Nowatorskie metody pasywnego oczyszczania do szybkiego wytwarzania przezroczystości optycznej w całej tkance OUN
8 maja 2018
Tutaj prezentujemy dwie nowatorskie metodologie, psPACT i mPACT, do osiągnięcia maksymalnej przezroczystości optycznej i późniejszej mikroskopowej analizy unaczynienia tkanek w nienaruszonym całym OUN gryzonia.
Ogólnym celem tych metod psPACT i mPACT jest szybkie usunięcie całej tkanki OUN bez konieczności stosowania elektroforetycznego systemu oczyszczania tkanek. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie modeli badań nad chorobami człowieka, takimi jak choroba Alzheimera lub urazy oraz zwyrodnienia i nowotworzenie Główną zaletą tej techniki jest to, że tkanka OUN myszy nie jest uszkadzana przez elektroforetyczne oczyszczanie tkanki i jest szybko usuwana przez zmodyfikowane oczyszczanie pasywne.
Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody po użyciu oryginalnego PACT i wcześniejszej metody oczyszczania mózgu. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ metoda psPACT i mPACT są trudne do przeprowadzenia, ponieważ metoda ta składa się z wielu etapów przygotowania próbki. Rozpocznij od przygotowania roztworu koktajlu PACT, dodając proszek VA-044 do roztworu 4% PFA i 4% akrylamidu o końcowym stężeniu 0,25%Po perfuzji tkanek roztworem PACT, całkowicie zanurz cały mózg i rdzeń kręgowy w 50-mililitrowej probówce zawierającej schłodzony roztwór PACT i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 24 godziny.
24 godziny później przenieś tkankę do 50-mililitrowej probówki zawierającej świeży, zimny roztwór PACT i podłącz nakrętkę probówki do systemu hybrydyzacji żelu tkankowego, podłączonego do zbiornika azotu i ustawionego na 37 stopni Celsjusza. Następnie włącz próżnię i gaz na 10 minut, aby zanurzyć próbkę w gazowym azocie. Aby spolimeryzować hydrożel, umieść probówkę zawierającą próbkę w inkubatorze wytrząsającym ustawionym na 150 obr./min i 37 stopni Celsjusza na trzy godziny lub do momentu zakończenia polimeryzacji.
Po inkubacji użyj bibuły, aby usunąć pozostały spolimeryzowany hydrożel otaczający tkanki. Następnie przenieś tkankę do 50-mililitrowej probówki zawierającej roztwór klarujący. Umieścić próbkę w inkubatorze wstrząsającym ustawionym na 37 stopni Celsjusza i 150 obr./min, aż tkanka zostanie usunięta.
Średnio potrzeba około 20 dni, aby OUN myszy osiągnął pełną klarowność. Rozpocznij psPACT od OUN od myszy perfundowanej 4% PFA, która została utrwalona w 4% PFA w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 24 godziny. Myj utrwaloną tkankę przez godzinę w 0,1 molowym PBS.
Po umyciu przenieś tkankę do roztworu A4P0 i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Następnego dnia, po umyciu tkanki w PBS przez pięć minut, zanurz tkankę w 0,25% VA-044 w PBS i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez sześć do 24 godzin. Oddzielenie akrylamidu i następujący po nim etap VA-044 pozwala uniknąć konieczności usuwania pozostałych niespolimeryzowanych monomerów hydrożelowych, które otaczają tkankę, co może zagrozić końcowej integralności tkanki po osiągnięciu przezroczystości za pomocą PACT.
Po inkubacji przenieść tkanki do świeżego, zimnego roztworu VA-044. Następnie zanurzyć próbkę w gazowym azocie na 10 minut. Przenieś tkankę do roztworu czyszczącego.
Następnie inkubować próbkę w inkubatorze z wytrząsaniem ustawionym na 37 stopni Celsjusza i 150 obr./min, aż tkanka zostanie oczyszczona. Średnio potrzeba około 17 dni, aby OUN myszy osiągnął pełną klarowność. W przypadku mPACT postępuj zgodnie z protokołem psPACT do momentu kroku rozwiązania czyszczącego.
Następnie całkowicie zanurz roztwór oczyszczający tkanki zawierający 0,5% alfa-tioglicerol, środek niebrązowiejący, oprócz 8% SDS w 0,1-molowym PBS. Umieścić próbkę w inkubatorze wstrząsającym ustawionym na 37 stopni Celsjusza i 150 obr./min, aż tkanka zostanie usunięta. Średnio wystarczy tylko dwa tygodnie, aby mysi OUN osiągnął pełną klarowność za pomocą mPACT.
W niniejszym badaniu próbki mózgu myszy poddane działaniu protokołu mPACT osiągnęły przezroczystość optyczną po 14 dniach, wyprzedzając próbki poddane działaniu protokołów PACT i psPACT. Próbki całego ośrodkowego układu nerwowego szczurów oczyszczone za pomocą mPACT osiągnęły maksymalny klirens w ciągu 20 dni. Same mózgi dorosłych szczurów, w przeciwieństwie do całego OUN, zostały oczyszczone za pomocą mPACT w ciągu zaledwie pięciu dni.
Po opanowaniu tę technikę można wykonać w ciągu dwóch tygodni z całym OUN myszy, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny neurobiologii i anatomii do badania chorób patofizjologicznych, takich jak uszkodzenia tkanek, wady rozwojowe, nowotwory i choroby neurodegeneracyjne w modelach OUN ssaków.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia dwie innowacyjne metodologie, psPACT i mPACT, mające na celu zwiększenie przejrzystości optycznej i ułatwienie analizy mikroskopowej nienaruszonych naczyń krwionośnych ośrodkowego układu nerwowego (CNS) gryzoni. Techniki te mają na celu szybkie oczyszczanie całej tkanki CNS bez jej uszkadzania, co pozwala na rozwiązanie kluczowych kwestii związanych z modelami ludzkich chorób, takich jak choroba Alzheimera i tumorigenaza.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Techniki utrwalania i przejrzyszczania tkanek
- Obrazowanie mikroskopowe
Wstęp
- Badanie opiera się na poprzednich metodach, wskazując na ograniczenia elektroforetycznego przejaśniania tkanek.
- Podkreśla potrzebę szybkiego i skutecznego procesu przejaśniania tkanek OUN gryzoni.
- Oferuje rozwiązania zarówno dla badań podstawowych, jak i implikacji klinicznych w neuronauce.
Cel badania
- Opracowanie i walidacja psPACT oraz mPACT jako wydajnych protokołów utrwalania i przejrzystości tkanek OUN.
- Rozszerzenie możliwości badawczych dla naukowców zajmujących się schorzeniami neuropatologicznymi.
- Ułatwienie lepszej wizualizacji naczyń krwionośnych w tkankach OUN.
Zastosowane metody
- Metody obejmują wieloetapowy protokół przygotowania i przejrzystości tkanek OUN z wykorzystaniem roztworów PACT.
- Kluczowe modele biologiczne obejmują próbki OUN myszy i szczura, z naciskiem na uzyskanie przejrzystości optycznej.
- Proces psPACT zazwyczaj trwa około 20 dni do uzyskania pełnej przejrzystości, natomiast mPACT może osiągnąć ten efekt w około 14 dni.
- W procesach polimeryzacji i przejrzystości stosuje się specjalistyczne roztwory i środowiska inkubacyjne.
Główne wyniki
- Metoda mPACT oferuje znaczną redukcję czasu przejaśniania tkanki w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
- Próbki poddane mPACT wykazały przejrzystość optyczną w krótszym czasie, co sugeruje zwiększoną efektywność w zastosowaniach badawczych.
- Techniki te okazują się skuteczne w ułatwianiu badania różnych schorzeń neurologicznych.
Wnioski
- Niniejsze badanie umożliwia szybkie i efektywne oczyszczanie tkanki OUN, co usprawnia możliwości badawcze w dziedzinie neuronauki.
- Nowe metodologie stanowią cenne narzędzia do badania mechanizmów chorobowych oraz uszkodzeń tkanek.
- Istotne są wnioski dotyczące rozumienia chorób neurodegeneracyjnych oraz usprawnienia badań patologicznych dzięki ulepszonym technikom obrazowania.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Nowoczesne metody pasywnego wyjaśniania, takie jak psPACT i mPACT, rozwiązują krytyczny problem w badaniach i rozwoju neuronauk, umożliwiając szybkie uzyskanie wysokiej wierności przezroczystości optycznej całych tkanek OUN bez uszkodzeń elektroforetycznych. Możliwość ta wspiera walidację celów i ograniczanie ryzyka mechanistycznego w modelach chorób neurodegeneracyjnych poprzez zachowanie architektury podkomórkowej przy jednoczesnym przyspieszeniu harmonogramów obrazowania. Techniki te zwiększają pewność prognostyczną w badaniach przedklinicznych nad chorobą Alzheimera, tumorigenezą oraz modelami urazów dzięki lepszej wizualizacji fenotypów neuropatologicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biopharmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych w nienaruszonych modelach OUN poprzez zachowanie struktur podkomórkowych i obwodów komórkowych na potrzeby badań nad oddziaływaniem z celem.
- Wartość operacyjna: Redukuje artefakty przetwarzania tkanek związane z przejaśnianiem elektroforetycznym, co poprawia powtarzalność wyników przesiewowych fenotypowych.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez zapewnienie wyraźniejszych odczytów postępu neurodegeneracji w systemach istotnych dla danej choroby.
Przesiewy i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie standaryzowanych i przejrzystych preparatów OUN, odpowiednich do obrazowania biomarkerów subkomórkowych i modulacji szlaków z wysoką rozdzielczością.
- Wartość operacyjna: Eliminuje konieczność stosowania specjalistycznego sprzętu elektroforetycznego, obniżając bariery wdrożenia analizy w zespołach badawczych.
- Skalowalność: mPACT pozwala na uzyskanie przejrzystości OUN myszy w ciągu ok. 14 dni, co umożliwia przewidywalne harmonogramy kampanii przesiewowych związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Ułatwia płynne przejście z etapu odkryć do walidacji przedklinicznej poprzez zachowanie integralności tkanki w podłużnych badaniach tumorigenezy i wad rozwojowych.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Umożliwia wizualizację struktur subkomórkowych w tkankach patologicznych, co zmniejsza niejednoznaczność w interpretacji mechanizmu działania celu.
- Wierność modelu choroby: Wspiera spójne oczyszczanie OUN u różnych gatunków gryzoni (myszy/szczura), zwiększając porównywalność międzybadawczą w zakresie farmakologii bezpieczeństwa.
Integracja potoku i przepływu pracy
psPACT i mPACT wpisują się w kontinuum od wczesnego etapu odkrywania do badań przedklinicznych, wspierając w szczególności walidację celu aż po optymalizację wiodącego związku poprzez dostarczanie mierzalnych modeli OUN przygotowanych do obrazowania.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez poprzez mapowanie 3D ekspresji białek i rozkładu komórek w nienaruszonych tkankach, co pozwala wyjaśnić udział poszczególnych szlaków w modelach chorób.
- Screening: Pozwala na uzyskanie powtarzalnych, ilościowych preparatów tkankowych, które wspierają standaryzowaną ocenę wpływu związków na architekturę OUN.
- Analityka: Generuje obrazy o wysokiej rozdzielczości, które umożliwiają zespołom porównywanie zmian strukturalnych w różnych warunkach terapeutycznych przy poprawionym stosunku sygnału do szumu.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość proteomiczną i strukturalną od fazy odkryć po etapy przedkliniczne, wspierając dopasowanie biomarkerów w modelach neurodegeneracji i urazów.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę do klarowania OUN, którą można zastosować w wielu projektach badających neuropatologię, ograniczając tym samym powielanie prac nad opracowaniem metod.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celów poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej dzięki wizualizacji nienaruszonych tkanek.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i powtarzalność poprzez wyeliminowanie zmiennych parametrów elektroforetycznych oraz zależności od sprzętu.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez przyspieszenie generowania danych przedklinicznych dla kandydatów celujących w OUN.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację programów neurodegeneracyjnych i onkologicznych z uwzględnieniem ryzyka dzięki szybszym i wyraźniejszym odczytom fenotypowym.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu histologii tkanek, chemii hydrożeli oraz realizacji protokołów inkubacji w celu zarządzania wieloetapowym przygotowaniem próbek.
- Proces jest zależny od inkubatorów z wytrząsarką, systemów gazu azotowego oraz środowisk z kontrolowaną temperaturą w fazach polimeryzacji hydrożelu i przejaśniania.
- Konieczna jest międzyzespołowa standaryzacja przygotowania roztworów (np. stężeń VA-044, SDS) oraz kontrola czasu w celu zapewnienia powtarzalności między laboratoriami.
- Adaptacja do tkanek innych niż OUN (np. nerki, śledziony) wymaga walidacji czasu przejaśniania i zachowania struktury, zgodnie z materiałem źródłowym.
- Ograniczenie praktyczne: powodzenie protokołu zależy od skrupulatnej realizacji ze względu na wiele etapów przygotowania, a odchylenia grożą niepełnym przejaśnieniem lub uszkodzeniem tkanek.
