Adaptacja wychwytywania hybrydyzacji białek związanych z chromatyną do proteomiki komórek ssaków

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w naszym zrozumieniu regulacji genomu, takie jak to, w jaki sposób warianty sekwencji związane z chorobą w regionach niekodujących wpływają na ekspresję i regulację genów poprzez zmianę wiązania białek, a także może pomóc w identyfikacji tych białek. Główną zaletą tej techniki jest to, że nie wymaga ona żadnej manipulacji genetycznej komórkami lub tkankami, ani przeciwciał, ani żadnej wcześniejszej wiedzy na temat białek wiążących DNA, które mogą wchodzić w interakcje z DNA w tym locus. Tę procedurę zademonstruje Danu Perumalla, technik z mojego laboratorium.

Po zaprojektowaniu oligonukleotydów zgodnie z protokołem tekstowym, płytkę od 2 do 5 razy 10 do 5 komórek limfoblastoidalnych lub innych linii komórkowych w kolbie T25 z 6 mililitrami pożywki RPMI 1640, uzupełnionej 1% paciorkowcem Pen, 2 mil lub więcej L-glutaminy i 5% FBS. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Użyj hemocytometru lub automatycznego licznika komórek, aby zmierzyć gęstość komórek.

Zanim komórki osiągną 1 razy 10 do 6 komórek na mililitr, wiruj je z prędkością 100 razy G przez pięć minut i przenieś do kolby T75 z 25 mililitrami pożywki RPMI 1640 przygotowanej wcześniej w tym filmie. Hoduj komórki, aż osiągną gęstość komórek 1 razy 10 do 6 komórek na mililitr, a następnie przenieś komórki do kolby T150 w 38 mililitrach tego samego podłoża i hoduj je przez dodatkowe dwa dni. Następnie odwiruj ogniwa z prędkością 100 razy G przez pięć minut i ponownie zawieś je w 10 mililitrach pożywki RPMI 1640.

Następnie wlej zawiesinę do butelki rolkowej o powierzchni 1850 centymetrów kwadratowych zawierającej 500 mililitrów pożywki i inkubuj komórki w tych samych warunkach, co poprzednio, z wyjątkiem stałego obrotu. Po osiągnięciu pożądanej liczby komórek odwiruj hodowlę w temperaturze 100 razy G przez pięć minut i ponownie zawieś komórki w 36 mililitrach pożywki RPMI 1640. Następnie przenieś zawiesinę komórkową do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów i usuń małe porcje do zliczania komórek i ekstrakcji DNA.

Aby usieciować komórki, dodaj 1 mililitr 37% formaldehydu, aby osiągnąć końcowe stężenie 1%, Następnie inkubuj komórki z prędkością od 10 do 30 obr./min w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Ugasić reakcję sieciowania, dodając 2 mililitry 2,5-molowego roztworu glicyny, aby uzyskać końcowe stężenie 125 milimolów. Następnie inkubuj komórki z rotacją przez pięć minut.

Po granulowaniu komórek przez odwirowanie, użyj lodowatego 1X PBS, aby dwukrotnie umyć komórki. Kontynuuj lizę i rozdrabnianie komórek lub ponownie zawieś osad w 5 mililitrach bufora do lizy komórek i zamroź zawiesinę kropla po kropli w ciekłym azocie. Następnie przechowuj próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Aby przeprowadzić lizę i sheering, ponownie zawieś osad w 20 mililitrach buforu do lizy komórek. Odwirować komórki w temperaturze 400 razy G, w 4 stopniach Celsjusza przez pięć minut. Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś komórki w 6 mililitrach buforu do lizy jąder z inhibitorami proteazy.

Przygotowując się do sonikacji, podziel próbkę równomiernie na sześć do ośmiu probówek Microfuge. Umieść próbki na lodzie lub zimnym stojaku i użyj sonikatora z mikrokońcówką, aby poddać je sonikacji przy amplitudzie 65% z pięcioma stałymi seriami po 20 sekund, pozwalając zawiesinie ostygnąć przez co najmniej 40 sekund między impulsami. Odwirować komórki w temperaturze 12 000 razy G i 4 stopnie Celsjusza przez 10 minut, a następnie przenieść supernatant do nowej probówki i wyrzucić granulki.

Po oszacowaniu całkowitego odzysku za pomocą fluorometrii, należy zamknąć próbki. Po przygotowaniu hybrydyzacyjnych i płuczących zgodnie z protokołem tekstowym, należy użyć 1 200 mikrolitrów buforu hybrydyzacyjnego 1X, aby trzykrotnie przepłukać 600 mikrolitrów kulek. Następnie użyj 1 200 mikrolitrów buforu hybrydyzacyjnego 2X, aby ponownie zawiesić kulki.

W 1,5-mililitrowych mikroprobówkach wirówkowych dodaj 600 mikrolitrów próbki, 120 mikrolitrów umytych kulek zawieszonych w buforze hybrydyzacyjnym 2X i 480 mikrolitrów buforu hybrydyzacyjnego 2X. Inkubować probówki w temperaturze 31 stopni Celsjusza i od 30 do 60 obr./min przez 10 minut. Następnie umieść probówki na magnesie, aż kulki zostaną unieruchomione, i przenieś próbki do nowych probówek przed wyrzuceniem koralików.

Zawiesić wychwytywane oligonukleotydy do roztworu roboczego o stężeniu 10 pikomoli na mikrolitr i dodać 4 mikrolitry tego roztworu do każdej probówki. Inkubować probówki w temperaturze 42 stopni Celsjusza od 30 do 60 obr./min przez 40 minut. Podczas inkubacji odłóż potrzebne koraliki, umyj je trzy razy jak poprzednio, ale tym razem użyj bufora hybrydyzacyjnego 1X, aby je ponownie zawiesić.

Dodaj umyte kulki do probówek i inkubuj próbki z prędkością od 30 do 60 obr./min w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Umieść rurki na magnesie i usuń supernatant po unieruchomieniu kulek. Po umyciu kulek wymyj próbkę, dodając 40 mikrolitrów wody molekularnej i inkubuj probówki w temperaturze 94 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Umieść probówki na magnesie i odczekaj kilka minut, aż roztwór się klaruje, a następnie przenieś supernatant do nowej probówki i wyrzuć kulki. Przechowuj próbkę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza lub przystąp do analizy proteomicznej zgodnie z protokołem tekstowym. Aby ocenić wydajność wychwytywania, użyj wody molekularnej do rozcieńczenia podwielokrotności eluatu, od jednego do dziesięciu.

Po wyekstrahowaniu DNA z podwielokrotności pobranej wcześniej w filmie, użyj próbki DNA i wody molekularnej, aby przygotować krzywą wzorcową z pięcioma szeregowymi rozcieńczeniami od jednego do dziesięciu. Przygotować główną mieszankę qPCR, dodając startery i sondy, a następnie dozować odpowiednią ilość do każdego dołka reakcji. Do każdej studzienki dodaj 5 mikrolitrów rozcieńczonej próbki, krzywej wzorcowej lub wody o jakości cząsteczkowej, aby nie służyły jako kontrola szablonu.

Uszczelnij płytkę i obracaj ją 100 razy G przez jedną minutę. Następnie uruchom próbki w systemie qPCR, korzystając z parametrów znalezionych w protokole tekstowym. Na koniec użyj krzywej standardowej do oceny plonów i zaszyfrowanego przechwytywania, aby ocenić specyficzność chwytania.

Pokazano tutaj wychwyty hybrydyzacji przy użyciu miareczkowania oligonukleotydów. Liczba oligonukleotydów jest stopniowo zwiększana, przy czym całkowite stężenie jest utrzymywane na stałym poziomie. Eksperyment ten pomaga określić, ile różnych oligonukleotydów jest potrzebnych do osiągnięcia optymalnej wydajności hybrydyzacji.

Ujawnia również wszelkie oczywiste szkodliwe interakcje hybrydyzacyjne między określonym zestawem oligonukleotydów oraz jeśli istnieją jakieś oligonukleotydy o słabej specyficzności, co skutkuje wysokim tłem. Duża część fragmentów usieciowanej chromatyny nie będzie podatna na wychwycenie hybrydyzacji. Jeśli wychwyt hybrydyzacji zakończy się sukcesem, kolejny eksperyment wychwytywania tego samego materiału chromatyny, przy użyciu innego zestawu oligonukleotydów wychwytu, da porównywalne plony, jak w przypadku użycia świeżej chromatyny.

Jednak w drugim eksperymencie wychwytywania z użyciem oryginalnych oligonukleotydów i resztek chromatyny z pierwszego eksperymentu, wydajność zmniejszy się o około 90%, jeśli większość materiału podatnego na hybrydyzację została wychwycona w pierwszym eksperymencie. Rysunek ten przedstawia wychwytywanie hybrydyzacji różnych docelowych regionów chromosomów, przy czym każdy region służy jako kontrola negatywna dla drugiego. Zakodowana sekwencja służy również jako prawdziwa kontrola negatywna.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując tej procedury, należy pamiętać, aby najpierw przetestować wychwytywane oligonukleotydy, aby upewnić się, że pożądany region jest podatny na wychwytywanie hybrydyzacji. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak immunoprecypitacja chromatyny, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak miejsce w genomie, w którym wiążą się zidentyfikowane białka oddziałujące z DNA.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać HyCCAPP w celu wzbogacenia interesujących regionów genomowych w celu identyfikacji de novo lokalnych interakcji białkowych.