Mikrorozcieńczenie bulionu Badania przesiewowe in vitro: łatwa i szybka metoda wykrywania nowych związków przeciwgrzybiczych

Ogólnym celem tej metody jest ocena aktywności potencjalnych związków przeciwgrzybiczych przy użyciu modyfikacji testu wrażliwości na mikrorozcieńczenie bulionu, stosowanego w laboratoriach klinicznych. Metoda ta służy do oceny aktywności grzybiczej związków naturalnych lub syntetycznych, co jest jednym z pierwszych testów w opracowywaniu terapii przeciwgrzybiczych. Udostępniamy instrukcje dotyczące wstępnego badania przesiewowego pod kątem nowych leków przeciwgrzybiczych przy użyciu małych objętości w krótkim czasie, zwłaszcza jeśli eksperymenty są przeprowadzane z automatyzacją.

Procedurę zademonstruje Daniel Zamith-Miranda, adiunkt w moim laboratorium. Rozpocznij tę procedurę od wyhodowania szczepów grzybów do testu, jak opisano w protokole tekstowym. Następnego dnia zebrać komórki, odwirowując stożkowe probówki o sile 1200 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Odrzuć supernatant, dodaj dziesięć mililitrów PBS do każdej probówki i ponownie zawieś komórki. Ponownie odwirować w temperaturze 1200 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Powtórz mycie PBS i odwirowanie jeszcze dwa razy.

Po trzecim praniu ponownie zawieś ogniwa w pięciu mililitrach pożywki RPMI 1640 o podwójnej mocy. W zależności od zmętnienia zawiesiny komórkowej należy przygotować jeden mililitr rozcieńczenia od jednego do 100 lub od jednego do 1000 każdego szczepu w probówce do mikrowirówki. Pobrać dziesięć mikrolitrów tego rozcieńczenia, umieścić je w komorze hemocytometru i policzyć całkowitą liczbę komórek w czterech rogowych kwadrantach pod mikroskopem.

Po obliczeniu gęstości zawiesiny każdej komórki, należy przygotować zawiesiny komórek w pożywce RPMI 1640 o podwójnej mocy. Przygotuj 4 000 komórek na mililitr dla szczepów C. albicans i 20 000 komórek na mililitr dla szczepów C. neoformans. Lipholizowane peptydy są przechowywane w alikatach do jednorazowego użycia w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza i rozpuszczane w wodzie dejonizowanej tylko przed każdym eksperymentem.

Stężenie peptydu powinno być dwukrotnie wyższe od najwyższego stężenia końcowego badanego w teście. Przygotowywane są również referencyjne leki przeciwgrzybicze. Test przeciwgrzybiczy przeprowadza się w trzech i 96 dołkach polistyrenowych mikropłytkach.

Stosując dwukrotne seryjne rozcieńczenie każdego peptydu i kontrolnego środka przeciwgrzybiczego oraz końcową objętość 50 mikrolitrów na studzienkę. Najważniejszym krokiem w protokole jest seryjne rozcieńczanie, więc bądź bardzo ostrożny podczas kilku następnych kroków, aby uniknąć błędu, który zagrozi całej analizie. Za pomocą pipety dodaj 100 mikrolitrów peptydu przeciwgrzybiczego w stężeniu o podwójnej mocy najwyższego pożądanego stężenia końcowego w kolumnach od pierwszej do trzeciej w rzędzie A. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 50 mikrolitrów sterylnej wody do pozostałych studzienek w rzędach od B do H. Usuń 50 mikrolitrów studzienek o najwyższym stężeniu.

Przenieść do odpowiednich dołków następnego stężenia i homogenizować, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół. Powtarzać seryjne rozcieńczanie, aż do osiągnięcia studzienek o najniższym stężeniu i wyrzucić 50 mikrolitrów z tych studzienek. Pozostawić kolumny 11 i 12 w wierszach A, B i C tylko z wodą dla ślepych prób kontrolnych lub ujemnych kontroli wzrostu.

Dodać 50 mikrolitrów inokulum o podwójnej mocy w pożywce RPMI 1640 do każdej studzienki kolumny od pierwszej do trzeciej oraz kolumny 11. Końcowe stężenie C.albicans wyniesie 2 000 komórek na mililitr. Końcowe stężenie C.neoformans wyniesie 10 000 komórek na mililitr.

Przygotuj ujemne kontrole wzrostu, mieszając 50 mikrolitrów wody i 50 mikrolitrów dostosowanego inokulum bez środka przeciwgrzybiczego. Przygotować ślepe próby kontrolne, łącząc 50 mikrolitrów wody i 50 mikrolitrów pożywki bez komórek. Załaduj elementy sterujące do odpowiednich studzienek.

Obserwuj wszystkie studzienki za pomocą odwróconego mikroskopu optycznego, a następnie inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni z wytrząsaniem przy 200 obr./min. Po okresie inkubacji należy ponownie obserwować wszystkie studzienki, aby zweryfikować zmiany w morfologii, a także sprawdzić, czy nie ma oznak zanieczyszczenia. Uzyskaj obraz każdej płyty za pomocą aparatu cyfrowego.

W tym reprezentatywnym teście trzy peptydy przeciwdrobnoustrojowe lub AMP o stężeniach od 100 mikromolowych do punktu siódmego ósmego mikromolowego oceniono pod kątem aktywności przeciwgrzybiczej przeciwko C. neoformans. W zestawie znajdowała się kontrola wzrostu i ślepa próba. Każda studzienka z klarownym podłożem podobnym do studzienek ślepych jest uważana za wynik pozytywny, podczas gdy każda studzienka z zmętnieniem analogicznym do studzienek z ujemną kontrolą wzrostu jest uważana za ujemną.

Ponieważ minimalne stężenie hamujące (MIC) definiuje się jako najniższe stężenie związku przeciwdrobnoustrojowego, które całkowicie hamuje widoczny wzrost grzybów pod koniec okresu inkubacji, 25 mikromolów jest uważane za MIC dla AMP1. I, 12 przecinek pięć mikromolowych, MIC dla AMP2. AMP3 będzie musiał zostać poddany ponownej ocenie, ponieważ grzyb rósł we wszystkich testowanych stężeniach.

W ten sam sposób trzy odrębne peptydy testowane przeciwko C. albicans, oznaczone jako 50 mikromolowe, są MIC dla AMP1. Sześć mikromolów to MIC dla AMP2, a 25 mikromolów to MIC dla AMP3. Przykład słabego wyniku, prawdopodobnie wynikającego z nieprawidłowego pipetowania na etapie rozcieńczania, ilustrują kolumny od piątej do siódmej rzędu C na tej tabliczce, gdzie występują różnice we wzroście C. neoformans między kontrpróbami.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około dwie godziny, plus czas wzrostu grzybów, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Pamiętaj, aby zdawać sobie sprawę z cech fizykochemicznych tych badanych cząsteczek. Następnie należy użyć odpowiednich rozpuszczalników jako kontroli na wypadek, gdyby były potrzebne, i zawsze używać komórek w tej samej fazie wzrostu.

Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak test zabijania w czasie, stosowanie barwników żywotności i testy ST60, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, czy związek ma działanie grzybobójcze czy fungistatyczne. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny mikrologii medycznej do zbadania kilku źródeł naturalnych lub syntetycznych związków w poszukiwaniu związków przeciwgrzybiczych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak rozpocząć hodowlę grzybów, przygotować komórki do testu, wykonać seryjne rozcieńczenia i przeczytać wyniki po inkubacji szczepów grzybów z naszymi testowanymi związkami.

Nie zapominaj, że praca z patogenami grzybiczymi może być bardzo niebezpieczna. Podczas wykonywania tej procedury należy podjąć przygotowania, takie jak noszenie środków ochrony osobistej, praca w kapturze bezpieczeństwa biologicznego i stosowanie odpowiednich praktyk bezpieczeństwa.