Name: Mikrorozcieńczenie bulionu Badania przesiewowe in vitro: łatwa i szybka metoda wykrywania nowych związków przeciwgrzybiczych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Poznaj metodę mikrorozcieńczenia bulionu do przesiewowego badania aktywności przeciwgrzybiczej nowych związków. Ta technika umożliwia szybką ocenę leków przeciwgrzybiczych z użyciem małych objętości próbek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy CAPES-Brazil, CNPq-Brazil, FAP/DF za wsparcie finansowe. Jesteśmy wdzięczni dr Hugo Costacie Paesowi za korektę manuskryptu.

1. Rozwiązania i media
<ol>
	<li>Przygotuj 2X pożywkę Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), bulion dekstrozy Sabouraud i agar dekstrozy Sabouraud zgodnie z tabelą 1.</li>
</ol>
2. Warunki wzrostu inokulum grzybów
<ol>
	<li>Przechowuj wszystkie szczepy grzybów jako zamrożone zapasy w 35% glicerolu w temperaturze -80 °C, aż będą potrzebne.</li>
	<li>Przed każdym eksperymentem wykonaj następujące czynności.
	<ol>
		<li>Dla szczepów Candida albicans:
		<ol>
			<li>Rozmrozić fiolkę podstawową i przenieść 200 μl do 10 ml bulionu z dekstrozy Sabouraud w sterylnej probówce polipropylenowej o pojemności 50 ml z nakrętką i hodować przez noc w temperaturze 30 °C z mieszaniem (200 obr./min). Pamiętaj, aby pochylić rurkę i pozostawić nakrętkę lekko uchyloną, aby lepiej napowietrzyć kulturę.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dla szczepów Cryptococcus neoformans:
		<ol>
			<li>Zeskrobać zamrożoną powierzchnię fiolki z zapasem. Umieścić komórki na płytkach z agarem z dekstrozą Sabouraud i inkubować przez 48 godzin w temperaturze 30 °C. Po widocznym wzroście wyizolowanych kolonii należy przechowywać płytki w lodówce (4 °C) szczelnie zamkniętej folią parafinową do 15 dni.</li>
			<li>Zebrać średniej wielkości izolowaną kolonię z płytki za pomocą sterylnej wykałaczki lub sterylnej pętli do zaszczepiania i zaszczepić 10 ml bulionu dekstrozowego Sabouraud w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Inkubować przez około 24 godziny w temperaturze 30 °C przy mieszaniu (200 obr./min).</li>
			<li>Nie należy przekraczać 24 godzin inkubacji. Pamiętaj, aby pochylić rurkę i pozostawić nakrętkę lekko uchyloną, aby uzyskać lepszą wentylację. Zawsze dobrze jest ustandaryzować etap wzrostu komórek przed każdym badaniem, ponieważ jest to ważny czynnik wpływający na oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe. 
			UWAGA: Oba grzyby były hodowane w temperaturze 30 °C w celu szybkiego rozmnażania się w naszych eksperymentach, ale temperatura może być zmieniona, aby odzwierciedlić cele badania, na przykład leczenie kliniczne (37 °C). Co najważniejsze, ten początkowy czas inkubacji powinien być ustalony z wyprzedzeniem dla każdego izolatu grzyba i utrzymywany przez wszystkie testy, aby zapewnić odtwarzalność.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po wzroście grzybów zebrać komórki, odwirowując stożkowe probówki o stężeniu 1 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić sklarowany osad i dodać 10 ml PBS.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki i ponownie odwirować przy 1 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Powtórzyć mycie PBS i odwirowanie jeszcze dwa razy. Po trzecim praniu ponownie zawieś komórki w 5 ml (w zależności od wielkości granulki) pożywki 2X RPMI-1640.</li>
	<li>Przygotować 1 ml rozcieńczenia 1:100 lub 1:1 000 w probówce mikrowirówkowej (w zależności od zmętnienia zawiesiny komórek).</li>
	<li>Pobrać 10 μl tego rozcieńczenia, umieścić je w komorze hemocytometru i policzyć całkowitą liczbę komórek w czterech rogowych kwadrantach pod mikroskopem. Obliczyć stężenie według wzoru: (całkowita liczba komórek/4) x współczynnik rozcieńczenia x 10,4 (stała rozcieńczenia komory).
	<ol>
		<li>Rozważ 100% żywotności, jeśli liczba żywotności i warunki wzrostu były systematycznie skorelowane dla badanego izolatu. 
		UWAGA: Standaryzacja i kontrola jakości liczby żywotności może być przeprowadzona poprzez powlekanie wsteczne zgodnie z metodą Europejskiego Komitetu ds. Badania Wrażliwości Na Środki Przeciwdrobnoustrojowe (EUCAST) Minimalne Stężenie Hamujące (MIC) dla drożdży10.</li>
		<li>Jeśli korelacja wzrostu/żywotności nie została ustalona dla badanego izolatu, zmierz żywotność grzyba, licząc żywe komórki w hemocytometrze za pomocą barwników, które selektywnie barwią martwe komórki, takich jak floksyna B11, trypan blue12, lub Janus Green13. Używaj komórek grzybów do tego protokołu tylko wtedy, gdy żywotność populacji w tym momencie wynosi 90% lub więcej. 
		UWAGA: Martwe/żywe barwniki mogą nie działać dobrze z wybranym grzybem. Przetestuj je przed użyciem. Na przykład niebieski barwnik trypanowy nie działa dobrze z C. neoformans.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Następnie przygotuj zawiesiny komórek w pożywce 2X RPMI-1640 (2X dostosowaną inokulum w pożywce RPMI-1640). W przypadku płytek 96-dołkowych należy rozważyć objętość 5 ml na każdą płytkę.
	<ol>
		<li>Dla wszystkich szczepów C. albicans należy przygotować zawiesinę komórek podstawowych 4 x 103 komórek/ml. Stężenie to wynosi 2 razy więcej niż końcowe stężenie komórek w każdym dołku (2 x 103 komórki / ml).</li>
		<li>W przypadku szczepów C. neoformans należy przygotować podstawową hodowlę komórek 2 x 104 komórek/ml. Stężenie to jest dwukrotnie większe niż końcowe stężenie komórek w każdym dołku (1 x 104 komórek/ml).</li>
		<li>W przypadku innych grzybów należy przeprowadzić test ze znanym lekiem przeciwgrzybiczym, którego stężenie będzie idealne dla danego badania w odniesieniu do czasu inkubacji. Weź pod uwagę metabolizm i czas duplikacji grzyba.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Peptydy (nieznany czynnik)
<ol>
	<li>Przechowuj liofilizowane peptydy w temperaturze -20 °C i rozpuszczaj je w wodzie dejonizowanej przed każdym eksperymentem. Maksymalny czas przechowywania po rozpuszczeniu w wodzie będzie zależał od charakteru każdego peptydu.</li>
	<li>Przygotować podwielokrotności dwukrotnie wyższe od najwyższego stężenia końcowego badanego w teście (2X). Najlepiej przygotować niewielką liczbę porcji z wystarczającą ilością peptydu do jednorazowego użycia, aby uniknąć cykli zamrażania i rozmrażania. 
	UWAGA: Wybór stężenia powinien opierać się na literaturze i właściwościach peptydu. Zaleca się rozpoczęcie seryjnych rozcieńczeń od około 100 μM peptydu, a następnie zmniejszanie lub zwiększanie tego zakresu stężeń w zależności od uzyskanych wyników.</li>
</ol>
4. Referencyjne leki przeciwgrzybicze (kontrole pozytywne)
<ol>
	<li>Dla osób rozcieńczonych w wodzie: przygotować 2X roztwór o najwyższym stężeniu w analizie (patrz sekcja 5: Test przeciwgrzybiczy dla etapów rozcieńczania).
	<ol>
		<li>W przypadku szczepów C. albicans należy przygotować roztwór 128 μg/ml flukonazolu lub 128 μg/ml kaspofunginy. Stężenie w płytce dla obu wyniesie 64 μg/ml.</li>
		<li>W przypadku szczepów C. neoformans należy przygotować roztwór 32 μg/ml amfoterycyny B (roztwór rozpuszczalny w wodzie). Stężenie w płytce wyniesie 16 μg/ml. 
		UWAGA: Zwykle amfoterycyna B jest rozcieńczana w dimetylosulfotlenku (DMSO), ponieważ ten środek przeciwgrzybiczy jest słabo rozpuszczalny w wodzie. Jednak na rynku dostępne są rozpuszczalne w wodzie preparaty amfoterycyny B.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku leków przeciwgrzybiczych rozcieńczonych w rozpuszczalniku organicznym: przygotuj 100-krotny roztwór podstawowy w DMSO, a następnie rozcieńcz go do 10-krotnego roztworu w wodzie do użycia. 
	UWAGA: Tak więc w studni końcowe stężenie DMSO nie przekroczy 1%. Studnia, w której grzyb będzie rósł w pożywce zawierającej 1% DMSO, ponieważ wymagana jest kontrola, biorąc pod uwagę, że niektóre grzyby nie tolerują dobrze tego stężenia rozpuszczalnika. Pamiętaj, że DMSO jest światłoczułe, dlatego przykryj płytkę folią lub umieść ją w ciemnej komorze na czas trwania inkubacji.</li>
</ol>
5. Test przeciwgrzybiczy
UWAGA: Testy przeciwgrzybicze in vitro są przeprowadzane na podstawie testu wrażliwości na mikrorozcieńczenie bulionu według wytycznych Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 z pewnymi modyfikacjami.
<ol>
	<li>Przygotować dwukrotne seryjne rozcieńczenie każdego peptydu i kontrolować działanie przeciwgrzybicze w 96-dołkowych mikropłytkach polistyrenowych do końcowej objętości 50 μl.
	<ol>
		<li>Za pomocą pipety dodać 100 μl środka przeciwgrzybiczego/peptydu o stężeniu 2X najwyższego pożądanego stężenia końcowego w kolumnach 1-3, w wierszu A.</li>
		<li>Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 50 μl sterylnej wody do pozostałych studzienek, w rzędach od B do H.</li>
		<li>Usunąć 50 μl studzienek o najwyższym stężeniu (rząd A), przenieść do następnego dołka o następnym stężeniu (rząd B) i homogenizować.</li>
		<li>Powtarzaj powyższe kroki, aż studzienka będzie miała najniższe stężenie i wyrzuć 50 μl tej studzienki (rząd H). Pozostawić kolumny 11 i 12 (rzędy A, B, C) tylko z wodą do ślepej próby lub kontroli ujemnej/wzrostu.</li>
		<li>Dodać 50 μl 2X dostosowanego inokulum w pożywce RPMI-1640 do każdej studzienki (kolumny 1-3 plus kolumna 11 (ujemna/kontrola wzrostu)); końcowe stężenie dla C. albicans wyniesie 2 x 103 komórki/ml, a końcowe stężenie dla szczepów C. neoformans wyniesie 10-4 komórki/ml.</li>
		<li>Przygotować ślepą próbę kontrolną (50 μl wody + 50 μl 2X pożywki RPMI-1640 bez komórek) i kontrolę ujemną/wzrostu (50 μl wody + 50 μl dostosowanego inokulum 2X pożywki RPMI-1640 bez środka przeciwgrzybiczego) i załadować do płytki studzienki, jak opisano powyżej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórzyć procedurę dla każdego badanego związku i wybranego środka przeciwgrzybiczego (kolumny 4-10). 
	UWAGA: Seryjne rozcieńczenia można wykonać pionowo, jak w eksperymencie poniżej, lub poziomo na płytce (tj. jeśli liczba rozcieńczeń danego związku/ekstraktu, który należy przebadać, wynosi osiem lub więcej).
	<ol>
		<li>Jeśli związki, leki referencyjne lub którykolwiek z ich składników są światłoczułe, należy przeprowadzić test w ograniczonym świetle, przykryć płytki folią lub umieścić w ciemnej komorze podczas inkubacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozważ następujące opcjonalne zalecenia.
	<ol>
		<li>Uszczelnij płytę przezroczystą pokrywą, która umożliwia wymianę gazu, ponieważ pomaga to zmniejszyć parowanie.</li>
		<li>Umieść płytkę w wilgotnej komorze, co również pomoże zmniejszyć parowanie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 24 godziny lub 48 godzin w przypadku wszystkich szczepów C. albicans i przez 48 godzin z otrząsaniem 200 obr./min w przypadku C. neoformans. Dolna objętość końcowa (100 μl) zapewnia, że nie dochodzi do rozlania. 
	UWAGA: Nie zaobserwowano istotnej różnicy między odczytami MIC po 24 i 48 godzinach dla szczepów C. albicans. Niemniej jednak odczyty po 48 godzinach są łatwiejsze do wizualizacji.</li>
	<li>Obserwuj wszystkie studzienki, za pomocą odwróconego mikroskopu optycznego, przed okresem inkubacji i po nim, aby sprawdzić zmiany w morfologii, a także sprawdzić, czy nie ma oznak zanieczyszczenia. 
	UWAGA: Odczyty można wykonać wizualnie i sfotografować pod koniec eksperymentu. Przed każdym odczytem należy lekko zhomogenizować płytkę. Odczyty można również wykonać, mierząc jego OD przy 600 nm, jeśli nie obserwuje się zagęszczenia komórek lub filamentacji.</li>
	<li>Eksperymenty należy przeprowadzić co najmniej trzy razy w różnych terminach.</li>
</ol>

<ol><li>Armstrong-James, D., Meintjes, G., Brown, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neglected+epidemic%3A+fungal+infections+in+HIV%2FAIDS%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A neglected epidemic: fungal infections in HIV/AIDS.</a> Trends Microbiol. 22 (3), 120-127 (2014).</li>
<li>Romani, L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21394104">Immunity to fungal infections.</a> Nat Rev Immunol. 11 (4), 275-288 (2011).</li>
<li>Pfaller, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+drug+resistance%3A+mechanisms%2C+epidemiology%2C+and+consequences+for+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med%22%5BJournal%5D)">Antifungal drug resistance: mechanisms, epidemiology, and consequences for treatment.</a> Am J Med. 125 (1 Suppl), S3-S13 (2012).</li>
<li>Hancock, R. E., Diamond, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+cationic+antimicrobial+peptides+in+innate+host+defences%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The role of cationic antimicrobial peptides in innate host defences.</a> Trends Microbiol. 8 (9), 402-410 (2000).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snake+cathelicidin+from+Bungarus+fasciatus+is+a+potent+peptide+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Snake cathelicidin from Bungarus fasciatus is a potent peptide antibiotics.</a> PLoS One. 3 (9), e3217(2008).</li>
<li>Du, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AaeAP1+and+AaeAP2%3A+novel+antimicrobial+peptides+from+the+venom+of+the+scorpion%2C+Androctonus+aeneas%3A+structural+characterisation%2C+molecular+cloning+of+biosynthetic+precursor-encoding+cDNAs+and+engineering+of+analogues+with+enhanced+antimicrobial+and+anticancer+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">AaeAP1 and AaeAP2: novel antimicrobial peptides from the venom of the scorpion, Androctonus aeneas: structural characterisation, molecular cloning of biosynthetic precursor-encoding cDNAs and engineering of analogues with enhanced antimicrobial and anticancer activities.</a> Toxins (Basel). 7 (2), 219-237 (2015).</li>
<li>Benincasa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungicidal+activity+of+five+cathelicidin+peptides+against+clinically+isolated+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Fungicidal activity of five cathelicidin peptides against clinically isolated yeasts.</a> J Antimicrob Chemother. 58 (5), 950-959 (2006).</li>
<li>CLSI. <a target="_blank" href="https://clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m27s/">Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibiliy Testing of Yeasts; Approved Standard -Third Edition. CLSI document M27-A3</a>. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2008).</li>
<li>Guilhelmelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+Scorpion+Venom-Derived+Antifungal+Peptides+against+Planktonic+Cells+of+Candida+spp.+and+Cryptococcus+neoformans+and+Candida+albicans+Biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Activity of Scorpion Venom-Derived Antifungal Peptides against Planktonic Cells of Candida spp. and Cryptococcus neoformans and Candida albicans Biofilms.</a> Front Microbiol. 7, 1844(2016).</li>
<li>The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for yeasts, version, 7.3.1 2017. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/AFST/Files/EUCAST_E_Def_7_3_1_Yeast_testing__definitive.pdf">http://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/AFST/Files/EUCAST_E_Def_7_3_1_Yeast_testing__definitive.pdf</a> (2017).</li>
<li>Roongruangsree, U. T., Kjerulf-Jensen, C., Olson, L. W., Lange, L. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1439-0434.1988.tb04474.x/full">Viability Tests for Thick Walled Fungal Spores (ex: Oospores of Peronospora manshurica).</a> Journal of Phytopathology. 123 (3), 244-252 (1988).</li>
<li>Boedijn, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+as+stain+for+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technol%22%5BJournal%5D)">Trypan blue as stain for fungi.</a> Stain Technol. 31 (3), 115-116 (1956).</li>
<li>Goihman-Yahr, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+plating+efficiency+and+estimation+of+viability+of+suspensions+of+Paracoccidioides+brasiliensis+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mycopathologia%22%5BJournal%5D)">Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells.</a> Mycopathologia. 71 (2), 73-83 (1980).</li>
<li>Tati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histatin+5-spermidine+conjugates+have+enhanced+fungicidal+activity+and+efficacy+as+a+topical+therapeutic+for+oral+candidiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Histatin 5-spermidine conjugates have enhanced fungicidal activity and efficacy as a topical therapeutic for oral candidiasis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 58 (2), 756-766 (2014).</li>
<li>Petrou, M. A., Shanson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibility+of+Cryptococcus+neoformans+by+the+NCCLS+microdilution+and+Etest+methods+using+five+defined+media%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Susceptibility of Cryptococcus neoformans by the NCCLS microdilution and Etest methods using five defined media.</a> J Antimicrob Chemother. 46 (5), 815-818 (2000).</li>
<li>Zaragoza, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process+analysis+of+variables+for+standardization+of+antifungal+susceptibility+testing+of+nonfermentative+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Process analysis of variables for standardization of antifungal susceptibility testing of nonfermentative yeasts.</a> Antimicrob Agents Chemother. 55 (4), 1563-1570 (2011).</li>
<li>Rodriguez-Tudela, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+shaking+on+antifungal+susceptibility+testing+of+Cryptococcus+neoformans%3A+a+comparison+of+the+NCCLS+standard+M27A+medium%2C+buffered+yeast+nitrogen+base%2C+and+RPMI-2%25+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Influence of shaking on antifungal susceptibility testing of Cryptococcus neoformans: a comparison of the NCCLS standard M27A medium, buffered yeast nitrogen base, and RPMI-2% glucose.</a> Antimicrob Agents Chemother. 44 (2), 400-404 (2000).</li>
<li>Beggs, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+phase+in+relation+to+ketoconazole+and+miconazole+susceptibilities+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Growth phase in relation to ketoconazole and miconazole susceptibilities of Candida albicans.</a> Antimicrob Agents Chemother. 25 (3), 316-318 (1984).</li>
<li>Alcouloumre, M. S., Ghannoum, M. A., Ibrahim, A. S., Selsted, M. E., Edwards, J. E. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungicidal+properties+of+defensin+NP-1+and+activity+against+Cryptococcus+neoformans+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Fungicidal properties of defensin NP-1 and activity against Cryptococcus neoformans in vitro.</a> Antimicrob Agents Chemother. 37 (12), 2628-2632 (1993).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Testy mikrorozcieńczeń mogą analizować potencjalną aktywność przeciwgrzybiczą związku docelowego przy użyciu niewielkich ilości związku, a jednocześnie testować go w zakresie stężeń. W związku z tym protokół ten jest zalecany jako pierwszy krok w badaniach przesiewowych pod kątem potencjalnych nowych związków przeciwgrzybiczych. Przedstawiony tutaj protokół opiera się na protokole M27-A3, początkowo zaprojektowanym w celu pomocy w wyborze terapii przeciwgrzybiczej w klinikach i może być dostosowany do wielu nowych związk...

Infekcje grzybicze stały się ważnym problemem medycznym w ostatnich dziesięcioleciach, znacznie wzrosły, głównie z powodu wzrostu liczby osób z obniżoną odpornością, takich jak osoby poddawane leczeniu raka oraz osoby żyjące z HIV/AIDS lub przeszczepionymi organami1,2. Jednak bardzo ograniczony wachlarz dostępnych leków przeciwgrzybiczych i rosnąca liczba doniesień o oporności grzybów na nie przyczyniają się do poważnych problemów związanych z terapią grzybic układowych3.
Potencjalnym źródłem nowych związków przeciwgrzybiczych są peptydy przeciwbakteryjne (AMP), małe peptydy kationowe wytwarzane przez wiele organizmów jako część ich wrodzonej odpowiedzi immunologicznej na infekcję4. Niemniej jednak metoda przesiewowa mająca na celu przetestowanie tych związków pod kątem patogenów grzybowych nie jest ustandaryzowana. Do oceny aktywności przeciwgrzybiczej AMP zastosowano różne procedury, czasami dla tego samego mikroorganizmu modelowego5,6,7. Różnice te oraz brak szczegółów w niektórych protokołach komplikują porównania między związkami i utrudniają odtwarzalność.
Jednym ze sposobów standaryzacji testowania nowych kandydatów na leki jest przestrzeganie wytycznych używanych do definiowania podatności na leki przeciwgrzybicze w warunkach klinicznych, takich jak wytyczne Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3. Jednak te testy wrażliwości na leki przeciwgrzybicze są zbyt restrykcyjne i nie uwzględniają różnic w metabolizmie u różnych gatunków, ponieważ zostały ustalone tylko dla kilku wybranych środków. Na przykład nie uwzględniają potrzeb metabolicznych drożdży niefermentujących.
Ten protokół pozwala na ocenę aktywności potencjalnych związków przeciwgrzybiczych i jest tutaj stosowany do poszukiwania peptydów przeciwgrzybiczych. Opiera się na teście wrażliwości na mikrorozcieńczenie bulionu z wytycznych CLSI M27-A3 z modyfikacjami optymalizującymi badania przesiewowe nowych związków8,9. Zmiany te pozwalają na użycie niewielkich ilości związku, zmian temperatury lub początkowego inokulum oraz różnych pożywek w celu optymalnego wzrostu przed testem, przy jednoczesnej standaryzacji wyników z użyciem referencyjnych leków przeciwgrzybiczych jako kontroli. Metoda ta, przy użyciu wielodołkowych płytek hodowlanych, umożliwia szybkie i niezawodne przesiewanie dużej liczby związków.
Ze względu na swoją nieodłączną elastyczność, ten protokół może być używany z różnymi klasami chemicznymi związków i przeciwko innym mikroorganizmom, z niewielkimi adaptacjami.

<table><tbody><tr><td>Pożywki i odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 pożywka z l-glutaminą, bez wodorowęglanu sodu</td><td>Thermo Fisher</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 3-(N-morfolino)propanosulfonowy (MOPS) (o que a gente usa tem um s&oacute; dio, completa o nome dele please)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Użyj do buforowania 2X RPMI medium</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Din&acirc; mika</td><td>1528-1</td><td>137 mM do soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)</td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>J.T.Baker</td><td>3040-01</td><td>2,7 mM do soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)</td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V000129</td><td>10 mM do soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)</td></tr><tr><td>Diwodorofosforan potasu (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60230</td><td>2 mM do soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)</td></tr><tr><td>BD Difco Sabouraud bulion dekstrozowy</td><td>BD</td><td>238230</td><td></td></tr><tr><td>BD Difco Sabouraud Agar dekstrozowy</td><td>BD</td><td>210950</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V000123</td><td>35% dla (solu&ccedil; &atilde; o de estoque? Criopreserva&ccedil; &atilde; o?)</td></tr><tr><td>Sterylna woda</td><td></td><td></td><td>Para dilui&ccedil; &atilde; o das drogas na dilui&ccedil; &atilde; o seriada</td></tr><tr><td>Leki przeciwgrzybicze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Flukonazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8929</td><td></td></tr><tr><td>Caspofungin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1160</td><td></td></tr><tr><td>Plastics</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL probówka</td> <td>stożkowaSarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie Petri</td><td>J.Prolab</td><td>0304-5</td><td></td></tr><tr><td>96 dołkowa płytka</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik na sterylny roztwór</td><td>KASVI</td><td>K30-208</td><td>Służy do pipetowania roztworów za pomocą wielokanałowego pipetu</td></tr><tr><td><mocny>Sprzęt i inne materiały</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop optyczny</td><td>Nikon</td><td>E200MV</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Thermo Fisher</td><td>MegaFuge 16R</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Ethik Technology</td><td>403-3D Zestaw</td><td>na 37&deg; </td></tr><tr><td>C Shaker</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Excella E25</td><td>Ustawiony na 37&deg; C, 200 RPM</td></tr><tr><td>Komora zliczania komórek, Neubauer</td><td>BOECO Niemcy</td><td>BOE 13</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta wielokanałowa</td><td>HTL</td><td>5123</td><td></td></tr></tbody></table>

mikrorozcieńczenie bulionu badania przesiewowe in vitro: łatwa i szybka metoda wykrywania nowych związków przeciwgrzybiczych

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

Infekcje grzybicze stały się ważnym stanem chorobowym w ostatnich dziesięcioleciach, ale liczba dostępnych leków przeciwgrzybiczych jest ograniczona. W tym scenariuszu konieczne jest poszukiwanie nowych leków przeciwgrzybiczych. Przedstawiony tutaj protokół szczegółowo opisuje metodę badania peptydów pod kątem ich właściwości przeciwgrzybiczych. Opiera się na teście wrażliwości na mikrorozcieńczenie bulionu z wytycznych Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 z modyfikacjami dostosowanymi do badań peptydów przeciwdrobnoustrojowych jako potencjalnych nowych środków przeciwgrzybiczych. Protokół ten opisuje funkcjonalny test do oceny aktywności związków przeciwgrzybiczych i może być łatwo zmodyfikowany w celu dopasowania do dowolnej klasy badanych cząsteczek. Ponieważ testy są wykonywane na 96-dołkowych płytkach przy użyciu małych objętości, badanie przesiewowe na dużą skalę można przeprowadzić w krótkim czasie, zwłaszcza jeśli przeprowadza się je w warunkach automatyzacji. Procedura ta ilustruje, w jaki sposób ustandaryzowany i regulowany protokół kliniczny może pomóc w poszukiwaniu nowych cząsteczek w celu poprawy terapii chorób grzybiczych.

MIC definiuje się jako najniższe stężenie związku przeciwdrobniczego, które całkowicie hamuje widoczny wzrost grzybów po zakończeniu okresu inkubacji. Ponieważ celem niniejszego protokołu jest opracowanie szybkiej metody przesiewowej dla potencjalnych środków przeciwgrzybiczych, każda studnia z klarowną pożywką, podobną do studni kontrolnych (blank), jest uznawana za wynik dodatni, natomiast każda studnia z zmętnieniem analogicznym do studni kontrolnych negatywnych/wzrostowych jest uznawa...

Łatwa i elastyczna metoda mikrorozcieńczania bulionu do badania związków przeciwgrzybiczych i ekstraktów.

Mikrorozcieńczenie bulionu Badania przesiewowe in vitro: łatwa i szybka metoda wykrywania nowych związków przeciwgrzybiczych

Fungal infections have become an important medical condition in the last decades, but the number of available antifungal drugs is limited. In this ...

Ogólnym celem tej metody jest ocena aktywności potencjalnych związków przeciwgrzybiczych przy użyciu modyfikacji testu wrażliwości na mikrorozcieńczenie bulionu, stosowanego w laboratoriach klinicznych. Metoda ta służy do oceny aktywności grzybiczej związków naturalnych lub syntetycznych, co jest jednym z pierwszych testów w opracowywaniu terapii przeciwgrzybiczych. Udostępniamy instrukcje dotyczące wstępnego badania przesiewowego pod kątem nowych leków przeciwgrzybiczych przy użyciu małych objętości w krótkim czasie, zwłaszcza jeśli eksperymenty są przeprowadzane z automatyzacją.Procedurę zademonstruje Daniel Zamith-Miranda, adiunkt w moim laboratorium. Rozpocznij tę procedurę od wyhodowania szczepów grzybów do testu, jak opisano w protokole tekstowym. Następnego dnia zebrać komórki, odwirowując stożkowe probówki o sile 1200 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Odrzuć supernatant, dodaj dziesięć mililitrów PBS do każdej probówki i ponownie zawieś komórki. Ponownie odwirować w temperaturze 1200 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Powtórz mycie PBS i odwirowanie jeszcze dwa razy.Po trzecim praniu ponownie zawieś ogniwa w pięciu mililitrach pożywki RPMI 1640 o podwójnej mocy. W zależności od zmętnienia zawiesiny komórkowej należy przygotować jeden mililitr rozcieńczenia od jednego do 100 lub od jednego do 1000 każdego szczepu w probówce do mikrowirówki. Pobrać dziesięć mikrolitrów tego rozcieńczenia, umieścić je w komorze hemocytometru i policzyć całkowitą liczbę komórek w czterech rogowych kwadrantach pod mikroskopem.Po obliczeniu gęstości zawiesiny każdej komórki, należy przygotować zawiesiny komórek w pożywce RPMI 1640 o podwójnej mocy. Przygotuj 4 000 komórek na mililitr dla szczepów C. albicans i 20 000 komórek na mililitr dla szczepów C. neoformans. Lipholizowane peptydy są przechowywane w alikatach do jednorazowego użycia w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza i rozpuszczane w wodzie dejonizowanej tylko przed każdym eksperymentem.Stężenie peptydu powinno być dwukrotnie wyższe od najwyższego stężenia końcowego badanego w teście. Przygotowywane są również referencyjne leki przeciwgrzybicze. Test przeciwgrzybiczy przeprowadza się w trzech i 96 dołkach polistyrenowych mikropłytkach.Stosując dwukrotne seryjne rozcieńczenie każdego peptydu i kontrolnego środka przeciwgrzybiczego oraz końcową objętość 50 mikrolitrów na studzienkę. Najważniejszym krokiem w protokole jest seryjne rozcieńczanie, więc bądź bardzo ostrożny podczas kilku następnych kroków, aby uniknąć błędu, który zagrozi całej analizie. Za pomocą pipety dodaj 100 mikrolitrów peptydu przeciwgrzybiczego w stężeniu o podwójnej mocy najwyższego pożądanego stężenia końcowego w kolumnach od pierwszej do trzeciej w rzędzie A. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 50 mikrolitrów sterylnej wody do pozostałych studzienek w rzędach od B do H. Usuń 50 mikrolitrów studzienek o najwyższym stężeniu.Przenieść do odpowiednich dołków następnego stężenia i homogenizować, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół. Powtarzać seryjne rozcieńczanie, aż do osiągnięcia studzienek o najniższym stężeniu i wyrzucić 50 mikrolitrów z tych studzienek. Pozostawić kolumny 11 i 12 w wierszach A, B i C tylko z wodą dla ślepych prób kontrolnych lub ujemnych kontroli wzrostu.Dodać 50 mikrolitrów inokulum o podwójnej mocy w pożywce RPMI 1640 do każdej studzienki kolumny od pierwszej do trzeciej oraz kolumny 11. Końcowe stężenie C.albicans wyniesie 2 000 komórek na mililitr. Końcowe stężenie C.neoformans wyniesie 10 000 komórek na mililitr.Przygotuj ujemne kontrole wzrostu, mieszając 50 mikrolitrów wody i 50 mikrolitrów dostosowanego inokulum bez środka przeciwgrzybiczego. Przygotować ślepe próby kontrolne, łącząc 50 mikrolitrów wody i 50 mikrolitrów pożywki bez komórek. Załaduj elementy sterujące do odpowiednich studzienek.Obserwuj wszystkie studzienki za pomocą odwróconego mikroskopu optycznego, a następnie inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni z wytrząsaniem przy 200 obr./min. Po okresie inkubacji należy ponownie obserwować wszystkie studzienki, aby zweryfikować zmiany w morfologii, a także sprawdzić, czy nie ma oznak zanieczyszczenia. Uzyskaj obraz każdej płyty za pomocą aparatu cyfrowego.W tym reprezentatywnym teście trzy peptydy przeciwdrobnoustrojowe lub AMP o stężeniach od 100 mikromolowych do punktu siódmego ósmego mikromolowego oceniono pod kątem aktywności przeciwgrzybiczej przeciwko C. neoformans. W zestawie znajdowała się kontrola wzrostu i ślepa próba. Każda studzienka z klarownym podłożem podobnym do studzienek ślepych jest uważana za wynik pozytywny, podczas gdy każda studzienka z zmętnieniem analogicznym do studzienek z ujemną kontrolą wzrostu jest uważana za ujemną.Ponieważ minimalne stężenie hamujące (MIC) definiuje się jako najniższe stężenie związku przeciwdrobnoustrojowego, które całkowicie hamuje widoczny wzrost grzybów pod koniec okresu inkubacji, 25 mikromolów jest uważane za MIC dla AMP1. I, 12 przecinek pięć mikromolowych, MIC dla AMP2. AMP3 będzie musiał zostać poddany ponownej ocenie, ponieważ grzyb rósł we wszystkich testowanych stężeniach.W ten sam sposób trzy odrębne peptydy testowane przeciwko C. albicans, oznaczone jako 50 mikromolowe, są MIC dla AMP1. Sześć mikromolów to MIC dla AMP2, a 25 mikromolów to MIC dla AMP3. Przykład słabego wyniku, prawdopodobnie wynikającego z nieprawidłowego pipetowania na etapie rozcieńczania, ilustrują kolumny od piątej do siódmej rzędu C na tej tabliczce, gdzie występują różnice we wzroście C. neoformans między kontrpróbami.Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około dwie godziny, plus czas wzrostu grzybów, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Pamiętaj, aby zdawać sobie sprawę z cech fizykochemicznych tych badanych cząsteczek. Następnie należy użyć odpowiednich rozpuszczalników jako kontroli na wypadek, gdyby były potrzebne, i zawsze używać komórek w tej samej fazie wzrostu.Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak test zabijania w czasie, stosowanie barwników żywotności i testy ST60, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, czy związek ma działanie grzybobójcze czy fungistatyczne. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny mikrologii medycznej do zbadania kilku źródeł naturalnych lub syntetycznych związków w poszukiwaniu związków przeciwgrzybiczych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak rozpocząć hodowlę grzybów, przygotować komórki do testu, wykonać seryjne rozcieńczenia i przeczytać wyniki po inkubacji szczepów grzybów z naszymi testowanymi związkami.Nie zapominaj, że praca z patogenami grzybiczymi może być bardzo niebezpieczna. Podczas wykonywania tej procedury należy podjąć przygotowania, takie jak noszenie środków ochrony osobistej, praca w kapturze bezpieczeństwa biologicznego i stosowanie odpowiednich praktyk bezpieczeństwa.

broth-microdilution-vitro-screening-an-easy-fast-method-to-detect-new

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy prostą, szybką i niezawodną metodę tworzenia biofilmów Candida albicans z wykorzystaniem 96-dołkowych płytek mikrotytacyjnych oraz jej przydatność w badaniu wrażliwości komórek wewnątrz biofilmów na środki przeciwgrzybicze.

Metoda z wykorzystaniem 96-dołkowej płytki mikrotytrującej do monitorowania tworzenia się i badania wrażliwości przeciwgrzybiczej biofilmów Candida albicans

Opracowaliśmy platformę wysokiej gęstości do mikromacierzy, składającą się z 3D nano-biofilmów C. albicans, nazwaną CaBChip. Profil wrażliwości leków testowanych na CaBChip jest porównywalny z konwencjonalnym modelem płytki 96-dołkowej, co sugeruje, że chip grzybiczy jest idealnie dostosowany do prawdziwie wysokoprzepustowego przesiewu leków przeciwgrzybiczych.

Chip do hodowli biofilmu Candida albicans (CaBChip) do wysokoprzepustowego przesiewu leków przeciwgrzybiczych

Źródło: Koeth, L. M., et al., A Reference Bulion Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobical. J. Vis. Exp. (2015).Ten film przedstawia metodę mikrorozcieńczenia bulionu w celu określenia minimalnego stężenia hamującego (MIC) antybiotyku lipoglikopeptydowego przeciwko bakteriom Gram-dodatnim. Obejmuje izolację kolonii bakteryjnych, rozcieńczanie, inokulację studzienek mikropłytek o różnych stężeniach antybiotyków oraz weryfikację czystości...

Metoda mikrorozcieńczania bulionu do badania wrażliwości bakterii Gram-dodatnich na antybiotyki

Ten film demonstruje test in vitro do badania związków przeciwgrzybiczych za pomocą testu mikrorozcieńczenia bulionu. Badane związki rozcieńcza się seryjnie na płytce do mikromiareczkowania i inkubuje z inokulum grzybów. Po inkubacji płytkę bada się pod kątem studzienek, w których nie stwierdzono wzrostu grzybów, w celu oceny potencjału przeciwgrzybiczego badanych związków i ich minimalnego stężenia hamującego (MIC).

Test mikrorozcieńczenia bulionu in vitro do badań przesiewowych związków przeciwgrzybiczych

Tutaj opisujemy test fenotypowy mający zastosowanie do wysokoprzepustowych/wysokotreściowych ekranów małych interferujących bibliotek syntetycznego RNA (siRNA), związków chemicznych i Mycobacterium tuberculosis. Metoda ta polega na wykrywaniu znakowanych fluorescencyjnie Mycobacterium tuberculosis w znakowanej fluorescencyjnie komórce gospodarza za pomocą zautomatyzowanej mikroskopii konfokalnej.

Mikroskopowy test fenotypowy do oznaczania ilościowego prątków wewnątrzkomórkowych przystosowany do badań przesiewowych o wysokiej przepustowości/wysokiej zawartości

Tutaj przedstawiamy protokół określania wrażliwości na dalbawancynę klinicznie istotnych bakterii Gram-dodatnich przy użyciu referencyjnej metodologii mikrorozcieńczenia bulionu.

Referencyjna metoda mikrorozcieńczenia bulionu do badania wrażliwości in vitro dalbawancyny na bakterie rozwijające się tlenowo

Tutaj prezentujemy protokoły do szybkiego badania i charakteryzowania enzymów pod kątem aktywności przeciwdrobnoustrojowej. Test dyfuzji mikroszkiełkowej i test uwalniania barwnika wykorzystują docelowe substraty bakteryjne do jakościowej i ilościowej oceny aktywności enzymatycznej.

Testy jakościowe i ilościowe do wykrywania i charakterystyki białkowych środków przeciwdrobnoustrojowych

Opracowano test czasu rzeczywistego o wysokiej przepustowości, aby jednocześnie zidentyfikować (1) środki przeciwdrobnoustrojowe penetrujące komórki eukariotyczne skierowane na wewnątrzkomórkowy patogen bakteryjny i (2) ocenić cytotoksyczność komórek eukariotycznych. Wariant tej samej technologii został następnie połączony z technologią cyfrowego dozowania, aby umożliwić łatwe badania w wysokiej rozdzielczości, zależności od dawki oraz dwu- i trójwymiarowej synergii.

Wysokowydajne testy w czasie rzeczywistym z podwójnym odczytem wewnątrzkomórkowej aktywności przeciwdrobnoustrojowej i cytotoksyczności komórek eukariotycznych

Opracowaliśmy modułowy, wysokoprzepustowy system przesiewowy do odkrywania nowych związków przeciwko Mycobacterium tuberculosis, ukierunkowanych na bakterie rosnące wewnątrzkomórkowo i w bulionie, a także cytotoksyczność wobec komórki gospodarza ssaków.

System badań przesiewowych skuteczności i cytotoksyczności inhibitorów ukierunkowanych na wewnątrzkomórkowe prątki gruźlicy

Opisujemy zmodyfikowaną metodę opartą na agarze, zaprojektowaną do ilościowego określenia przeciwgrzybiczego działania produktów pochodzenia roślinnego. Za pomocą tego protokołu można ocenić zarówno lotny, jak i nielotny wkład w aktywność przeciwgrzybiczą. Ponadto skuteczność przeciwko grzybom można zmierzyć na kluczowych etapach rozwoju w jednym zestawie eksperymentalnym.

Pomiar lotnej i nielotnej aktywności przeciwgrzybiczej produktów kontroli biologicznej

Protokół oparty na 96-dołkowej płytce mikromiareczkowej przy użyciu testu redukcji 2,3-bis(2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenylo)-5-karboksyanilid-2H-tetrazolium (XTT) jest opisany tutaj, w celu zbadania wpływu przeciwciał na biofilmy utworzone przez C. tropicalis. Ten protokół in vitro może być wykorzystany do sprawdzenia wpływu potencjalnych nowych związków przeciwgrzybiczych na aktywność metaboliczną komórek gatunku Candida w biofilmach.

Rozpuszczalny test redukcyjny na bazie tetrazoliu do oceny wpływu przeciwciał na biofilmy Candida tropicalis

Poznaj metodę mikrorozcieńczenia bulionu do przesiewowego badania aktywności przeciwgrzybiczej nowych związków. Ta technika umożliwia szybką ocenę leków przeciwgrzybiczych z użyciem małych objętości próbek.

Mikrorozcieńczenie bulionu Badania przesiewowe in vitro: łatwa i szybka metoda wykrywania nowych związków przeciwgrzybiczych

Przeglądaj więcej filmów