Hemisekcja boczna rdzenia kręgowego i asymetryczna ocena zachowania u dorosłych szczurów
24 marca 2020
Tutaj opisujemy procedury chirurgiczne mające na celu uzyskanie niezawodnej bocznej hemisekcji rdzenia kręgowego (HX) na 9 poziomie klatki piersiowej u dorosłych szczurów oraz oceny neurobehawioralne przeznaczone do wykrywania asymetrycznych deficytów po takim jednostronnym urazie.
Protokół ten zapewnia wiarygodny zwierzęcy model bocznej hemisekcji rdzenia kręgowego, który naśladuje zespół Browna-Sequarda u ludzi, oraz nową połączoną skalę zachowań do oceny asymetrycznych deficytów zachowania. Ten mysi model hemisekcji może pogłębić naszą wiedzę na temat zaburzeń neurologicznych, które występują w zespole Browna-Sequarda u ludzi. W przeciwieństwie do wyżej wymienionych ocen, nasza nowa połączona skala zachowań może być zastosowana do dowolnej formy, która wymagała oceny asymetrycznej, deficytów lokomotywy i w laboratorium.
Wykorzystanie tego spójnego, naturalnego modelu przekroju półprzewodnika może ułatwić porównanie wyników eksperymentu między badaniami podstawowymi a badaniami translacyjnymi. Używanie spójnego wyniku z tym modelem może być trudne dla początkujących. Krytycznym krokiem jest umieszczenie igły pionowo w linii środkowej, jako wskazówka do wywołania urazu.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonywać zarówno zabiegi chirurgiczne, jak i behawioralne. W dniu zabiegu należy oczyścić stół operacyjny 70% etanolem, a na stole położyć podgrzaną poduszkę grzewczą. Po pokryciu pola operacyjnego sterylnym obłożeniem chirurgicznym należy potwierdzić brak reakcji na uszczypnięcie palca u znieczulonego szczura.
Nałóż maść na oczy zwierzęcia, aby zapobiec wysuszeniu rogówki, i ogol włosy leżące nad kręgami piersiowymi. Następnie oczyść odsłoniętą skórę trzema naprzemiennymi peelingami na bazie jodu i etanolu. Kiedy zwierzę jest gotowe, zlokalizuj trzynaste żebro i podążaj za żebrem grzbietowo, aby zidentyfikować jego połączenie z kręgiem T-13.
Policz, aby zidentyfikować kręg T-9 i użyj ostrza skalpela numer piętnaście, aby wykonać trzy- do czterocentymetrowego nacięcia skóry w linii środkowej nad ośmioma do jedenastymi wyrostkami kolczystymi kręgów. Przenieś szczura pod mikroskopem chirurgicznym i tępo wypreparuj i oddziel mięśnie przykręgosłupowe bocznie od wyrostków kolczystych w kierunku fasetek kręgów T-9 i T-10 po obu stronach. Odblokuj kręgosłup za pomocą zmodyfikowanego uchwytu stabilizującego, wykonaj szczelinę po obu stronach bocznej kości kręgowej i wsuń ramiona uchwytu ze stali nierdzewnej pod odsłonięte fasety wyrostka poprzecznego.
Dokręć, aby zabezpieczyć uchwyt i użyj kątomierza, aby odsłonić blaszki kręgowe T-8 do 11 i wyrostki kolczyste. Za pomocą rongeura odetnij wyrostek kolczysty T-9 i usuń niewielką część blaszki, od lewej do linii środkowej i całą prawą część blaszki, tak bocznie, jak to możliwe. Następnie delikatnie włóż ronguer pod blaszkę i odetnij po jednym małym kawałku kości na raz, aż pożądany obszar laminektomii zostanie zakończony.
Następnie zidentyfikuj grzbietową linię środkową rdzenia kręgowego i wbij igłę o rozmiarze 30 pionowo przez linię środkową, do rdzenia kręgowego, aż do brzusznej ściany kanału kręgowego, ze skosem skierowanym w prawo. Zatamuj krwawienie małym kawałkiem sterylnej pianki żelowej i włóż jedną końcówkę nożyczek mikrochirurgicznych do irydektomii przez linię środkową ścieżki igły, a drugą końcówkę wzdłuż bocznej powierzchni prawego półmikordu, aby wykonać całkowite nacięcie na prawym półmikordzie. Użyj bocznej krawędzi tej samej igły jako noża, aby przeciąć szczelinę zmiany, aby potwierdzić pełną prawą półsekcję.
I wizualizuj dno kanału kręgowego, aby zweryfikować kompletność prawej półsekcji. Użyj mieszanki cementowej do zbudowania wąskiego mostu nad gąbką oraz wyrostków kolczystych T-8 i T-10. Następnie zszyj warstwy mięśni i skóry oddzielnie jedwabną nicią 4/0 i wstrzyknij podskórnie 0,9% sterylnej soli fizjologicznej, aby utrzymać nawilżenie.
Uciskanie pęcherza moczowego dwa do trzech razy dziennie przez pierwszy tydzień i jeden do dwóch razy w kolejnych tygodniach, aż do powrotu spontanicznego oddawania moczu. W odpowiednich punktach doświadczalnych po zabiegu umieść dorosłego szczura w doświadczeniu na otwartym polu i badaj lokomocję zwierzęcia przez cztery minuty. Korzystając z tabeli, przypisz wartość 1 dla "tak" i 0 dla "nie" dla każdej kategorii zachowania i zsumuj łączną wartość, aby uzyskać ostateczny jednostronny wynik kroku półsekcji od 0 do 8.
Do celów analizy sprzęgu bramek należy zarejestrować zwierzę doświadczalne chodzące po urządzeniu do wąskiego pasa startowego i przypisać wynik 0 dla nr 1 dla zwykłego "i/lub niezdarnego" i 2 dla normalnego dla każdej kategorii sprzęgu. W celu oceny umiejscowienia kontaktowego należy trzymać zwierzę w pozycji pionowej, tak aby obie tylne kończyny były dostępne do reakcji na umieszczenie, i lekko przesunąć powierzchnię grzbietową jednej kończyny tylnej do przodu w kierunku krawędzi powierzchni. Obserwuj ułożenie stopy na powierzchni i przypisz wynik umieszczenia kontaktu z tylną kończyną 0 w przypadku braku umieszczenia" i 1 w przypadku umieszczenia"W celu oceny chodzenia po siatce umieść szczura na podwyższonej siatce drucianej pokrytej tworzywem sztucznym o wymiarach trzydzieści sześć na trzydzieści osiem centymetrów z 3 cm kwadratowymi otworami i nagraj wideo szczura swobodnie chodzącego po platformie przez 30 kroków, aby umożliwić ilościowe określenie liczby błędów w stawianiu stóp dla każdej kończyny w celu określenia ciężkości deficyt motoryczny.
Aminofluorescencyjne barwienie przekroju poprzecznego w epicentrum uszkodzenia wskazuje na całkowitą utratę prawego półmikordu. I zachowanie lewej półkordy przeciwległej do urazu. Wyniki poszczególnych miar oceny bramek mogą być analizowane oddzielnie lub mogą być łączone w złożony łączny wynik zachowania po hemisekcji.
W ciągu pierwszych trzech dni po urazie szczury tracą zdolność do chodzenia, a ruchy przypominające kroki zaczynają pojawiać się ponownie po stronie kostnej po 7-10 dniach od urazu. A większość kroków to stopnie grzbietowe. Do 28 dni po hemisekcji T-9 szczury mogą podejmować kroki podeszwowe z praktycznie normalną koordynacją.
Dla porównania, tylna kończyna przeciwskrzydłowa jest mniej przerwana, a wynik jednostronnej hemisekcji spada w ciągu pierwszych pięciu dni po urazie i wraca do wartości wyjściowej do 10 dnia po urazie. W przypadku całkowitego testu sprzęgania bramki zarówno stabilność, jak i zdolność adaptacji koordynacji po hemisekcji są znacznie zmniejszone w ciągu pierwszych pięciu dni po urazie. Dotyczy to również umieszczania kontaktu i chodzenia po siatce ipsilateralnej kończyny tylnej, zwykle odzyskując, gdy zwierzę zaczyna stawiać kroki podeszwowe.
Spowodowanie czystego zranienia może być trudne. Umieszczenie igły w środku może być pomocną wskazówką zapewniającą całkowite oddzielenie tkanki.
Przegląd
W niniejszym artykule szczegółowo opisano procedury chirurgiczne umożliwiające uzyskanie wiarygodnego bocznego przerwania rdzenia kręgowego na poziomie 9. kręgu piersiowego u dorosłych szczurów. Przedstawiono również oceny neurobehawioralne służące do wykrywania asymetrycznych deficytów po jednostronnym urazie.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Ocena behawioralna
- Modele zwierzęce
Wstęp
- Model bocznej hemisekcji rdzenia kręgowego naśladuje zespół Browna-Séquarda.
- Zrozumienie deficytów neurologicznych w tym modelu może dostarczyć cennych informacji na temat schorzeń u ludzi.
- Wprowadzono nową, połączoną skalę behawioralną do oceny deficytów.
- Osiągnięcie spójnych wyników może być trudne dla osób początkujących.
Cel badania
- Ustanowienie wiarygodnego modelu zwierzęcego dla urazów rdzenia kręgowego.
- Opracowanie skali behawioralnej do oceny deficytów lokomocyjnych.
- Ułatwienie porównań między badaniami podstawowymi a translacyjnymi.
Zastosowane metody
- Procedury chirurgiczne w celu wywołania hemisekcji u dorosłych szczurów.
- Oceny behawioralne, w tym testy otwartego pola oraz oceny chodu po kratownicy.
- Systemy punktacji dla lokomocji i reakcji stawiania stóp.
- Analiza histologiczna w celu potwierdzenia całkowitości uszkodzenia.
Główne wyniki
- Szczury wykazują początkową utratę zdolności do chodzenia po urazie.
- Ruchy przypominające kroki pojawiają się ponownie po stronie ipsilateralnej po 7-10 dniach.
- Funkcja tylnej kończyny po stronie kontralateralnej powraca do wartości bazowej do 10. dnia.
- Wyniki behawioralne wskazują na znaczną regenerację do 28. dnia po urazie.
Wnioski
- Model ten dostarcza wiedzy na temat wzorców powrotu do sprawności po urazie rdzenia kręgowego.
- Oceny behawioralne mogą skutecznie mierzyć stopień regeneracji oraz występujące deficyty.
- Niniejsza analiza pogłębia zrozumienie zespołu Browna-Séquarda u ludzi.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół ustanawia wiarygodny szczurzy model bocznej hemisekcji rdzenia kręgowego, który naśladuje ludzki zespół Browna-Séquarda, umożliwiając mechaniczną weryfikację i redukcję ryzyka dla kandydatów terapeutycznych ukierunkowanych na asymetryczne deficyty sensoryczno-motoryczne. Zintegrowana skala behawioralna (CBS-HX) zapewnia ilościową ocenę jednostronną kończyn tylnych, co wspiera walidację celów i pewność prognostyczną w przedklinicznych procesach odkrywania leków. Dzięki umożliwieniu interfunkcjonalnego porównania wzorców regeneracji po stronie ipsylateralnej i kontralateralnej, model ten wspomaga selekcję projektów w portfolio oraz decyzje o dostosowanym do ryzyka rozwoju interwencji neuroprotekcyjnych lub neurorestauracyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie hipotez terapeutycznych związanych z jednostronną modulacją szlaków sensoryczno-motorycznych oraz mechanizmami regeneracji specyficznymi dla danego szlaku.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ustandaryzowane ramy chirurgiczne i behawioralne dla spójnej oceny zaangażowania celu w ramach kampanii badawczych.
- Wartość prognostyczna: Wspiera biologiczną redukcję ryzyka poprzez izolację wkładu funkcjonalnego strony ipsilateralnej względem kontralateralnej, co zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną podczas identyfikacji wiodących kandydatów.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość analizy: CBS-HX generuje mierzalne, złożone wyniki (0–18) na podstawie jednostronnego stawiania kroków tylną kończyną, sprzęgania, ustawiania kontaktu oraz chodzenia po kratce, co umożliwia wysokoprzepustowy screening funkcjonalny.
- Powtarzalność: Ustandaryzowane kryteria punktacji (np. przypisanie 0/1 dla stawiania kroków, 0–2 dla sprzęgania) zapewniają niezawodność między oceniającymi oraz standaryzację analizy w różnych laboratoriach.
- Skalowalność: Platformy do testów w otwartej przestrzeni i chodzenia po kratce wspierają powtarzalne oceny podłużne, co ułatwia analizy zależności dawka-odpowiedź oraz przebiegu czasowego w kaskadach screeningowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Model odtwarza kluczowe cechy ludzkiego zespołu Browna-Séquarda, w tym jednostronny niedowład ruchowy oraz przeciwstronne zaburzenia czucia bólowego i termicznego, co poprawia zgodność z translacyjnymi biomarkerami.
- Ciągłość przedkliniczna: Umożliwia podłużne śledzenie powrotu funkcji (np. powrót podparcia stopy do 28. dnia), co pozwala na podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju w fazie przedklinicznej z uwzględnieniem oceny ryzyka.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Pozwala na oddzielną analizę reakcji kończyn tylnych po stronie ipsilateralnej i kontralateralnej, co pozwala odróżnić efekty specyficzne dla celu od kompensacji systemowej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu, przez identyfikację związku wiodącego, aż po przedkliniczne testy skuteczności, wspierając decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) w oparciu o asymetryczny powrót funkcji.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących jednostronnej modulacji szlaków oraz ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez śledzenie upośledzenia kończyn tylnych po stronie ipsilateralnej.
- Przesiew: Dostarcza gotowe do analizy wyniki ilościowe (np. podpunkty CBS-HX) do niezawodnej oceny związków w testach funkcji motorycznych.
- Analityka: Generuje podłużne zestawy danych behawioralnych (np. wyniki kroków w ciągu 28 dni), które umożliwiają statystyczne porównanie efektów leczenia w grupach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Modeluje patofizjologię ludzkiej hemisekcji, wspierając dopasowanie biomarkerów oraz ciągłość przejścia z etapu przedklinicznego do klinicznego w strategiach regeneracji sensoryczno-motorycznej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Chirurgiczna i behawioralna struktura badawcza jest adaptowalna do innych modeli niepełnego SCI oraz różnych poziomów kręgosłupa, co sprzyja ponownemu wykorzystaniu platformy w portfelach odkryć.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez izolowanie jednostronnych deficytów neurologicznych i śledzenie wzorców czasowych powrotu do sprawności.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki ustandaryzowanym punktom orientacyjnym podczas operacji (np. identyfikacja kręgu T9 poprzez liczenie żeber) i ślepym ocenom behawioralnym.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesne podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) na podstawie asymetrycznych profili powrotu funkcji motorycznych, co zmniejsza ryzyko biologiczne na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Ułatwia priorytetyzację kandydatów z uwzględnieniem ryzyka, wykazujących zależną od dawki poprawę wyników CBS-HX, w szczególności po stronie uszkodzenia.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu mikrochirurgii gryzoni, anatomii rdzenia kręgowego oraz technik sterylnych, aby zapewnić całkowitość uszkodzenia i dobrostan zwierząt.
- Metoda zależy od instrumentarium mikrochirurgicznego (np. mikroskopu chirurgicznego, kleszczyków kostnych, igły 30-gauge) oraz infrastruktury opieki pooperacyjnej (np. mat grzewczych, protokołów opróżniania pęcherza moczowego).
- Konieczna jest standaryzacja międzyzespołowa pomiędzy grupami zajmującymi się chirurgią, behawiorem i histologią w celu zachowania spójności w weryfikacji i ocenie uszkodzeń.
- Adaptacja do innych modeli (np. hemisekcji szyjnej lub lędźwiowej) wymaga dostosowania punktów orientacyjnych kręgów oraz czułości testów behawioralnych do regionalnych funkcji motorycznych.
- Ograniczenia praktyczne obejmują zmienność techniczną w zakresie całkowitości uszkodzenia, co można zniwelować poprzez walidację histologiczną (np. barwienie aminofluorescencyjne) oraz kryteria wykluczenia behawioralnego.
