Analizowanie wielobiałkowych kompleksów sygnalizacyjnych za pomocą oczyszczania powinowactwa z komplementacją bimolekularną (BiCAP)
15 czerwca 2018
Ten manuskrypt opisuje protokół oczyszczania powinowactwa do uzupełnienia bimolekularnego (BiCAP). Ta nowatorska metoda ułatwia specyficzną izolację i dalszą charakterystykę proteomiczną dowolnych dwóch oddziałujących białek, wykluczając jednocześnie nieskompleksowane pojedyncze białka, a także kompleksy utworzone z konkurującymi partnerami wiążącymi.
Ta metoda może pomóc nam odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii i biochemii komórki, takie jak to, w jaki sposób dynamiczne składanie białek i kompleksów białkowych kontroluje szlaki sygnałowe i zachowanie komórek. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy specyficznie wyizolować dwa oddziałujące białka, wykluczając jednocześnie nieskompleksowane pojedyncze białka i konkurujących ze sobą partnerów wiążących. Chociaż używamy tej metody, aby zapewnić wgląd w receptywną dimeryzację kinazy tyrozynowej w raku piersi, można ją również zastosować do każdego innego fizjologicznego otoczenia lub choroby.
Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zdaliśmy sobie sprawę, że GFP nanobody rozpoznał trójwymiarowy epitop GFP i innych białek fluorescencyjnych. Aby rozpocząć, dodaj 150 nanogramów wektora wejściowego, 150 nanogramów wektora docelowego i osiem mikrolitrów buforu TE do probówki o pojemności 0,2 mililitra. Następnie dodaj dwa mikrolitry rekombinazy i ZiMex i krótko odwiruj.
Inkubuj reakcję przez godzinę w temperaturze pokojowej, następnie dodaj jeden mikrolitr roztworu proteinazy K i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut, aby zatrzymać reakcję. Następnie rozmrozić komórki kompetentne do szoku cieplnego na lodzie. I przenieś 50 mikrolitrów komórek do 14-mililitrowej rurki polipropylenowej z okrągłym dnem.
Dodaj jeden mikrolitr produktu reakcji do komórek i delikatnie wymieszaj. Inkubować komórki przez 20 minut na lodzie. Następnie poddaj ogniwa szokowi termicznemu w łaźni wodnej o temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 45 sekund, zanim włożysz komórki z powrotem do lodu.
Dodaj jeden mililitr pożywki LB do komórek. I inkubować próbkę, wstrząsając przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie umieść przemianę na 10-centymetrowej płytce agarowej z ampicyliną i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc.
Aby rozpocząć oczyszczanie plazmidu, dodaj ampicylinę i 100 mililitrów pożywki LB do dużej stożkowej kolby. Następnie użyj pętli do zaszczepiania, aby usunąć pojedynczą kolonię z płytki agarowej. Zanurzyć pętlę inokulacyjną w pożywce LB i krótko wymieszać, a następnie przykryć górną część kolby folią aluminiową i inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z potrząsaniem.
Stąd oczyść plazmidowe DNA za pomocą standardowego zestawu do oczyszczania plazmidowego DNA Maxiprep, przed przystąpieniem do transfekcji. Najpierw wysiew komórki HEK 293T w 10-centymetrowych szalkach zawierających 10 mililitrów DMEM. Następnie rozcieńczyć 2,5 mikrograma każdego wektora komplementacji fluorescencji dwucząsteczkowej w 500 mikrolitrach buforu transfekcyjnego.
Dodaj 10 mikrolitrów odczynnika do transfekcji i wiruj mieszaninę przez 10 sekund. Następnie krótko odwirować próbki i inkubować je w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie dodaj kroplami mieszaninę transfekcji DNA do naczynia.
Następnie inkubować próbki przez osiem do 24 godzin. Przygotuj bufor do lizy komórek i uzupełniony bufor do lizy komórek, jak opisano w protokole tekstowym. Następnie dwukrotnie umyj komórki lodowatym PBS.
Odessać PBS i dodać jeden milimetr lodowatego buforu do lizy komórek. Następnie umieść naczynie na lodzie i inkubuj przez pięć minut. Następnie użyj skrobaka do komórek, aby usunąć komórki i przenieś je do schłodzonej probówki mikrowirówkowej.
Odwirować probówkę pod ciśnieniem 18 000 razy większym niż grawitacja przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby usunąć resztki komórkowe, a następnie przenieść klarowny supernatant do świeżej probówki do mikrowirówki. Umyj odpowiednią objętość kulek agarozy w jednym mililitrze PBS, a następnie odwiruj kulki pod 300-krotnością grawitacji i ostrożnie usuń supernatant. Następnie dodaj 20 mikrolitrów kulek agarozy do każdej próbki.
I inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie godziny, z rotacją od końca do końca. Odwiruj kulki przy 300-krotności grawitacji i trzykrotnie umyj je w buforze do lizy komórek. Następnie ponownie zawiesić umyte kulki w 50 mikrolitrach rozcieńczonego buforu do próbki.
Na koniec podgrzej próbki w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez dwie do trzech minut. W tym badaniu metoda BiCAP jest stosowana do obserwacji pozytywnej interakcji dla kilku typów białek około 16 godzin po kotransfekcji HEK293T komórek. Mikroskopia konfokalna służy do obserwacji dimeryzacji RTKERBB2 na błonie plazmatycznej oraz wiązania ubikwityny z ligazą E3 UBR5.
Po oczyszczeniu powinowactwa za pomocą nanociała GFB, w próbce kotransfekcji można wykryć tylko białko kontrolne Venus na całej długości oraz oddziałujące białka znakowane V1 i V2. Próbując wykonać tę procedurę, pamiętaj, aby zoptymalizować rozmieszczenie znacznika komplementacji fluorescencji dwucząsteczkowej oraz C-końcowego lub N-końcowego końca interesującego Cię białka. Jest to konieczne, aby zaobserwować pozytywną interakcję białko/białko.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać technikę BiCAP i jak zastosować ją do interesującej Cię interakcji białkowej. Zgodnie z tą procedurą, można zastosować wiele dalszych technik charakteryzacji, takich jak ChIPseek, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, w jaki sposób dimeryzacja czynników transkrypcyjnych kontroluje wiązanie DNA.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy manuskrypt opisuje metodę Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP), która umożliwia specyficzną izolację dwóch oddziałujących ze sobą białek. Technika ta wyklucza białka nietworzące kompleksów oraz konkurencyjne partnery wiążące, dostarczając wiedzy na temat oddziaływań białkowych w różnych kontekstach biologicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Biochemia
- Proteomika
Wprowadzenie
- Zrozumienie oddziaływań białkowych jest kluczowe dla wyjaśnienia komórkowych szlaków sygnalizacyjnych.
- Tradycyjne metody mogą nie izolować skutecznie specyficznych kompleksów białkowych.
- Metoda BiCAP wykorzystuje rozpoznawanie GFP przez nanoprzeciwciała do ukierunkowanej izolacji.
- Metodę tę można zastosować w różnych warunkach fizjologicznych oraz w badaniach nad różnymi chorobami.
Cel badania
- Opracowanie metody specyficznej izolacji oddziałujących ze sobą białek.
- Pogłębienie zrozumienia dynamiki kompleksów białkowych w zachowaniu komórek.
- Dostarczenie wiedzy na temat mechanizmów chorobowych, takich jak rak piersi.
Zastosowane metody
- Przygotowanie wektorów wejściowych i docelowych.
- Wykorzystanie rekombinazy i ZiMex do badań oddziaływań białkowych.
- Wirowanie w celu usprawnienia reakcji.
- Zastosowanie BiCAP do badania oddziaływań białkowych w różnych kontekstach.
Główne wyniki
- Pomyślna izolacja dwóch oddziałujących białek.
- Wykluczenie białek nietworzących kompleksów oraz konkurencyjnych partnerów.
- Wnioski dotyczące dimeryzacji kinaz tyrozynowych receptorowych.
- Potencjalne zastosowania w innych chorobach i warunkach fizjologicznych.
Wnioski
- BiCAP jest cennym narzędziem do badania oddziaływań białkowych.
- Metodę tę można dostosować do różnych zastosowań badawczych.
- Ułatwia ona zrozumienie złożonych procesów biologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Analiza dynamicznych, wielobiałkowych kompleksów sygnałowych jest kluczowa dla minimalizacji ryzyka podczas walidacji celów oraz wyjaśniania mechanizmów szlaków w wczesnych etapach odkrywania leków. Technika BiCAP umożliwia specyficzną izolację i charakterystykę proteomiczną oddziałujących par białek, z wykluczeniem białek nietworzących kompleksów oraz partnerów konkurencyjnych, co zwiększa pewność prognostyczną w badaniach mechanistycznych. Możliwość ta wspiera świadomą selekcję projektów w portfolio oraz decyzje o postępach w badaniach z uwzględnieniem analizy ryzyka, zarówno w badaniach podstawowych, jak i translacyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia precyzyjne badanie oddziaływań białko-białko, które są kluczowe dla regulacji szlaków sygnałowych.
- Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez izolację wyłącznie rzeczywistych partnerów oddziałujących.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez wykluczanie kompleksów niespecyficznych lub konkurencyjnych.
- Zwiększa pewność prognostyczną w odniesieniu do dalszych hipotez biologicznych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do ilościowych i powtarzalnych analiz w dalszych etapach procesu.
- Zwiększa specyficzność analizy poprzez izolację wyłącznie odpowiednich kompleksów białkowych.
- Wspiera standaryzację i skalowalność kampanii przesiewowych ukierunkowanych na oddziaływania białkowe.
- Umożliwia wiarygodną ocenę wpływu związków na montaż kompleksów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje wyniki mechanistyczne z interakcjami białek istotnymi dla przebiegu chorób, takimi jak dimeryzacja receptorów w modelach nowotworowych.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej, umożliwiając przeprowadzanie dalszych analiz proteomicznych i funkcjonalnych.
- Wspiera podejmowanie decyzji w oparciu o analizę ryzyka poprzez wyjaśnienie biologicznego znaczenia kompleksów docelowych.
Integracja potoku i przepływu pracy
BiCAP integruje się z procesem odkrywania leków, od wczesnego testowania hipotez, poprzez identyfikację związków wiodących, aż po walidację przedkliniczną, wspierając zarówno badania mechanistyczne, jak i badania translacyjne.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez dotyczących składania się kompleksów białkowych oraz integracji szlaków sygnałowych.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowe do analizy, specyficznie izolowane kompleksy do powtarzalnych analiz ilościowych.
- Analityka: Zapewnia przejrzyste odczyty proteomiczne do porównywania warunków oddziaływań i perturbacji.
- Badania translacyjne: Łączy wnioski mechanistyczne z modelami chorób, wspierając dopasowanie biomarkerów i celów terapeutycznych.
- Zastosowania wielokrotne: Oferuje szeroko adaptowalną platformę dla różnorodnych badań oddziaływań białkowych w wielu obszarach terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów.
- Wartość operacyjna: standaryzuje izolację kompleksów białkowych, poprawiając powtarzalność i skalowalność.
- Wartość strategiczna: dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji go/no-go i zwiększa efektywność kapitałową poprzez wczesne wyjaśnienie ryzyka biologicznego.
- Wpływ na portfolio: wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zwalidowanych celów.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie klonowania molekularnego, hodowli komórkowych i analiz proteomicznych.
- Niezbędny jest dostęp do detekcji opartej na fluorescencji, odczynników nanobody oraz infrastruktury do oczyszczania powinowactwa.
- Wymagana jest standaryzacja międzyzespołowa w zakresie rozmieszczenia znaczników i warunków analizy.
- Metoda jest adaptowalna w różnych systemach modelowych, ale może wymagać optymalizacji dla konkretnych par białek.
- Rozmieszczenie znaczników oraz stabilność kompleksu stanowią ograniczenia praktyczne, które muszą zostać rozwiązane drogą empiryczną.
Często zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
0:45
Plasmid Cloning
2:54
Cell Culture and Transfection
3:41
Harvesting Lysates
4:31
Affinity Purification and Preparation of BiCAP Eluant for Western Blotting
5:22
Results: BiCAP Method is a Powerful Technique to Specifically Purify and Characterize Interacting Proteins
6:06
Conclusion
