Pomiar endoreduplikacji za pomocą cytometrii przepływowej izolowanych protoplastów bulw

Ogólnym celem tego eksperymentu jest ocena poziomu endoreduplikacji w bulwach ziemniaka. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące morfologii bulw ziemniaka, takie jak etap rozwoju, w którym tkanki bulw poddawane są endoreduplikacji. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona znacznie wyraźniejsze wyniki w porównaniu z typowymi preparatami do cytometrii przepływowej.

Procedurę zademonstruje Parker Laimbeer. Doktorant z mojego laboratorium. Po przygotowaniu roztworów i zgodnie z protokołem tekstowym, bulwy ziemniaka należy wysterylizować powierzchniowo, zanurzając je w 71% etanolu na co najmniej pięć minut.

Usuń materiały roślinne z etanolu i pozostaw je do wyschnięcia na powietrzu. Przygotować i oznaczyć sterylne 50-mililitrowe stożkowe probówki dla każdej próbki i wlać do każdej z nich 15 mililitrów sterylizowanego z filtrem roztworu do inkubacji plazmolizy lub PIS. Używając wysterylizowanego skalpela lub korka, należy pobrać próbkę o długości około jednego centymetra sześciennego w celu wysterylizowania tkanki.

Użyj skalpela do sterylizacji, aby grubo posiekać tkankę na około trzy milimetrowe kawałki. I przenieś tkankę do stożkowej rurki zawierającej PIS. Następnie inkubuj tkankę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.

Aby wytworzyć protoplasty ziemniaka, zacznij od przygotowania i przefiltrowania odpowiedniej ilości roztworu enzymu lub ES z 0,71 molowym mannitolem, trzema milimolowymi chlorkami wapnia i jednym milimolowym fosforanem monopotasowym. Jeden milimolowy chlorek magnezu, 4% celulaza Onozuka R-10, 0,8% Macerozym R-10, 1% celulaza hemi i 10 milimolowy bufor MES, pH 5,8. Za pomocą pipety serologicznej odessać PIS z próbek w probówkach.

Dodaj 10 mililitrów ES do każdej próbki i odwróć probówki dwa do trzech razy. Następnie inkubować próbki w temperaturze 29% Celsjusza i 180 obr./min przez noc. Trzeciego dnia, aby zebrać i umyć protoplasty, wyjmij próbki z wytrząsarki i pozwól im osiąść przez około 10 minut.

Za pomocą pipety serologicznej odessać jak najwięcej roztworu ES, uważając, aby uniknąć strawionej tkanki. Następnie za pomocą mikropipety i trzymając probówkę pod kątem, ponownie usuń pozostały roztwór ES, omijając strawioną tkankę. Bardzo ważne jest, aby usunąć jak najwięcej roztworu do płukania protoplastów, aby uniknąć uszkodzenia jąder.

Trzymanie probówki pod kątem może pomóc w usunięciu roztworu przy jednoczesnym pozostawieniu protoplastów. Dodaj 15 mililitrów PWS do każdej próbki. I delikatnie odwróć rurkę dwa do trzech razy.

Pozwól protoplastom osiąść przez 10 minut. Następnie użyj pipety serologicznej, aby usunąć PWS. I mikropipeta do usuwania resztek płynu.

Trzymając próbki na lodzie, dodaj 1,5 mililitra lodowatego FCB do każdej probówki. Krótko wstrząsnąć lub zwirować każdą próbkę, aby rozbić zagregowaną tkankę. Ważne jest, aby rozbić grudki tkanki bulw, aby FCB mógł w pełni przeniknąć do komórek i uwolnić jądra.

Jeśli ma zostać dodana kontrolka, zaczynając od tego kroku, użyj żyletki, aby drobno posiekać mały liść w 1,5 mililitra lodowatego FCB. Próbki kontrolne powinny być tego samego rodzaju co próbki doświadczalne, najlepiej o tym samym genotypie. Włóż 1,5-mililitrową probówkę do mikrowirówki z odciętą końcówką i metalową siatką o grubości 106 mikrometrów stopioną do dna do dwumililitrowej mikroprobówki wirówkowej.

Następnie przepuść jeden mililitr zawiesiny tkankowej FCB przez filtr. Dodaj 250 mikrolitrów roztworu RNA do każdej próbki. Następnie odwróć probówki i inkubuj je przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Do każdej próbki dodać 125 mikrolitrów wcześniej przygotowanego roztworu jodku propidyny lub PI. Odwróć probówki i inkubuj je na lodzie przez 30 minut. Próbki należy zużywać tak szybko, jak to możliwe, a w ciągu dwóch godzin uniknąć degradacji.

Utwórz dwa wykresy punktowe, używając skali logarytmicznej rozproszenia do przodu w stosunku do rozrzutu bocznego i PI w stosunku do rozproszenia bocznego. Utwórz również histogram z liczbą PI na osi x. Skala logarytmiczna jest wymagana, aby upewnić się, że wszystkie zdarzenia mieszczą się w skali, ponieważ jądra mogą znacznie różnić się fluorescencją.

Załadować probówkę ze znaną próbką kontrolną, taką jak tkanka liścia z in vitro, z genotypu próbki. I dostosuj napięcie tak, aby wszystkie zdarzenia były na dużą skalę. Zwrócić uwagę na kanał piku 2C w próbce kontrolnej.

Piki 2C w próbkach doświadczalnych powinny przypadać w tym samym miejscu. Załaduj eksperymentalną próbkę bulw i ponownie upewnij się, że wszystkie zdarzenia są zgodne ze skalą. Jeśli wymagana jest regulacja, powtórz regulację napięcia próbki kontrolnej w celu zidentyfikowania kanału pików 2C.

Ręcznie zabramkować jądra protoplastów za pomocą wykresu rozproszenia bocznego w funkcji PI. Następnie ustaw histogram PI tak, aby pokazywał tylko region bramkowanych jąder protoplastów. Zbierz żądaną liczbę zdarzeń z każdej próbki.

Często badacze używają 10 000 zdarzeń bramkowanych do cytometrii przepływowej. Jednak w tym przypadku stosuje się 2000 zdarzeń dla próbek protoplastów bulw, aby pomieścić więcej próbek i próbek o niskich stężeniach. Wytwarzanie protoplastów jest niezbędne do uzyskania powtarzalnych wyników cytometrii przepływowej z bulw ziemniaka.

Których ogólna morfologia jest pokazana tutaj. Oddzielenie miąższu rdzeniowego od miąższu szpikowego zilustrowano czarnymi liniami. Pierścień naczyniowy, który oddziela miąższ od kory, jest oznaczony czarną strzałką.

Wyizolowane protoplasty powinny być kuliste i symetryczne z nienaruszoną błoną plazmatyczną. Zwróć uwagę na różnicę w wielkości między protoplastami liści i bulw, a także różnice w wielkości w tkance, które mogą wskazywać na różne poziomy endoreduplikacji. Na tym rysunku przedstawiono różnice w wynikach, które mogą wystąpić zarówno na wykresach punktowych cytometrii przepływowej, jak i na histogramach.

Nienaruszone jądra wykazują wyraźną separację między pikami w celu ilościowego określenia względnej obfitości komórek, podczas gdy próbki zintegrowane z pikami wykazują przesunięte szerokie i nakładające się na siebie zasady. Na odpowiednich wykresach punktowych czarne pola wskazują bramkowanie zdarzeń jądrowych dla histogramów, a grupowanie zdarzeń znajduje odzwierciedlenie w szerokości pików histogramu. Ten eksperyment analizujący poziomy endoreduplikacji lub EI potwierdza wcześniejsze wyniki, że tkanka rdzeniowa wykazuje wyższe EI niż tkanka kory

Co zaskakujące, profil tkanki miąższowej był podobny do kory mózgowej, a także istotnie różnił się od tkanki rdzeniowej. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o zachowaniu sterylności próbki przez pierwsze dwie inkubacje, a także o utrzymywaniu próbek na lodzie tak długo, jak to możliwe po lizie protoplastów. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak manipulacja genetyczna, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, jakie geny wpływają na poziom endoreduplikacji bulw.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ekstrahować protoplasty z bulw ziemniaka i przygotowywać je do cytometrii przepływowej w celu zbadania ich poziomu endoreduplikacji. Nie zapominaj, że praca z jodkiem propidyny może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak odpowiednie środki ochrony osobistej.