnik microscope.</a> Appl Opt. 41, 805-812 (2002).</li>
<li>Ghouali, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-field+optical+coherence+tomography+of+human+donor+and+pathological+corneas%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Full-field optical coherence tomography of human donor and pathological corneas.</a> Curr Eye Res. 24, 1-9 (2014).</li>
<li>Akiba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrahigh-resolution+imaging+of+human+donor+cornea+using+full-field+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Ultrahigh-resolution imaging of human donor cornea using full-field optical coherence tomography.</a> J Biomed Opt. 12, 041202(2007).</li>
<li>Latour, G., Georges, G., Lamoine, L. S., Deumie, C., Conrath, J., Hoffart, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+graft+cornea+and+laser+incisions+imaging+with+micrometer+scale+resolution+full-field+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Human graft cornea and laser incisions imaging with micrometer scale resolution full-field optical coherence tomography.</a> J Biomed Opt. 15, 056006(2010).</li>
<li>Grieve, K., Georgeon, C., Andreiuolo, F., Borderie, M., Ghoubay, D., Rault, J., Borderie, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+microscopic+features+of+keratoconic+corneal+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Imaging microscopic features of keratoconic corneal morphology.</a> Cornea. 35, 1621-1630 (2016).</li>
<li>Borderie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+parameters+in+assessment+of+human+donor+corneal+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmol.+95%22%5BJournal%5D)">New parameters in assessment of human donor corneal stroma.</a> Acta Ophthalmol. 95. 297, e297-e306 (2017).</li>
<li>Borderie, V. M., Scheer, S., Touzeau, O., Vedie, F., Carvajal-Gonzalez, S., Laroche, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+organ+cultured+corneal+tissue+selection+before+penetrating+keratoplasty%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Donor organ cultured corneal tissue selection before penetrating keratoplasty.</a> Br J Ophthalmol. 82, 382-388 (1998).</li>
<li>Borderie, V. M., Baudrimont, M., Lopez, M., Carvajal, S., Laroche, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+deswelling+period+in+dextran-containing+medium+after+corneal+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the deswelling period in dextran-containing medium after corneal organ culture.</a> Cornea. 16, 215-223 (1997).</li>
<li>Tech, L. L. , Light-CT Scanner. http://www.lltechimaging.com/products-applications/products (2017).</li>
<li>Doughty, M. J., Müller, A., Zaman, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+reliability+of+human+corneal+endothelial+cell-density+estimates+using+a+noncontact+specular+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Assessment of the reliability of human corneal endothelial cell-density estimates using a noncontact specular microscope.</a> Cornea. 19, 148-158 (2000).</li>
<li>Irsch, K., Borderie, M., Grieve, K., Plamann, K., Laroche, L., Borderie, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Objective+analysis+of+stromal+light+backscattering+with+full-field+optical+coherence+tomographic+microscopy+shows+potential+to+quantify+corneal+transparency.+Frontiers+in+Optics%5BTitle%5D)+AND+%22OSA+Technical+Digest+%28online%29%2C+paper+FW6A.6%22%5BJournal%5D)">Objective analysis of stromal light backscattering with full-field optical coherence tomographic microscopy shows potential to quantify corneal transparency. Frontiers in Optics.</a> OSA Technical Digest (online), paper FW6A.6. , (2015).</li>
<li>Bocheux, R., Pernot, P., Borderie, V., Plamann, K., Irsch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+measures+of+corneal+transparency%2C+derived+from+objective+analysis+of+depth-resolved+corneal+images%2C+demonstrated+with+full-field+optical+coherence+tomographic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE.+e0221707%22%5BJournal%5D)">Quantitative measures of corneal transparency, derived from objective analysis of depth-resolved corneal images, demonstrated with full-field optical coherence tomographic microscopy.</a> PLoS ONE. e0221707. 14, (2019).</li>
<li>Karimi, A. H., Wong, A., Bizheva, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+detection+and+cell+density+assessment+of+keratocytes+in+the+human+corneal+stroma+from+ultrahigh+resolution+optical+coherence+tomograms%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Automated detection and cell density assessment of keratocytes in the human corneal stroma from ultrahigh resolution optical coherence tomograms.</a> Biomed Opt Express. 2, 2905-2916 (2011).</li>
<li>Ku, J. Y., Niederer, R. L., Patel, D. V., Sherwin, T., McGhee, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+scanning+in+vivo+confocal+analysis+of+keratocyte+density+in+keratoconus%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Laser scanning in vivo confocal analysis of keratocyte density in keratoconus.</a> Ophthalmology. 115, 845-850 (2008).</li>
<li>Ozgurhan, E. B., Kara, N., Yildirim, A., Bozkurt, E., Uslu, H., Demirok, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+corneal+microstructure+in+keratoconus%3A+a+confocal+microscopy+study%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of corneal microstructure in keratoconus: a confocal microscopy study.</a> Am J Ophthalmol. 156, 885-893 (2013).</li>
<li>Erie, J. C., Patel, S. V., McLaren, J. W., Nau, C. B., Hodge, D. O., Bourne, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratocyte+density+in+keratoconus.+A+confocal+microscopy+study%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Keratocyte density in keratoconus. A confocal microscopy study.</a> Am J Ophthalmol. 134, 689-695 (2002).</li>
<li>Imre, L., Resch, M., Nagymihaly, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Konfokale+In-vivo-Hornhautmikroskopie+nach+Keratoplastik%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Konfokale In-vivo-Hornhautmikroskopie nach Keratoplastik.</a> Ophthalmology. 102, 140-146 (2005).</li>
<li>Niederer, R. L., Perumal, D., Sherwin, T., McGhee, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+scanning+in+vivo+confocal+microscopy+reveals+reduced+innervation+and+reduction+in+cell+density+in+all+layers+of+the+keratoconic+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Laser scanning in vivo confocal microscopy reveals reduced innervation and reduction in cell density in all layers of the keratoconic cornea.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 2964-2970 (2008).</li>
<li>Patel, S., McLaren, J., Hodge, D., Bourne, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+human+keratocyte+density+and+corneal+thickness+measurement+by+using+confocal+microscopy+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Normal human keratocyte density and corneal thickness measurement by using confocal microscopy in vivo.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 42, 333-339 (2001).</li>
<li>Komuro, A., Hodge, D. O., Gores, G. J., Bourne, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+during+corneal+storage+at+4+degrees%5BTitle%5D)+AND+%22C.+Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Cell death during corneal storage at 4 degrees.</a> C. Invest Ophthalmol Vis Sci. 40, 2827-2832 (1999).</li>
<li>Gambato, C., Longhin, E., Catania, A. G., Lazzarini, D., Parrozzani, R., Midena, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+and+corneal+layers%3A+an+in+vivo+corneal+confocal+microscopy+study%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Arch+Clin+Exp+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Aging and corneal layers: an in vivo corneal confocal microscopy study.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 253, 267-275 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany tutaj protokół jakościowej i ilościowej oceny zrębu dawcy rogówki za pomocą FF-OCM opiera się na podobnej do histologicznej analizie makroskopowych i mikroskopowych cech wskazujących na stan zrębu, wykraczający poza możliwości OCT w domenie spektralnej i mikroskopii konfokalnej 21,24,25 i umożliwia różnicowanie chorych tkanek od normalnych tkanek ludzkich.
Oprócz doskonałej oceny jakości śródbłonka ludzkich rogówek dawcy za pomocą mikroskopii zwierciadlanej, ocena jakości zrębu jest wyzwaniem w bankach oczu i zazwyczaj ogranicza się do ogólnej obserwacji za pomocą biomikroskopii w lampie szczelinowej i/lub mikroskopii świetlnej w obecnych protokołach. Brak drobnej rozdzielczości przy użyciu istniejących metod oznacza nie tylko, że rogówki z niektórymi chorobami zrębu mogą zostać wybrane, które pogarszają wynik keratoplastyki, ale także, że rogówki mogą zostać odrzucone z powodu zmętnień zrębu, które w rzeczywistości ograniczają przednie zręby lub obszary nabłonka i nadal mogą być stosowane do zabiegów keratoplastyki śródbłonka14.
Obecny protokół banku oczu może być uzupełniony o FF-OCM, który ze względu na swoją doskonałą rozdzielczość stanowi potężne i nieinwazyjne narzędzie do zakończenia oceny jakości rogówki, zwłaszcza zrębu (w tym warstwy Bowmana). W przeciwieństwie do badania w lampie szczelinowej, przeszczep pozostaje zanurzony w zamkniętej komorze wypełnionej nośnikiem pamięci przez cały czas akwizycji obrazu FF-OCM, co zmniejsza potencjalne ryzyko zanieczyszczenia.
W celu pomyślnego uzyskania obrazu za pomocą FF-OCM (patrz Tabela materiałów) ważne jest, aby obiektyw mikroskopu był dobrze zanurzony w żelu optycznym, który jest nakładany na szkiełko nakrywkowe uchwytu próbki (krok 2.2.3). Ponadto zaleca się regularne sprawdzanie kalibracji urządzenia, procedurę, którą należy wykonać również po nieudanej automatycznej regulacji (krok 2.2.2) i uzyskać dostęp za pośrednictwem "Narzędzia i opcje" w oprogramowaniu do akwizycji (patrz tabela materiałów). Procedura, która polega na wykorzystaniu lustra kalibracyjnego w uchwycie próbki, jest taka sama, jak w przypadku zwykłego przygotowania próbki (patrz krok 1.2), z wyjątkiem tego, że żel optyczny należy nałożyć na lustro przed umieszczeniem szkiełka nakrywkowego.
Seria przeszczepów rogówki dawcy, u których stwierdzono prawidłowe zrąb zgodnie z istniejącymi procedurami banku oczu, została wykorzystana do opisania protokołu w tym manuskrypcie i w szczególności wykazania przydatności FF-OCM do precyzyjnej i wiarygodnej oceny jakości zrębu dawcy. Te normalne rogówki dawcy porównano z patologicznymi rogówkami zanurzonymi w pożywce magazynowej, wykazując, że analiza histologiczna, która była możliwa dzięki FF-OCM kilku cech zrębu (zilustrowanych na rycinie 2, rycinie 3, rycinie 4, rycinie 5, rycinie 6, figurze 7 i rycinie 8) w przeszczepach rogówki, pozwala odróżnić chore od normalnych ludzkich tkanek rogówki.
Oprócz zmian morfologicznych, takich jak obecność blizn (ryc. 5 i ryc. 7), tkanki zwłóknieniowej (ryc. 8), jezior (ryc. 2), prążków Vogta (ryc. 4) lub zwiększonej średnicy nerwu zrębu (ryc. 4), w chorej rogówce występują typowe cechy zrębu. Parametrami zrębu szczególnie istotnymi w ocenie jakości zrębu wydają się być grubość warstwy Bowmana i jej zmienność oraz współczynnik odbicia zrębu. Kluczowymi etapami w ramach protokołu są zatem kroki 4.1 i 4.3.
Podczas gdy jest wydzielana podczas rozwoju ludzkiej rogówki, warstwa Bowmana, w szczególności, staje się wyraźna w 19 tygodniu ciąży i nigdy nie naprawia się po urodzeniu32. Uszkodzenie warstwy Bowmana jest zatem nieodwracalne i służy jako idealny wskaźnik wcześniejszego uszkodzenia zrębu w tkance rogówki dawcy, w tym uszkodzeń spowodowanych chirurgią refrakcyjną, zakaźnym zapaleniem rogówki, stożkiem rogówki. Takie choroby rogówki, które stanowią przeciwwskazania do użycia rogówki dawcy, są związane ze zmniejszoną i zmienną grubością warstwy Bowmana z powodu przerwania i bliznowacenia (ryc. 5) i prawdopodobnie zostaną pominięte w obecnych protokołach banku oczu, gdy historia dawcy nie jest dokładnie znana.
Chociaż przezroczystość rogówki jest osłabiona po śmierci dawcy z powodu pośmiertnego obrzęku rogówki, oczekuje się, że ilość światła wstecznie rozproszonego lub odbicia zrębu będzie się zmniejszać wykładniczo wraz z głębokością zrębu (patrz ryc. 3 i ryc. 4A); w rezultacie logarytm znormalizowanego odbicia zrębu będzie funkcją liniową głębokości zrębu w normalnych rogówkach dawcy, reprezentowaną przez wartości R-kwadrat bliskie 1. I odwrotnie, obecność cech makroskopowych jest związana z nieliniowymi logarytmicznymi profilami głębokości i wskazuje na chorobę zrębu (Figura 4B i Figura 7)25.
Ponieważ gęstość keratocytów jest odpowiedzialna za syntezę i odnowę włókien kolagenowych zrębu oraz macierzy zewnątrzkomórkowej, uzasadnione wydaje się założenie, że gęstość keratocytów jest kolejnym istotnym parametrem do oceny jakości zrębu dawcy i że tkanki wykazujące bardzo niską liczbę keratocytów nie powinny być przeszczepiane. Protokół zawiera zatem precyzyjną i wiarygodną metodę pomiaru gęstości keratocytów na podstawie obrazów FF-OCM, która może być łatwo stosowana w bankach oczu25 i jest zgodna z konwencją mikroskopii konfokalnej. Należy zauważyć, że w przypadku FF-OCM gęstość keratocytów można również określić, licząc keratocyty bezpośrednio w widoku przekroju poprzecznym33, co stanowi potencjalną przewagę nad mikroskopią konfokalną, która wymaga liczenia keratocytów na wielu wycinkach en face. Jednak w przeciwieństwie do żywych pacjentów, u których wykazano, że gęstość keratocytów jest niższa u pacjentów z chorobą niż u normalnych osób z grupy kontrolnej 34,35,36,37 i koreluje z ciężkością choroby 34,38, nie miało to miejsca w próbkach tkanek ludzkich ex vivo 25, a dalsze badania są konieczne w celu ustalenia, czy wymagana jest minimalna liczba keratocytów w rogówkach dawcy, aby zapewnić dobrą poprawę wzroku po przeszczepie. Niska gęstość keratocytów w tkance dawcy, podobnie jak w tkance patologicznej, może być wyjaśniona starzeniem się, pośmiertną utratą komórek wywołaną niedokrwieniem i/lub przechowywaniem tkanki dawcy 27,39,40,41. Należy również podkreślić, że normalne rogówki dawcy, które zostały pobrane i zobrazowane w tym protokole, były albo przechowywane i obrzęknięte, albo zopęczniałe, albo zostały wyrzucone przez bank oka przed przeszczepem z powodu złej jakości śródbłonka zgodnie ze standardami Stowarzyszenia Banków Oczu UE. Gdyby obrazowanie FF-OCM wraz z opisanym protokołem zostało włączone do ustawienia banku oczu, rogówki byłyby zazwyczaj oceniane w stanie świeższym niż było to możliwe w tym przypadku, co może wpływać na gęstość keratocytów.
Opisany tutaj protokół analizy jakości zrębu może zostać rozszerzony o ocenę błony Descemeta, którą można również rozwiązać za pomocą FF-OCM pod względem grubości i struktury21,24. Może to okazać się przydatne do selekcji tkanek do keratoplastyki śródbłonka błony Descemeta, gdzie cienkie błony Descemeta mogą być trudniejsze do oddzielenia od zrębu.
Podsumowując, FF-OCM umożliwia precyzyjną i wiarygodną ocenę zrębu rogówki ludzkiego dawcy podczas przechowywania. Poprawiając jakość przeszczepów, dodanie tego protokołu do obecnych procedur bankowania oczu może potencjalnie poprawić badania przesiewowe i selekcję tkanek dawcy, a tym samym wyniki keratoplastyki. Rzeczywista integracja urządzenia FF-OCM z rutyną banku oczu powinna być ułatwiona dzięki najnowszym aktualizacjom technologicznym, w tym szybszej akwizycji obrazu i większemu polu widzenia dzięki opracowaniu niestandardowej kamery CMOS oraz projektowaniu niestandardowych sterylnych jednorazowych kaset do przechowywania i obsługi rogówki podczas obrazowania.

Choroby rogówki są jedną z głównych przyczyn ślepoty na całym świecie1. Niektóre choroby mogą być leczone tylko chirurgicznie, często polegające na wymianie części (np. keratoplastyka blaszkowa) lub całej (tj. keratoplastyka penetrująca) chorej rogówki, za pomocą tkanki dawcy, przeszczepu, pobranego od niedawno zmarłej osoby. W przypadku chorób rogówki, które nie wpływają na śródbłonek (np. stożek rogówki, blizny zrębowe po zakaźnym zapaleniu rogówki, urazach i dystrofiach zrębu), głęboka keratoplastyka blaszkowata przednia (DALK) jest obecnie uważana za technikę chirurgiczną z wyboru2,3,4,5. Technika ta umożliwia zachowanie śródbłonka rogówki biorcy, zastępując tylko centralny nabłonek rogówki i zrąb, co wiąże się z mniejszą częstością odrzucania przeszczepu, brakiem odrzucenia śródbłonka, mniejszą utratą komórek śródbłonka i korzystnym stosunkiem kosztów do opłacalności6,7,8,9,10,11. DALK pozwala ponadto na wykorzystanie rogówek o mniej niż optymalnej jakości śródbłonka jako przeszczepów, ponieważ ta uszkodzona warstwa nie zostanie przeszczepiona12. I odwrotnie, jakość zrębu rogówki dawcy będzie prawdopodobnie głównym czynnikiem ograniczającym powodzenie przeszczepu i odzyskanie wzroku, ponieważ zrąb jest jedyną warstwą rogówki dawcy, która pozostaje, podczas gdy nabłonek dawcy zostanie zastąpiony nabłonkiem biorcy. Niestety, środki do oceny zrębu rogówki dawcy w bankach oczu są ograniczone. Zazwyczaj obejmują one badanie gałki ocznej dawcy w lampie szczelinowej, gdy pobieranie tkanek odbywa się za pomocą enukleacji oraz badanie zrębu dawcy pod mikroskopem świetlnym13. Niektóre banki okulistów zaczęły uzupełniać takie standardowe procedury za pomocą optycznej koherentnej tomografii w domenie Fouriera (FD-OCT)14.
Okulistyczna optyczna koherentna tomografia koherentna (OCT), optyczny odpowiednik obrazowania ultradźwiękowego15, wykorzystuje interferencję szerokopasmowego lub przestrajalnego światła do generowania optycznych przekrojów siatkówki16 i przedniego segmentu17. W OCT w dziedzinie czasu, podstawie wczesnych systemów klinicznych, położenie lustra referencyjnego jest zmienione, tak że wzorce interferencyjne pojawiają się, gdy wiązka referencyjna przebyła prawie tyle samo czasu, co wiązka odbita na różnych interfejsach tkankowych, przy czym skany A są generowane w funkcji czasu. W FD-OCT (zwanym również KTT w dziedzinie spektralnej lub częstotliwości), który jest podstawą większości nowoczesnych systemów klinicznych, lustro referencyjne jest ustalane w jednej pozycji, a pojedynczy skan A, ze wszystkimi wzorcami interferencyjnymi zmieszanymi ze sobą, jest rejestrowany na raz i analizowany za pomocą analizy Fouriera.
Podczas gdy kliniczne (czasowe lub spektralne) systemy OCT pozwalają na przekrojowe widoki rogówki i wykrywanie zmętnień zrębu przy wyższej rozdzielczości osiowej niż biomikroskopia w lampie szczelinowej, ich rozdzielczość boczna jest ograniczona. Mikroskopia konfokalna18 pozwala na badanie rogówki w rozdzielczości bocznej zbliżonej do szczegółów histologicznych, ale jest ograniczona osiowo.
Pełnopolowa optyczna koherentna tomograficzna mikroskopia (FF-OCT lub FF-OCM)19,20 łączy w sobie elementy zarówno mikroskopii konfokalnej, jak i OCT, osiągając rozdzielczość poprzeczną porównywalną do rozdzielczości osiowej około 1 μm. Mówiąc dokładniej, FF-OCM wykorzystuje niespójne szerokopasmowe źródła światła (np. lampę halogenową) i optykę o dużej aperturze numerycznej do uzyskiwania obrazów tomograficznych 2D en face bez skanowania bocznego. Skanując w kierunku głębokości, FF-OCM umożliwia nieinwazyjne obrazowanie 3D świeżych lub utrwalonych próbek tkanek biologicznych ex vivo. Został on użyty do zobrazowania klasy cornea<sup="xref">21,22,23. Zapewniając zarówno widoki en face, jak i przekroje poprzeczne w wysokiej rozdzielczości, FF-OCM dostarcza informacji zarówno o strukturze histologicznej, jak i szczegółach komórkowych rogówki. W rzeczywistości wykazano, że FF-OCM dostarcza informacji strukturalnych lepszych niż histologia i był w stanie zidentyfikować więcej wskaźników choroby, co było możliwe dzięki połączeniu OCT w domenie spektralnej i mikroskopii konfokalnej24,25.
Tutaj opisujemy protokół jakościowej i ilościowej oceny zrębu dawcy rogówki za pomocą FF-OCM. Metoda opiera się na podobnej do histologicznej analizie makroskopowych i mikroskopowych cech wskazujących na stan zrębu, w tym trzech ilościowych parametrów zrębu (tj. grubości warstwy Bowmana i jej zmienności oraz odbicia zrębu). Opisany protokół jest zatem stosowany do prawidłowych i nieprawidłowych tkanek rogówki i umożliwia różnicowanie chorych od normalnych tkanek rogówki ludzkiej.

<table><tbody><tr><td>Light-CT Scanner</td><td>LLTech, Francja</td><td>http://www.lltechimaging.com/products-applications/products/</td> <td>Urządzenie FF-OCM użyte w tym manuskrypcie do obrazowania</td></tr><tr><td>CorneaJet</td><td>EuroBio, Francja</td><td>http://www.eurobio-cornea.com/en/corneamax-10-100-ml-xml-352-822.html</td><td>Pożywka do hodowli narządów, w której przechowywane są rogówki dawcy</td></tr><tr><td>CorneaMax</td><td>EuroBio, Francja</td><td>http://www.eurobio-cornea.com/en/corneajet-10-50-ml-xml-352-823.html</td><td>Pożywka do hodowli narządów z dodatkiem dekstranu stosowana do deturgescencji&nbsp;</td></tr><tr><td>Fidżi (ImageJ)</td><td>National Institute of Health, Bethesda, MD, Stany Zjednoczone</td><td>https://fiji.sc/</td> <td>Oprogramowanie do przetwarzania obrazów typu open source</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks, Inc., Natick, MA, USA</td><td>https://www.mathworks.com/products/matlab.html</td><td>Oprogramowanie do obliczeń matematycznych</td></tr></tbody></table>

pełnopolowa optyczna mikroskopia koherentna do histologicznej analizy cech zrębu w przeszczepach rogówki

Full-Field Optical Coherence Microscopy for Histology-Like Analysis of Stromal Features in Corneal Grafts

Jakość zrębu rogówki dawcy, który stanowi około 90% całkowitej grubości rogówki, prawdopodobnie będzie jednym z głównych, jeśli nie głównym, czynnikiem ograniczającym powodzenie głębokiej przedniej blaszki i penetrującej keratoplastyki. Są to zabiegi chirurgiczne, które polegają na zastąpieniu odpowiednio części lub wszystkich chorych warstw rogówki tkanką dawcy, przeszczepem, pobranym od niedawno zmarłej osoby. Jednak środki do oceny jakości zrębu przeszczepów rogówki w bankach oczu są ograniczone i brakuje im możliwości ilościowej oceny wskaźników choroby w wysokiej rozdzielczości. Pełnopolowa optyczna mikroskopia koherentna (FF-OCM), umożliwiająca obrazowanie 3D w wysokiej rozdzielczości świeżych lub utrwalonych próbek tkanek biologicznych ex vivo, jest nieinwazyjną techniką dobrze nadającą się do oceny rogówki dawcy. W tym miejscu opisano metodę analizy jakościowej i ilościowej zrębu rogówki za pomocą FF-OCM. Protokół został z powodzeniem zastosowany do prawidłowych rogówek dawcy i patologicznych guzików rogówki i może być stosowany do identyfikacji zdrowych i patologicznych cech zarówno na poziomie makroskopowym, jak i mikroskopowym, ułatwiając w ten sposób wykrywanie zaburzeń zrębu, które mogą zagrozić wynikowi keratoplastyki. Poprawiając kontrolę jakości przeszczepów, protokół ten może potencjalnie skutkować lepszą selekcją (i odrzuceniem) tkanek dawcy, a tym samym zmniejszeniem liczby niepowodzeń przeszczepów.

Urządzenie FF-OCM (patrz Tabela materiałów)28 a ogólna konfiguracja wykorzystana w niniejszym manuskrypcie została przedstawiona na Rycina 1. Rycina 2 przedstawia obrzękniętą rogówkę ludzkiego dawcy po przechowywaniu w medium do hodowli organowej, co stanowi patofizjologiczny model rogówki obrzękniętej i uniemożliwia pozyskanie obrazu FF-OCM przez pełną grubość rogówki ze względu na ograniczoną głębokość penetracji. Przeniesienie do medium do hodowli organowej uzupełnionego dekstranem powoduje ustąpienie obrzęku i prowadzi do uzyskania rogówek dawców o prawidłowej grubości, co przedstawiono w Rycina 3Chore rogówki można rozpoznać po zmianach morfologicznych i typowych cechach stromy, w tym po zmniejszonej i zmiennej grubości stromy (Rycina 4) i/lub warstwa Bowmana (Rysunek 5). Ocena gęstości keratocytów (Rycina 6) oraz odblaskowości zrębu (Rysunek 7) może dodatkowo wspomóc analizę histologiczną oraz różnicowanie tkanek rogówki prawidłowych od patologicznych przy użyciu FF-OCM, wykraczając poza możliwości klinicznych systemów OCT (Rycina 8).
<img alt="Układ mikroskopowy i schemat, źródło białego światła, kamera CMOS, obrazowanie próbki, analiza optyczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57104/57104fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat i fotografie ogólnego układu oraz urządzenia FF-OCM wykorzystanego w tej pracy. (A) Fotografia urządzenia FF-OCM (patrz Tabela materiałów)28. (B) Schemat i układ optyczny urządzenia. (C) Fotografia rogówki ludzkiego dawcy w uchwycie na próbkę. (D) Powiększenie obiektywu imersyjnego i uchwytu na próbkę. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57104/57104fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopowy obraz histologicznego przekroju skóry z obszarami wskazanymi strzałkami; analiza struktury tkanki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57104/57104fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Normalna ludzka rogówka w hodowli organowej przed deturgescencją. Przekrój poprzeczny (A) i widok en face (B, przekrój przez zraz) obrzękniętej rogówki spowodowany przechowywaniem w pożywce do hodowli organowej, gdzie jeziora obrzęku są widoczne jako ciemne obszary (wskazane strzałkami). Grubość rogówki wzrosła dwukrotnie, przekraczając 1 100 µm, co uniemożliwiło obrazowanie w całej jej głębokości. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57104/57104fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazy optycznej koherentnej tomografii; schemat struktury tkanki, skala 100 µm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57104/57104fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Normalna ludzka rogówka w hodowli organowej po deturgescencji. Przekrój poprzeczny przez całą rogówkę (A) oraz en face widok zrębowy (B) odobrzękłej rogówki zanurzonej w medium z dodatkiem dekstranu, wykazującej regularnie rozłożone hiperrefleksyjne (białe) keratocyty. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57104/57104fig3large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Porównanie histologiczne tkanek, obrazy mikroskopowe, przedstawiające różne struktury komórkowe, skala 100 μm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57104/57104fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Ogólna ocena morfologii i cech zrębu, w tym grubości zrębu. W porównaniu z prawidłową rogówką ludzką (A), rogówki z keratokonałem (B) charakteryzuje się zmniejszoną i zmienną grubością stromy, a także licznymi, równoległymi prążkami Vogta, widocznymi w przekrojach jako ciemne pionowe pasma, oraz grubymi nerwami stromalnymi, które mogą występować w środkowej części stromy en face przekroje (C). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57104/57104fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazy optycznej koherentnej tomografii warstw skóry; A, B; analiza struktury mikroskopowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57104/57104fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Ocena grubości błony Bowmana, która jest ograniczona z przodu hiperrefleksyjną błoną podstawną nabłonka, a z tyłu hiperrefleksyjnymi keratocytami w najbardziej przedniej części zrębu. W porównaniu z prawidłową rogówką ludzką (A), rogówka patologiczna (np. w keratokonusie) (B) charakteryzuje się zmniejszoną i zmienną grubością błony Bowmana z powodu przerw i bliznowacenia. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57104/57104fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza mikroskopowa; po lewej: obrazowanie mikrostruktury, po prawej: wzór fluorescencji, skala 100 μm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57104/57104fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Ocena gęstości keratocytów. (A) Jądra keratocytów są liczone ręcznie na ulepszonych i odwróconych obrazach en face po wybraniu obszaru zainteresowania o wymiarach 300 µm x 300 µm. (B) Policzone jądra są zaznaczone strzałkami. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57104/57104fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Dane spektroskopowe; log(intensywność) w funkcji głębokości zrębu, wykres z wartościami R², wstawka z obrazem mikroskopowym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57104/57104fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: Ocena odblaskowości zrębu. Ilość światła rozproszonego wstecz maleje (wykładniczo) wraz z głębokością w zrębie rogówek zdrowych dawców (patrz Rycina 3 i Rycina 4A), co skutkuje liniowymi logarytmicznymi profilami głębokości, reprezentowanymi przez wartości R-kwadrat bliskie 1 (linia zielona). Może to nie mieć miejsca w przypadku rogówek patologicznych z obszarami zrębu o zwiększonym rozproszeniu wstecznym światła (patrz Rycina 4B). Obecność takich cech makroskopowych, jak w przykładzie rogówki z blizną w zrębie po zapaleniu rogówki o podłożu infekcyjnym (przedstawione we wstawce), spowoduje zatem nieliniowe logarytmiczne profile głębokości intensywności, reprezentowane przez wartość R-kwadrat poniżej określonego progu (np. niższą niż 0,9425; linia czerwona). Należy zauważyć, że w rzeczywistości przedstawiono logarytmiczne profile głębokości amplitudy, ponieważ FF-OCM mierzy amplitudę światła rozproszonego wstecznie przez próbkę, a nie jego intensywność. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57104/57104fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Porównanie histologiczne i obrazowe, skala 100μm, przekrój tkanki, analiza kontrastu optycznego, mikrostruktura." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57104/57104fig8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8: Demonstracja zalet FF-OCM w stosunku do histologii i SD-OCT. (A) Histologia oraz (B) odpowiadający jej obraz SD-OCT uzyskany z tej samej rogówki in vivo przed keratoplastyką. (C) Odpowiadający przekrój poprzeczny FF-OCM wycinka rogówki ex vivo po keratoplastyce, ilustrujący wyższą rozdzielczość w porównaniu do klinicznych obrazów SD-OCT. Włóknienie jest również wyraźniej widoczne w obrazach FF-OCM niż w badaniu histologicznym. Wysoką gęstość keratocytów w górnej części zrębu można wyraźnie dostrzec zarówno w widoku przekroju poprzecznego (C), jak i w widoku en face (D). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57104/57104fig8large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Opisujemy użycie pełnej koherentnej mikroskopii optycznej jako metody wysokiej jakości oceny zrębu dawcy rogówki. Protokół ten może być stosowany do identyfikacji cech wskazujących na zdrowie lub chorobę i ma na celu poprawę badań przesiewowych i selekcji tkanek dawcy, a tym samym wyników keratoplastyki.

Pełnopolowa optyczna mikroskopia koherentna do histologicznej analizy cech zrębu w przeszczepach rogówki

The quality of donor corneal stroma, which makes up about 90% of total corneal thickness, is likely to be one of the main, if not the major, limiting ...

Metoda ta może poprawić badania przesiewowe i selekcję tkanek dawcy rogówki w bankach oczu, poprawić wyniki przeszczepu rogówki. Główną zaletą tej techniki jest możliwość oceny w wysokiej rozdzielczości oraz to, że rogówka pozostaje zanurzona w zamkniętej komorze wypełnionej nośnikiem pamięci przez cały czas akwizycji obrazu, co zmniejsza potencjalne ryzyko zanieczyszczenia. Procedurę zademonstruje Maelle Vilbert, doktorantka z naszego laboratorium.Na początek umieść rogówkę zanurzoną w podłożu do przechowywania w uchwycie na próbkę nabłonkiem skierowanym do góry. Umieść czyste szkiełko nakrywkowe z krzemionki dostarczone z uchwytem na próbkę na wierzchu rogówki. Następnie zamknij uchwyt, delikatnie obracając jego podstawę, aż próbka zostanie lekko spłaszczona i unieruchomiona pod szkiełkiem nakrywkowym, zapewniając stosunkowo równą powierzchnię obrazowania.Podejmij środki ostrożności, aby uniknąć pęcherzyków powietrza. Nałóż grubą warstwę żelu okulistycznego lub optycznego na szkiełko nakrywkowe jako medium zanurzeniowe. Zainicjuj urządzenie, włączając wyłącznik zasilania z tyłu urządzenia.Świecenie się zielonej diody LED z przodu urządzenia wskazuje, że zasilanie jest włączone. Upewnij się, że stolik do obrazowania jest czysty, z wyjątkiem ruchomej tacy. Następnie kliknij OK w oprogramowaniu do akwizycji, aby zainicjować silniki po wyświetleniu monitu.Aby skonfigurować urządzenie, należy wprowadzić identyfikator próbki w wyznaczonym i obowiązkowym polu. Opcjonalnie wprowadź przykładowy opis i opis badania. Następnie kliknij przycisk Uzyskaj obraz makra, aby utworzyć migawkę próbki, która może być później używana do celów pozycjonowania bocznego i nawigacji.Po spełnieniu oczekiwań zweryfikuj obraz po wyświetleniu monitu, klikając przycisk Tak. Po czym urządzenie przesunie tacę na próbki pod obiektyw i wykona automatyczną regulację. Przed kontynuowaniem upewnij się, że obiektyw mikroskopu jest dobrze zanurzony w żelu optycznym.Przygotuj akwizycję, przechodząc do karty Eksploruj. Przed uzyskaniem stosu obrazów przejdź do środka rogówki za pomocą joysticka lub ręcznego wyboru na ekranie. Zmieniaj głębokość obrazowania poprzez obracanie joysticka, regulację suwaka lub ręczne wprowadzanie danych z klawiatury w graficznym interfejsie użytkownika.Następnie dostosuj wartość uśrednienia do 40, aby uzyskać optymalne obrazowanie rogówki. Wprowadź wartość powierzchni rogówki lub lokalizację pierwszego obrazu w polu głębi. Następnie wybierz kartę Pobierz, aby pobrać obrazy.Wybierz i ustaw odstępy między warstwami odpowiadające rozdzielczości osiowej urządzenia. Wprowadź wartość grubości rogówki w polu Liczba plasterków. Przejrzyj parametry i czas akwizycji.A gdy będziesz zadowolony, naciśnij OK, aby uruchomić przejęcie. Podczas akwizycji należy unikać kontaktu ze stołem, na którym ustawiony jest mikroskop. Aby ocenić grubość warstwy zrębu i Bowmana, zmierz odległości przekrojów rogówki.Na przykład dodaj pięć równomiernie rozmieszczonych punktów w poprzek przekroju poprzecznego, zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Narysuj linię między dwoma punktami o znanej odległości zgodnie z domyślnym polem widzenia. Następnie przejdź do zakładki Analiza i wybierz opcję Ustaw skalę.Wprowadź znaną odległość i jednostkę długości w odpowiednich polach. Ustaw na 1024 piksele lub 780 mikrometrów i kliknij przycisk OK. Narysuj linię między dwoma punktami o nieznanej odległości i odczytaj długość lub odległość zmierzoną bezpośrednio z paska stanu. Zapisać średnią i współczynnik zmienności.Kliknij kartę Obraz i wybierz opcję Reslice Z w obszarze Stosy, aby określić gęstość keratynocytów. Spowoduje to zsumowanie obrazów zrębu en face w grupach po siedem, aby uzyskać warstwy o porównywalnej grubości. W celu dalszej analizy uwzględnij wszystkie dostępne wycinki en face dla najbardziej przedniego zrębu, 15 obrazów dla zrębu przedniego, pięć obrazów dla zrębu środkowego i pięć obrazów dla zrębu tylnego.Na każdym obrazie przybliżonym wybierz obszar zainteresowania o wymiarach 300 na 300 mikrometrów. Aby poprawić wizualizację jądra, odwróć obraz za pomocą opcji Odwróć na karcie Edycja. Dostosuj kontrast i jasność, klikając kartę Obraz i przechodząc do opcji Jasność-Kontrast.Aby ręcznie policzyć jądra komórek, przejdź do Wtyczki i przejdź do Licznik komórek na karcie Analizuj. Naciśnij Inicjuj, a następnie wybierz typ licznika. Następnie policz jądra komórkowe, klikając ciemne owalne elementy na odwróconym obrazie, biorąc pod uwagę te, które lądują na obramowaniu obrazu tylko dla dwóch z czterech stron obrazu.Wyselekcjonowana rogówka ludzkiego dawcy była spuchnięta po przechowywaniu w pożywce do hodowli narządów, co dawało patofizjologiczny model obrzęku rogówki i uniemożliwiało uzyskanie obrazu na całej grubości rogówki ze względu na ograniczoną głębokość penetracji. Przeniesienie do pożywki do hodowli narządów uzupełnionej dekstryną zmniejszyło obrzęk i spowodowało uzyskanie rogówki dawcy o normalnej grubości. Chore rogówki rozpoznano po zmianach morfologicznych i typowych cechach zrębu, w tym zmniejszeniu zmiennej grubości zrębu lub warstwy Bowmana.Ocena gęstości keratynocytów i odbicia zrębu dodatkowo pomogła w analizie histologicznej i różnicowaniu prawidłowych i patologicznych tkanek rogówki za pomocą pełnopolowej optycznej mikroskopii koherentnej, co wykracza poza możliwości klinicznych systemów optycznej koherentnej tomografii. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić jakościową i ilościową analizę histologiczną zrębu rogówki, co pozwala na odróżnienie choroby od normalnych tkanek rogówki człowieka.

full-field-optical-coherence-microscopy-for-histology-like-analysis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Mikroskopia konfokalna rogówki jest nieinwazyjną techniką kliniczną, która może być wykorzystana do ilościowej oceny uszkodzeń włókien C w celu diagnozy i stratyfikacji pacjentów z rosnącym stopniem nasilenia neuropatii.

Konfokalna mikroskopia rogówki: Nowoczesna nieinwazyjna metoda ilościowej oceny patologii małych włókien w neuropatiach obwodowych

Przeszczep śródbłonkowy rogówki jest techniką chirurgiczną stosowaną w leczeniu chorób tylnej części rogówki. Disekcja za pomocą mechanicznego mikrokeratomu w celu przygotowania tkanki pozwala na uzyskanie cieńszych, bardziej symetrycznych graftów, z mniejszą utratą komórek śródbłonka oraz lepszymi efektami terapeutycznymi. Disekcje mogą być przeprowadzane w banku tkanek oka przed zabiegiem transplantacji rogówki.

Przygotowanie tkanki rogówki od dawcy do keratoplastyki śródbłonowej

Opisano metodę obrazowania preparatów z resekcji płuc ex vivo za pomocą obrazowania w dziedzinie częstotliwości optycznych (OFDI) oraz uzyskiwania precyzyjnej korelacji z histologią, co jest niezbędne do opracowania specyficznych kryteriów interpretacji OFDI w patologii płuc. Metoda ta może być zastosowana w przypadku innych typów tkanek i technik obrazowania w celu uzyskania precyzyjnej korelacji obrazowania z histologią dla dokładnej interpretacji i oceny obrazów. Kryteria obrazowania...

Obrazowanie w optycznej domenie częstotliwości próbek resekcji płuc ex vivo: uzyskanie korelacji obrazu z histopatologią w stosunku jeden do jednego

Ten protokół opisuje, jak techniki obrazowania o wysokiej rozdzielczości, takie jak optyczna koherentna tomografia w domenie spektralnej i skaningowa oftalmoskopia laserowa, mogą być wykorzystane u małych gryzoni, przy użyciu systemu platformy obrazowania okulistycznego, aby uzyskać informacje odpowiednio o grubości siatkówki i rozmieszczeniu komórek mikrogleju.

In vivo (in vivo) Obrazowanie myszy reporterowych Cx3cr1gfp/gfp z optyczną koherentną tomografią w domenie spektralnej i skaningową oftalmoskopią laserową

Ten protokół opisuje nowatorski trójwymiarowy model in vitro, w którym komórki zrębu rogówki i zróżnicowane komórki neuronalne są hodowane razem, aby pomóc w badaniu i zrozumieniu interakcji dwóch typów komórek.

Inżynieria tkanki rogówki: model in vitro interakcji zrębu-nerw ludzkiej rogówki

Optyczna tomografia koherentna (OCT), technologia obrazowania trójwymiarowego, została wykorzystana do monitorowania i charakteryzowania kinetyki wzrostu sferoid wielokomórkowych guzów. Wykazano precyzyjną wolumetryczną kwantyfikację sferoid guza przy użyciu metody liczenia wokseli oraz bezznacznikowe wykrywanie martwych tkanek w sferoidach w oparciu o wewnętrzny kontrast tłumienia optycznego.

Podłużne monitorowanie morfologiczne i fizjologiczne trójwymiarowych sferoid nowotworowych za pomocą optycznej koherentnej tomografii

Prezentowana tutaj jest wielofotonowa mikroskopijna platforma do obrazowania powierzchni oka myszy na żywo. Fluorescencyjna mysz transgeniczna umożliwia wizualizację jąder komórkowych, błon komórkowych, włókien nerwowych i naczyń włosowatych na powierzchni oka. Nieliniowe sygnały generujące drugą harmoniczną pochodzące ze struktur kolagenowych zapewniają obrazowanie bez znaczników dla architektur zrębowych.

Niestandardowa platforma mikroskopii wielofotonowej do obrazowania na żywo rogówki i spojówki myszy

Tutaj opisujemy użycie optycznej koherentnej tomografii spektralnej (SD-OCT) do wizualizacji struktur siatkówki i oka in vivo w modelach zwyrodnienia siatkówki, jaskry, retinopatii cukrzycowej i krótkowzroczności.

Strukturalne oceny in vivo chorób oczu w modelach gryzoni przy użyciu optycznej koherentnej tomografii

Przedstawiamy protokół użycia światłowodowej konfokalnej laserowej mikroendoskopii (CLM) do nieinwazyjnego badania czasoprzestrzennego rozkładu liposomów w oku po wstrzyknięciu podspojówkowym.

Przestrzenno-czasowe obrazowanie in vivo ocznych systemów dostarczania leków za pomocą światłowodowej konfokalnej laserowej mikroendoskopii

Ten protokół przedstawia zbiór sarkomerów, wapnia i makroskopowych danych geometrycznych z aktywnie kurczącego się trabecula serca ex vivo. Te równoczesne pomiary są możliwe dzięki integracji trzech modalności obrazowania.

Jednoczesne obrazowanie w jasnym polu, fluorescencji i optycznej koherentnej tomografii kurczących się beleczków serca ex vivo

Stripping Only Descemeta to eksperymentalna procedura, w której pacjenci z centralnym gutem rogówki wynikającym z dystrofii śródbłonka Fuchsa mają usuniętą błonę Descemeta na potrzeby komórek obwodowych w celu regeneracji warstwy śródbłonka. Przedstawiono nowatorską metodologię symulującą DSO w dystroficznych rogówkach ludzkich ex vivo z przyspieszonym gojeniem stymulowanym przez eFGF1 (NM141).

Model hodowli ludzkiego narządu rogówki z usuwaniem Descemeta tylko z przyspieszonym gojeniem stymulowanym przez zmodyfikowany czynnik wzrostu fibroblastów 1

Poznaj pełnopolową optyczną mikroskopię koherentną do analizy zrębu rogówki dawcy. Ta metoda umożliwia jakościową i ilościową ocenę tkanek, poprawiając selekcję przeszczepów.

Pełnopolowa optyczna mikroskopia koherentna do histologicznej analizy cech zrębu w przeszczepach rogówki

Przeglądaj więcej filmów