Name: Izolacja i hodowla mikrogleju gryzoni w celu promowania dynamicznej, rozgałęzionej morfologii w pożywce wolnej od surowicy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Naucz się izolować i hodować mikroglej gryzoni w pożywce wolnej od surowicy. Ta metoda pozwala uzyskać czyste kultury komórkowe do badań nad morfologią i funkcją mikrogleju w układzie nerwowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez Międzynarodowe Konsorcjum Badawcze Fundacji Christophera i Dany Reeve ds. Urazów Rdzenia Kręgowego, Fundację Badań Medycznych dr Miriam i Sheldona G. Adelsonów, Fundację JPB, Instytut Badań Podstawowych Novartis, hojne datki od Vincenta i Stelli Coates, oraz Fundację Badań nad Rakiem Damona Runyona (DRG-2125-12).

Wszystkie procedury dotyczące gryzoni były zgodne z wytycznymi Uniwersytetu Stanforda, które są zgodne z krajowymi i stanowymi prawami i politykami. Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Panel Administracyjny ds. Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi Uniwersytetu Stanforda.
UWAGA: Wszystkie kompozycje roztworów i znajdują się w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie szalki Petriego do immunopanningu CD11b (Dzień 0)
UWAGA: Przygotuj 1 naczynie immunopanujące na każde 1 - 2 mózgi młodocianych szczurów.
<ol>
	<li>Dodaj 25 ml 50 ml roztworu Tris pH 9,5 o stężeniu 50 ml na 15-centymetrowej szalce Petriego.</li>
	<li>Dodaj kozie przeciwciała anty-mysie IgG (łańcuchy H+L) do naczynia, aby uzyskać końcowe stężenie 6 μg/ml. Zakręć płytą, aby równomiernie rozprowadzić.</li>
	<li>Inkubować naczynie przez 1 - 3 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Trzykrotnie przepłukać naczynia preparatem DPBS++ (sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) z Ca2+ i Mg2+), a następnie zastąpić roztworem buforu do płukania zawierającym 1 μg/ml przeciwciała OX42. Pozostaw naczynia na noc w temperaturze pokojowej na płaskiej powierzchni.</li>
</ol>
2. Pobieranie tkanek (Dzień 1)
UWAGA: Ten protokół powinien zająć ~3 - 4 godziny.
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem upewnij się, że wszystkie roztwory są sterylne i schłodzone na lodzie. Schłodzić wszystkie narzędzia na lodzie i wysterylizować etanolem przed użyciem.</li>
	<li>Postępując zgodnie z odpowiednimi procedurami regulacyjnymi, uśmierc młodego szczura laboratoryjnego przez uduszenie dwutlenkiem węgla. 
	UWAGA: Alternatywnie, młodsze zwierzęta mogą zostać uśmiercone za pomocą śmiertelnej dawki ketaminy/ksylazyny (100 - 200 μL 24 mg/ml ketaminy, 2,4 mg/ml ksylazyny). Ketamina/ksylazyna musi być stosowana, jeśli zwierzęta są w wieku poniżej 14 dni. W przypadku wykorzystania wielu zwierząt należy pobrać tkankę od jednego zwierzęcia i umieścić ją we wstępnie schłodzonym DPBS++ na lodzie przed przystąpieniem do kolejnych zwierząt.</li>
	<li>Uszczypnij tylną łapę i upewnij się, że zwierzę całkowicie nie reaguje, zanim przejdziesz dalej.</li>
	<li>Przezskórnie perfundować zwierzę za pomocą 10 - 30 ml lodowatego buforu perfuzyjnego za pomocą igły 271/2-G, aż bufor będzie czysty. 
	UWAGA: Objętość bufora perfuzyjnego będzie się różnić w zależności od wielkości/wieku zwierzęcia.</li>
	<li>Natychmiast po perfuzji usuń głowę zwierzęcia. Wchodząc z rdzenia kręgowego, przetnij kłykieć potyliczny z każdej strony nożyczkami preparacyjnymi, uważaj, aby nie uszkodzić mózgu. Po dokładnym przecięciu każdej strony, przeciąć jedną stronę wzdłuż kości ciemieniowej i czołowej w kierunku kości nosowej. Za pomocą kleszczy ostrożnie odciągnij górną część czaszki, szybko usuń mózg (lub interesujące struktury OUN) i umieść we wstępnie schłodzonym DPBS++ na lodzie.</li>
	<li>Powtórz te czynności dla wszystkich pozostałych zwierząt. 
	UWAGA: Wszystkie kolejne kroki należy wykonywać w okapie z przepływem laminarnym w odpowiednich sterylnych warunkach.</li>
</ol>
3. Dysocjacja mechaniczna (Dzień 1)
<ol>
	<li>Po zebraniu wszystkich mózgów, posiekaj jeden mózg na kawałki o wielkości 1 mm3 na szalce Petriego na lodzie za pomocą zimnego ostrza skalpela i przenieś do lodowatego homogenizatora z 5 - 7 ml lodowatego buforu do namaczania. Dysocjuj jeden mózg na raz.</li>
	<li>Oddziel tkankę za pomocą 10 - 20 delikatnych i niekompletnych pociągnięć za pomocą luźno dopasowanego homogenizatora z odskokiem. Należy uważać, aby nie zgniatać bezpośrednio tkanki na dnie homogenizatora, ale zamiast tego przepchnąć tkankę przez przestrzeń między bokami tłoka a homogenizatorem.</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij tłok, aby zapobiec przedostawaniu się pęcherzyków powietrza. Pozwól, aby słabo zdysocjowane kawałki tkanki osiadły na dnie homogenizatora i przenieś supernatant do nowej schłodzonej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Zastąp usuniętą objętość świeżym buforem do odmieniania i powtórz kroki 3.2 i 3.3, w sumie przez 3-4 rundy lub do momentu, gdy cała tkanka zostanie zdysocjowana. Powtórz procedurę dla każdego mózgu.</li>
</ol>
4. Usuwanie mieliny (Dzień 1)
UWAGA: Usuwanie mieliny służy do izolacji mikrogleju od zwierząt starszych niż P12.
<ol>
	<li>Zmierz objętość zawiesiny komórek w stożkowej probówce o pojemności 50 ml za pomocą pipety o pojemności 25 ml, a następnie dodaj lodowaty bufor do zanurzania, aby dostosować całkowitą objętość do 33,5 ml.</li>
	<li>Dodać 10 ml buforu do separacji mieliny (MSB) do zawiesiny komórek i dokładnie wymieszać, kilkakrotnie odwracając probówkę. Spowoduje to 23% końcowe stężenie MSB w objętości 43,5 ml.</li>
	<li>Wirować przez 15 minut przy 500 x g w temperaturze 4 °C z powolnym hamowaniem. 
	UWAGA: Zwolnienie wirówki powinno zająć około 1,5 - 2 minut. W ten sposób wytworzy się górna warstwa mieliny i szczątków martwych komórek, nieco mętny supernatant i mniejszy osad, który jest wzbogacony o żywe komórki.</li>
	<li>Usunąć górną warstwę mieliny/zanieczyszczeń i supernatant za pomocą pipety. Zachowaj ostrożność podczas zdejmowania wierzchniej warstwy, aby upewnić się, że jak najwięcej z niej zostało usunięte.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 12 ml buforu do płukania. Delikatnie rozetrzeć zawiesinę komórkową, aby rozbić wszelkie grudki komórek, które mogą pozostać.</li>
</ol>
5. Immunopanning (Dzień 1)
<ol>
	<li>Przepuść zawiesinę komórek przez sitko komórkowe o średnicy 70 μm, aby usunąć duże zanieczyszczenia lub grudki komórek.</li>
	<li>Opłucz naczynie do patelni pokryte OX42 trzykrotnie za pomocą DPBS++. Nie pozwól, aby talerz całkowicie wyschł między praniami.</li>
	<li>Odlej ostatnie płukanie DPBS++ i nałóż przefiltrowaną zawiesinę komórkową na naczynie do garnkowania. Delikatnie zakręć płytką, aby rozprowadzić komórki, a następnie inkubuj płytkę na płaskiej powierzchni w temperaturze pokojowej przez 20 minut, aby komórki się przykleiły. Nie inkubuj dłużej niż 20 minut, w przeciwnym razie komórki staną się bardzo trudne do odzyskania z naczynia.</li>
	<li>Opłucz naczynie do patelni DPBS++ 10 razy, aby usunąć nieprzylegające komórki. Mikroglej będzie mocno przymocowany do płytki, więc obracaj płytkę przy każdym płukaniu, aby zapewnić usunięcie innych nieprzylegających komórek.</li>
	<li>Odlej ostatnie płukanie DPBS++ i zastąp 15 ml DPBS++ i 200 μl trypsyny (1,25% roztwór podstawowy).</li>
	<li>Inkubować naczynie przez ≤10 minut w temperaturze 37 °C z 10% CO2 w celu strypsynizacji. 
	UWAGA: Nie kontynuuj dłużej niż 10 minut, w przeciwnym razie mikroglej stanie się trudny do usunięcia.</li>
	<li>Po 10 minutach trypsynizacji mikroglej nadal będzie przyklejony do płytki. Odlej trypsynę/DPBS++ i delikatnie przemyj 2x DPBS++, aby usunąć trypsynę, zastąp 12 ml lodowatej pożywki do wzrostu mikrogleju (MGM).</li>
	<li>Umieść naczynie do patelni na lodzie na 2 minuty, aby osłabić interakcję komórka/podłoże, i upewnij się, że naczynie jest płaskie, aby zapobiec wysychaniu obszarów naczynia do patelni</li>.
	<li>Energicznie pipetować za pomocą pipety o pojemności 10 ml i kontrolera pipet na wysokich obrotach, aby odzyskać komórki z naczynia do płukania. Narysuj siatkę o wymiarach 16 x 16 ze strumieniem płynu z pipety, aby spróbować usunąć wszystkie komórki.</li>
	<li>Sprawdź komórki pod mikroskopem przy 20-krotnym powiększeniu, aby upewnić się, że komórki oderwały się od płytki. Zaznacz miejsca na wierzchu naczynia, w których komórki nadal tkwią, i powtórz pipetowanie w tych obszarach.</li>
	<li>Zebrać zawiesinę komórek i podwielokrotność 3 - 4 ml supernatantu na 15 ml probówki stożkowej. Wirować przez 15 minut przy 500 x g w 4 °C z powolnym hamowaniem. 
	UWAGA: Wirowanie mikrogleju przez małą objętość pozwala na maksymalny odzysk komórek.</li>
	<li>Odessać supernatant, pozostawiając 0,5 ml MGM z osadem komórkowym.</li>
	<li>Ponownie zawieś każdą granulkę w pozostałym MGM i połącz komórki ze wszystkich probówek.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Komórki płytkowe zgodnie z opisem w krokach 6 - 7 w zależności od zastosowania.</li>
	<li>Komórki hodowlane w temperaturze 37 °C z 10% CO2, 
	UWAGA: Komórki można hodować przez okres do 3 - 4 tygodni przy regularnych zmianach pożywki lub jeden tydzień bez zmian pożywki.</li>
</ol>
6. Punktowe powlekanie płytek do hodowli tkankowych/szkiełek nakrywkowych (Dzień 1)
<ol>
	<li>Umieścić 15 μl kolagenowej powłoki dożylnej bezpośrednio w środku 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej pokrytej anionowo/kationową (szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli Materiałów) i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C z 10% CO2 .</li>
	<li>Po zliczeniu komórek za pomocą hemocytometru rozcieńczyć komórki do 2,3 x 105/ml w MGM. Odessać plamkę kolagenową dożylnie i natychmiast wprowadzić 15 μl zawiesiny komórkowej do tego miejsca; Da to 3,5 x 103 komórki/plamkę. Inkubować przez 5 - 10 minut w temperaturze 37 °C z 10% CO2 , aby umożliwić komórkom przyleganie, delikatnie dodać 500 μl pożywki wzrostowej (TIC) o równowadze CO2 TGF-β2 / IL-34 / cholesterolu (TIC).</li>
	<li>W przypadku powlekania szkiełek nakrywkowych, należy najpierw pokryć szkiełka nakrywkowe ze sterylnego szkła 10 μg/ml roztworem D-lizyny (PDL) w H2O przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, przemyć 3 razy H2O i pozostawić do wyschnięcia w okapie w świetle UV. Po wyschnięciu szkiełek nakrywkowych należy przystąpić do punktowego powlekania szkiełek nakrywkowych zgodnie z opisem w kroku 6.2.</li>
</ol>
7. Posiewanie do izolacji RNA/białka
<ol>
	<li>W dniu 1 pokryć całą powierzchnię 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej pokrytej anionowo-kationową powłoką dożylną kolagenu i inkubować przez 10 minut - 1 godzinę w temperaturze 37 °C z 10% CO2 , a następnie usunąć i natychmiast rozszczepić 3 - 5 x 104 komórek/basenik w zrównoważonych pożywkach TICCO 2.</li>
	<li>W dniu 2 należy wykonać 50% wymianę podłoża dla każdego dołka następnego dnia po przygotowaniu. Martwe komórki mają tendencję do grupowania się w środku studni, więc weź stamtąd pożywkę.</li>
	<li>Wykonuj 50% zmianę pożywki co 2-3 dni, aby utrzymać kultury. Jeśli zmiany pożywki wprowadzą niepożądaną zmienną dla hodowli, komórki mogą przetrwać około 1 tygodnia bez żadnych zmian pożywki, w przeciwieństwie do ponad 3 tygodni przy regularnej konserwacji.</li>
</ol>

<ol><li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+Function+in+the+Central+Nervous+System+During+Health+and+Neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration.</a> Annu Rev Immunol. 35, 441-468 (2017).</li>
<li>Wu, Y., Dissing-Olesen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%3A+Dynamic+Mediators+of+Synapse+Development+and+Plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglia: Dynamic Mediators of Synapse Development and Plasticity.</a> Trends Immunol. 36 (10), 605-613 (2015).</li>
<li>Lou, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+receptor+P2RY12-dependent+microglial+closure+of+the+injured+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Purinergic receptor P2RY12-dependent microglial closure of the injured blood-brain barrier.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (4), 1074-1079 (2016).</li>
<li>Haynes, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+P2Y12+receptor+regulates+microglial+activation+by+extracellular+nucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The P2Y12 receptor regulates microglial activation by extracellular nucleotides.</a> Nat Neurosci. 9 (12), 1512-1519 (2006).</li>
<li>Gosselin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+environment-dependent+transcriptional+network+specifies+human+microglia+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity.</a> Science. 356 (6344), (2017).</li>
<li>Lavin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+macrophage+enhancer+landscapes+are+shaped+by+the+local+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment.</a> Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).</li>
<li>Hoeffel, G., Ginhoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+of+Tissue-Resident+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ontogeny of Tissue-Resident Macrophages.</a> Front Immunol. 6, 486(2015).</li>
<li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).</li>
<li>Bohlen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+Requirements+for+Microglial+Survival%2C+Specification%2C+and+Function+Revealed+by+Defined-Medium+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures.</a> Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).</li>
<li>Herz, J., Filiano, A. J., Smith, A., Yogev, N., Kipnis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+Cells+in+the+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Myeloid Cells in the Central Nervous System.</a> Immunity. 46 (6), 943-956 (2017).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Ponieważ mikroglej służy jako wartownicze komórki odpornościowe OUN, są wysoce wrażliwe na zmiany środowiskowe; Dlatego należy zachować szczególną ostrożność, aby zminimalizować reakcje zapalne w komórkach podczas ich izolacji i hodowli8. W tym protokole osiąga się to poprzez prędkość i temperaturę. Utrzymywanie komórek na lodzie lub w temperaturze 4 °C, gdy tylko jest to możliwe, znacznie zmniejsza aktywację, dlatego wszystkie etapy wirowania odbywają się w temperaturze 4 °C, zwierzęta są perfund...

Jako makrofagi miąższu OUN, mikroglej oddziałuje z szeroką gamą obwodów neuronalnych i sieci sygnalizacji glejowej. Odgrywają istotną rolę w rozwoju i homeostazie mózgu poprzez przycinanie synaptyczne, apoptotyczne oczyszczanie komórek i przejściowe interakcje z procesami neuronalnymi1,2. Mikroglej wcześnie reaguje na urazy neurologiczne, rozszerzając swoje długie, cienkie procesy na miejsca zmian chorobowych, aby koordynować reakcje zapalne i ograniczać krwawienie3,4. Zmiany w morfologii i funkcji mikrogleju są wszechobecne zarówno w ostrych, jak i przewlekłych urazach OUN, a mikroglej wykazuje zmienioną morfologię, lokalizację i ekspresję mediatorów stanu zapalnego w różnym zakresie stanów chorobowych1. Badania genetyczne na ludziach wskazują, że mutacje, które zmieniają ryzyko chorób neurodegeneracyjnych, są często głównie lub wyłącznie wyrażane przez mikroglej w nienaruszonym OUN, co wskazuje na kluczową rolę mikrogleju w patogenezie lub progresji choroby5. Biorąc pod uwagę ich znaczenie w urazach i chorobach, pogłębienie wiedzy na temat biologii mikrogleju jest priorytetem dla opracowania nowych podejść terapeutycznych.
Wiele krytycznych postępów w zrozumieniu biologii mikrogleju powstało dzięki ekstrapolacji technik i mechanizmów odkrytych w badaniach innych populacji makrofagów, w tym metod hodowli, profili ekspresji genów i definicji stanów funkcjonalnych/morfologicznych. Chociaż uogólnione funkcje makrofagów często rozgrywają się w zaskakujący sposób w krajobrazie OUN, mikroglej sam w sobie jest wysoce wyspecjalizowany, wykazując rozgałęzioną morfologię i unikalną sygnaturę ekspresji genów, która odróżnia je od innych makrofagów tkankowych6. Mikroglej ma linię, która różni się od większości innych makrofagów tkankowych; kolonizują OUN podczas wczesnej embrionalnej fali prymitywnej hematopoezy i samoodnawiają się przez całe życie, niezależnie od wkładu ostatecznej hematopoezy7. W pełni dojrzała sygnatura ekspresji genów dorosłego mikrogleju nie jest osiągana aż do drugiego tygodnia po urodzeniu8. Sygnały środowiskowe z otaczającej tkanki odgrywają główną rolę w dyktowaniu specyficznych dla tkanek cech makrofagów6, co w OUN obejmuje ograniczoną ekspozycję na czynniki przenoszone przez krew zapewnianą przez barierę krew-mózg9.
Jedną przeszkodą w pełnym zrozumieniu udziału mikrogleju w homeostazie i chorobie OUN jest trudność w podsumowaniu specjalistycznych właściwości dojrzałego mikrogleju obserwowanego in vivo z oczyszczonymi komórkami in vitro. Opracowano wiele metod izolowania i hodowli nienaruszonego mikrogleju, ale większość podejść opiera się na surowicy w celu wsparcia przeżycia komórek. Wykazaliśmy, że dodanie surowicy, która jest z natury zmiennym odczynnikiem zawierającym szeroki wachlarz bioaktywnych cząsteczek, jest szczególnie problematyczne podczas pracy z mikroglejem, ponieważ sprzyja morfologii amulicznej, zwiększonej proliferacji i zwiększonej fagocytozie9 często obserwowane in vivo, gdy mikroglej jest narażony na czynniki przenoszone przez krew po przerwaniu bariery krew-mózg. Według tych wskaźników komórki wystawione na działanie surowicy przypominają mikroglej w stanach urazu lub choroby, ale takie zmiany są zmniejszone, gdy mikroglej jest hodowany w określonej pożywce wzrostowej zawierającej CSF-1 (lub IL-34), TGF-β, cholesterol i selenin.
Ten protokół dostarcza szczegółów dotyczących hodowli mikrogleju u młodych szczurów w warunkach wolnych od surowicy, co jest związane z ostatnio opublikowanymi pracami9. Protokół ten został uproszczony dla szczurów od 21 do 30 dnia po urodzeniu (P21 - P30), ale może być dostosowany do izolowania mikrogleju od szczurów i myszy w każdym wieku, chociaż wydajność i ogólna żywotność będą się różnić w zależności od gatunku i wieku zwierzęcia. Maksymalne plony i optymalną żywotność osiąga się przy użyciu lekko niedojrzałego mikrogleju (~P9), przy czym plony i żywotność stopniowo zmniejszają się do nieco niższych poziomów u dorosłych zwierząt. Mikroglej można również wyizolować od myszy, ale odkryliśmy, że komórki szczurów wykazują znacznie wyższą wydajność, żywotność i złożoność rozgałęzionych morfologii w porównaniu z komórkami myszy w hodowlach bez surowicy. Zwierzęta w wieku powyżej P50 nie były oceniane za pomocą tego protokołu. Ta procedura izolacji immunologicznej została zoptymalizowana w celu zminimalizowania zmian w profilach transkrypcyjnych mikrogleju podczas izolacji i maksymalizacji żywotności komórek w dalszej kolejności. Korzystając z tych technik i preparatów pożywek, kultury pierwotne o wysokiej żywotności mogą być utrzymywane przez tygodnie. Mikroglej hodowany w tych warunkach wykazuje wysoce rozgałęzioną morfologię, obejmującą szybkie wydłużanie i cofanie procesów oraz stosunkowo niskie tempo proliferacji. Podkreślamy znaczenie ekspozycji surowicy na te właściwości i omawiamy mocne i słabe strony tej metody w porównaniu z innymi podejściami.

<table><tbody><tr><td>Szczur: Sprague-Dawley</td><td>Charles River</td><td>Cat# 400</td><td></td></tr><tr><td>mysz anty-szczur CD11b monoklonalny (klon OX42)</td><td>Bio-Rad</td><td>Cat# MCA275R</td><td>Panoramowanie: 1:1,000; Barwienie: 1:500</td></tr><tr><td>Koza wielokolnikowa anty-Iba1</td><td>Abcam</td><td>Cat# AB5076</td><td>Barwienie: 1:500</td></tr><tr><td>Królik poliklonalny anty-Ki67</td><td>Abcam</td><td>Cat# AB15580</td><td>Barwienie: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey anty-mysz 594</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# 11055</td><td>Barwienie: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey anty-koza 488</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# A-21203</td><td>Barwienie: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# A-31573</td><td>Barwienie: 1:500</td></tr><tr><td>Triton-X (detergent w barwieniu ICC)</td><td>Thermo Fisher Cat</td><td># 28313</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan heparanu</td><td>Galen Materiały laboratoryjne</td><td>Kat# GAG-HS01</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>Kat# M3149</td><td></td></tr><tr><td>Pepton z suchej masy mlecznej</td><td>Sigma</td><td>Cat# P6838</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&beta; 2</td><td>Peprotech</td><td>Cat# 100-35B</td><td></td></tr><tr><td>Mysz IL-34</td><td>R& D Systems</td><td>Cat# 5195-ML/CF</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol z wełny owczej</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>Cat# 700000P</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen IV</td><td>Corning&nbsp;</td><td>Kat# 354233</td><td></td></tr><tr><td>Kwas oleinowy</td><td>Cayman Chemicals&nbsp;</td><td>Kat# 90260</td><td></td></tr><tr><td>11(Z)Kwas eikosadienowy (gondoiczny)</td><td>Kajmany Chemikalia&nbsp;</td><td>Kot# 20606</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM barwnik</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium homodimer-1</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# E1169</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Worthington</td><td>Cat# DPRFS</td><td></td></tr><tr><td>Percoll PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>Cat# 17-5445-02</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Sigma</td><td>Cat# T9935</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>Kot# 21041-02</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/ Streptomycyna</td><td>Gibco Kot</td><td># 15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Gibco</td><td>Cat# 25030-081</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylocysteina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Cat# A9165</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>Cat# 16634</td><td></td></tr><tr><td>Apo-transferyna&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Cat# T1147</td><td></td></tr><tr><td>Selenin sodu</td><td>Sigma</td><td>Cat# S-5261</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (wysoki poziom glukozy)</td><td>Gibco</td><td>Cat# 11960-044</td><td></td></tr><tr><td>Dapi Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>Cat# 0100-20&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lizyna&nbsp;</td><td>Tabliczki Sigma</td><td>Cat# A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>Primaria&nbsp;</td><td>VWR</td><td>Cat# 62406-456</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Odczynniki magazynowe&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Apo-transferyna</td><td></td><td></td><td>Rekonstytucja: 10 mg/ml w PBS Stosowane stężenie: 1:100 Przechowywanie: -20&deg; C</td></tr><tr><td>N-acetylocysteina</td><td></td><td></td><td>Rekonstytucja: 5 mg/ml w H2O Stosowane stężenie: 1:1,000 Przechowywanie: -20&deg; C</td></tr><tr><td>Selenin</td><td></td><td></td> sodu <td>Rekonstytucja: 2,5 mg/ml w H2O Stosowane stężenie: 1:25 000 Przechowywanie: -20&deg; C</td></tr><tr><td>Rekonstytucja kolagenu IV</td><td></td><td></td><td>: 200 &mu; g/ml w PBS Stosowane stężenie: 1:100 Przechowywanie: -80&deg; C</td></tr><tr><td>TGF-b2</td><td></td><td></td><td>Rekonstytucja: 2 mg/ml w PBS Stosowane stężenie: 1:1,000 Przechowywanie: -20&deg; C</td></tr><tr><td>IL-34</td><td></td><td></td><td>Rekonstytucja: 200 &mu; g / ml w PBS Stosowane stężenie: 1:1,000 Przechowywanie: -80&deg; C</td></tr><tr>Cholesterol <td></td><td></td><td>z wełny owczej</td><td>Rekonstytucja: 1,5 mg/ml w 100% etanolu Zastosowane stężenie: 1:1,000 Przechowywanie: -20&deg; C</td></tr><tr><td>Siarczan</td><td></td><td></td> heparanu <td>Rekonstytucja: 1 mg/ml w H2O Stosowane stężenie: 1:1,000 Przechowywanie: -20&deg; C</td></tr><tr><td>Kwas oleinowy/Kwas</td><td></td><td></td> gondoinowy <td>Rekonstytucja: Gondoik: 0,001 mg/ml; Oleinowy: 0,1 mg/ml w 100% etanolu Stosowane stężenie: 1:1 000 Przechowywanie: -20&deg; C</td></tr><tr><td>Rekonstytucja heparyny</td><td></td><td></td><td>: 50 mg/ml w PBS Stosowane stężenie: 1:100 Przechowywanie: -20&deg; C</td></tr><tr><td>Nazwa<</td><td>strong>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Solutions&nbsp; Receptura </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>perfusion buffer</td><td></td><td></td><td>: 50 &mu; g/ml heparyny w DPBS++ (PBS z Ca++ i Mg++) Uwagi: Stosuj, gdy jest lodowaty</td></tr><tr>Bufor <td></td><td></td><td>do douncingu</td><td>Przepis: 200 &mu; L 0,4% DNazy w 50 ml DPBS++ Uwagi: Stosować, gdy jest lodowaty</td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td> do płukania <td>Przepis: 2 mg / ml peptonu z suchej masy mlecznej w pożywce DPBS +</td></tr> <tr><td>+ Microglea (MGM)</td><td></td><td></td><td>Receptura: DMEM / F12 zawierający 100 jednostek / ml penicyliny, 100 &mu; g/ml streptomycyny, 2 mM glutaminy, 5 &mu; g/ml N-acetylocysteiny, 5 &mu; g/ml insuliny, 100 &mu; g / ml apo-transferyny i 100 ng / ml seleninu sodu Uwagi: Użyj lodowatego MGM, aby usunąć mikroglej z naczynia do immnopaningu.</td></tr><tr>Receptura powlekania <td></td><td></td><td>kolagenu dożylnego</td><td>: MGM zawierający 2 &mu; g / ml kolagenu IV</td></tr><tr><td>Przepis na bufor</td><td></td><td></td> separacyjny mieliny<td>: 9 ml Percoll PLUS, 1 ml 10x PBS bez Ca++ i Mg++, 9 &mu; L 1 M CaCl2, 5 &mu; L 1 M MgCl2 Uwagi: Dobrze wymieszać po dodaniu&nbsp; CaCl2 i MgCl2</td></tr><tr><td>TGF-b2/IL-34/Pożywki wzrostowe zawierające cholesterol (TIC)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Receptura: MGM zawierający ludzkie 2 ng/ml TGF-b2, 100 ng/ml mysiej IL-34, 1,5 &mu; g/ml cholesterolu z wełny owczej, 10 &mu; g/ml siarczanu heparanu, 0,1 &m; g/ml kwasu oleinowego i 0,001 &mu; g/ml kwas gondowy Uwagi: Upewnij się, że dodałeś cholesterol do podłoża podgrzanego do 37 stopni Celsjusza; C i nie dodawać więcej niż 1,5 &mu; g / ml lub wytrąci się. Nie filtruj mediów zawierających cholesterol. Zrównoważ pożywkę TIC z 10% CO2 przez 30 minut - 1 godzinę przed dodaniem do komórek, aby zapewnić optymalne pH.</td></tr></tbody></table>

izolacja i hodowla mikrogleju gryzoni w celu promowania dynamicznej, rozgałęzionej morfologii w pożywce wolnej od surowicy

Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

Mikroglej stanowi 5 - 10% wszystkich komórek ośrodkowego układu nerwowego (OUN) i coraz częściej przyciąga uwagę ze względu na ich wkład w rozwój, homeostazę i chorobę. Chociaż makrofagi są szczegółowo badane od dziesięcioleci, wyspecjalizowane cechy mikrogleju, makrofagów rezydujących w tkankach OUN, pozostają w dużej mierze tajemnicze, częściowo ze względu na ograniczenia w zdolności do podsumowania dojrzałych właściwości mikrogleju w hodowli. Tutaj ilustrujemy prostą procedurę szybkiej izolacji czystego mikrogleju z dojrzałego mózgu gryzonia. Opisujemy również warunki hodowli bez surowicy, które wspierają wysoki poziom żywotności mikrogleju w czasie. Mikroglej hodowany w tych warunkach o zdefiniowanej pożywce wykazuje skomplikowane procesy rozgałęzione i dynamiczne zachowanie nadzoru. Ilustrujemy niektóre skutki ekspozycji surowicy na hodowlę mikrogleju i omawiamy, jak te kultury wolne od surowicy wypadają w porównaniu zarówno z kulturami narażonymi na surowicę, jak i mikroglejem in vivo.

Niniejszy protokół opisuje metodę hodowli wysokiej czystości rozgałęzionych mikroglejów pochodzących od młodych szczurów. Podobne wyniki można uzyskać, wykorzystując zwierzęta niedojrzałe, okołoporodowe i dorosłe, co omówiono poniżej. Ponieważ izolacja komórek często wiąże się z subtelnymi niuansami i licznymi możliwościami obumarcia komórek, zastosowaliśmy punkty kontroli jakości, aby pomóc w ocenie sukcesu na różnych etapach. Zazwyczaj monitorowaliśmy zawiesiny komórkowe za pomocą hemoc...

Wysiłki zmierzające do szczegółowego zrozumienia funkcji mikrogleju zostały utrudnione przez brak modeli hodowli mikrogleju, które podsumowują właściwości dojrzałego mikrogleju in vivo. Protokół ten opisuje podejście oparte na izolacji i hodowli, mające na celu utrzymanie solidnego przetrwania wysoce rozgałęzionego dojrzałego mikrogleju szczurów w warunkach o zdefiniowanej pożywce.

Izolacja i hodowla mikrogleju gryzoni w celu promowania dynamicznej, rozgałęzionej morfologii w pożywce wolnej od surowicy

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

Ogólnym celem tego protokołu hodowli komórkowej jest wygenerowanie wysoce czystych kultur mikrogleju z rozwijających się lub dorosłych gryzoni, które mogą być utrzymywane bez ekspozycji na surowicę. Ta procedura może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w neurobiologii związane z morfologią mikrogleju, ketozą włóknistą i interakcją mikrogleju z innymi typami komórek OUN. Główną zaletą tego protokołu jest to, że mikroglej można szybko wyizolować z tkanki gryzoni w każdym wieku i hodować bez ekspozycji na surowicę.Aby usunąć mózg, odetnij kłykieć potyliczny od rdzenia kręgowego zwierzęcia po obu stronach nożyczkami preparacyjnymi, uważając, aby nie uszkodzić mózgu. Następnie przetnij skórę wzdłuż górnej części czaszki i przetnij jedną stronę wzdłuż kości ciemieniowej i czołowej w kierunku kości nosowej. Ostrożnie odciągnij górną część czaszki kleszczami, szybko wyjmij mózg i umieść go we wstępnie schłodzonym DPBS na lodzie.Powtórz procedurę dla wszystkich pozostałych zwierząt. Po zebraniu mózgów w zimnych DPBS, posiekaj każdy mózg na jednomilimetrowe kawałki sześcienne na szalce Petriego na lodzie za pomocą zimnego ostrza skalpela i przenieś do lodowatego homogenizatora z zanurzeni

isolation-culture-rodent-microglia-to-promote-dynamic-ramified

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Izolowanie pierwotnych mikroglejów z heterogenicznej populacji komórek mózgu jest niezbędne do zbadania ich roli w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Niniejszy protokół opisuje technikę mechanicznej izolacji i mieszanej hodowli komórkowej, która zapewnia wysoką wydajność oraz wysoką czystość żywych, pierwotnych komórek mikrogleju do badań in vitro i dalszych zastosowań.

Izolacja pierwotnych mikroglejów z mieszanych kultur komórek glejowych tkanki mózgu noworodka szczura

W tym filmie opisujemy protokół izolacji komórek CD11b, w tym mikrogleju, z mózgów młodych myszy za pomocą sortowania komórek aktywowanego magnetycznie. Tkanki mózgowe są homogenizowane w celu uzyskania zawiesin pojedynczych komórek, które są inkubowane z mikrokulkami pokrytymi przeciwciałem anty-CD11b, a następnie rozdzielane na podstawie kolumny magnetycznej w celu oczyszczenia populacji komórek CD11b +.

Izolacja magnetyczna mikrogleju z mózgów młodych myszy

Film pokazuje prostą metodę hodowli mysich astrocytów w izolacji od innych komórek mózgowych. Podczas hodowli, przy użyciu pożywek specyficznych dla astrocytów i hamowaniu przylegania komórek nieastrocytowych, metoda selektywnie hoduje astrocyty. Te hodowane astrocyty wykazują gwiaździstą morfologię z drobnymi wyrostkami.

Prosta technika izolacji i hodowli mysich astrocytów

Ten film demonstruje metodę izolowania i hodowli mikrogleju z mózgów szczurów. Polega ona na oddzieleniu mikrogleju od innych komórek neuronalnych i nieneuronalnych za pomocą płytek pokrytych przeciwciałem monoklonalnym specyficznym dla mikrogleju.

Izolacja i hodowla mikrogleju z mózgów szczurów przy użyciu pożywek bez surowicy

Ten film demonstruje technikę selektywnego usuwania mikrogleju z pierwotnej hodowli neuronów szczura. Neurony ziarniste móżdżku są traktowane antymetabolitem w celu wyeliminowania proliferujących komórek glejowych. Dodatkowo są one traktowane środkami ukierunkowanymi na lizosomy w celu usunięcia mikrogleju z hodowli.

Selektywne usuwanie mikrogleju z hodowli neuronów granulatu móżdżku szczura

Przedstawiamy metody efektywnej i szybkiej izolacji/hodowli żywotnego mikrogleju z kory mózgowej noworodka i dorosłego rdzenia kręgowego.  Sekcja i posiew mikrogleju korowego może być przeprowadzona w ciągu 90 minut, a późniejsze zbieranie mikrogleju odbywa się ~ 10 dni po początkowym rozbiorze.

Hodowla mikrogleju z ośrodkowego układu nerwowego noworodków i dorosłych

Jednym z kluczy do udanego badania biologii mikrogleju jest zachowanie funkcji immunologicznej mikrogleju ex vivo podczas izolacji z tkanki OUN. Wyizolowanie mikrogleju za pomocą wytrząsania obrotowego daje wysoce czyste i immunofunkcjonalne hodowle komórek, oceniane za pomocą obrazowania fluorescencyjnego, immunocytochemii i ELISA po aktywacji mikrogleju za pomocą bodźców prozapalnych lipopolisacharydu (LPS) i Pam3CSK4 (Pam).

Izolacja mikrogleju korowego z zachowanym immunofenotypem i funkcjonalnością od mysich noworodków

Tutaj prezentujemy protokół izolacji mikrogleju od pourodzeniowych szczeniąt myszy (dzień 1) do eksperymentów in vitro. Ta improwizowana metoda izolacji zapewnia zarówno wysoką wydajność, jak i czystość, co stanowi znaczną przewagę nad alternatywnymi metodami, która pozwala na szeroki zakres eksperymentów w celu wyjaśnienia biologii mikrogleju.

Szybka i udoskonalona izolacja magnetyczna CD11b pierwotnego mikrogleju o zwiększonej czystości i wszechstronności

Przedstawiono protokół izolacji pierwotnego mikrogleju z mysich mózgów. Technika ta pomaga w pogłębieniu obecnego zrozumienia schorzeń neurologicznych. Wirowanie w gradiencie gęstości i separacja magnetyczna są połączone w celu uzyskania wystarczającej wydajności próbki o wysokiej czystości. Ponadto przedstawiamy etapy charakterystyki mikrogleju.

Charakterystyka i izolacja pierwotnego mikrogleju myszy za pomocą wirowania w gradifikacji gęstości

Ten protokół jest wydajną, opłacalną i solidną metodą izolowania pierwotnego mikrogleju od żywej, dorosłej, ludzkiej tkanki mózgowej. Wyizolowany pierwotny mikroglej ludzki może służyć jako narzędzie do badania procesów komórkowych w homeostazie i chorobie.

Pozyskiwanie ludzkiego mikrogleju z tkanki mózgowej dorosłego człowieka

Pierwotne kultury mikrogleju są powszechnie używane do oceny nowych cząsteczek przeciwzapalnych. Niniejszy protokół opisuje powtarzalną i odpowiednią metodę magnetycznego izolowania mikrogleju od nowonarodzonych młodych.

Izolacja magnetyczna komórek mikrogleju od noworodków myszy do pierwotnych hodowli komórkowych

Naucz się izolować i hodować mikroglej gryzoni w pożywce wolnej od surowicy. Ta metoda pozwala uzyskać czyste kultury komórkowe do badań nad morfologią i funkcją mikrogleju w układzie nerwowym.

Izolacja i hodowla mikrogleju gryzoni w celu promowania dynamicznej, rozgałęzionej morfologii w pożywce wolnej od surowicy

Przeglądaj więcej filmów