Name: Określanie, czy DNA barwione barwnikiem cyjaninowym może być trawione za pomocą enzymów restrykcyjnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: Poznaj metodę trawienia fluorescencyjnie znakowanego DNA enzymami restrykcyjnymi wrażliwymi i niewrażliwymi na metylację. Technika ta pozwala ocenić integralność DNA po zakończeniu eksperymentów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

To badanie zostało sfinansowane przez National Institute for General Medical Science (NIGMS) (5605100122001), składnik National Institutes of Health (NIH), a także University of Nebraska at Kearney (UNK) Summer Student Research Program (SSRP) oraz UNK Undergraduate Research Fellowship (URF).

1. Przygotowanie barwników, i żelu agarozowego
<ol>
	<li>Przygotuj następujące roztwory do barwienia DNA lub trawienia barwionego DNA.
	<ol>
		<li>Przygotuj 1x TE (Tris-HCl i kwas etylenodiaminotetraoctowy; EDTA) buforu przy użyciu 10 mM Tris-HCl i 1 mM EDTA w cylindrze miarowym lub kolbie miarowej. Przechowywać w temperaturze pokojowej (18 - 25 °C).</li>
		<li>Wykonaj porcje każdego barwnika: TOTO-1, YOYO-1, POPO-1, BOBO-1, TOTO-3, YOYO-3, POPO-3, BOBO-3 (Tabela 1). Odpipetować 4 μl 1 mM barwnika do ciemnobursztynowej lub czarnej probówki o pojemności 1,5 ml i dodać 36 μl 1x TE, wymieszać za pomocą pipety; Stężenie to daje 100 μM roztworu barwnika (łącznie 40 μL). Wykonaj ten krok dla każdego barwnika. Przechowywać w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Unikaj wystawiania barwnika na działanie światła, aby zapobiec fotowybielaniu lub degradacji barwnika.</li>
		<li>Przygotować bufor 1 przy użyciu 10 mM bis-tris-propanu-HCl, 10 mM MgCl2 i 100 μg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Przygotować bufor 2 przy użyciu 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2 i 100 μg/ml BSA. Przygotować bufor 3 przy użyciu 50 mM octanu potasu, 20 mM octanu tris, 10 mM octanu magnezu i 100 μg/ml BSA. Każdy enzym będzie wymagał do działania jednego z tych specyficznych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj następujące roztwory do elektroforezy żelowej.
	<ol>
		<li>Zrób 6-krotnie obciążający barwnik, łącząc 0,25% błękitu bromofenolowego, 0,25% cyjanolu ksylenowego, 15% Ficollu w dH2O. Przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Aby przygotować 0,7% żel agarozowy, odważyć 0,07 g agarozy o wysokiej temperaturze żelowania (HGT) w kolbie Erlenmeyera, dodać 100 ml buforu 1x TAE i umieścić odwróconą zlewkę na wierzchu kolby.
		<ol>
			<li>Podgrzej roztwór na gorącej płycie, aż na dnie kolby zaczną tworzyć się bąbelki i unoszą się do góry.</li>
			<li>Wyjmij roztwór z płyty grzejnej, pozwól roztworowi ostygnąć, aż kolbę będzie można dotknąć gołą ręką, a następnie wlej żel do żelowej formy o wymiarach 24,5 cm x 21,8 cm za pomocą grzebienia żelowego, aby utworzyć dołki.</li>
			<li>Usuń bąbelki w pobliżu grzebienia lub na powierzchni żelu, przebijając je końcówką pipety i pozwól żelowi zestalić się przez co najmniej 15 minut. Można go przechowywać w lodówce (4 °C) zawinięty w folię spożywczą przez 1 tydzień, aby zapobiec wysuszeniu żelu lub zanieczyszczeniu. Aby uzyskać więcej informacji na temat uruchamiania żelu, zapoznaj się z Lee i wsp.33. 
			UWAGA: Użyj grzebienia żelowego z 30 pojedynczymi dołkami. Każda studzienka powinna mieć 4,5 mm szerokości i głębokość 2 mm. Wysokość studni będzie zależeć od ilości żelu wlanego do pudełka.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotować 1x bufor TAE (Tris - octan - EDTA) używając 40 mM Tris-HCl, 20 mM kwasu octowego i 1 mM EDTA. Przechowywać w temperaturze pokojowej (18 - 25 °C).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie barwionego DNA
<ol>
	<li>Wybarwić lambda DNA (300-800 ng) przy użyciu różnych podwielokrotności barwników. Każdy barwnik (Tabela 1) będzie miał sześć różnych stężeń, które będą testowane, co daje łącznie 48 reakcji na enzym restrykcyjny. Poniższy proces przedstawia konfigurację dla 1 reakcji (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć lambda DNA za pomocą 1x TE do 100 ng/μL. Przechowywać w temperaturze 4 °C. Przygotować roztwór o całkowitej objętości 300 μL.</li>
		<li>Barwienie niemetylowanego DNA lambda. Dla każdego pasma oczekiwanego na podstawie przeglądu należy oszacować 75 - 100 ng/pasmo. Dodaj odpowiednie ilości barwnika, aby uzyskać stężenia 1,9 μM, 3,8 μM, 19,4 μM, 32,2 μM, 48,3 μM, 63,5 μM / 100 ng DNA.</li>
		<li>Inkubować przez noc (15 h - 18 h) w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Pozostaw jedną reakcję niezabarwioną, aby działała jako kontrola25. 
		UWAGA: Użyj niemetylowanego DNA do reakcji trawienia. Enzymy wrażliwe na metylację nie mogą przecinać metylowanych regionów w DNA i sprawiają wrażenie niepełnego trawienia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie testu enzymu restrykcyjnego
<ol>
	<li>Trawić barwione DNA za pomocą enzymu restrykcyjnego, aby określić, czy ten enzym może trawić wstępnie wybarwione DNA (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1).
	<ol>
		<li>Następnego dnia dodać 20 j. enzymu restrykcyjnego, 3 μl odpowiedniego buforu (Tabela 2) oraz destylowaną, autoklawowaną i filtrowaną wodę, co daje w sumie 30 μl. Do każdej reakcji enzymatycznej należy dobrać bufor o najwyższej wydajności cięcia, który można znaleźć na stronie producenta.</li>
		<li>Umieść reakcje w łaźni wodnej w temperaturze optymalnej aktywności enzymatycznej, podanej w Tabeli 2 dla 6 enzymów użytych w Maschmann i wsp., przez 2 - 4 godziny (Tabela 2)25.</li>
		<li>Zatrzymaj reakcję, dodając 2 μL 0,5 M EDTA pH 8,0.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Elektroelucja barwionego DNA w żelu agarozowym
<ol>
	<li>Zdejmij boki z formy żelowej o wymiarach 24,5 cm x 21,8 cm (krok 1.2.2) i umieść żel w pudełku do elektroforezy żelowej. Wlej 2,5 L 1x bufor TAE do pudełka. Ostrożnie wyjmij grzebień żelowy z żelu, aby dołki były dostępne33.</li>
	<li>Pipetować reakcje enzymu restrykcyjnego na folię z tworzywa sztucznego i połączyć każdą reakcję z 6-krotnym barwnikiem ładującym. Do każdego roztworu reakcyjnego dodać 1 μl 6x barwnika ładującego na 5 - 6 μl roztworu DNA (1x). Następnie pipetować reakcje (zawierające barwnik ładujący <18 μl) do studzienek.</li>
	<li>Wymieszaj 1 μl z 1 kb drabiny, 9 μl 1x TE i 2 μl 6x barwnika ładującego. Załaduj roztwór do studzienek, które otaczają inne roztwory.</li>
	<li>Przykryj pudełko żelowe ciemnoniebieskim lub czarnym papierem lub tkaniną. Podłącz pojemnik na żel do zasilania, ustaw zasilanie na 30 V i uruchom go na noc (15 - 20 godzin). Wyłącz światła, gdy żel jest uruchomiony, aby zapobiec fotorozszczepieniu znakowanego DNA.</li>
	<li>Następnego ranka wyłącz zasilanie. Wyjmij żel za pomocą tacki i przenieś go do pojemnika z 45 μl bromku etydyny i 1 litrem 1x buforu TAE. Przechowuj pojemnik w temperaturze pokojowej w ciemności lub przykryj folią, aby zapobiec ekspozycji na światło. Pozostaw żel na co najmniej 45 minut w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Bromek etydyny należy stosować w rękawiczkach i okularach ochronnych. Podczas czyszczenia pojemnika zawierającego roztwór bromku etydyny i wyrzucania żelu należy zapoznać się z wytycznymi dotyczącymi utylizacji w poszczególnych stanach, aby ustalić, jak postępować ze zużytym bromkiem etydyny; Dodatkowo zamiast bromku etydyny można zastosować inne barwniki.</li>
</ol>
5. Obrazowanie żelu agarozowego
<ol>
	<li>Umieść żel na transiluminatorze światła niebieskiego, który emituje maksymalny strumień świetlny w zakresie 400-500 nm. Rób zdjęcia aparatem podłączonym do stacji. 
	UWAGA: Upewnij się, że używasz osłony iluminatora i załóż okulary ochronne przed włączeniem źródła światła. 
	UWAGA: Ten krok można również wykonać przy użyciu dowolnego źródła światła UV lub standardowego skanera żelowego.</li>
	<li>Wyświetl zdjęcia w ImageJ, przeciągając plik na pasek stanu ImageJ, a obraz zostanie wyświetlony.</li>
	<li>Określ szybkość trawienia dla eksperymentu, porównując prążki na żelu z oczekiwanym wzorem żelu in silico. Aby określić szybkość trawienia, liczbę prążków eksperymentalnych dzieli się przez oczekiwaną liczbę prążków DNA24,25. Jeśli eksperymentalny wzór prążka strawionego DNA ma oczekiwany wzór, szybkość trawienia wynosi 1. Jeśli wzorzec ma więcej fragmentów niż oczekiwano, szybkość trawienia jest większa niż 1. Jeśli wzór ma mniej fragmentów niż oczekiwano, szybkość trawienia jest mniejsza niż jeden.</li>
</ol>

<ol><li>Teague, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+human+genome+structure+by+single-molecule+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">High-resolution human genome structure by single-molecule analysis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24), 10848-10853 (2010).</li>
<li>Ananiev, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+mapping+discerns+genome+wide+DNA+methylation+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles.</a> BMC Mol Biol. 9, 68(2008).</li>
<li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+rice+genome+sequence+by+optical+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Validation of rice genome sequence by optical mapping.</a> BMC Genomics. 8, 278(2007).</li>
<li>Reslewic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+shotgun+optical+mapping+of+Rhodospirillum+rubrum%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Whole-genome shotgun optical mapping of Rhodospirillum rubrum.</a> Appl Environ Microbiol. 71 (9), 5511-5522 (2005).</li>
<li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+shotgun+optical+mapping+of+Rhodobacter+sphaeroides+strain+2.4.1+and+its+use+for+whole-genome+shotgun+sequence+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Whole-genome shotgun optical mapping of Rhodobacter sphaeroides strain 2.4.1 and its use for whole-genome shotgun sequence assembly.</a> Genome Res. 13 (9), 2142-2151 (2003).</li>
<li>Gupta, A., Kounovsky-Shafer, K. L., Ravindran, P., Schwartz, D. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s10404-015-1685-y">Optical mapping and nanocoding approaches to whole-genome analysis.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 20 (44), 1-14 (2016).</li>
<li>Kounovsky-Shafer, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presentation+of+large+DNA+molecules+for+analysis+as+nanoconfined+dumbbells%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Presentation of large DNA molecules for analysis as nanoconfined dumbbells.</a> Macromolecules. 46 (20), 8356-8368 (2013).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanochannel+confinement%3A+DNA+stretch+approaching+full+contour+length%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length.</a> Lab Chip. 11 (10), 1721-1729 (2011).</li>
<li>Yu, H., Jo, K., Kounovsky, K. L., de Pablo, J. J., Schwartz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+propulsion%3A+chemical+sensing+and+chemotaxis+of+DNA+driven+by+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Molecular propulsion: chemical sensing and chemotaxis of DNA driven by RNA polymerase.</a> J Am Chem Soc. 131 (16), 5722-5723 (2009).</li>
<li>Lam, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+mapping+on+nanochannel+arrays+for+structural+variation+analysis+and+sequence+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genome mapping on nanochannel arrays for structural variation analysis and sequence assembly.</a> Nat Biotechnol. 30 (8), 771-776 (2012).</li>
<li>Cao, H., Tegenfeldt, J. O., Austin, R. H., Chou, S. Y. <a target="_blank" href="https://austingroup.princeton.edu/publications/gradient-nanostructures-interfacing-microfluidics-and-nanofluidics">Gradient nanostructures for interfacing microfluidics and nanofluidics.</a> Applied Physics Letters. 81 (16), 3058-3060 (2002).</li>
<li>Gupta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+reveals+widespread+structural+variation+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis reveals widespread structural variation in multiple myeloma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (25), 7689-7694 (2015).</li>
<li>Wu, C. W., Schramm, T. M., Zhou, S., Schwartz, D. C., Talaat, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+mapping+of+the+Mycobacterium+avium+subspecies+paratuberculosis+genome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Optical mapping of the Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis genome.</a> BMC Genomics. 10, 25(2009).</li>
<li>Jo, K., Schramm, T. M., Schwartz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-molecule+barcoding+system+using+nanoslits+for+DNA+analysis+%3A+nanocoding%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A single-molecule barcoding system using nanoslits for DNA analysis : nanocoding.</a> Methods Mol Biol. 544, 29-42 (2009).</li>
<li>Jo, K., Chen, Y. L., de Pablo, J. J., Schwartz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elongation+and+migration+of+single+DNA+molecules+in+microchannels+using+oscillatory+shear+flows%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Elongation and migration of single DNA molecules in microchannels using oscillatory shear flows.</a> Lab Chip. 9 (16), 2348-2355 (2009).</li>
<li>Jo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-molecule+barcoding+system+using+nanoslits+for+DNA+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A single-molecule barcoding system using nanoslits for DNA analysis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (8), 2673-2678 (2007).</li>
<li>Reccius, C. H., Mannion, J. T., Cross, J. D., Craighead, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compression+and+free+expansion+of+single+DNA+molecules+in+nanochannels%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Compression and free expansion of single DNA molecules in nanochannels.</a> Phys Rev Lett. 95 (26), 268101(2005).</li>
<li>Staerk, D., Hamed, A. A., Pedersen, E. B., Jacobsen, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisintercalation+of+homodimeric+thiazole+orange+dyes+in+DNA%3A+effect+of+modifying+the+linker%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Bisintercalation of homodimeric thiazole orange dyes in DNA: effect of modifying the linker.</a> Bioconjug Chem. 8 (6), 869-877 (1997).</li>
<li>Spielmann, H. P., Wemmer, D. E., Jacobsen, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+structure+of+a+DNA+complex+with+the+fluorescent+bis-intercalator+TOTO+determined+by+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Solution structure of a DNA complex with the fluorescent bis-intercalator TOTO determined by NMR spectroscopy.</a> Biochemistry. 34, 8542-8553 (1995).</li>
<li>Carlsson, C., Jonsson, M., Akerman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+bands+in+DNA+gel+electrophoresis+caused+by+bis-intercalating+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes.</a> Nucleic Acids Res. 23 (13), 2413-2420 (1995).</li>
<li>Kundukad, B., Yan, J., Doyle, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+YOYO-1+on+the+mechanical+properties+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Effect of YOYO-1 on the mechanical properties of DNA.</a> Soft Matter. 10 (48), 9721-9728 (2014).</li>
<li>Technologies, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTechnologies%2C+L+%22The+Molecular+Probes+Handbook%3A+A+guide+to+Fluorescent+Probes+and+Labeling+Technologies%22">The Molecular Probes Handbook: A guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies</a>. , 11th, (2010).</li>
<li>Riehn, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restriction+mapping+in+nanofluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Restriction mapping in nanofluidic devices.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (29), 10012-10016 (2005).</li>
<li>Meng, X., Cai, W., Schwartz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+restriction+endonuclease+activity+by+DNA+binding+fluorochromes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Struct+Dyn%22%5BJournal%5D)">Inhibition of restriction endonuclease activity by DNA binding fluorochromes.</a> J Biomol Struct Dyn. 13 (6), 945-951 (1996).</li>
<li>Maschmann, A., Kounovsky-Shafer, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+restriction+enzyme+activity+when+cutting+DNA+labeled+with+the+TOTO+Dye+family%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleosides+Nucleotides+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Determination of restriction enzyme activity when cutting DNA labeled with the TOTO Dye family.</a> Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. , 1-12 (2017).</li>
<li>Biebricker, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+DNA+intercalators+on+DNA+and+DNA-processing+enzymes+elucidated+through+force-dependent+binding+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The impact of DNA intercalators on DNA and DNA-processing enzymes elucidated through force-dependent binding kinetics.</a> Nature Communications. 6, 7304(2015).</li>
<li>Gunther, K., Mertig, M., Seidel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+and+structural+properties+of+YOYO-1+complexed+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanical and structural properties of YOYO-1 complexed DNA.</a> Nucleic Acids Res. 38 (19), 6526-6532 (2010).</li>
<li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clone-free%2C+single+molecule+map+of+the+domestic+cow+%28Bos+taurus%29+genome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A clone-free, single molecule map of the domestic cow (Bos taurus) genome.</a> BMC Genomics. 16, 644(2015).</li>
<li>Ray, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+structural+alterations+in+solid+tumor+oligodendroglioma+by+single+molecule+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Discovery of structural alterations in solid tumor oligodendroglioma by single molecule analysis.</a> BMC Genomics. 14, 505(2013).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+of+the+model+medicinal+mushroom+Ganoderma+lucidum%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Genome sequence of the model medicinal mushroom Ganoderma lucidum.</a> Nat Commun. 3, 913(2012).</li>
<li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+molecule+scaffold+for+the+maize+genome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">A single molecule scaffold for the maize genome.</a> PLoS Genet. 5 (11), e1000711(2009).</li>
<li>Sischka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+and+kinetics+between+DNA+and+DNA+binding+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms and kinetics between DNA and DNA binding ligands.</a> Biophys J. 88 (1), 404-411 (2005).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li>
<li>Zipper, H., Brunner, H., Bernhagen, J., Vitzthum, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigations+on+DNA+intercalation+and+surface+binding+by+SYBR+Green+I%2C+its+structure+determination+and+methodological+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications.</a> Nucleic Acids Res. 32 (12), e103(2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W celu strawienia znakowanego fluorescencyjnie DNA (ryc. 1) wymagany jest szereg kroków. Po pierwsze, DNA jest barwione fluorochromem przez noc. DNA można inkubować z dimerami cyjaniny przez krótszy okres czasu; jednak Carlsson i in. odkryli, że DNA tworzy podwójne prążki dla każdego rozmiaru DNA z powodu niepełnego barwienia20. Aby temu zaradzić, DNA można zabarwić przez noc, aby zapobiec występowaniu podwójnych prążków. Jest to kluczowy kro...

Seria TOTO (TOTO-1, YOYO-1, POPO-1, BOBO-1, TOTO-3, YOYO-3, POPO-3 i BOBO-3; Tabela 1) jest wykorzystywany w wielu różnych eksperymentach, w których wymagana jest wizualizacja DNA1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. Rodzina dimerów cyjaniny jest szeroko stosowana ze względu na ich wydajność kwantową, czułość i wysokie powinowactwo do cząsteczek DNA18,19,20. Barwniki dimerowe cyjaniny mają dużą selektywność dla dwuniciowego DNA, a po interkalacji mają od 100 do 1000 razy większy wzrost fluorescencji21. Barwniki pirydynowe (YOYO-1, TOTO-1, YOYO-3 i TOTO-3) mają krótszą długość fali emisji niż ich odpowiedniki barwnika chinoliowego (BOBO-1, POPO-1, BOBO-3 i POPO-3) (Tabela 1)22. Również wydajność kwantowa dla dimerów cyjaniny interkalowanych do DNA jest wysoka (0,2 - 0,6)22. Jednak użycie enzymu do określenia profilu metylacji cząsteczki DNA2 lub stretch23 cząsteczki DNA już wybarwionej barwnikiem fluorescencyjnym wymaga metody określenia, jakie enzymy będą trawić wybarwione DNA. Do tej metody można użyć dowolnego rodzaju barwnika, który interkaluje się z DNA lub dowolnego enzymu, który daje dostrzegalny wzór substratu DNA.
Meng et al. najpierw określili szybkość trawienia wstępnie wybarwionego DNA za pomocą elektroforezy żelowej przy użyciu różnych barwników24. Maschmann i in. zagłębili się głębiej, aby przyjrzeć się rodzinie barwników TOTO. Obaj określili szybkość trawienia barwionego DNA, aby sprawdzić, czy DNA barwione danym barwnikiem może być trawione za pomocą enzymu restrykcyjnego25. Inne metody badają efekty wiązania barwników interkalowanych z DNA za pomocą pęsety optycznej26 lub NMR27. Każda metoda wymaga specjalistycznego sprzętu; Natomiast metoda ta pozwala na użycie sprzętu, którym dysponuje większość laboratoriów biologii molekularnej, aby określić, czy barwnik zakłóca trawienie enzymu restrykcyjnego.
Dodatkowo, w innych metodach pomiaru długości danej cząsteczki, mapowanie optyczne polega na wydłużeniu niebarwionych cząsteczek DNA na powierzchni i strawieniu DNA w celu określenia rozciągliwości i rozmiaru fragmentów. Wykazano, że interkalacja barwnika zwiększa długość konturu fluorescencyjnie barwionych cząsteczek DNA i w zależności od użytego barwnika długości konturów są różne21. Ta metoda została wykorzystana w różnych genomach1,3,4,6,13,28,29,30,31. Jeśli jednak cząsteczki zostały wstępnie wybarwione, w zależności od barwnika i enzymu, enzym może nie być w stanie przeciąć DNA zabarwionego danym barwnikiem. Dlatego metoda ta określa, czy DNA wybarwione danym barwnikiem może zostać strawione przez enzym. Dodatkowo, w zależności od stężenia barwnika i użytego barwnika, ruchliwość prążków DNA w żelu będzie migrować wolniej niż natywne DNA ze względu na częściowe odwijanie szkieletu DNA, aby zrobić miejsce na wstawienie barwnika między parami zasad32.
Czasami jednak te barwniki mogą częściowo lub całkowicie hamować działanie niektórych enzymów restrykcyjnych7,24. Uważa się, że jest to spowodowane zmianą strukturalną w DNA spowodowaną przyłączeniem barwnika fluorescencyjnego, co może uniemożliwić enzymowi rozpoznanie jego specyficznej sekwencji. Zrozumienie, w jaki sposób te barwniki wpływają na enzymy restrykcyjne, może pomóc w eksperymentach, w których wymagany jest profil metylacji lub rozciągnięcie barwionego DNA.
W naszej metodzie, DNA zostało zabarwione interesującym fluorochromem i strawione enzymem restrykcyjnym. Następnie DNA poddano elektroforezie na żelu, zobrazowano i zmierzono szybkość trawienia enzymu restrykcyjnego. Enzymy restrykcyjne zostały wybrane na podstawie wzoru cięcia na żelu. Zbyt wiele prążków powodowało nakładanie się prążków DNA, a zbyt mało prążków nie dawało pełnego obrazu cząsteczki DNA. Istnieje złoty środek, w którym można określić profil strawionej cząsteczki DNA; w związku z tym będzie to zależeć od użytego DNA i enzymu. Zaletą tej metody jest jej prostota; Wymaga jedynie sprzętu używanego w trawieniu restrykcyjnym i elektroforezie żelowej.

<table><tbody><tr><td>Niemetylowane lambda DNA</td><td>NEB</td><td>N3013S</td><td></td></tr><tr><td>YOYO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Y3601</td><td></td></tr><tr><td>TOTO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T3600</td><td></td></tr><tr><td>POPO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3580</td><td></td></tr><tr><td>BOBO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>B3582</td><td></td></tr><tr><td>YOYO-3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Y3606</td><td></td></tr><tr><td>TOTO-3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T3604</td><td></td></tr><tr><td>POPO-3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3584</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>PmlI</td><td>NEB</td><td>R0532S</td><td></td></tr><tr><td>ScaI</td><td>NEB</td><td>R3122S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI&nbsp;</td><td>NEB</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>NEB</td><td>R0104S</td><td></td></tr><tr><td>SmaI</td><td>NEB</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher</td><td>BP152-1</td><td>Drażniący</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>S316-212</td><td>Toksyczny</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher</td><td>S25358</td> Bufor <td>i drażniący</td></tr><tr><td>1</td><td>NEB</td><td>B7201S</td><td>NEB 1.1</td></tr><tr><td>Bufor 2</td><td>NEB</td><td>B7202S</td><td>NEB 2.1</td></tr><tr><td>Bufor 3</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td>NEB Cutsmart</td></tr><tr><td>Żel agarozowy o wysokiej temperaturze żelowania</td><td>Lonza</td><td>50041</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Fisher</td><td>S25118</td><td>Niebezpieczny</td></tr><tr><td>transiluminator światła niebieskiego</td><td>Ciemny czytnik</td><td>DR196</td><td>Nosić odpowiednie okulary&nbsp;</td></tr><tr><td>Bromek etydyny</td><td>Fisher</td><td>15585011</td><td>rakotwórczy; inne alternatywy to Nancy 520, Gel red itp.</td></tr><tr><td>Aparat Cannon EOS Rebel T3I</td><td>Cannon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Apogee Model H4</td><td>Biorad</td><td>1704510</td><td></td></tr><tr><td>Power Pac Basic Power Supply</td><td>Biorad</td><td>1645050&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP525-25</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenol niebieski</td><td>Fisher Scientific</td><td>B-392</td><td></td></tr><tr><td>Ksylen Cyanol</td><td>Eastmen</td><td>T1579</td><td></td></tr></tbody></table>

określanie, czy dna barwione barwnikiem cyjaninowym może być trawione za pomocą enzymów restrykcyjnych

Determining if DNA Stained with a Cyanine Dye Can Be Digested with Restriction Enzymes

Wizualizacja DNA do mikroskopii fluorescencyjnej wykorzystuje różne barwniki, takie jak barwniki cyjaninowe. Barwniki te są wykorzystywane ze względu na ich wysokie powinowactwo i wrażliwość na DNA. W celu określenia, czy cząsteczki DNA są pełnej długości po zakończeniu eksperymentu, wymagana jest metoda określająca, czy wybarwione cząsteczki są pełnej długości poprzez trawienie DNA za pomocą enzymów restrykcyjnych. Jednak barwione DNA może hamować enzymy, więc potrzebna jest metoda, aby określić, jakich enzymów można użyć do DNA barwionego fluorochromem. W tej metodzie DNA jest barwione barwnikiem cyjaninowym przez noc, aby umożliwić zrównoważenie barwnika i DNA. Następnie wybarwione DNA jest trawione enzymem restrykcyjnym, ładowane do żelu i poddawane elektroforezie. Eksperymentalne prążki trawienia DNA są porównywane z trawieniem in silico w celu określenia aktywności enzymu restrykcyjnego. Jeśli liczba pasm jest taka sama, jak oczekiwano, reakcja jest zakończona. Więcej prążków niż oczekiwano wskazuje na częściowe trawienie, a mniej prążków wskazuje na niepełne trawienie. Zaletą tej metody jest jej prostota i wykorzystanie sprzętu, który byłby potrzebny naukowcowi do testu enzymu restrykcyjnego i elektroforezy żelowej. Ograniczeniem tej metody jest to, że enzymy dostępne dla większości naukowców są enzymami dostępnymi na rynku; Można jednak użyć dowolnych enzymów restrykcyjnych.

Aby określić, czy barwnik interkalkujący wpływa na działanie enzymu restrykcyjnego rozcinającego DNA, należy postępować zgodnie z odpowiednią kolejnością kroków (Rysunek 1). Po sfarbowaniu DNA i jego trawieniu określonym enzymem można wykonać obraz żelu, aby określić liczbę fragmentów i ich wielkość (Rysunek 2). Aby wyznaczyć sprawność enzymu, należy podzielić całkowitą oczekiwaną liczbę widocznych prążków przez liczbę zaobserwow...

Barwienie cząsteczek DNA do mikroskopii fluorescencyjnej pozwala naukowcowi na ich oglądanie podczas eksperymentu. W przedstawionej tutaj metodzie cząsteczki DNA są wstępnie barwione barwnikami fluorescencyjnymi i trawione enzymami restrykcyjnymi wrażliwymi na metylację i metylację.

Określanie, czy DNA barwione barwnikiem cyjaninowym może być trawione za pomocą enzymów restrykcyjnych

Visualization of DNA for fluorescence microscopy utilizes a variety of dyes such as cyanine dyes. These dyes are utilized due to their high affinity and ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest trawienie znakowanych fluorescencyjnie cząsteczek DNA za pomocą enzymów restrykcyjnych wrażliwych na metylację i metylację oraz określenie szybkości trawienia eksperymentu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z dziedziny chemii lub biologii, takich jak genomika. Zaletą tej metody jest to, że naukowiec może strawić wstępnie wybarwione DNA za pomocą enzymu, aby określić, czy DNA jest pełnej długości po zakończeniu innego eksperymentu.Procedurę zademonstruje Drew Thompson, student studiów licencjackich z mojego laboratorium. Aby uzyskać 0,7% żel agarozowy, należy odważyć 1,4 grama agarozy o wysokiej temperaturze żelowania w kolbie Erlenmeyera. Następnie dodać 200 mililitrów buforu 1x TAE i umieścić odwróconą zlewkę na wierzchu kolby.Podgrzej roztwór na gorącej płycie, aż na dnie kolby zaczną tworzyć się bąbelki i unoszą się do góry. Zdjąć roztwór z płyty grzejnej i pozostawić do ostygnięcia, aż kolbę będzie można dotknąć gołą ręką. Następnie wlej żel do żelowej formy o wymiarach 24,5 cm na 21,8 cm za pomocą grzebienia żelowego, aby stworzyć dołki.Użyj końcówki pipety, aby rozbić bąbelki w pobliżu grzebienia lub na powierzchni żelu

determining-if-dna-stained-with-cyanine-dye-can-be-digested-with

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Niniejsza publikacja opisuje sposób wykorzystania systemu identyfikacji gatunków ryb Agilent Fish Species Identification System do określania gatunku ryby poprzez ekstrakcję DNA oraz przeprowadzenie analizy PCR i RFLP.

Protokół identyfikacji gatunków ryb w oparciu o DNA

Fotostabilne barwniki cyjaninowe są dołączane do oligonukleotydów w celu monitorowania hybrydyzacji poprzez transfer energii.

Synteza sond hybrydyzacyjnych DNA zmieniających długość fali przy użyciu fotostabilnych barwników cyjaninowych

Identyfikacja fizycznych interakcji między genami a elementami regulatorowymi jest trudna, ale została ułatwiona dzięki metodom wychwytywania konformacji chromosomów. Ta modyfikacja protokołu 4C-seq łagodzi stronniczość PCR, minimalizując nadmierną amplifikację matryc PCR i maksymalizując mapowalność odczytów poprzez włączenie etapu trawienia enzymu ograniczającego dodawanie.

Wysokoprzepustowa identyfikacja sekwencji regulatorowych genów przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji wychwytywania konformacji chromosomów kołowych (4C-seq)

Tutaj prezentujemy protokół użycia oranżu tiazolowego do wykrywania DNA w eksperymentach z elektroforezą żelową. Zastosowanie oranżu tiazolowego pozwala na eliminację bromku etydyny, a detekcję fluorescencji można osiągnąć za pomocą światła UV lub niebieskiego.

Elektroforeza DNA z użyciem oranżu tiazolowego zamiast bromku etydyny lub alternatywnych barwników

Genom jest zorganizowany w przestrzeni jądrowej w różne struktury, które mogą być ujawnione za pomocą technologii przechwytywania konformacji chromosomów. Metoda Hi-C w jądrze zapewnia zbiór interakcji chromatyny w całym genomie w liniach komórkowych Drosophila, który generuje mapy kontaktów, które można badać w rozdzielczości megabazowej na poziomie fragmentu restrykcyjnego.

W jądrze Hi-C w komórkach Drosophila

Korzystając z DNA znakowanego kwantowo kropkami i mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem, możemy badać mechanizm reakcji endonukleaz restrykcyjnych, używając nieznakowanego białka. Ta technika jednocząsteczkowa pozwala na masowo multipleksowaną obserwację poszczególnych interakcji białko-DNA, a dane mogą być łączone w celu wygenerowania dobrze wypełnionych rozkładów czasu przebywania.

Analiza w czasie przebywania pojedynczej cząsteczki rozszczepienia DNA za pośrednictwem endonukleazy restrykcyjnej

Tutaj szczegółowo prezentujemy adaptację techniki przechwytywania konformacji chromosomów (3C) z naciskiem na zaangażowanie i naukę na studiach licencjackich.

Uzyskanie A z 3Cs: Przechwytywanie konformacji chromosomów dla studentów

Protokół ten demonstruje wykonanie testu pojedyncząłego w celu wizualizacji na żywo rozwijania DNA za pomocą helikazy CMG. Opisuje (1) przygotowanie substratu DNA, (2) oczyszczanie fluorescencyjnie znakowanej helikazy Drosophila melanogaster CMG, (3) przygotowanie komórki przepływowej mikrofluidycznej do mikroskopii całkowitej fluorescencji odbicia wewnętrznego (TIRF) oraz (4) test odwijania DNA pojedyncząłą.

Wizualizacja rozwijania DNA w czasie rzeczywistym pojedyncząłą cząsteczką przez helikazę CMG

Przedstawiono protokół profilowania metabolicznego próbek biologicznych za pomocą elektroforezy kapilarnej - spektrometrii mas z wykorzystaniem projektu interfejsu porowatej końcówki bez osłony.

Elektroforeza kapilarna bez osłonki – spektrometria mas do profilowania metabolicznego próbek biologicznych

Odkładanie się amyloidu jest cechą charakterystyczną różnych chorób i dotyka wiele różnych narządów. W pracy opisano zastosowanie luminescencyjnego sprzężonego barwienia fluorescencyjnego oligotiofenem w połączeniu z technikami mikroskopii fluorescencyjnej. Ta metoda barwienia stanowi potężne narzędzie do wykrywania i eksploracji agregatów białkowych zarówno w warunkach klinicznych, jak i naukowych.

Obrazowanie tkanek amyloidowych barwionych luminescencyjnymi sprzężonymi oligotiofenami za pomocą hiperspektralnej mikroskopii konfokalnej i obrazowania fluorescencji

Poznaj metodę trawienia fluorescencyjnie znakowanego DNA enzymami restrykcyjnymi wrażliwymi i niewrażliwymi na metylację. Technika ta pozwala ocenić integralność DNA po zakończeniu eksperymentów.

Określanie, czy DNA barwione barwnikiem cyjaninowym może być trawione za pomocą enzymów restrykcyjnych

Przeglądaj więcej filmów