Name: Nowatorskie metody pasywnego oczyszczania do szybkiego wytwarzania przezroczystości optycznej w całej tkance OUN (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Poznaj metody psPACT i mPACT do szybkiego oczyszczania całej tkanki OUN u myszy i szczurów bez elektroforezy. Techniki te umożliwiają badanie chorób neurodegeneracyjnych i nowotworowych z zachowaniem integralności próbek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Brain Korea 21 PLUS Project for Medical Science, Yonsei University. Ponadto prace te były wspierane przez grant z National Research Foundation of Korea (NRF-2017R1D1A1B03030315).

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez odpowiednią komisję etyki badań w Yonsei University College of Medicine. Wszystkie zwierzęta doświadczalne są uśmiercane zgodnie z wytycznymi komitetu ds. opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi w Yonsei University College of Medicine.
1. Przygotowanie odczynników
Uwaga: Paraformaldehyd (PFA), akryloamid i siarczan dodecylu sodu (SDS) są toksycznymi substancjami drażniącymi i dlatego powinny być używane w dygestoriach z odpowiednim sprzętem ochrony osobistej (PPE; fartuch laboratoryjny, rękawice, okulary ochronne).
<ol>
	<li>4% roztwór akryloamidu (AA) (A4P0): Dodać 20 ml 40% roztworu akryloamidu do 180 ml 0,1 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS).</li>
	<li>0,25% roztwór VA-044: Dodać 0,5 g proszku dichlorowodorku dichlorowodorku 2,2'-Azobis[2-(2-imidazolin-2-ylo)propanu] (VA-044) do 200 ml 0,1 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS). Podczas gdy proszek VA-044 może być przechowywany w temperaturze pokojowej, po rozpuszczeniu w PBS musi być przechowywany w temperaturze 4 °C. Aby uzyskać najlepsze wyniki, przygotuj tylko taką ilość roztworu, jaka jest potrzebna do eksperymentu.</li>
	<li>Roztwór koktajlu PACT: Dodać 10 g akrylamidu do 225 ml 4% roztworu paraformaldehydu (PFA) i dostosować objętość do 200 ml z 4% PFA. Przed użyciem dodać 100 mg proszku VA-044 do 40 ml mieszaniny w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Bufor roztworu oczyszczającego PACT: Dodać 40 g dodecylosiarczanu sodu (SDS) do 350 ml 0,1 M PBS i dostosować objętość do 500 ml za pomocą 0,1 M PBS. W przypadku roztworu czyszczącego mPACT dodać 0,5% α-tioglicerolu do buforu roztworu czyszczącego PACT.</li>
	<li>Myszy użyte w tym badaniu były 2-tygodniowymi samcami myszy BALB; szczury użyte w tym badaniu były 2-tygodniowymi samcami szczurów SD.</li>
</ol>
2. Znieczulenie i chirurgia perfuzji
Uwaga: PFA i akryloamid są toksycznymi substancjami drażniącymi i dlatego powinny być używane w dygestorii z odpowiednimi środkami ochrony osobistej.
<ol>
	<li>Znieczulić zwierzę w pomieszczeniu wolnym od patogenów za pomocą 30 mg/kg zoletilu za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą o rozmiarze 26. Monitoruj zwierzę przez 5 -10 minut.</li>
	<li>Gdy zwierzę osiągnie chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia, użyj metody reakcji na uszczypnięcie palca, aby określić głębokość znieczulenia. Potwierdź brak odpowiedzi. 
	UWAGA: Poniższe kroki obejmujące operację na myszach i szczurach są zgodne z podobnym protokołem użytym w poprzednim badaniu11.</li>
	<li>Wykonaj 5-6 cm nacięcie pod klatką piersiową, przez powłokę i ścianę brzucha.</li>
	<li>Użyj zakrzywionych, nożyczek, aby wykonać nacięcie w przeponie, dotykając okolicy klatki piersiowej, aby wcześniej zlokalizować miejsce nacięcia.</li>
	<li>Przedłuż nacięcie na całej długości klatki piersiowej, aby odsłonić jamę opłucnej.</li>
	<li>Ostrożnie przemieszcz płuca. Wykonaj przecięcie przez klatkę piersiową aż do obojczyka. Za pomocą nożyczek do tęczówki wykonaj małe nacięcie na tylnym końcu lewej komory. Włóż igłę perfuzyjną o rozmiarze 18 rozmiarów lub oliwkową do aorty wstępującej, przechodząc przez przeciętą komorę.</li>
	<li>Zabezpiecz igłę i zapobiegnij wyciekowi, zaciskając serce hemostatem. Alternatywnie, użyj zmodyfikowanego hemostatu, aby zacisnąć aortę wokół końcówki igły.</li>
	<li>Wykonaj duże nacięcie w prawym przedsionku, uważając, aby zminimalizować uszkodzenie aorty zstępującej. Szczur jest teraz gotowy do perfuzji.</li>
</ol>
3. Cała perfuzja i sekcja szczura
Uwaga: PFA i akryloamid są toksycznymi substancjami drażniącymi i dlatego powinny być używane w dygestorii z odpowiednimi środkami ochrony osobistej.
UWAGA: Następujące pełne etapy perfuzji są podobne do protokołu użytego w poprzednim badaniu przez Woo et al. (2016)10,11.
<ol>
	<li>Przymocuj prawe przedsionek serca do igły o rozmiarze 18, uważając, aby nie wprowadzić żadnych pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Za pomocą strzykawki o pojemności 50 ml szybko i równomiernie przepompuj 50 ml zimnego 0,1 M PBS roztworu zawierającego heparynę (10 jednostek/ml).</li>
	<li>Podłącz igłę o rozmiarze 18 do rurki pompy perystaltycznej.</li>
	<li>Przemyć 200 ml zimnego 0,1 M PBS roztworu zawierającego heparynę (10 jednostek/ml) z prędkością krążenia 10 ml/min.</li>
	<li>Utrwalić za pomocą 250 ml zimnego 4% roztworu PFA przy prędkości cyrkulacji 10 ml/min. Na tym etapie szczur powinien być sztywny.</li>
	<li>Zebrać i przechowywać pozostały roztwór PFA do usunięcia.</li>
	<li>W przypadku PACT należy przetopić tkanki schłodzonym roztworem koktajlu PACT zawierającym 4% PFA, 4% akryloamidu i 0,25% proszku VA-044 za pomocą igły o rozmiarze 18, a następnie usunąć głowę i kręgosłup. Odsłoń czaszkę, wykonując nacięcie w linii środkowej od szyi do nosa. Ten dodatkowy etap perfuzji nie jest konieczny w przypadku metod psPACT i mPACT; Po fiksacji natychmiast odizoluj głowę i kręgosłup oraz odsłoń czaszkę.</li>
	<li>Odsłoń podstawę czaszki, usuwając wszelkie resztki mięśni szyi i kręgosłupa.</li>
	<li>Użyj rongeurów i nożyczek, aby oderwać czaszkę. Usuń mózg i rdzeń kręgowy.</li>
	<li>Tkankę należy przechowywać w 4% PFA w temperaturze 4 °C; tkanki można przechowywać do 1 tygodnia.</li>
</ol>
4. Infuzja monomeru hydrożelowego i polimeryzacja ośrodkowego układu nerwowego szczura i myszy
Uwaga: Akrylamid, SDS, α-tioglicerol i PFA są substancjami drażniącymi i dlatego powinny być używane w dygestorium i z odpowiednim PEE.
<ol>
	<li>PACT (Technika Pasywnego Oczyszczania)
	<ol>
		<li>Wyizolować i wyhodować cały OUN (mózg i rdzeń kręgowy) od myszy i szczurów do probówki o pojemności 50 ml zawierającej schłodzony roztwór koktajlu PACT zawierający 4% PFA, 4% akrylamid i 0,25% VA-044 w proszku i przechowywać w temperaturze 4 °C przez 24 godziny. Upewnij się, że tkanka jest całkowicie zanurzona w roztworze.</li>
		<li>Zanurzyć próbkę w gazowym azocie na 10 minut za pomocą systemu hybrydyzacji żelu tkankowego podłączonego do zbiornika azotu: Ustawić system na 37 °C. Przenieść tkanki do 50 ml probówki zawierającej świeży zimny (4 °C) roztwór koktajlu PACT i połączyć z nakrętką probówki, a następnie włączyć próżnię.</li>
		<li>Aby spolimeryzować hydrożel, należy umieścić probówkę zawierającą próbkę w inkubatorze z wytrząsaniem (150 obr./min, 37 °C) na 3 godziny lub do zakończenia polimeryzacji.</li>
		<li>Za pomocą bibuły (patrz Tabela materiałów) usuń pozostały spolimeryzowany hydrożel otaczający tkanki.</li>
		<li>Przenieść tkankę do probówki o pojemności 50 ml zawierającej roztwór klarujący (8% SDS w 0,1 M PBS, pH 8,0).</li>
		<li>Umieścić próbkę w inkubatorze z wytrząsaniem ustawionym na temperaturę 37 °C i prędkość obrotową 150 obr./min, aż tkanka zostanie usunięta. Średnio potrzeba około 20 dni, aby OUN myszy osiągnął pełną klarowność.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>psPACT (Technika Pasywnego Oczyszczania Oddzielnego od Procesu)
	<ol>
		<li>Odizoluj cały OUN (mózg i rdzeń kręgowy) za pomocą noża do kości i nożyczek od myszy i szczurów z utrwalonym PFA na czystej ławce.</li>
		<li>Przenieść tkanki do probówki o pojemności 50 ml zawierającej 4% PFA i przechowywać w temperaturze 4 °C przez 24 godziny. Upewnij się, że tkanka jest całkowicie zanurzona w utrwalaczu.</li>
		<li>Myć utrwaloną tkankę przez 1 godzinę w 0,1 M PBS, a następnie przenieść do roztworu A4P0 (4% akryloamid w 0,1 M PBS). Przechowywać w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.</li>
		<li>Myj chusteczkę przez 5 minut w 0,1 M PBS.</li>
		<li>Zanurz tkankę w 0,25% VA-044 w 0,1 M PBS. Przechowywać w temperaturze 37 °C przez 6-24 godziny, a następnie przenieść do świeżego 0,25% roztworu VA-044/PBS.</li>
		<li>Osadź próbkę w gazowym azocie na 10 minut za pomocą systemu hybrydyzacji żelu tkankowego (patrz tabela materiałów) podłączonego do zbiornika azotu: Przenieś tkanki do probówki o pojemności 50 ml zawierającej świeży zimny (4 °C) 0,25% roztwór VA-044/PBS i połącz z nakrętką probówki. Włącz odkurzacz.</li>
		<li>Przenieść tkankę do roztworu oczyszczającego (8% SDS w 0,1 M PBS, pH 8,0).</li>
		<li>Inkubować próbkę w inkubatorze z wytrząsaniem ustawionym na temperaturę 37 °C i prędkość obrotową 150 obr./min, aż tkanka zostanie usunięta. Średnio potrzeba około 17 dni, aby OUN myszy osiągnął pełną klarowność.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>mPACT (zmodyfikowana technika pasywnego oczyszczania)
	<ol>
		<li>Odizoluj cały OUN (mózg i rdzeń kręgowy) za pomocą noża do kości i nożyczek od myszy i szczurów z utrwalonym PFA na czystej ławce.</li>
		<li>Wykonaj kroki 4.2.2 - 4.2.8 protokołu psPACT.</li>
		<li>Przenieś tkankę do roztworu czyszczącego. Należy zauważyć, że w przeciwieństwie do protokołów PACT i psPACT, mPACT wymaga roztworu oczyszczającego składającego się z 0,5% α-tioglicerolu oprócz 8% SDS w 0,1 M PBS, pH 8,0. α-tioglicerol jest środkiem niebrązowiejącym, który pomaga szybciej i skuteczniej oczyszczać tkanki. Upewnij się, że tkanka jest całkowicie zanurzona w roztworze.</li>
		<li>Umieścić próbkę w inkubatorze z wytrząsaniem ustawionym na temperaturę 37 °C i prędkość obrotową 150 obr./min, aż tkanka zostanie usunięta. Średnio potrzeba około 2 tygodni, aby OUN myszy osiągnął pełną klarowność.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Dopasowanie współczynnika załamania światła i barwienie immunologiczne oczyszczonego ośrodkowego układu nerwowego
UWAGA: nRIMS (Nycodenz-based Refractive Index Matching Solution) składa się z 0,8 g/ml proszku Nycodenz rozpuszczonego w 30 ml buforze zasadowym (0,01% azydku sodu i Tween-20 w 0,1 M PBS, pH 8,0). Zaleca się, aby roztwór umieścić w inkubatorze z wytrząsaniem o temperaturze 37 °C, aby umożliwić prawidłowe rozsolwatowanie proszku.
<ol>
	<li>Inkubować tkanki w 0,1% Triton X-100 w 0,1 M PBS przez 2 godziny, a następnie blokować 2% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w 0,1 M PBS przez 6 godzin.</li>
	<li>Przemyj skrawki trzykrotnie w PBST (0,1% Tween-20 w 0,1 M PBS) przez 2 godziny. Wybarwiaj skrawki pierwotnymi przeciwciałami (w tym przypadku przeciwciałem anty-króliczym PECAM-CD31, które barwi naczynia krwionośne) przez 2 dni.</li>
	<li>Wybarwić skrawki przeciwciałami drugorzędowymi (w tym przypadku koniugatem fluorescencyjnym kozy anty-króliczej IgG Cy3) w 2% BSA przez 2 dni.</li>
	<li>Oznakowane chusteczki należy myć trzykrotnie w PBST przez 2 godziny i przechowywać w 15 ml nRIMS przez 2 - 10 dni.</li>
	<li>Przed obrazowaniem przenieś znakowane tkanki do niewielkiej ilości nRIMS na 35- lub 60-milimetrowych szalkach do hodowli tkankowych. Przymocuj silikonem wokół dolnej krawędzi naczynia.</li>
	<li>Dodaj 1,5 - 2 ml świeżych felg.</li>
</ol>
6. Przetwarzanie obrazu
<ol>
	<li>Uzyskanie obrazów oczyszczonych tkanek za pomocą skanowania płytek za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego z 10-krotnym powiększeniem (patrz tabela materiałów). W przypadku tkanki znakowanej Cy3 należy stosować długości fal 550-600 nm.</li>
</ol>

<ol><li>Zhu, X., Xia, Y., Wang, X., Si, K., Gong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+brain+imaging%3A+A+powerful+tool+for+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Bull%22%5BJournal%5D)">Optical brain imaging: A powerful tool for neuroscience.</a> Neurosci Bull. 33 (1), 95-102 (2017).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li>
<li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLARITY+reveals+dynamics+of+ovarian+follicular+architecture+and+vasculature+in+three-dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions.</a> Sci Rep. 7, 44810(2017).</li>
<li>Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+application+of+the+electrophoretic+tissue+clearing+technology%2C+CLARITY%2C+to+intact+solid+organs+including+brain%2C+pancreas%2C+liver%2C+kidney%2C+lung%2C+and+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine.</a> BMC Dev Biol. 14, 48(2014).</li>
<li>Jensen, K. H. R., Berg, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+perspectives+in+tissue+clearing+using+CLARITY%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Advances and perspectives in tissue clearing using CLARITY.</a> J Chem Neuroanat. 86, 19-34 (2017).</li>
<li>Treweek, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+tissue+stabilization+and+selective+extractions+via+tissue-hydrogel+hybrids+for+high-resolution+intact+circuit+mapping+and+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping.</a> Nat Protoc. 10 (11), 1860-1896 (2015).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li>
<li>Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+tissue+clearing+%28PACT%29%3A+Technical+evaluation+and+new+perspectives+in+immunofluorescence%2C+histology%2C+and+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure.</a> Sci Rep. 6, 34331(2016).</li>
<li>Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+optical+transparency+of+rodent+tissues+by+modified+PACT-based+passive+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing.</a> Exp Mol Med. 48 (12), 274(2016).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li>
<li>Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+clearing+of+the+mouse+central+nervous+system+using+passive+CLARITY%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY.</a> J Vis Exp. (112), (2016).</li>
<li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeDB%3A+A+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SeeDB: A simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li>
<li>Choi, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+the+receptor+for+advanced+glycation+end+products+in+neurons+and+astrocytes+in+a+triple+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Increased expression of the receptor for advanced glycation end products in neurons and astrocytes in a triple transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> Exp Mol Med. 46, 75(2014).</li>
<li>Chang, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contralaterally+transplanted+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+precursor+cells+%28ENStem-A%29+migrate+and+improve+brain+functions+in+stroke-damaged+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Contralaterally transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursor cells (ENStem-A) migrate and improve brain functions in stroke-damaged rats.</a> Exp Mol Med. 45, 53(2013).</li>
<li>Kim, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+differential+plaque+depositions+in+the+brains+of+Tg2576+and+Tg-APPswe%2FPS1dE9+transgenic+mouse+models+of+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Analysis of differential plaque depositions in the brains of Tg2576 and Tg-APPswe/PS1dE9 transgenic mouse models of Alzheimer disease.</a> Exp Mol Med. 44 (8), 492-502 (2012).</li>
<li>Kinameri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prdm+proto-oncogene+transcription+factor+family+expression+and+interaction+with+the+Notch-Hes+pathway+in+mouse+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Prdm proto-oncogene transcription factor family expression and interaction with the Notch-Hes pathway in mouse neurogenesis.</a> PLoS One. 3 (12), e3859(2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podczas gdy pasywne, nieelektroforetyczne metody ekstrakcji zastosowane w PACT znacznie poprawiły spójność osiągniętą z poprzednimi metodami oczyszczania tkanek, takimi jak CLARITY 2,3,4,7,8, technika ta nadal ma kilka wad, z których najbardziej palącą jest czas wymagany do osiągnięcia maksymalnej przejrzystości tkanek 12. W niniejszym...

Podstawowym celem badań naukowych i klinicznych jest osiągnięcie pełnego zrozumienia budowy i funkcji narządów; jednak niezwykle złożona natura organów ssaków często służy jako bariera do pełnego osiągnięcia tego celu1. CLARITY (Tisssue-hYdrogel, kompatybilny z przezroczystym lipidowym hybrydyzowanym akrylamidem, sztywnym obrazowaniem)2,3,4, który polega na zbudowaniu hybrydy hydrożelowej na bazie akrylamidu z nienaruszonych tkanek, osiąga optyczną klirens różnych narządów, w tym mózgu, wątroby i śledziony, zachowując jednocześnie ich integralność strukturalną5. W ten sposób projekt CLARITY umożliwił nie tylko wizualizację, ale także możliwość precyzyjnego przeanalizowania złożonych sieci komórkowych i morfologii tkanek bez konieczności przeprowadzania sekcji.
Aby osiągnąć klirens tkankowy, CLARITY wykorzystuje metody elektroforetyczne do usunięcia zawartości lipidów z dostępnej próbki. Podczas gdy w ramach projektu CLARITY zauważono, że wytwarza się fizycznie stabilne hybrydy tkankowo-hydrożelowe, badania wykazały, że zastosowanie metod elektroforetycznego oczyszczania tkanek (ETC) daje zmienne wyniki pod względem jakości tkanek, w tym brązowienia, uszkodzenia epitopów i utraty białka5,6. Aby rozwiązać te problemy, opracowano zmodyfikowane protokoły, takie jak PACT (PAssive Clarity Technique), który zastępuje leczenie ETC pasywną techniką delipidacji opartą na jonowym depilencie7,8,9. Pomimo osiągnięcia większej spójności wyników, PACT wymaga więcej czasu na uzyskanie maksymalnego klirensu. Co więcej, żadna z tych technik nie została jeszcze zastosowana do całej formy OUN lub w większych modelach gryzoni, takich jak szczury i świnki morskie.
Niniejsze badanie ma na celu rozwiązanie tych ograniczeń poprzez zaproponowanie nowych metodologii, psPACT (process-separate PACT) i mPACT (modified PACT), ułatwiających szybkie usuwanie całego OUN i narządów wewnętrznych zarówno w modelach mysich, jak i szczurzych10. W szczególności psPACT przetwarza tkanki w 4% akrylamidu i 0,25% VA-044 w dwóch oddzielnych etapach podczas tworzenia hydrożelu; mPACT zasadniczo obejmuje te same kroki, ale uzupełnia roztwór czyszczący na bazie SDS o 0,5% α-tioglicerolu jako kluczowy odczynnik. Obie techniki wykorzystują endogenny układ krążenia układowego i mózgowo-rdzeniowego, aby znacznie skrócić czas potrzebny do wytworzenia klirensu optycznego. Jako dowód słuszności zasady, demonstrujemy zastosowanie mikroskopii konfokalnej do analizy wzorców naczyń krwionośnych w oczyszczonych tkankach10.

<table><tbody><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>Affymetrix, Inc.</td><td>75819</td><td>Roztwór czyszczący</td></tr><tr><td>Nycodenz</td><td>Axia-Shield</td><td>1002424</td><td>roztwór nRIMS</td></tr><tr><td>40% roztwór akryloamidu Bio</td><td>Rad Laboratories, Inc.</td><td>161-0140</td><td>Polimeryzacja (A4P0)</td></tr><tr><td>2,2&ostrego;-azobis[2-(2-imidazolin-2-ylo)propanu] Dichlorowodorek</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>017-19362</td><td>Polimeryzacja (VA-044)</td></tr><tr><td>1-Tioglycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1753-100ML</td><td>Roztwór czyszczący (mPACT)</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Georgiachem</td><td>9005-64-5</td><td>Roztwór nRIMS</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-50ML</td><td>Barwienie immunologiczne</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Bovogen</td><td>BSA100</td><td>Heparyna barwienia immunologicznego</td></tr><tr><td></td><td>Merck Millipore</td><td>375095</td><td>Perfusion (PBS)</td></tr><tr><td>Roztwór azydku sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002-25G</td><td>nRIMS</td></tr><tr><td>przeciwciało PECAM-CD31</td> Santa <td>Cruz Biotechnology Inc.</td><td>sc-28188</td><td>Immuno Staining</td></tr><tr><td>Goat anty-króliczo-IgG Cy3 fluorescencyjny koniugat</td><td>Jackson ImmunoResearch Inc.</td><td>111-165-003</td><td>Barwienie immunologiczne</td></tr><tr><td>4% paraformaldehyd</td><td>Tech & Innowacja</td><td>BPP-9004</td><td>Perfuzja, polimeryzacja</td></tr><tr><td>20X sól fizjologiczna buforowana fosforanem (pH 7,4)</td><td>Tech & Innowacja</td><td>BPB-9121</td><td>Perfuzja, bufor</td></tr><tr><td>10 ml striptizerka</td><td>Coatar</td><td>4488</td><td>Probówka do przenoszenia roztworu</td></tr><tr><td>50 ml</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td>Probówka czyszcząca</td></tr><tr><td>35 mm Naczynie do hodowli komórkowych</td><td>SPL</td><td>20035</td><td>Obrazowanie</td></tr><tr><td>Naczynie konfokalne</td><td>SPL</td><td>211350</td><td>Obrazowanie</td></tr><tr><td>1 ml strzykawka</td><td>Korea vaccine Co., Ltd</td><td>26G 1/2</td><td>Znieczulenie&nbsp;</td></tr><tr><td>Strzykawka 50 ml</td><td>Korea vaccine Co., Ltd</td><td>21G1 1/4</td><td>Perfusion</td></tr><tr><td>Akrylamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3553</td><td>Polimeryzacja (A4P0)</td></tr><tr><td>Papier Whatman 3MM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z270849</td><td>Bibuła do usuwania żelu</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Obrazowanie Zeiss</td><td>LSM780</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie ZEN lite</td><td>Obrazowanie Zeiss</td><td>ZEN 2012</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>Longerpump</td><td>BT100-1F</td><td>Perfusion</td></tr><tr><td>EasyGel</td><td>Lifecanvas Technologies</td><td>EasyGel</td><td>System hybrydyzacji żelu tkankowego</td></tr></tbody></table>

nowatorskie metody pasywnego oczyszczania do szybkiego wytwarzania przezroczystości optycznej w całej tkance oun

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Od czasu opracowania CLARITY, bioelektrochemicznej techniki oczyszczania, która pozwala na trójwymiarowe mapowanie fenotypów w przezroczystych tkankach, powstało wiele nowatorskich metodologii oczyszczania, w tym CUBIC (czyste, niezakłócone koktajle obrazowania mózgu i analiza obliczeniowa), SWITCH (ogólnosystemowa kontrola czasu interakcji i kinetyki substancji chemicznych), MAP (powiększona analiza proteomu) i PACT (technika pasywnej przejrzystości), aby dalej rozwijać Rozszerzenie istniejącego zestawu narzędzi do analizy mikroskopowej tkanek biologicznych. Niniejsze badanie ma na celu ulepszenie i optymalizację oryginalnej procedury PACT dla szeregu nienaruszonych tkanek gryzoni, w tym całego ośrodkowego układu nerwowego (OUN), nerek, śledziony i całych zarodków myszy. Te nowatorskie techniki, określane jako psPACT (process-separate PACT) i mPACT (modified PACT), zapewniają wysoce skuteczne metody mapowania obwodów komórkowych i wizualizacji struktur subkomórkowych w nienaruszonych normalnych i patologicznych tkankach. W poniższym protokole przedstawiamy szczegółowy zarys krok po kroku, w jaki sposób osiągnąć maksymalny klirens tkanek przy minimalnym naruszeniu ich integralności strukturalnej za pomocą psPACT i mPACT.

Kształtowanie przezroczystego modelu całego ośrodkowego układu nerwowego z wykorzystaniem zoptymalizowanych technik pasywnego klarowania
Optyczne przejrzyszczanie całych tkanek OUN myszy i szczura zostało szybko osiągnięte przy użyciu różnych pasywnych technik przejrzyszczania (Rycina 1). Schemat przejrzyszczania tkanek w czasie przedstawiono na Rycynie 2A</stro...

Tutaj prezentujemy dwie nowatorskie metodologie, psPACT i mPACT, do osiągnięcia maksymalnej przezroczystości optycznej i późniejszej mikroskopowej analizy unaczynienia tkanek w nienaruszonym całym OUN gryzonia.

Nowatorskie metody pasywnego oczyszczania do szybkiego wytwarzania przezroczystości optycznej w całej tkance OUN

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

Ogólnym celem tych metod psPACT i mPACT jest szybkie usunięcie całej tkanki OUN bez konieczności stosowania elektroforetycznego systemu oczyszczania tkanek. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie modeli badań nad chorobami człowieka, takimi jak choroba Alzheimera lub urazy oraz zwyrodnienia i nowotworzenie Główną zaletą tej techniki jest to, że tkanka OUN myszy nie jest uszkadzana przez elektroforetyczne oczyszczanie tkanki i jest szybko usuwana przez zmodyfikowane oczyszczanie pasywne.Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody po użyciu oryginalnego PACT i wcześniejszej metody oczyszczania mózgu. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ metoda psPACT i mPACT są trudne do przeprowadzenia, ponieważ metoda ta składa się z wielu etapów przygotowania próbki. Rozpocznij od przygotowania roztworu koktajlu PACT, dodając proszek VA-044 do roztworu 4% PFA i 4% akrylamidu o końcowym stężeniu 0,25%Po perfuzji tkanek roztworem PACT, całkowicie zanurz cały mózg i rdzeń kręgowy w 50-mililitrowej probówce zawierającej schłodzony roztwór PACT i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 24 godziny.24 godziny później przenieś tkankę do 50-mililitrowej probówki zawierającej świeży, zimny roztwór PACT i podłącz nakrętkę probówki do systemu hybrydyzacji żelu tkankowego, podłączonego do zbiornika azotu i ustawionego na 37 stopni Celsjusza. Następnie włącz próżnię i gaz na 10 minut, aby zanurzyć próbkę w gazowym azocie. Aby spolimeryzować hydrożel, umieść probówkę zawierającą próbkę w inkubatorze wytrząsającym ustawionym na 150 obr./min i 37 stopni Celsjusza na trzy godziny lub do momentu zakończenia polimeryzacji.Po inkubacji użyj bibuły, aby usunąć pozostały spolimeryzowany hydrożel otaczający tkanki. Następnie przenieś tkankę do 50-mililitrowej probówki zawierającej roztwór klarujący. Umieścić próbkę w inkubatorze wstrząsającym ustawionym na 37 stopni Celsjusza i 150 obr./min, aż tkanka zostanie usunięta.Średnio potrzeba około 20 dni, aby OUN myszy osiągnął pełną klarowność. Rozpocznij psPACT od OUN od myszy perfundowanej 4% PFA, która została utrwalona w 4% PFA w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 24 godziny. Myj utrwaloną tkankę przez godzinę w 0,1 molowym PBS.Po umyciu przenieś tkankę do roztworu A4P0 i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Następnego dnia, po umyciu tkanki w PBS przez pięć minut, zanurz tkankę w 0,25% VA-044 w PBS i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez sześć do 24 godzin. Oddzielenie akrylamidu i następujący po nim etap VA-044 pozwala uniknąć konieczności usuwania pozostałych niespolimeryzowanych monomerów hydrożelowych, które otaczają tkankę, co może zagrozić końcowej integralności tkanki po osiągnięciu przezroczystości za pomocą PACT.Po inkubacji przenieść tkanki do świeżego, zimnego roztworu VA-044. Następnie zanurzyć próbkę w gazowym azocie na 10 minut. Przenieś tkankę do roztworu czyszczącego.Następnie inkubować próbkę w inkubatorze z wytrząsaniem ustawionym na 37 stopni Celsjusza i 150 obr./min, aż tkanka zostanie oczyszczona. Średnio potrzeba około 17 dni, aby OUN myszy osiągnął pełną klarowność. W przypadku mPACT postępuj zgodnie z protokołem psPACT do momentu kroku rozwiązania czyszczącego.Następnie całkowicie zanurz roztwór oczyszczający tkanki zawierający 0,5% alfa-tioglicerol, środek niebrązowiejący, oprócz 8% SDS w 0,1-molowym PBS. Umieścić próbkę w inkubatorze wstrząsającym ustawionym na 37 stopni Celsjusza i 150 obr./min, aż tkanka zostanie usunięta. Średnio wystarczy tylko dwa tygodnie, aby mysi OUN osiągnął pełną klarowność za pomocą mPACT.W niniejszym badaniu próbki mózgu myszy poddane działaniu protokołu mPACT osiągnęły przezroczystość optyczną po 14 dniach, wyprzedzając próbki poddane działaniu protokołów PACT i psPACT. Próbki całego ośrodkowego układu nerwowego szczurów oczyszczone za pomocą mPACT osiągnęły maksymalny klirens w ciągu 20 dni. Same mózgi dorosłych szczurów, w przeciwieństwie do całego OUN, zostały oczyszczone za pomocą mPACT w ciągu zaledwie pięciu dni.Po opanowaniu tę technikę można wykonać w ciągu dwóch tygodni z całym OUN myszy, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny neurobiologii i anatomii do badania chorób patofizjologicznych, takich jak uszkodzenia tkanek, wady rozwojowe, nowotwory i choroby neurodegeneracyjne w modelach OUN ssaków.

novel-passive-clearing-methods-for-rapid-production-optical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszej pracy opisujemy szybką i prostą metodę obrazowania fluorescencyjnie znakowanych komórek w półgrubych skrawkach mózgu. Poprzez utrwalenie, pocięcie i optyczne klarowanie tkanki mózgowej opisujemy, w jaki sposób standardowe obrazowanie epifluorescencyjne lub konfokalne może być wykorzystane do wizualizacji poszczególnych komórek i sieci neuronalnych w obrębie nienaruszonej tkanki nerwowej.

Szybka metoda obrazowania fluorescencyjnego o wysokiej rozdzielczości w półgrubych przekrojach mózgu

Techniki optycznego oczyszczania rewolucjonizują sposób wizualizacji tkanek. W tym raporcie opisujemy modyfikacje oryginalnego protokołu CLARITY (Clear, Lipid-exchanged, Engineerized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel), który zapewnia bardziej spójne i tańsze wyniki.

Optyczne oczyszczanie ośrodkowego układu nerwowego myszy za pomocą pasywnego CLARITY

ACT-PRESTO (technika aktywnej przejrzystości - efektywny i stabilny transfer makrocząsteczek do organów związany z ciśnieniem) umożliwia szybkie, skuteczne, ale niedrogie oczyszczanie tkanek i szybką penetrację przeciwciał do oczyszczonych tkanek poprzez pasywną dyfuzję lub dostarczanie wspomagane ciśnieniem. Za pomocą tej metody można oczyścić szeroki zakres tkanek, znakować immunologicznie wieloma przeciwciałami i obrazować objętość.

ACT-PRESTO: Biologiczne metody oczyszczania tkanek i znakowania immunologicznego w obrazowaniu objętościowym

Połączenie znakowania przeciwciałami, optycznego oczyszczania i zaawansowanej mikroskopii świetlnej pozwala na trójwymiarową analizę całych struktur lub organów. Opisano tutaj prostą metodę łączenia znakowania immunologicznego grubych plasterków nerki, oczyszczania optycznego za pomocą cynamonianu etylu oraz obrazowania konfokalnego, które umożliwia wizualizację i kwantyfikację trójwymiarowych struktur nerkowych.

Optyczne oczyszczanie i obrazowanie znakowanej immunologicznie tkanki nerki

Neuronalna morfologia dendrytyczna często leży u podstaw funkcji. Rzeczywiście, wiele procesów chorobowych, które wpływają na rozwój neuronów, objawia się fenotypem morfologicznym. Protokół ten opisuje prostą i potężną metodę analizy nienaruszonych altan dendrytycznych i związanych z nimi kolców.

Obrazowanie i kwantyfikacja nienaruszonych dendrytów neuronalnych za pomocą oczyszczania tkanek w ramach projektu CLARITY

Protokół dostarcza szczegółową metodę obrazowania neuronów w wycinku mózgu za pomocą metody oczyszczania tkanki, ScaleSF. Protokół obejmuje przygotowanie tkanki mózgowej, klarowanie tkanek, postępowanie z oczyszczonymi wycinkami oraz konfokalne obrazowanie struktur neuronalnych za pomocą laserowej mikroskopii skaningowej od poziomu mezoskopowego do mikroskopowego.

Metoda oczyszczania tkanek do obrazowania neuronów ze skal mezoskopowych do mikroskopowych

Sferoidy nowotworowe są coraz częściej wykorzystywane do oceny interakcji komórek nowotworowych z mikrośrodowiskiem i odpowiedzi na terapię. Niniejszy protokół opisuje solidną, ale prostą metodę pół-wysokoprzepustowego obrazowania sferoid guza 3D przy użyciu szybkiego usuwania optycznego.

Szybkie oczyszczanie optyczne do półwysokoprzepustowej analizy sferoidów nowotworowych

Obecny protokół zapewnia krok po kroku procedurę szybkiego i jednoczesnego oczyszczania optycznego, wieloetapowego znakowania i wolumetrycznej rekonstrukcji 3D dziesiątek pośmiertnych odcinków ludzkiego mózgu poprzez połączenie (SWITCH - H2O2 - Pozyskiwanie antygenu R- 2,2'-tiodieetanol [TDE]) KRÓTKA technika transformacji tkankowej z obrazowaniem mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą arkusza świetlnego w rutynowym protokole wysokoprzepustowym.

Optyczne oczyszczanie i znakowanie w mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych w wielkoskalowym obrazowaniu ludzkiego mózgu

Protokół ten łączy w sobie oczyszczanie optyczne i znakowanie immunologiczne w celu obrazowania konfokalnego całej objętości organoidów siatkówki z pełnym mocowaniem. Zachowuje strukturę 3D, umożliwiając szczegółową wizualizację kluczowych ścieżek neuronalnych, usprawniając badanie dojrzewania siatkówki, organizacji przestrzennej i jej potencjalnych zastosowań w modelowaniu chorób i medycynie spersonalizowanej.

Wizualizacja organoidów siatkówki w całości z rozdzielczością komórkową

Techniki oczyszczania optycznego, takie jak roztwory cząsteczek absorpcyjnych, tymczasowo zmniejszają rozpraszanie światła w celu poprawy obrazowania biologicznego i oferują biokompatybilne, odwracalne strategie obrazowania in vivo dla głęboko osadzonych narządów. Protokół ten przedstawia szczegółowe procedury eksperymentalne, a także zaawansowane przetwarzanie obrazu w celu uzyskania wysokiej jakości, dynamicznego obrazowania dynamiki w czasie rzeczywistym u żywych zwierząt.

Przejściowe oczyszczanie optyczne z wykorzystaniem cząsteczek absorpcyjnych do obrazowania ex vivo i in vivo

Poznaj metody psPACT i mPACT do szybkiego oczyszczania całej tkanki OUN u myszy i szczurów bez elektroforezy. Techniki te umożliwiają badanie chorób neurodegeneracyjnych i nowotworowych z zachowaniem integralności próbek.

Nowatorskie metody pasywnego oczyszczania do szybkiego wytwarzania przezroczystości optycznej w całej tkance OUN

Przeglądaj więcej filmów