Name: Chipy mikroprzepływowe do dyfrakcji rentgenowskiej kryształów in situ i dynamicznego rozpraszania światła in situ do krystalografii szeregowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania mikroprzepływowych chipów do krystalizacji białek i zbierania danych dyfrakcyjnych rentgenowskich w temperaturze pokojowej. Technika minimalizuje uszkodzenia mechaniczne kryształów białkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez fundusz zalążkowy PIER PIF-2015-46, granty BMBF 05K16GUA i 05K12GU3 oraz klaster doskonałości "Hamburskie Centrum Ultraszybkiego Obrazowania – Struktura, Dynamika i Kontrola Materii w Skali Atomowej" Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Praca autorów związanych z Center for Free-Electron Laser Science została sfinansowana przez Stowarzyszenie Helmholtza z funduszy zorientowanych na program. Dane synchrotronowe MX zostały zebrane na linii badawczej P14 obsługiwanej przez EMBL Hamburg w pierścieniu magazynowym PETRA III (DESY, Hamburg, Niemcy).

<ol><li>Rasmussen, B. F., Stock, A. M., Ringe, D., Petsko, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystalline+ribonuclease+A+loses+function+below+the+dynamical+transition+at+220+K%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystalline ribonuclease A loses function below the dynamical transition at 220 K.</a> Nature. 357 (6377), 423-424 (1992).</li>
<li>Tilton, R. F. J. R., Dewan, J. C., Petsko, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+temperature+on+protein+structure+and+dynamics%3A+X-ray+crystallographic+studies+of+the+protein+ribonuclease-A+at+nine+different+temperatures+from+98+to+320+K%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of temperature on protein structure and dynamics: X-ray crystallographic studies of the protein ribonuclease-A at nine different temperatures from 98 to 320 K.</a> Biochemistry. 31 (9), 2469-2481 (1992).</li>
<li>Fraser, J. S., Clarkson, M. W., Degnan, S. C., Erion, R., Kern, D., Alber, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hidden+alternative+structures+of+proline+isomerase+essential+for+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hidden alternative structures of proline isomerase essential for catalysis.</a> Nature. 462 (7273), 669-673 (2009).</li>
<li>Juers, D. H., Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+solvent+transport+in+cryo-annealing+of+macromolecular+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D%22%5BJournal%5D)">The role of solvent transport in cryo-annealing of macromolecular crystals.</a> Acta Crystallogr. D. 60 (Pt 3), 412-421 (2004).</li>
<li>Huang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+meso+in+situ+serial+X-ray+crystallography+of+soluble+and+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D%22%5BJournal%5D)">In meso in situ serial X-ray crystallography of soluble and membrane proteins.</a> Acta Crystallogr. D. 71 (Pt 6), 1238-1256 (2015).</li>
<li>Gati, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+structure+of+granulin+determined+from+native+nanocrystalline+granulovirus+using+an+X-ray+free-electron+laser%5BTitle%5D)+AND+%22P.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Atomic structure of granulin determined from native nanocrystalline granulovirus using an X-ray free-electron laser.</a> P. Natl. Acad. Sci. USA. 114 (9), 2247-2252 (2017).</li>
<li>Gati, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+crystallography+on+in+vivo+grown+microcrystals+using+synchrotron+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 1 (Pt 2), 87-94 (2014).</li>
<li>von Dreele, R. B. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?S0021889806045493">Multipattern Rietveld refinement of protein powder data.</a> J. Appl. Crystallogr. 40 (1), 133-143 (2007).</li>
<li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+cubic+phase+technologies+for+membrane+protein+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 21 (4), 559-566 (2011).</li>
<li>Gati, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGati%2C+C+%22Data+processing+and+analysis+in+serial+crystallography+at+advanced+X-ray+sources%22">Data processing and analysis in serial crystallography at advanced X-ray sources</a>. , Dissertation, Hamburg (2015).</li>
<li>Stellato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Room-temperature+macromolecular+serial+crystallography+using+synchrotron+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Room-temperature macromolecular serial crystallography using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 1 (Pt 4), 204-212 (2014).</li>
<li>Botha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Room-temperature+serial+crystallography+at+synchrotron+X-ray+sources+using+slowly+flowing+free-standing+high-viscosity+microstreams%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D%22%5BJournal%5D)">Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams.</a> Acta Crystallogr. D. 71 (Pt 2), 387-397 (2015).</li>
<li>Nogly, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+cubic+phase+serial+millisecond+crystallography+using+synchrotron+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 2 (Pt 2), 168-176 (2015).</li>
<li>Martin-Garcia, J. M., Conrad, C. E., Coe, J., Roy-Chowdhury, S., Fromme, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4909539/">Review: Serial femtosecond crystallography: A revolution in structural biology.</a> Arch. Biochem. Biophys. 602, 32-47 (2016).</li>
<li>White, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?db5097">CrystFEL: A software suite for snapshot serial crystallography.</a> J Appl Crystallogr. 45 (2), 335-341 (2012).</li>
<li>Perry, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+approach+for+protein+structure+determination+at+room+temperature+via+on-chip+anomalous+diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic approach for protein structure determination at room temperature via on-chip anomalous diffraction.</a> Lab Chip. 13 (16), 3183-3187 (2013).</li>
<li>Schlichting, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+femtosecond+crystallography%3A+the+first+five+years%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Serial femtosecond crystallography: the first five years.</a> IUCrJ. 2 (Pt 2), 246-255 (2015).</li>
<li>Sui, S., Perry, S. L. <a target="_blank" href="http://aca.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.4979640">Microfluidics: From crystallization to serial time-resolved crystallography.</a> Struct. Dynam.-US. 4 (3), (2017).</li>
<li>Ghazal, A., Lafleur, J. P., Mortensen, K., Kutter, J. P., Arleth, L., Jensen, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+X-ray+compatible+microfluidics+for+applications+in+soft+materials+and+life+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Recent advances in X-ray compatible microfluidics for applications in soft materials and life sciences.</a> Lab Chip. 16 (22), 4263-4295 (2016).</li>
<li>Heymann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Room-temperature+serial+crystallography+using+a+kinetically+optimized+microfluidic+device+for+protein+crystallization+and+on-chip+X-ray+diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Room-temperature serial crystallography using a kinetically optimized microfluidic device for protein crystallization and on-chip X-ray diffraction.</a> IUCrJ. 1 (Pt 5), 349-360 (2014).</li>
<li>Schubert, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicrystal+diffraction+data-collection+approach+for+studying+structural+dynamics+with+millisecond+temporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">A multicrystal diffraction data-collection approach for studying structural dynamics with millisecond temporal resolution.</a> IUCrJ. 3 (Pt 6), 393-401 (2016).</li>
<li>Weierstall, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+cubic+phase+injector+facilitates+membrane+protein+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography.</a> Nat. Commun. 5, 3309(2014).</li>
<li>Conrad, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+inert+crystal+delivery+medium+for+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography.</a> IUCrJ. 2 (Pt 4), 421-430 (2015).</li>
<li>Cohen, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Goniometer-based+femtosecond+crystallography+with+X-ray+free+electron+lasers%5BTitle%5D)+AND+%22P.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Goniometer-based femtosecond crystallography with X-ray free electron lasers.</a> P. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (48), 17122-17127 (2014).</li>
<li>Erskine, D., YU, P. Y., Freilich, S. C. <a target="_blank" href="http://www.spectralfringe.org/EDI/MyOlderPubs/PolyImide1988.pdf">High-Pressure Visible Spectroscopy of Polyimide Film.</a> J. Polym. Sci. Pol. Lett. 26 (11), 465-468 (1988).</li>
<li>Tsai, C. -L., Yen, H. -J., Chen, W. -C., Liou, G. -S. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2012/jm/c2jm32480f">Novel solution-processable optically isotropic colorless polyimidothioethers-TiO2 hybrids with tunable refractive index.</a> J. Mater. Chem. 22 (33), 17236-17244 (2012).</li>
<li>Destremaut, F., Salmon, J. -B., Qi, L., Chapel, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+with+on-line+dynamic+light+scattering+for+size+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidics with on-line dynamic light scattering for size measurements.</a> Lab Chip. 9 (22), 3289-3296 (2009).</li>
<li>Chastek, T. Q., Iida, K., Amis, E. J., Fasolka, M. J., Beers, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+platform+for+integrated+synthesis+and+dynamic+light+scattering+measurement+of+block+copolymer+micelles%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic platform for integrated synthesis and dynamic light scattering measurement of block copolymer micelles.</a> Lab Chip. 8 (6), 950-957 (2008).</li>
<li>Heymann, M., Fraden, S., Kim, D. <a target="_blank" href="http://ieeexplore.ieee.org/document/6589983/">Multi-Height Precision Alignment With Selectively Developed Alignment Marks.</a> J. Microelectromech. S. 23 (2), 424-427 (2014).</li>
<li>Schubert, R., et al. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?jo5012">Reliably distinguishing protein nanocrystals from amorphous precipitate by means of depolarized dynamic light scattering.</a> J Appl Crystallogr. 48 (5), 1476-1484 (2015).</li>
<li>Aghvami, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925400517304318">Rapid prototyping of cyclic olefin copolymer (COC) microfluidic devices.</a> Sensor Actuat. B-Chem. 247, 940-949 (2017).</li>
<li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalker%2C+JM+%22The+Proteomics+Protocols+Handbook%22">The Proteomics Protocols Handbook</a>. , Humana Press Inc. Totowa, NJ. (2005).</li>
<li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2815665/">XDS.</a> Acta Crystallogr D. 66 (Pt 2), 125-132 (2010).</li>
<li>Vagin, A., Teplyakov, A. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?dz5175">Molecular replacement with MOLREP.</a> Acta Crystallogr. D. 66 (Pt 1), 22-25 (2010).</li>
<li>Winn, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+CCP4+suite+and+current+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D%22%5BJournal%5D)">Overview of the CCP4 suite and current developments.</a> Acta Crystallogr. D. 67, 235-242 (2011).</li>
<li>Murshudov, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((REFMAC5+for+the+refinement+of+macromolecular+crystal+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D%22%5BJournal%5D)">REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures.</a> Acta Crystallogr. D. 67 (Pt 4), 355-367 (2011).</li>
<li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+development+of+Coot%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D%22%5BJournal%5D)">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallogr. D. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).</li>
<li>Owen, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+fast+detectors+to+enter+a+new+dimension+in+room-temperature+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D%22%5BJournal%5D)">Exploiting fast detectors to enter a new dimension in room-temperature crystallography.</a> Acta Crystallogr. D. 70 (Pt 5), 1248-1256 (2014).</li>
<li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?wi0022">Automatic-Indexing of Rotation Diffraction Patterns.</a> J. Appl. Crystallogr. 21, 67-71 (1988).</li>
<li>Zarrine-Afsar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallography+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D%22%5BJournal%5D)">Crystallography on a chip.</a> Acta Crystallogr. D. 68 (Pt 3), 321-323 (2012).</li>
<li>Boukellal, H., Selimović, S., Jia, Y., Cristobal, G., Fraden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple%2C+robust+storage+of+drops+and+fluids+in+a+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Simple, robust storage of drops and fluids in a microfluidic device.</a> Lab Chip. 9 (2), 331-338 (2009).</li>
<li>Aghvami, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+prototyping+of+cyclic+olefin+copolymer+%28COC%29+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Sens.+Actuator+B+Chem%22%5BJournal%5D)">Rapid prototyping of cyclic olefin copolymer (COC) microfluidic devices.</a> Sens. Actuator B Chem. 247, 940-949 (2017).</li>
<li>Shemesh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stationary+nanoliter+droplet+array+with+a+substrate+of+choice+for+single+adherent%2Fnonadherent+cell+incubation+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Stationary nanoliter droplet array with a substrate of choice for single adherent/nonadherent cell incubation and analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (31), 11293-11298 (2014).</li>
<li>Sun, M., Bithi, S. S., Vanapalli, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+static+droplet+arrays+with+tuneable+gradients+in+material+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic static droplet arrays with tuneable gradients in material composition.</a> Lab Chip. 11 (23), 3949-3952 (2011).</li>
<li>Shim, J. -U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+and+measurement+of+the+phase+behavior+of+aqueous+solutions+using+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Control and measurement of the phase behavior of aqueous solutions using microfluidics.</a> J. Am. Chem. Soc. 129 (28), 8825-8835 (2007).</li>
<li>Schubert, R., Meyer, A., Baitan, D., Dierks, K., Perbandt, M., Betzel, C. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.cgd.6b01826">Real-Time Observation of Protein Dense Liquid Cluster Evolution during Nucleation in Protein Crystallization.</a> Cryst. Growth Des. 17 (6), 3579(2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Produkujemy urządzenia mikroprzepływowe do dyfrakcji rentgenowskiej in situ poprzez modelowanie żywicy epoksydowej jako materiału wypełniającego i folii poliimidowej jako materiału okiennego. Nasza procedura zoptymalizowała różne etapy procesu produkcyjnego w porównaniu z poprzednimi projektami chipów rentgenowskich16,21. Zmniejszyliśmy grubość okna, a tym samym rozproszenie tła, jednocześnie ułatwiając produkcję, ponieważ wymagana jest mniejsza liczba etapów procesu. Krystalizacja in situ przy użyciu opisanego protokołu przynosi znaczne korzyści. Umożliwia zbieranie danych dyfrakcyjnych w temperaturze pokojowej, a tym samym wyklucza potrzebę ochrony kriogenicznej, która w niektórych przypadkach wiąże się z ryzykiem wprowadzenia artefaktów do struktury białka. Co więcej, kryształy nie są poddawane naprężeniom fizycznym, ponieważ można uniknąć przenoszenia kryształów z ich rodzimego środowiska. Dzięki tej procedurze kryształy zachowują swoją najwyższą jakość i nie są poddawane żadnej obróbce.
Z naszego doświadczenia wynika, że najbardziej krytyczne kroki w ramach protokołu koncentrują się na kontrolowaniu procesu krystalizacji. Parametry pozwalające uzyskać odpowiednie do promieniowania rentgenowskiego kryształy o odpowiednich wymiarach muszą być zidentyfikowane empirycznie i nie mogą być uzyskane bezpośrednio z eksperymentów dyfuzji pary. Stosowanie identycznych stężeń białka i środka strącającego nie zawsze skutkowało kryształami w różnych chipach, a czasami w różnych dołkach w tym samym chipie. Wskazuje to, że należy dokładnie rozważyć wszystkie czynniki wpływające na zarodkowanie i wzrost kryształów, takie jak skład ługu macierzystego lub kinetyka krystalizacji (poprzez trajektorię parowania). Ponieważ większe kryształy ulegają dyfrakcji do wyższej rozdzielczości, idealnie rosną odpowiednio duże kryształy. Proces zarodkowania i wzrostu kryształów może być śledzony za pomocą pomiarów DLS. Regulacja ostrości lasera w cienkich przedziałach krystalizacyjnych chipa o grubości ~50 μm może być trudna i może wymagać starannego ręcznego wyrównania. Dzięki zastosowaniu odwiertów głębszych niż 100 μm, automatyczne wyrównywanie lasera było wykonalne i niezawodne, dzięki czemu wiele odwiertów można było monitorować za pomocą zautomatyzowanych schematów akwizycji.
Chipy rentgenowskie na bazie poliimidu wytwarzają tylko niskie tło, a my wykazujemy przydatność tych urządzeń do rutynowego zbierania danych dyfrakcji rentgenowskiej, rozwiązując struktury dla trzech modelowych białek. Najlepsza rozdzielczość uzyskana w chipie różniła się, w porównaniu z poprzednio osiąganymi rozdzielczościami, od znacznie większych kryształów białkowych i konwencjonalnego zbierania danych rentgenowskich. Może to wynikać z kilku czynników, a dalsza optymalizacja warunków krystalizacji może jeszcze bardziej poprawić dyfrakcję. Możliwe było zebranie danych dyfrakcyjnych in situ z rozdzielczością do 1,8 A przy zastosowaniu kryształu o wymiarach mniejszych niż 30 μm. Szczegółowa analiza danych dyfrakcji taumatyny dostarczyła informacji na temat uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem. Aby ograniczyć zakres uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem, tylko jeden pojedynczy kryształ powinien być odsłonięty na każdy przedział w urządzeniu mikroprzepływowym, ponieważ może dojść do dyfuzji rodników do i w sąsiednich kryształach. Aby zwiększyć szybkość gromadzenia danych, powinno to zostać zautomatyzowane w przyszłości.
Ze względu na morfologię kryształów w niektórych przypadkach może wystąpić preferowana orientacja. Tak było na przykład w przypadku zestawu danych dotyczących tioredoksyny, w którym kryształy miały zdecydowanie preferowaną orientację w stosunku do okien chipów. Nawet tutaj udało nam się zebrać kompletny zestaw danych dyfrakcyjnych. Jeżeli kryształy wykazują preferowaną orientację w chipie, a w szczególności, jeśli odpowiadająca im grupa przestrzenna ma również niską symetrię, wówczas kompletność zbioru danych powinna być monitorowana podczas zbierania w taki sposób, aby można było zebrać wystarczające wzory dyfrakcyjne.
Badania czasowo-rozdzielcze z wykorzystaniem tych chipów są bezpośrednio możliwe przy użyciu reakcji indukowanych światłem z podejściem pompa-sonda. Należy wyjaśnić przepuszczalność światła z folii poliimidowej dla lasera pompującego i alternatywnie można zastosować optycznie przezroczysty poliimid lub COC. Obecne geometrie mikroprzepływowe nie pozwalają na eksperymenty z mieszaniem substratu po wyhodowaniu kryształów. Spodziewamy się jednak, że opisany protokół wytwarzania chipów rentgenowskich będzie również odpowiedni dla takich projektów mieszania zarówno dla dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego w czasie, jak i podejścia rozpraszania19.

Znajomość struktury 3D białka jest niezbędna do zrozumienia jego funkcjonalności. Struktury o rozdzielczości zbliżonej do atomowej są dotychczas najczęściej uzyskiwane za pomocą krystalografii rentgenowskiej. Technika ta wystawia kryształy białek na działanie promieniowania rentgenowskiego, a powstałe wzory dyfrakcyjne są następnie analizowane w celu określenia struktury i udoskonalenia. W tradycyjnej krystalografii rentgenowskiej kompletny zestaw danych dyfrakcyjnych jest rejestrowany z pojedynczego, najlepiej dużego kryształu w temperaturach kriogenicznych. Takie kryształy jednak w większości przypadków nie są trywialne do wyhodowania, a zidentyfikowanie odpowiednich warunków kriokonserwacji może samo w sobie stać się wyzwaniem, a czasami może również powodować odchylenia od natywnej struktury białka5.
Ostatnie osiągnięcia technologiczne w rentgenowskim laserze na swobodnych elektronach (FEL) i liniach synchrotronowych pozwoliły na rozwiązywanie struktur z mniejszych kryształów, ponieważ pojawiły się nowe linie mikroskupiające wiązkę, zwiększona jasność wiązki promieniowania rentgenowskiego i ulepszone detektory promieniowania rentgenowskiego6,7. Zazwyczaj małe kryształy są łatwiejsze do wyhodowania niż duże i wolne od wad kryształy8,9. Jednak małe kryształy cierpią z powodu uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem rentgenowskim znacznie szybciej niż duże kryształy. Dzieje się tak, ponieważ w porównaniu z dużym kryształem, wyższa dawka promieniowania rentgenowskiego musi być rzutowana na mniejszą objętość kryształu, aby załamać się do porównywalnej rozdzielczości. Dlatego nawet ochrona kriogeniczna często nie wystarcza do zarejestrowania pełnego zestawu danych dyfrakcyjnych z pojedynczego mikrokryształu.
Aby pokonać tę przeszkodę, krystalografia szeregowa stała się metodą z wyboru do zbierania i łączenia wzorów dyfrakcyjnych z wielu losowo rozmieszczonych mikrokryształów w celu uzyskania kompletnego zestawu danych. Uszkodzenia kryształów wywołane promieniowaniem są minimalizowane poprzez rozłożenie całkowitej dawki promieniowania rentgenowskiego użytej do rozwiązania struktury białkowej na dużą liczbę kryształów5,10. W eksperymencie FEL "dyfrakcja przed zniszczeniem" każdy kryształ jest używany tylko do jednej ekspozycji przy użyciu femtosekundowych impulsów promieniowania rentgenowskiego. Z kolei linie mikrofokusowe przy źródłach synchrotronowych trzeciej generacji mogą wykonywać krystalografię szeregową z krótkimi czasami naświetlania promieniowaniem rentgenowskim w ciągu kilku milisekund11,12,13,14. Jednak bez oscylacji lub rotacji kryształów podczas zbierania danych, można zarejestrować tylko częściowe odbicia Bragga, a zatem do określenia struktury zwykle wymagane są dziesiątki tysięcy lub więcej wzorów dyfrakcyjnych15. Do tej pory opracowano różnorodny zestaw metod dostarczania próbek do krystalografii seryjnej, co zostało niedawno sprawdzone14,16,17,18,19. Wśród nich z powodzeniem połączono kilka strategii dostarczania próbek opartych na stałym celu, z rotacją kryształów podczas ekspozycji na promieniowanie rentgenowskie, dzięki czemu znacznie mniej wzorów dyfrakcyjnych może dostarczyć równie kompletnych zestawów danych, a jednocześnie zużywać mniej próbki w porównaniu z klasycznymi eksperymentami krystalografii szeregowej, w których rejestrowane są nieruchome obrazy7,16,20,21,22,23,24.
Przedstawiamy protokół do produkcji urządzeń mikroprzepływowych o niskim tle promieniowania rentgenowskiego. Urządzenia są wykonane z 5-minutowego kleju epoksydowego przy użyciu miękkiej litografii i nadają się do eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej in-situ w temperaturze pokojowej, które korzystają z integracji przygotowania próbki bezpośrednio z zestawem rentgenowskim, jak ma to miejsce w przypadku badań rozdzielczych w czasie, które przebiegają kinetyką wywołaną mieszaniem18,19. Kanały mikroprzepływowe są obustronnie osłonięte polimerową folią poliimidową, w wyniku czego powstają okienka rentgenowskie o łącznej grubości około 16 μm, które pozwalają na obrazowanie tła o niskim promieniowaniu rentgenowskim. Wszystkie użyte materiały zapewniają dobrą odporność na rozpuszczalniki. Ta metoda produkcji jest stosunkowo prosta i niedroga. Po pozyskaniu płytki wzorcowej SU-8 cała produkcja może zostać zakończona poza pomieszczeniem czystym w typowych warunkach laboratorium badawczego.
W przykładzie zastosowania opisujemy chipy do krystalografii szeregowej opartej na goniometrze o stałym celu. Po pierwsze, omówiono zagadnienia projektowe i produkcyjne dotyczące stosowania zaworów kapilarnych do mikrofluidalnego rozdzielania reakcji wodnej na wybraną liczbę kropel o wielkości nanolitrów. Ten mechanizm ładowania pozwala uniknąć utraty próbki w wyniku objętości martwej kanału, a dzielenie można łatwo przeprowadzić ręcznie, bez użycia pomp lub innych urządzeń do uruchamiania płynu. Takie izolowane krople roztworu białkowego o rozmiarach nanolitrów są monitorowane in situ za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS) w celu kontrolowania zarodkowania i wzrostu kryształów białka. Wcześniej wykazano, że pomiary DLS mogą być wykonywane w urządzeniach mikroprzepływowych składających się ze struktury polidimetylosiloksanu (PDMS) połączonej ze szkiełkiem podstawowym 25,26. Ponieważ warstwa poliimidowa ma wysoką transmisję dla długości fal dłuższych niż 550 nm, podejście to można rozszerzyć również na pomiary w przezroczystych chipach rentgenowskich, przy użyciu odpowiedniej długości fali lasera27,28. Na podstawie wyników DLS można zaobserwować początkowe zarodkowanie, a dalsze parowanie kropel można zatrzymać, aby uzyskać mniej, ale większe kryształy białka.
Po wyhodowaniu wystarczającej ilości kryształów, kompletne zestawy danych dyfrakcji rentgenowskiej mogą być następnie zebrane za pomocą goniometru opartego na krystalografii rentgenowskiej in situ w temperaturze pokojowej. Zestawy danych dyfrakcyjnych są przetwarzane przy użyciu zestawu narzędzi programowych i niestandardowych skryptów w celu rozwiązania struktury krystalicznej białka. Technika ta pozwala uniknąć artefaktów często indukowanych podczas kriokonserwacji stosowanej w konwencjonalnych eksperymentach krystalograficznych.
Porównujemy trzy docelowe struktury białek, które zostały rozwiązane przy użyciu około 10-20 μm małych kryształów hodowanych w chipie do rozdzielczości lepszej niż 2 A. Poprzez krystalizację i dyfrakcję in situ, obchodzenie się, a tym samym zakłócenia mechaniczne delikatnych kryształów są zminimalizowane. Protokół ten może być stosowany do kryształów białek, które ulegają dyfrakcji zarówno do wysokiej, jak i niskiej rozdzielczości (1,7 A do 3,0 A). Ponieważ prawie każdy kryształ może być użyty do dyfrakcji, niewiele próbki jest marnowane, co sprawia, że jest to bardzo wydajna metoda dostarczania kryształów.
Ten protokół zawiera szczegółowy przewodnik, jak przygotować przezroczyste mikroprzepływowe chipy rentgenowskie do krystalizacji białek in situ i zbierania danych dyfrakcyjnych. Procedura została starannie zaprojektowana, aby czerpać korzyści z precyzji mikroprzepływowej bez konieczności korzystania z zaawansowanego sprzętu w laboratorium. Ponadto zbieranie danych na linii synchrotronowej może być prowadzone bez konieczności korzystania ze specjalistycznego goniometru lub nawilżacza, co ułatwia odtworzenie wyników przez osoby niebędące ekspertami. Przedstawiona technika może być zastosowana do seryjnego gromadzenia danych z krystalografii milisekundowej w temperaturze pokojowej przy jednoczesnym utrzymaniu minimalnych uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem i bez wprowadzania naprężeń do kryształów po wzroście poprzez krioochronę lub obchodzenie się z kryształami. W związku z tym opisana metoda jest odpowiednia dla każdego projektu krystalizacji białek.

<table><tbody><tr><td>SU-8 Seria 3000</td><td>MicroChem Corp.</td><td>SU-8 3000</td><td>Photoresist</td></tr><tr><td>PGMEA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>484431</td><td>Developer</td></tr><tr><td></td>Alkohol <td></td><td></td><td>izopropylowy</td> Rozpuszczalnik</tr><tr><td>Etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rozpuszczalnik Klej epoksydowy</td><td>UHU</td><td>Plus Schnellfest 5 min</td><td>Klej epoksydowy</td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td>Folia silikonowa</td></tr><tr><td>Kapton</td><td>Dupont/ Amerykański gatunek Durafilm</td><td>HN, rozstaw 30 (7,5 &mu; m)</td> <td>folia poliamidowa</td></tr><tr><td>APTS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440140</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>GPTS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440167</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>Cytop CTX-109AE</td><td>Asahi Glass Co. Ltd</td><td>Cytop CTX-109AE</td><td>Powłoka fluoropolimerowa Cytop</td></tr><tr><td>CT-Solv 100E</td><td>Asahi Glass Co. Ltd</td><td>CT-Solv 100E</td><td>Cytop fluororozpuszczalnik</td></tr><tr><td>HFE-7500</td><td>3M</td><td>Novec 7500</td><td>Olej fluorowany</td></tr><tr><td>AutoCAD</td><td>AutoDesk Inc.</td><td>AutoCAD</td><td>CAD Software</td></tr><tr><td>Biopsy Punch</td><td>Harris</td><td>Uni-core 0,75 mm</td><td></td></tr><tr><td>Maska fotograficzna</td><td>JD Photo Data</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-calowy wafel</td><td>University Wafel</td><td></td><td>Silicon wafer</td></tr><tr><td>Mask aligner</td><td>S&Uuml; SS MicroTec</td><td>MJB4</td><td>Maska wyrównująca</td></tr><tr><td>mikser PDMS</td><td>Thinky</td><td>ARE-250</td><td></td></tr><tr><td>Maszyna plazmowa</td><td>Diener elektroniczna</td><td>Zepto</td><td></td></tr><tr><td>Thaumatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7638</td><td>Białko</td></tr><tr><td>Glukoza Izomeraza</td><td>Hamton Research</td><td>HR7-102</td><td>Białko</td></tr><tr><td>Bis-Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B9754</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>Winian sodu</td><td>Merck</td><td>106664</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10812846001</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth</td><td>6763.2</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>chlorek magnezu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208337</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>siarczan amonu</td><td>Sigma</td><td>Aldrich A4418</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6758</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>chlorek sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1064060250</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>PEG1500</td><td>Wymiary molekularne</td><td>MD2-100-6</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>bufor SPG</td><td>Jena Bioscience</td><td>CSS-389</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr chemiczny Light600</td><td>XtalConcepts</td><td></td><td>DLS Instrument</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultimaker2</td><td>Drukarka 3D</td><td>Ultimaker</td><td></td></tr><tr><td>Drukarka</td><td>3D</td><td>Form2 Formlabs</td><td></td></tr><tr><td>Filtr Amicon</td><td>Sartorius Stedim</td><td></td><td>0,2 i mikro; m filtr</td></tr><tr><td>Rurki</td><td>Adtech Polymer Engineering Ltd</td><td>Bioblock/05</td><td>Rurka PTFE 0,3 mm Średnica wewnętrzna x 0,76 mm Średnica zewnętrzna</td></tr><tr><td>Strzykawki&nbsp;</td><td>Igła do</td><td>końcówek Luer-Lock 1 ml</td>BD <td>309628</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Igła Terumo Agani</td><td>AN*2716R1</td><td>27Gx5/8"</td></tr></tbody></table>

chipy mikroprzepływowe do dyfrakcji rentgenowskiej kryształów in situ i dynamicznego rozpraszania światła in situ do krystalografii szeregowej

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Ten protokół opisuje wytwarzanie urządzeń mikroprzepływowych o niskim tło rentgenowskim, zoptymalizowanych pod kątem krystalografii szeregowej opartej na goniometrze. Urządzenia są wzorowane na kleju epoksydowym przy użyciu miękkiej litografii i nadają się do eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej in situ w temperaturze pokojowej. Dołki na próbki są obustronnie przykryte okienkami z polimerowej folii poliimidowej, które umożliwiają zbieranie danych dyfrakcyjnych przy niskim tle promieniowania rentgenowskiego. Ta metoda produkcji jest mało wymagająca i niedroga. Po pozyskaniu płytki wzorcowej SU-8 cała produkcja może zostać zakończona poza pomieszczeniem czystym w typowym środowisku laboratorium badawczego. Protokół projektowania i produkcji chipów wykorzystuje zawory kapilarne do mikrofluidalnego rozdzielania reakcji wodnej na zdefiniowane kropelki o rozmiarach nanolitrów. Ten mechanizm ładowania pozwala uniknąć utraty próbki w wyniku martwej objętości kanału i może być łatwo wykonany ręcznie bez użycia pomp lub innych urządzeń do uruchamiania płynu. Opisujemy, w jaki sposób izolowane krople roztworu białkowego o rozmiarach nanolitrów mogą być monitorowane in situ przez dynamiczne rozpraszanie światła w celu kontrolowania zarodkowania i wzrostu kryształów białka. Po wyhodowaniu odpowiednich kryształów można zebrać kompletne zestawy danych dyfrakcji rentgenowskiej za pomocą goniometru opartego na krystalografii rentgenowskiej in situ o stałym celu w temperaturze pokojowej. Protokół zapewnia niestandardowe skrypty do przetwarzania zestawów danych dyfrakcyjnych przy użyciu zestawu narzędzi programowych do rozwiązywania i udoskonalania struktury krystalicznej białka. Takie podejście pozwala uniknąć artefaktów, które mogą zostać wywołane podczas kriokonserwacji lub ręcznego obchodzenia się z kryształami w konwencjonalnych eksperymentach krystalograficznych. Przedstawiamy i porównujemy trzy struktury białkowe, które zostały rozwiązane przy użyciu małych kryształów o wymiarach około 10-20 μm wyhodowanych w chipie. Poprzez krystalizację i dyfrakcję in situ, obchodzenie się, a tym samym zakłócenia mechaniczne delikatnych kryształów są zminimalizowane. Protokół szczegółowo opisuje, jak wytworzyć niestandardowy przezroczysty chip mikroprzepływowy przeznaczony do krystalografii szeregowej in situ. Ponieważ prawie każdy kryształ może być używany do zbierania danych dyfrakcyjnych, te mikroprzepływowe chipy są bardzo wydajną metodą dostarczania kryształów.

Ten protokół opisuje szczegółowo, jak wytwarzać i obsługiwać urządzenia mikroprzepływowe do zbierania danych dyfrakcji rentgenowskiej w temperaturze pokojowej. Dodatkowo opisano, w jaki sposób monitorować krystalizację białek poprzez dynamiczne rozpraszanie światła oraz jak przetwarzać i analizować uzyskane dane dyfrakcyjne.

Chipy mikroprzepływowe do dyfrakcji rentgenowskiej kryształów in situ i dynamicznego rozpraszania światła in situ do krystalografii szeregowej

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Ogólnym celem tej procedury jest wyprodukowanie i uruchomienie urządzenia mikroprzepływowego do zbierania danych dyfrakcji rentgenowskiej krystalizacji białek w temperaturze pokojowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że krystalizacja wewnątrz chipa minimalizuje mechaniczne zakłócenia kryształów białka. Te przezroczyste chipy rentgenowskie są łatwe do wyprodukowania, mogą być bezpośrednio montowane na goniometrach większości synchrotronowych linii badawczych i efektywnie wykorzystują dostępne kryształy podczas zbierania danych dyfrakcji rentgenowskiej.Najpierw umieść główną formę projektu chipa rentgenowskiego na 10-centymetrowej szalce Petriego wyłożonej folią aluminiową. Wymieszaj razem około 30 gramów bazy PDMS i utwardzacza w stosunku 10 do jednego i wlej PDMS na mistrza na wysokość czterech milimetrów. Odgazuj PDMS w eksykatorze próżniowym na pięć minut i przedmuchnij powietrze, aby usunąć pozostałe pęcherzyki powietrza z powierzchni PDMS.Utwardź PDMS w piekarniku w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie delikatnie oderwij utwardzoną formę PDMS od mistrza. Użyj skalpela, aby odciąć nadmiar PDMS.Przed wykonaniem chipów rentgenowskich należy upewnić się, że miejsce pracy jest zaaranżowane tak, aby umożliwić łatwy dostęp do wszystkich potrzebnych urządzeń i komponentów podczas odlewania w formach epoksydowych. Aby rozpocząć wytwarzanie chipów, należy rozcieńczyć prekursory dwuskładnikowej żywicy epoksydowej etanolem do końcowego stężenia masowego etanolu 40% wagowo. Za pomocą mieszalnika wirowego wymieszaj ze sobą żywicę epoksydową i etanol.Odgazuj formę PDMS w eksykatorze próżniowym przez 30 minut, aby upewnić się, że PDMS może później wchłonąć małe pęcherzyki powietrza z żywicy epoksydowej. Wytnij kawałek folii poliimidowej o grubości 70 milimetrów na 70 milimetrów i owiń folię wokół szkiełka o wymiarach 75 milimetrów na 50 milimetrów. Przyklej krawędzie folii do tylnej części szkiełka, aby utworzyć płaską, sztywną powierzchnię poliimidową.Folię poliimidową z kiełkiem należy traktować plazmą tlenową przez 20 sekund. Następnie inkubować folię w wodnym roztworze APTS lub GPTS o stężeniu 1% objętości przez pięć minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Podczas silanizacji dokładnie wymieszaj roztwory prekursorów żywicy epoksydowej za pomocą małej szpatułki.Przenieść odgazowaną formę PDMS z eksykatora próżniowego na płaską powierzchnię. Wysuszyć silanizowaną folię poliimidową sprężonym powietrzem lub azotem. Szybko nałóż kroplę mieszanki żywicy na każdą mikrostrukturę na formie.Umieść folię poliimidową z wkładem skierowanym w dół na żywicy epoksydowej i mocno dociśnij szkiełko. Przykryj zespół folią plastikową i blachą. Umieść obciążniki na blasze, aby wywrzeć nacisk do 1,4 niutona na centymetr kwadratowy zespołu.Po 15 minutach delikatnie oddziel szkiełko od folii poliimidowej z wzorem epoksydowym i wytrzyj folię poliimidową do wyschnięcia. Umieść folię plastikową, blachę i obciążniki z powrotem na wierzchu. Pozostaw żywicę epoksydową do utwardzenia w temperaturze pokojowej przez godzinę.Następnie usuń obciążniki, blachę i folię plastikową. Delikatnie oderwij wzorzystą folię poliimidową od formy PDMS. Plazma traktuje wzorzystą folię przez 20 sekund i silanizuje wzorzystą folię za pomocą APTS lub GPTS, jak opisano wcześniej.W tych samych warunkach należy ssilaryzować nieskazitelną folię poliimidową z innym roztworem silanu. Wysuszyć obie folie powietrzem pod ciśnieniem. Następnie nanieś kroplę wody dejonizowanej na czystą, suchą, płaską powierzchnię.Wytnij poszczególne struktury wiórowe na folii poliimidowej i umieść wzorzystą folię poliimidową epoksydową stroną do góry na kropli wody i ostrożnie wygładź folię, aż będzie całkowicie płaska. Umieść drugą folię poliimidową na wzorzystej folii silanizowaną stroną zadrukowaną do dołu. Delikatnie ręcznie wygładź drugą folię od rogu do przeciwległego rogu, aby usunąć pęcherzyki powietrza i połączyć ze sobą arkusze poliimidu.Aby rozpocząć wytwarzanie portów dostępowych, należy wyciąć z utwardzonej, czteromilimetrowej płyty PDMS blok o rozmiarze wystarczającym do pokrycia wszystkich portów w poliimidowym chipie rentgenowskim bez zakrywania komory krystalizacji. Obróbka plazmowa, silanizacja i suszenie chipa poliimidowego i bloku PDMS. Dociśnij obrabiany blok do chipa nad portami.Przykryj chip folią plastikową, czystym szkiełkiem podstawowym i blachą. Stosuj nacisk 1,4 niutona na centymetr kwadratowy przez godzinę. Następnie użyj 0,75-milimetrowego stempla do biopsji, aby przebić otwory wlotowe i wylotowe, gdzie jest to zaznaczone w projekcie chipa.Uszczelnij tylną część chipa taśmą elektroizolacyjną z folii poliimidowej. Następnie rozcieńczyć 9% wagowo roztwór podstawowy przezroczystego materiału powlekającego z fluoropolimeru do 0,45% wagowo rozpuszczalnikiem fluorowanym. Podłączyć igłę o rozmiarze 27 i średnicy 5/8 cala do strzykawki.Załóż rurkę z politetrafluoroetylenu na koniec igły. Załaduj roztwór fluoropolimeru do jednomililitrowej strzykawki Luer Lock. Podłącz drugi koniec rurki do wylotu chipa rentgenowskiego.Wstrzyknąć roztwór fluoropolimeru do chipa, aż wszystkie kanały zostaną wypełnione, a następnie usunąć nadmiar roztworu fluoropolimeru za pomocą strzykawki wypełnionej powietrzem. Umieść wypełniony frytek płaską stroną do dołu na płycie grzejnej w temperaturze 190 stopni Celsjusza. Podgrzewaj chip przez pięć minut, aby odparować rozpuszczalnik, pokrywając w ten sposób kanały fluoropolimerem.Przed zabiegiem krystalizacji należy przefiltrować wybrany roztwór białkowy filtrem 0,2 mikrona. Odwirować roztwór przez 15 minut w temperaturze 16, 100 razy g i 20 stopni Celsjusza i odzyskać supernatant do eksperymentów krystalizacji. Aby rozpocząć proces krystalizacji, połącz równe objętości roztworu białka i jego strącacza.Pobrać około 20 mikrolitrów tej mieszaniny do strzykawki. Użyj igły o rozmiarze 27 i średnicy 5/8 cala i rurki PTFE, aby podłączyć strzykawkę do wlotu chipa rentgenowskiego. W ten sam sposób podłącz strzykawkę z olejem fluorowanym do wylotu.Monitorując chip pod mikroskopem, napełnij roztwór krystalizacyjny przez wlot do chipa w układzie równoległym. Wstrzyknąć wystarczającą ilość oleju fluorowanego, aby oddzielić komory krystalizacji w chipie. Następnie zablokuj zarówno port wlotowy, jak i wylotowy spinaczami do papieru lub innymi wąskimi zatyczkami.Przechowuj chip w odpowiednich warunkach krystalizacji. Powstawanie kryształów można teraz obserwować pod mikroskopem lub za pomocą dynamicznych pomiarów rozpraszania światła. Gdy będziesz gotowy do zbierania danych, użyj taśmy dwustronnej, aby przymocować chip rentgenowski do wydrukowanego w 3D adaptera do goniometru płytowego.Zamontuj adapter chipowy na goniometrze płytkowym na linii synchrotronowej. Zbierz i przeanalizuj dane dyfrakcyjne. Mikroskopia jasnego pola została wykorzystana do ilościowego określenia szybkości parowania wody z komór krystalizacyjnych chipa z folii poliimidowej.Dynamiczne rozpraszanie światła może wykryć początkowe zarodkowanie kryształów taumatyny w chipie PDMS na szklanym szkiełku o równoważnej geometrii, co pozwala na optymalizację warunków krystalizacji. Zebrano 10 wzorów dyfrakcyjnych z każdego z 83 kryształów taumatyny wyhodowanych w chipie poliimidowym z obrotem o jeden stopień podczas każdej klatki. Zestaw danych podzielono na pięć podzbiorów danych według ramek, a następnie oceniono intensywność zaniku znormalizowanej mocy dyfrakcyjnej w czasie.W czwartym zestawie danych moc dyfrakcyjna spadła poniżej 50%Wartości mierzonego współczynnika R w podzbiorach danych wzrosły z czasem, co wskazuje, że kryształy uległy uszkodzeniom promieniowania podczas zbierania danych. Przypisano to wolnym rodnikom generowanym podczas ekspozycji na promieniowanie rentgenowskie, degradującym sąsiednie kryształy w tym samym przedziale. Bipiramidalne kryształy taumatyny miały szeroki rozkład orientacji w chipie rentgenowskim.Ortorbombowe kryształy izomerazy glukozy również wykazywały szeroki rozkład orientacji, gdy były hodowane w chipie poliimidowym. Jednak kryształy tioredoksyny miały głównie orientację w płaszczyznach xy, xz i yz, potencjalnie ze względu na ich wydłużony kształt. Ogólnie rzecz biorąc, chipy te są bardzo wytrzymałe i mają niskie tło rentgenowskie.To sprawia, że ta metoda wytwarzania jest odpowiednia dla innych technik obrazowania rentgenowskiego, takich jak rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego pod małymi kątami. Procedurę tę można łatwo dostosować do potrzeb eksperymentu. Na przykład konstrukcja chipa może być modyfikowana poprzez dostosowanie wymiarów poszczególnych przegródek lub całkowitej liczby przegródek na chip.Szczególnym celem było dla nas zaprojektowanie przepływu pracy, który nie wymaga kosztownego sprzętu, takiego jak specjalistyczne narzędzia lub pompy mikroprzepływowe. Po obejrzeniu tego filmu i przeczytaniu manuskryptu powinieneś dobrze zrozumieć, jak krystalizować się w chipie, monitorować proces krystalizacji oraz rejestrować i analizować dane dyfrakcyjne przy użyciu podejścia chipowego. Po opanowaniu, technika ta umożliwia wsadową produkcję chipów mikroprzepływowych z urządzenia głównego PDMS w ciągu około trzech godzin bez konieczności korzystania z dedykowanego pomieszczenia czystego.

microfluidic-chips-for-situ-crystal-x-ray-diffraction-situ-dynamic

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Opisano zastosowanie obrazowania kontrastowego z kanałem elektronowym w skaningowym mikroskopie elektronowym do charakteryzowania defektów w cienkich warstwach heteroekspeksjalnych III-V/Si. Metoda ta daje podobne wyniki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej w widoku planowym, ale w znacznie krótszym czasie ze względu na brak wymaganego przygotowania próbki.

Obrazowanie kontrastowe z kanałem elektronowym do szybkiej charakterystyki heteroepitaksjalnej III-V

Opisujemy konfigurację linii badawczej przeznaczoną do przeprowadzania szybkiej dwuwymiarowej fluorescencji rentgenowskiej i mapowania mikrodyfrakcji rentgenowskiej próbek monokryształów lub proszków za pomocą dyfrakcji Laue (promieniowanie polichromatyczne) lub proszkowej (promieniowanie monochromatyczne). Wynikowe mapy dostarczają informacji o odkształceniu, orientacji, rozkładzie fazowym i odkształceniu plastycznym.

Synchrotronowe obrazowanie mikrodyfrakcji rentgenowskiej i fluorescencji próbek minerałów i skał

Ten artykuł szczegółowo opisuje protokół wytwarzania mikroprzepływowych chipów opracowanych do krystalizacji białek na chipie metodą dializy i eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej in situ. Proces mikroprodukcji umożliwia zintegrowanie półprzepuszczalnej membrany do dializy z regenerowanej celulozy z dowolnym odcięciem masy cząsteczkowej między dwiema warstwami chipa.

Krystalizacja białek na chipie za pomocą mikrodializy do badań dyfrakcji rentgenowskiej in situ

Opisano wszechstronne urządzenie mikroprzepływowe, które umożliwia krystalizację enzymu za pomocą metody przeciwdyfuzyjnej, wprowadzenie substratu do kryształów poprzez moczenie, oraz określenie struktury 3D kompleksu enzym:substrat poprzez seryjną analizę kryształów wewnątrz chipa w temperaturze pokojowej.

Krystalizacja i oznaczanie strukturalne kompleksu enzyma:substrat za pomocą krystalografii szeregowej w uniwersalnym chipie mikroprzepływowym

Protokół przedstawiony tutaj opisuje użycie Spotiton, nowatorskiego systemu robotycznego, do dostarczenia dwóch interesujących próbek na samozasłaniającą się, nanodrucianą siatkę, które mieszają się przez minimum 90 ms przed zeszkleniem w płynnym kriogenie.

Przygotowanie mikroskopowej siatki krioelektronowej do badań rozdzielczych w czasie przy użyciu nowatorskiego systemu robotycznego, Spotiton

Stosunek sygnału do szumu danych jest jednym z najważniejszych czynników przy wykonywaniu pomiarów dyfrakcji rentgenowskiej z mikrokryształów. Linia badawcza VMXm zapewnia środowisko o niskim poziomie hałasu i mikrowiązkę do takich eksperymentów. W tym miejscu opisano metody przygotowania próbek do montażu i chłodzenia mikrokryształów dla VMXm i innych linii badawczych do krystalografii makromolekularnej mikrofokusowej.

Rurociąg przygotowania próbek mikrokryształów na linii badawczej VMXm

Tutaj opisujemy procedury opracowane w naszym laboratorium do przygotowywania proszków z małych kryształów molekularnych do eksperymentów z dyfrakcją elektronów mikrokrystalicznych (MicroED).

Mikrokrystaliczna dyfrakcja elektronów małych cząsteczek

Tutaj opisujemy, jak korzystać z automatycznych procesów krystalografii makromolekularnej do analizy białko-struktura, szybkiej analizy kompleksu ligand-białko i badań przesiewowych fragmentów na dużą skalę w oparciu o technologię CrystalDirect w laboratorium HTX w EMBL Grenoble.

Zautomatyzowane rurociągi krystalograficzne w zakładzie EMBL HTX w Grenoble

Ten wkład opisuje, jak skonfigurować krystalizację białek na urządzeniach typu kryształ na krysztale oraz jak przeprowadzić automatyczne szeregowe zbieranie danych w temperaturze pokojowej za pomocą platformy krystalizacji na chipie.

Krystalizacja na chipie i dyfrakcja szeregowa na dużą skalę w temperaturze pokojowej

Tutaj opisane są protokoły przygotowania zestawów wirusów odpowiednich do analizy ciekłego EM i krio-EM w nanoskali przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Postęp w obrazowaniu w wysokiej rozdzielczości zespołów wirusów w cieczach i lodzie

Poznaj metodę wytwarzania mikroprzepływowych chipów do krystalizacji białek i zbierania danych dyfrakcyjnych rentgenowskich w temperaturze pokojowej. Technika minimalizuje uszkodzenia mechaniczne kryształów białkowych.

Chipy mikroprzepływowe do dyfrakcji rentgenowskiej kryształów in situ i dynamicznego rozpraszania światła in situ do krystalografii szeregowej (Wideo) | JoVE Journal

Chipy mikroprzepływowe do dyfrakcji rentgenowskiej kryształów in situ i dynamicznego rozpraszania światła in situ do krystalografii szeregowej

Przeglądaj więcej filmów