Określanie, czy DNA barwione barwnikiem cyjaninowym może być trawione za pomocą enzymów restrykcyjnych
2 lutego 2018
Barwienie cząsteczek DNA do mikroskopii fluorescencyjnej pozwala naukowcowi na ich oglądanie podczas eksperymentu. W przedstawionej tutaj metodzie cząsteczki DNA są wstępnie barwione barwnikami fluorescencyjnymi i trawione enzymami restrykcyjnymi wrażliwymi na metylację i metylację.
Ogólnym celem tego eksperymentu jest trawienie znakowanych fluorescencyjnie cząsteczek DNA za pomocą enzymów restrykcyjnych wrażliwych na metylację i metylację oraz określenie szybkości trawienia eksperymentu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z dziedziny chemii lub biologii, takich jak genomika. Zaletą tej metody jest to, że naukowiec może strawić wstępnie wybarwione DNA za pomocą enzymu, aby określić, czy DNA jest pełnej długości po zakończeniu innego eksperymentu.
Procedurę zademonstruje Drew Thompson, student studiów licencjackich z mojego laboratorium. Aby uzyskać 0,7% żel agarozowy, należy odważyć 1,4 grama agarozy o wysokiej temperaturze żelowania w kolbie Erlenmeyera. Następnie dodać 200 mililitrów buforu 1x TAE i umieścić odwróconą zlewkę na wierzchu kolby.
Podgrzej roztwór na gorącej płycie, aż na dnie kolby zaczną tworzyć się bąbelki i unoszą się do góry. Zdjąć roztwór z płyty grzejnej i pozostawić do ostygnięcia, aż kolbę będzie można dotknąć gołą ręką. Następnie wlej żel do żelowej formy o wymiarach 24,5 cm na 21,8 cm za pomocą grzebienia żelowego, aby stworzyć dołki.
Użyj końcówki pipety, aby rozbić bąbelki w pobliżu grzebienia lub na powierzchni żelu i pozwól żelowi zastygnąć przez co najmniej 15 minut. Aby wybarwić DNA lambda przy sześciu różnych stężeniach barwników, zacznij od użycia 1x TE do przygotowania 300 mikrolitrów 100 nanogramów na mikrolitr DNA lambda. Przechowywać roztwór w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Przygotowując próbkę dla każdego z następujących stężeń barwnika dla każdego pasma oczekiwanego w trawieniu restrykcyjnym, wybarwić od 75 do 100 nanogramów niemetylowanego DNA lambda. Próbki należy inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia, aby ustalić, czy enzym restrykcyjny może strawić wybarwione DNA, dodaj 20 jednostek enzymu restrykcyjnego, trzy mikrolitry odpowiedniego buforu o najwyższej wydajności cięcia oraz destylowaną autoklawowaną i filtrowaną wodę do reakcji o mocy 30 mikrolitrów.
Umieść reakcje w łaźni wodnej o optymalnej aktywności enzymatycznej i inkubuj je przez dwie do czterech godzin. Następnie zatrzymaj reakcje, dodając dwa mikrolitry 0,5 molowego EDTA pH 8,0. Usuń boki z wcześniej przygotowanej formy żelowej i umieść żel w pudełku do elektroforezy żelowej.
Wlej 2,5 litra 1x bufor TAE do pudełka. Następnie ostrożnie wyjmij grzebień żelowy z żelu, aby dołki były dostępne. Pipetować reakcje enzymu restrykcyjnego na folię z tworzywa sztucznego, a do każdego roztworu reakcyjnego dodać jeden mikrolitr 6-krotnego barwnika obciążającego na pięć do sześciu mikrolitrów roztworu DNA.
Następnie pipetować reakcje do studzienek. Wymieszaj jeden mikrolitr jednej drabiny kilobazowej, dziewięć mikrolitrów 1x TE i dwa mikrolitry 6x barwnika ładującego. Następnie załaduj roztwór do studzienek, które otaczają inne roztwory.
Przykryj pudełko żelowe ciemnoniebieskim lub czarnym papierem lub tkaniną, a następnie podłącz pudełko na żel do zasilania. Ustaw zasilanie na 30 V i uruchom je na noc. Wyłącz światła, gdy żel pracuje, aby zapobiec fotorozszczepieniu znakowanego DNA.
Następnego ranka przenieś żel z tacki do pojemnika z 45 mikrolitrami bromku etydyny i jednym litrem 1x buforu TAE. Przechowuj pojemnik w temperaturze pokojowej w ciemności lub przykryj go folią, aby zapobiec ekspozycji na światło. Pozostaw żel na co najmniej 45 minut w temperaturze pokojowej.
Aby zobrazować żel, umieść żel na transiluminatorze światła niebieskiego, który emituje maksymalny strumień świetlny od 400 do 500 nanometrów. Rób zdjęcia aparatem podłączonym do stacji. Określ szybkość trawienia dla eksperymentu zgodnie z protokołem tekstowym.
Wydajność enzymu określa się, dzieląc całkowitą liczbę oczekiwanych prążków przez liczbę widocznych prążków. Ponadto, w celu określenia przybliżonej wielkości prążków, wymagana jest kontrola, aby wiedzieć, gdzie spodziewane są natywne cząsteczki DNA w porównaniu z barwionym DNA. Zmniejszono mobilność pasm na pasach trzecim i czwartym, co spowodowało, że pasma przesunęły się bliżej studni.
Na tych pasach ilość barwnika nie wpływa zauważalnie na mobilność, więc opaski pasują do kontroli. Pasy piąty i szósty wykazują więcej prążków niż kontrola, co wskazuje na częściowe trawienie, co sugeruje, że barwniki wpłynęły na rozszczepienie w miejscach rozpoznania. W tym eksperymencie wszystkie oczekiwane prążki są widoczne dla wszystkich stężeń barwnika, więc kości nie zakłócały trawienia DNA.
Aby zobaczyć, jak zmienia się ruchliwość wraz ze wzrostem stężenia barwnika YOYO-1, obok każdego pasma umieszczono kolorowe gwiazdki. Na przykład pasma 3,5 kilozasady mają obok siebie czerwone gwiazdki w każdym stężeniu YOYO-1. Nieoczekiwane pasma na pasach piątym i szóstym nie są oznaczone gwiazdką obok pasm.
Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o przykryciu żelu ciemną kartką papieru i dokończeniu działania żelu w ciemnym pomieszczeniu. Upewnij się również, że używasz ciemnych rurek do swoich reakcji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak trawić fluorescencyjnie barwione cząsteczki DNA za pomocą enzymów restrykcyjnych i określać szybkość trawienia reakcji.
Nie zapominaj, że praca z bromkiem etydyny może być bardzo niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania zabiegu należy zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i okularów ochronnych. Upewnij się również, że nosisz odpowiednie okulary ochronne podczas korzystania z transiluminatora.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy eksperyment koncentruje się na trawieniu znakowanych fluorescencyjnie cząsteczek DNA przy użyciu enzymów restrykcyjnych wrażliwych i niewrażliwych na metylację. Metoda ta pozwala badaczom ocenić integralność DNA po różnych procedurach eksperymentalnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biochemia
- Genomika
- Mikroskopia fluorescencyjna
Wstęp
- Fluorescencyjne barwienie DNA umożliwia jego wizualizację podczas eksperymentów.
- Enzymy restrykcyjne są kluczowe dla analizy struktury i funkcji DNA.
- Wrażliwość na metylację dostarcza informacji na temat modyfikacji epigenetycznych.
- Metoda ta może pogłębić zrozumienie zagadnień zarówno w dziedzinie chemii, jak i biologii.
Cel badania
- Oznaczenie szybkości trawienia DNA znakowanego fluorescencyjnie.
- Ocena skuteczności enzymów restrykcyjnych w odniesieniu do DNA uprzednio barwionego.
- Badanie integralności DNA po przeprowadzeniu eksperymentu.
Zastosowane metody
- Przygotowanie 0,7% żelu agarozowego do elektroforezy.
- Zastosowanie enzymów restrykcyjnych wrażliwych i niewrażliwych na metylację.
- Barwienie fluorescencyjne cząsteczek DNA przed trawieniem.
- Wizualizacja DNA przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.
Główne wyniki
- Osiągnięto skuteczne trawienie DNA znakowanego fluorescencyjnie.
- Metoda ta umożliwiła ocenę integralności DNA.
- Wyniki wykazały efektywność zastosowanych enzymów restrykcyjnych.
- Mikroskopia fluorescencyjna zapewniła wyraźną wizualizację cząsteczek DNA.
Wnioski
- Metoda ta jest cenna w badaniu trawienia i integralności DNA.
- Znakowanie fluorescencyjne usprawnia wizualizację i analizę.
- Wyniki przyczyniają się do szerszych badań w dziedzinie genomiki i biologii molekularnej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ocena integralności DNA po manipulacjach eksperymentalnych jest kluczowa dla zapewnienia wiarygodności danych w procesach genomiki i biologii molekularnej. Metoda ta umożliwia szybką walidację funkcjonalną aktywności enzymów restrykcyjnych na DNA barwionym fluorescencyjnie, wspierając walidację celu oraz opracowywanie testów poprzez potwierdzenie, że znakowanie nie zakłóca późniejszego przetwarzania enzymatycznego. Stanowi ona prosty, dostępny sprzętowo sposób na minimalizację ryzyka w wynikach eksperymentalnych, w których integralność DNA jest warunkiem koniecznym do prawidłowej interpretacji.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Potwierdza, że barwienie barwnikiem cyjaninowym nie hamuje trawienia enzymami restrykcyjnymi, co umożliwia wiarygodną analizę celów DNA po znakowaniu.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje standardowe enzymy restrykcyjne oraz sprzęt do elektroforezy żelowej, które znajdują się w większości laboratoriów biologii molekularnej.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Umożliwia ilościową ocenę wydajności trawienia poprzez porównanie eksperymentalnych wzorów prążków z trawieniami in silico, co wspomaga standaryzację analizy.
- Wartość operacyjna: Wymaga jedynie podstawowych narzędzi do elektroforezy i wizualizacji, co ułatwia skalowalność w ramach platform przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez weryfikację, że znakowanie fluorescencyjne nie zmienia wzorców fragmentów DNA, co zapewnia ciągłość translacyjną.
- Wartość operacyjna: Kompatybilność z enzymami wrażliwymi zarówno na metylację, jak i brak metylacji, co poszerza zakres zastosowań w badaniach epigenetycznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w wczesne etapy procesów badawczych, w których znakowanie DNA poprzedza testy funkcjonalne, stanowiąc punkt kontrolny przed przejściem do identyfikacji związków wiodących lub badań nad mechanizmami działania.
- Biologia odkrywcza: Potwierdza, że DNA pozostaje nienaruszone i dostępne dla analiz enzymatycznych po barwieniu, co redukuje liczbę wyników fałszywie ujemnych w testach zaangażowania celu.
- Przesiewanie: Generuje ilościowe dane o wzorze prążków, które mogą być wykorzystane do ustalenia kryteriów akceptacji jakości próbek DNA w badaniach wysokoprzepustowych.
- Analityka: Umożliwia obliczenie wydajności enzymu poprzez porównanie liczby prążków, oferując prosty wskaźnik stopnia kompletności reakcji.
- Badania translacyjne: Gwarantuje, że metody detekcji oparte na fluorescencji nie upośledzają późniejszych analiz enzymatycznych, zachowując wierność testu.
- Powtarzalność w przedsiębiorstwie: Stanowi powtarzalny etap kontroli jakości, który można zastosować w wielu potokach eksperymentalnych skierowanych na DNA.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez potwierdzenie, że znakowanie fluorescencyjne nie utrudnia działania enzymów restrykcyjnych.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje powszechnie dostępne odczynniki oraz standardową infrastrukturę do elektroforezy w żelu.
- Wartość strategiczna: Zmniejsza ryzyko błędnych wniosków wynikających z niewykrytej degradacji DNA lub interferencji związanej ze znakowaniem.
- Wpływ na portfolio: Wspiera decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez zapewnienie wczesnej walidacji integralności próbek DNA.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga znajomości technik trawienia enzymami restrykcyjnymi oraz elektroforezy w żelu agarozowym.
- Zależne od dostępu do standardowego sprzętu do biologii molekularnej, w tym komór elektroforetycznych, zasilaczy i barwników do kwasów nukleinowych.
- Wymaga ostrożnego obchodzenia się z bromkiem etydyny lub alternatywnymi barwnikami do kwasów nukleinowych przy zastosowaniu odpowiednich środków bezpieczeństwa.
- Może wymagać optymalizacji czasu barwienia i stężenia barwnika w celu zminimalizowania potencjalnego hamowania enzymów.
- Opiera się na dokładnych przewidywaniach trawienia in silico w celu prawidłowej interpretacji eksperymentalnych wzorów prążków.
