Badanie roli sił fizycznych we wczesnej morfogenezie embrionalnej piskląt

Ogólnym celem tego eksperymentalnego protokołu jest zbadanie roli sił mechanicznych we wczesnym rozwoju embrionalnym mózgu poprzez eksperymenty ex ovo. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii i biomechaniki rozwoju, takie jak rola wskazówek mechanicznych w morfogenezie, czyli wytwarzaniu formy biologicznej. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona scharakteryzowanie roli sił mechanicznych w morfogenezie na poziomie tkanek i organizmów.

Aby rozpocząć tę procedurę, użyj delikatnych chusteczek z 70% etanolem, aby oczyścić zapłodnione, wolne od specyficznych patogenów jaja kurze White Leghorn. Następnie ułóż jajka w orientacji wzdłużnej na uchwycie. Następnie ustaw inkubator jaj na temperaturę docelową 37,5 stopnia Celsjusza i utrzymuj wilgotność na poziomie od 48 do 55%Wilgotność jest kontrolowana poprzez dodanie odpowiedniej ilości wody do inkubatora.

Inkubować jaja przez około 40 do 44 godzin do HH11 do 13. Następnie pozwól jajom ostygnąć w temperaturze pokojowej przez około 15 do 30 minut przed czyszczeniem 70% etanolem. Na tym etapie rozbij jajka od spodu, delikatnie rozsuń skorupkę i ostrożnie włóż zawartość na szalkę Petriego o wymiarach 150 na 15 milimetrów.

Aby upewnić się, że strona zarodka jest podniesiona, utrzymuj jaja w tej samej orientacji, w jakiej były inkubowane podczas ich pękania. Usuń cienką albuminę za pomocą jednorazowej pipety Pasteura. Oddziel gęstą albuminę od żółtka za pomocą kleszczy o końcach.

Upewnij się, że gęsta albumina została usunięta, lekko zeskrobując wierzch żółtka. Następnie, za pomocą kleszczyków z cienką końcówką, umieść pierścień z bibuły filtracyjnej na zarodku i wyśrodkuj go, dopasowując długą oś pierścienia do długiej osi zarodka. Następnie odetnij nożyczkami żółtko otaczające pierścień bibuły filtracyjnej.

Następnie wyciągnij pierścień i zarodek z żółtka w kierunku ukośnym w kierunku miejsca, w którym żółtko zostało po raz pierwszy przecięte. Następnie opłucz zarodek w dwóch sekwencyjnych 100-milimetrowych naczyniach z PBS o temperaturze pokojowej. Następnie umieść pierścień z bibuły filtracyjnej na 35-milimetrowej szalce Petriego.

Umieść zarodek grzbietową stroną do góry na drugiej bibule filtracyjnej na 35-milimetrowej szalce Petriego. Następnie umieść pierścień ze stali nierdzewnej na kanapce z bibuły filtracyjnej. Uważaj, aby nie uszkodzić zarodka.

Teraz dodaj trzy mililitry wcześniej przygotowanego CCM do każdej szalki Petriego. Usuń błonę witelinową każdego zarodka, delikatnie przesuwając ciągniętą igłę kapilarną po górnej części zarodka. Następnie oderwij błonę witeliny, zaczynając od przedniego końca i przechodząc do struny grzbietowej.

Następnie umieść osiem 35-milimetrowych szalek Petriego w jednej 150-milimetrowej szalce wyłożonej chusteczkami nasączonymi wodą, aby utrzymać wilgotność. Następnie umieść 150-milimetrową szalkę Petriego w zamykanej plastikowej torbie i napełnij worek mieszaniną gazów składającą się z 95% tlenu i 5% CO2. Zamknij worek i umieść go w inkubatorze o temperaturze 37,5 stopnia Celsjusza.

Teraz wyjmij zarodek z inkubatora i użyj systemu OCT, aby je zobrazować i określić kąt skrętu cewy nerwowej. Przenieś zarodki do mikroskopu świetlnego i wizualizuj w 10-krotnym powiększeniu. Użyj pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby stopniowo usunąć 0,2 mililitra pożywki z szalki Petriego.

Wykonuj zdjęcia w jasnym polu po każdej rundzie usuwania pożywki, aby zaobserwować wpływ interfejsu pożywka-powietrze na zarodek. Kontynuuj usuwanie pożywki, aż napięcie powierzchniowe w poprzek zarodka wywoła skręt. Zobrazuj zarodek ponownie za pomocą systemu OCT, aby ustalić ostateczny kąt skrętu do porównania w celu kontroli zarodków.

Aby zmienić kierunek pętli serca, użyj kleszczy, aby odwrócić bibułę filtracyjną tak, aby zarodek stał się brzuszną stroną do góry. Następnie użyj wyciągniętej rurki kapilarnej, aby rozciąć szczelinę w błonie splanchnopleure i wywrzeć siłę mechaniczną, aby popchnąć serce z prawej strony na lewą. Zastosuj napięcie powierzchniowe płynu, aby utrzymać serce po lewej stronie.

Następnie inkubuj zarodek przez kolejne 20 godzin, aby zobaczyć zmianę chiralności skrętu. Na zdjęciu pobrany zarodek z usuniętym VM w HH11. Ten sam zarodek inkubował przez 27 godzin po usunięciu VM, wykazując zmniejszone skręcanie.

Oto ten sam zarodek, który uległ skręceniu mózgu po zastosowaniu napięcia powierzchniowego płynu, a tutaj jest zarodek kontrolny z normalnym skrętem mózgu w porównywalnym stadium. Podczas wykonywania tej procedury należy uważać, aby nie uszkodzić zarodka. Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić inne metody, takie jak analiza elementów skończonych, w celu obliczeniowego modelowania, w jaki sposób siły fizyczne mogą wpływać na morfologię.

W związku z tym opracowana tutaj technika utorowała drogę do przyszłych badań nad mechaniką morfogenezy w zarodkach piskląt. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś zrozumieć, jak zbierać zarodki piskląt do hodowli in vitro, mikrochirurgicznie usuwać błonę witelinową, podsumowywać siłę dostarczaną przez błonę witeliny i monitorować morfologię zarodka za pomocą OCT i obrazowania w jasnym polu.