Name: Badanie roli sił fizycznych we wczesnej morfogenezie embrionalnej piskląt (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Odkryj metodę ex ovo do badania sił mechanicznych w morfogenezie mózgu zarodków kurzych. Protokół umożliwia analizę wpływu naprężeń powierzchniowych na rozwój biologiczny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Z.C. dziękuje za wsparcie ze strony funduszu startowego Dartmouth oraz stypendium Branco Weiss- Society for Science, zarządzanego przez ETH Zurich. Autorzy dziękują doktorom Larry'emu A. Taberowi, Benjamenowi A. Filasowi, Qiaohang Guo i Yunfei Shi za pomocne dyskusje, a także anonimowym recenzentom za komentarze. Materiał ten opiera się na pracach wspieranych przez National Science Foundation Graduate Research Fellowship w ramach grantu nr 1. DGE-1313911. Wszelkie opinie, ustalenia, wnioski lub zalecenia wyrażone w tym materiale są opiniami autora (autorów) i niekoniecznie odzwierciedlają poglądy National Science Foundation.

1. Przygotowanie pożywki do hodowli tkankowej
<ol>
	<li>Użyj 0,5 litrowej butelki Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) z 4,5 g/l glukozy, wodorowęglanem sodu i L-glutaminą jako bazą dla pożywki hodowlanej.</li>
	<li>W sterylnym okapie z przepływem laminarnym dodaj 10 ml antybiotyków do 0,5 l DMEM.</li>
	<li>Za pomocą sterylnej pipety przenieś 50 ml roztworu antybiotyków DMEM do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Dodać 50 ml surowicy pisklęcej do pozostałego roztworu antybiotyków DMEM w butelce o pojemności 0,5 l w sterylnym kapturze.</li>
	<li>Przechowywać końcowy roztwór (zwany dalej pożywką do hodowli piskląt [CCM]) w 50 ml stożkowej probówki, podwielokrotnościach w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
2. Inkubacja jaj
<ol>
	<li>Używaj delikatnych chusteczek z 70% etanolem do czyszczenia nawożonych, wolnych od specyficznych patogenów jaj kurzych White Leghorn. Ułóż jajka w orientacji wzdłużnej na uchwytach.</li>
	<li>Włącz inkubator do jaj, aby ustawić temperaturę docelową 37,5 °C i utrzymuj wilgotność na poziomie 48 - 55%. Wilgotność jest kontrolowana poprzez dodanie odpowiedniej ilości wody do inkubatora.</li>
	<li>Inkubować jaja do HH11-13, około 40 - 44 godzin.</li>
	<li>Pozwól jajom ostygnąć w temperaturze pokojowej przez około 15 - 30 minut przed spryskaniem/czyszczeniem 70% etanolem.</li>
</ol>
3. Wyciągnij szklane naczynia włosowate
<ol>
	<li>Zamontuj szklane rurki kapilarne o długości 10 cm i średnicy zewnętrznej 0,5 mm na ściągaczu do mikropipet.</li>
	<li>Ustaw parametry ciepła i ciągnięcia odpowiednio na 750 i 400. Naciśnij przycisk ciągnięcia, aby wciągnąć rurkę kapilarną w cienkie igły.</li>
</ol>
4. Metoda nośnika bibuły filtracyjnej
<ol>
	<li>Wytnij koła o średnicy około 3 cm z bibuły filtracyjnej.</li>
	<li>Wytnij prostokąt około 1 cm na 2 cm od koła za pomocą dziurkacza. Upewnij się, że usunąłeś wszelkie wystające lub ostre rogi.</li>
</ol>
5. Pobieranie i przygotowanie zarodków
<ol>
	<li>Rozbij jajka od spodu, delikatnie rozsuń skorupkę i ostrożnie włóż zawartość do szalki Petriego o wymiarach 150 mm x 15 mm. Aby upewnić się, że strona zarodka jest skierowana do góry, utrzymuj jaja w tej samej orientacji, w której były wysiadywane podczas ich łamania.</li>
	<li>Usuń cienką albuminę za pomocą jednorazowej pipety Pasteura.</li>
	<li>Oddziel gęstą albuminę od żółtka za pomocą kleszczy z końcami. Upewnij się, że gęsta albumina została usunięta, lekko zeskrobując wierzch żółtka szczypcami.</li>
	<li>Użyj kleszczyków z cienką końcówką, aby wyśrodkować i umieścić pierścień z bibuły filtracyjnej nad zarodkiem, dopasowując długą oś pierścienia do długiej osi zarodka.</li>
	<li>Odetnij nożyczkami żółtko otaczające pierścień bibuły filtracyjnej.</li>
	<li>Oderwij pierścień i zarodek od żółtka w kierunku ukośnym w kierunku miejsca, w którym żółtko zostało po raz pierwszy przecięte.</li>
	<li>Opłucz zarodki w dwóch sekwencyjnych naczyniach o średnicy 100 mm w temperaturze pokojowej 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS).</li>
	<li>Najpierw umieść pierścień z bibuły filtracyjnej na szalce Petriego o średnicy 35 mm. Następnie umieść zarodek grzbietową stroną do góry na bibule filtracyjnej już na szalce Petriego o średnicy 35 mm.</li>
	<li>Umieść pierścień ze stali nierdzewnej na kanapce z bibuły filtracyjnej. Upewnij się, że nie uszkodzisz zarodka.</li>
	<li>Do każdej szalki Petriego dodać 3 ml wcześniej przygotowanego CCM.</li>
	<li>Usuń VM z każdego zarodka, lekko przesuwając ciągnącą igłę kapilarną po górnej części zarodka i odrywając VM, zaczynając od przedniego końca (tuż nad przodomózgowiem) i przechodząc do struny grzbietowej (<silna klasa = "xfig">Figura 1A).</li>
	<li>Umieść osiem szalek Petriego o średnicy 35 mm w jednej naczyniu o średnicy 150 mm, która została wyłożona delikatnymi chusteczkami nasączonymi wodą (w celu utrzymania wilgotności).</li>
	<li>Umieść szalkę Petriego o średnicy 150 mm w zamykanej plastikowej torbie, a następnie napełnij worek mieszaniną gazów składającą się z 95%O2 i 5%CO2</li>.
	<li>Zamknąć worek i umieścić go w inkubatorze o temperaturze 37,5 °C.</li>
	<li>Inkubuj zarodki przez dodatkowe 27 godzin, aż do HH15-HH16 (<silna klasa="xfig">Ryc. 1B).</li>
</ol>
6. Wywoływanie napięcia powierzchniowego
<ol>
	<li>Wyjmij zarodki z inkubatora i użyj systemu optycznej koherentnej tomografii (OCT) do ich zobrazowania. Użyj OCT, aby określić kąt skręcania cewy neuronowej (NT) (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Przenieś zarodki do mikroskopu świetlnego i wizualizuj w 10-krotnym powiększeniu. Użyj pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby stopniowo usunąć 0,2 ml pożywki z szalki Petriego.</li>
	<li>Wykonuj zdjęcia w jasnym polu w każdym odstępie czasu, aby zaobserwować wpływ interfejsu pożywka-powietrze na zarodek.</li>
	<li>Usuwaj pożywkę, aż napięcie powierzchniowe w poprzek zarodka wywoła skręt (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C).</li>
	<li>Ponownie zobrazuj zarodek za pomocą systemu OCT, aby ustalić ostateczny kąt skrętu do porównania z zarodkami kontrolnymi. UWAGA: Obrazy jasnego pola uzyskano przy użyciu mikroskopu preparacyjnego. System optycznej koherentnej tomografii z dołączonym mikroskopem wykorzystano do pozyskania przekrojowych stosów obrazów żywych zarodków. Obrazy uzyskano w obszarze skanowania 3 x 10 mm x 3 mm3, a następnie przetworzono w oprogramowaniu do obrazowania. Na koniec zdjęcia modelu fizycznego zostały wykonane za pomocą cyfrowej lustrzanki jednoobiektywowej.</li>
</ol>
7. Modelowanie fizyczne naprężeń powierzchniowych/sił VM
<ol>
	<li>Opracuj uproszczoną geometrię 3D, która przypomina zarodek między HH14-17 w komercyjnym oprogramowaniu do modelowania (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A).</li>
	<li>Zaprojektuj formę negatywową geometrii 3D w komercyjnym oprogramowaniu do grafiki komputerowej 3D.</li>
	<li>Użyj drukarki 3D załadowanej filamentem akrylonitryl-butadien-styren o średnicy 1,75 mm, aby wydrukować 3D zaprojektowaną formę w formacie stereolitograficznym (.stl).</li>
	<li>Aby odlewać formę, wymieszaj składniki elastomeru z kauczuku silikonowego A i B w równych częściach i natychmiast wlej mieszaninę do formy; ustaw formę odlewniczą tak, aby utwardzała się w temperaturze pokojowej przez 12 godzin (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B).</li>
	<li>Zaznacz fizyczny model zarodka wzdłuż NT po stronie grzbietowej, aby uwidocznić skręt</li>.
	<li>Użyj szkiełka nakrywkowego, aby odtworzyć siłę przyłożoną do modelu fizycznego 3D, która naśladuje siłę VM lub napięcia powierzchniowego (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3D).</li>
	<li>Wstaw serię sztywnych drutów o długości równej boku modelu fizycznego. Po tym, jak szkiełko nakrywkowe wywiera siłę zewnętrzną na model mózgu, druty stają się przechylone pod kątem zależnym od lokalizacji. Określ kąt obrotu za pomocą arctan rzutowanej długości na oryginalną długość każdego drutu (Rysunek 3E).</li>
</ol>
8. Zmiana kierunku pętli serca
<ol>
	<li>Postępuj zgodnie z krokami w 3.1 i 3.2, aby uzyskać wyciągniętą rurkę kapilarną.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z krokami opisanymi w punktach od 5.1 do 5.10, aby przygotować zarodek.</li>
	<li>Użyj kleszczy, aby odwrócić bibułę filtracyjną, tak aby zarodek stał się brzusznie skierowany do góry.</li>
	<li>Użyj wyciągniętej rurki kapilarnej, aby rozciąć szczelinę w błonie splanchnopleure (SPL).</li>
	<li>Użyj rurki kapilarnej, aby wywrzeć siłę mechaniczną, aby popchnąć serce z prawej strony na lewą.</li>
	<li>Wykonaj czynności opisane w punktach od 5.12 do 5.15, aby zaobserwować zmianę skręcania.</li>
</ol>

<ol><li>Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://appliedmechanicsreviews.asmedigitalcollection.asme.org/article.aspx?articleid=1395451">Biomechanics of Growth, Remodeling, and Morphogenesis.</a> Appl. Mech. Rev. 48, 487-545 (1995).</li>
<li>Wyczalkowski, M. A., Chen, Z., Filas, B. A., Varner, V. D., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+models+for+mechanics+of+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+C+-+Embryo+Today%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Computational models for mechanics of morphogenesis.</a> Birth Defects Research Part C - Embryo Today: Reviews. 96, 132-152 (2012).</li>
<li>Savin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+growth+and+form+of+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">On the growth and form of the gut.</a> Nature. 476, 57-62 (2011).</li>
<li>Gjorevski, N., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanics+of+development%3A+Models+and+methods+for+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+C+-+Embryo+Today%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">The mechanics of development: Models and methods for tissue morphogenesis.</a> Birth Defects Research Part C - Embryo Today: Reviews. 90, 193-202 (2010).</li>
<li>Shyer, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Villification%3A+how+the+gut+gets+its+villi%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Villification: how the gut gets its villi.</a> Science. 342, 212-218 (2013).</li>
<li>Ambrosi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+biological+growth+and+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Mechanics+and+Physics+of+Solids%22%5BJournal%5D)">Perspectives on biological growth and remodeling.</a> Journal of the Mechanics and Physics of Solids. 59, 863-883 (2011).</li>
<li>Chen, Z., Majidi, C., Srolovitz, D. J., Haataja, M. <a target="_blank" href="http://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.3530441">Tunable helical ribbons.</a> Appl. Phys. Lett. 98, (2011).</li>
<li>Gerbode, S. J., Puzey, J. R., McCormick, A. G., Mahadevan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+cucumber+tendril+coils+and+overwinds%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">How the cucumber tendril coils and overwinds.</a> Science. 337, 1087-1091 (2012).</li>
<li>Armon, S., Efrati, E., Kupferman, R., Sharon, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometry+and+mechanics+in+the+opening+of+chiral+seed+pods%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Geometry and mechanics in the opening of chiral seed pods.</a> Science. 333, 1726-1730 (2011).</li>
<li>Filas, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+potential+role+for+differential+contractility+in+early+brain+development+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Biomech.+Model.+Mechanobiol%22%5BJournal%5D)">A potential role for differential contractility in early brain development and evolution.</a> Biomech. Model. Mechanobiol. 11, 1251-1262 (2012).</li>
<li>Xu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axons+pull+on+the+brain%2C+but+tension+does+not+drive+cortical+folding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech.+Eng%22%5BJournal%5D)">Axons pull on the brain, but tension does not drive cortical folding.</a> J. Biomech. Eng. 132, 71013(2010).</li>
<li>Chen, Z., Guo, Q., Dai, E., Forsch, N., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+embryonic+chick+brain+twists%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">How the embryonic chick brain twists.</a> J. R. Soc. Interface. 13, (2016).</li>
<li>Manca, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+growth+factor+regulates+axial+rotation+during+early+stages+of+chick+embryo+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Nerve growth factor regulates axial rotation during early stages of chick embryo development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 2009-2014 (2012).</li>
<li>Shi, Y., Yao, J., Xu, G., Taber, L. a <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bending+of+the+looping+heart%3A+differential+growth+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech.+Eng%22%5BJournal%5D)">Bending of the looping heart: differential growth revisited.</a> J. Biomech. Eng. 136, 1-15 (2014).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bending+and+twisting+the+embryonic+heart%3A+A+computational+model+for+c-looping+based+on+realistic+geometry%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Bending and twisting the embryonic heart: A computational model for c-looping based on realistic geometry.</a> Front. Physiol. 5, (2014).</li>
<li>Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphomechanics%3A+Transforming+tubes+into+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+and+Development%22%5BJournal%5D)">Morphomechanics: Transforming tubes into organs.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 27, 7-13 (2014).</li>
<li>Hosseini, H. S., Beebe, D. C., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+effects+of+the+surface+ectoderm+on+optic+vesicle+morphogenesis+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech%22%5BJournal%5D)">Mechanical effects of the surface ectoderm on optic vesicle morphogenesis in the chick embryo.</a> J. Biomech. 47, 3837-3846 (2014).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Dev. Dyn. 88, 49-92 (1951).</li>
<li>Shi, Y., Varner, V. D., Taber, L. a <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+is+cytoskeletal+contraction+required+for+cardiac+fusion+before+but+not+after+looping+begins%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Biol%22%5BJournal%5D)">Why is cytoskeletal contraction required for cardiac fusion before but not after looping begins?</a> Phys. Biol. 12, 16012(2015).</li>
<li>Garcia, K. E., Okamoto, R. J., Bayly, P. V., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contraction+and+stress-dependent+growth+shape+the+forebrain+of+the+early+chicken+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mech.+Behav.+Biomed.+Mater%22%5BJournal%5D)">Contraction and stress-dependent growth shape the forebrain of the early chicken embryo.</a> J. Mech. Behav. Biomed. Mater. 65, 383-397 (2017).</li>
<li>Faisst, A. M., Alvarez-Bolado, G., Treichel, D., Gruss, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotatin+is+a+novel+gene+required+for+axial+rotation+and+left-right+specification+in+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Rotatin is a novel gene required for axial rotation and left-right specification in mouse embryos.</a> Mech. Dev. 113, 15-28 (2002).</li>
<li>Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. a, Butcher, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex-ovo+chicken+embryo+culture+system+suitable+for+imaging+and+microsurgery+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An ex-ovo chicken embryo culture system suitable for imaging and microsurgery applications.</a> J. Vis. Exp. (44), (2010).</li>
<li>Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+for+chick+whole-embryo+culture+using+a+filter+paper+carrier%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier.</a> Dev. Dyn. 220, 284-289 (2001).</li>
<li>Campàs, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+cell-generated+mechanical+forces+within+living+embryonic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues.</a> Nat. Methods. 11, 183-189 (2014).</li>
<li>Schierenberg, E., Junkersdorf, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+eggshell+and+underlying+vitelline+membrane+for+normal+pattern+formation+in+the+early+C.+elegans+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Roux%27s+Arch.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of eggshell and underlying vitelline membrane for normal pattern formation in the early C. elegans embryo.</a> Roux's Arch. Dev. Biol. 202, 10-16 (1992).</li>
<li>Chuai, M., Weijer, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mechanisms+Underlying+Primitive+Streak+Formation+in+the+Chick+Embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The Mechanisms Underlying Primitive Streak Formation in the Chick Embryo.</a> Current Topics in Developmental Biology. 81, 135-156 (2008).</li>
<li>Voronov, D. A., Alford, P. W., Xu, G., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mechanical+forces+in+dextral+rotation+during+cardiac+looping+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of mechanical forces in dextral rotation during cardiac looping in the chick embryo.</a> Dev. Biol. 272, 339-350 (2004).</li>
<li>Raya, A., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unveiling+the+establishment+of+left-right+asymmetry+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Unveiling the establishment of left-right asymmetry in the chick embryo.</a> Mechanisms of Development. 121, 1043-1054 (2004).</li>
<li>Voronov, D. A., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+looping+in+experimental+conditions%3A+Effects+of+extraembryonic+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Cardiac looping in experimental conditions: Effects of extraembryonic forces.</a> Dev. Dyn. 224, 413-421 (2002).</li>
<li>Chen, Z., Huang, G., Trase, I., Han, X., Mei, Y. <a target="_blank" href="https://journals.aps.org/prapplied/abstract/10.1103/PhysRevApplied.5.017001">Mechanical Self-Assembly of a Strain-Engineered Flexible Layer: Wrinkling, Rolling, and Twisting.</a> Phys. Rev. Appl. 5, (2016).</li>
<li>Manner, J., Seidl, W., Steding, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+cervical+flexure%3A+an+experimental+study+on+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Anat.+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Formation of the cervical flexure: an experimental study on chick embryos.</a> Acta Anat. (Basel). 152, 1-10 (1995).</li>
<li>Ware, M., Schubert, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+early+axon+scaffold+in+the+rostral+brain+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Development of the early axon scaffold in the rostral brain of the chick embryo.</a> J. Anat. 219, 203-216 (2011).</li>
<li>Ramasubramanian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+role+of+intrinsic+and+extrinsic+forces+in+early+cardiac+S-looping%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">On the role of intrinsic and extrinsic forces in early cardiac S-looping.</a> Dev. Dyn. 242, 801-816 (2013).</li>
<li>Hoyle, C., Brown, N. a, Wolpert, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+left%2Fright+handedness+in+the+chick+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of left/right handedness in the chick heart.</a> Development. 115, 1071-1078 (1992).</li>
<li>Nerurkar, N. L., Ramasubramanian, A., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenetic+adaptation+of+the+looping+embryonic+heart+to+altered+mechanical+loads%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Morphogenetic adaptation of the looping embryonic heart to altered mechanical loads.</a> Dev. Dyn. 235, 1822-1829 (2006).</li>
<li>Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left-right+asymmetry+and+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Left-right asymmetry and the chick embryo.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 9, 67-76 (1998).</li>
<li>Roebroek, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+of+ventral+closure+and+axial+rotation+in+embryos+lacking+the+proprotein+convertase+Furin%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Failure of ventral closure and axial rotation in embryos lacking the proprotein convertase Furin.</a> Development. 125, 4863-4876 (1998).</li>
<li>Peebles, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+resonance+proton+spectroscopy+and+diffusion+weighted+imaging+of+chick+embryo+brain+in+ovo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Magnetic resonance proton spectroscopy and diffusion weighted imaging of chick embryo brain in ovo.</a> Dev. Brain Res. 141, 101-107 (2003).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerberus+regulates+left-right+asymmetry+of+the+embryonic+head+and+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cerberus regulates left-right asymmetry of the embryonic head and heart.</a> Curr. Biol. 9, 931-938 (1999).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podczas gdy zjawiska fizyczne odgrywają integralną rolę w morfogenezie 26,27,28,29,30, konkretne mechanizmy mechaniczne, wraz z koordynacją mechanizmów mechanicznych i molekularnych, pozostają w dużej mierze niezbadane. Wiadomo, że zgięcie brzuszne i skręt w prawo pierwotnego mózgu to dwa centralne procesy, które przyczyniają się do wczesnej morfogenezy embrio...

Współczesne badania nad biologią rozwojową koncentrują się głównie na zrozumieniu rozwoju z perspektywy genetyki molekularnej1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. Wiadomo, że zjawiska fizyczne odgrywają kluczową rolę w morfogenezie, czyli powstawaniu formy biologicznej14,15,16,17; Jednak konkretne mechaniczne mechanizmy rozwoju pozostają w dużej mierze niezbadane. Zgięcie brzuszne i skręcenie w prawo pierwotnej rurki mózgowej po etapie 11 Hamburgera-Hamiltona (HH 11)18 to dwa główne procesy, które przyczyniają się do zmiany kształtu embrionalnego19,20. W szczególności mechanizm fizyczny leżący u podstaw rozwoju skrętnego w mózgu embrionalnym pozostaje nie w pełni poznany.
Skręt embrionalny u zarodka pisklęcia jest jednym z najwcześniejszych zdarzeń morfogenetycznych asymetrii lewo-prawo (L-R) w rozwoju. Gdy proces asymetrii L-R jest zaburzony, wystąpią wady wrodzone, takie jak situs inversus, izomeria lub heterotaksja21. 
Tutaj prezentujemy protokół, który łączy eksperymenty ex-ovo22,23 z modelowaniem fizycznym w celu scharakteryzowania sił mechanicznych podczas wczesnego rozwoju embrionalnego mózgu. Celem przedstawionej metody jest zidentyfikowanie sił mechanicznych odpowiedzialnych za skręt mózgu oraz czynników wpływających na stopień skrętu we wczesnym okresie rozwoju12. Opierając się na obserwacji eksperymentalnej, że błona witelinowa (VM) ogranicza grzbietową stronę zarodka, postawiliśmy hipotezę, że VM zapewnia siłę niezbędną do wywołania skrętu rozwijającego się mózgu. Dlatego w tej metodzie usunęliśmy część maszyny wirtualnej, która obejmuje obszar mózgu, aby poznać wpływ na skręt mózgu. Ponadto zastosowano metodę przyłożenia napięcia powierzchniowego płynu, aby potwierdzić mechaniczną rolę VM i oszacować siłę potrzebną do skrętu mózgu, czego wcześniej nie robiono. Pomiar sił podczas morfogenezy embrionalnej jest trudnym zadaniem. Warto zauważyć, że w pionierskim badaniu Campàs i współpracownicy24 opracowali nowatorską metodę ilościowego określania stresu komórkowego za pomocą wstrzykniętych mikrokropel. Niemniej jednak metoda ta była ograniczona do pomiaru sił na poziomie komórkowym, a zatem nie miała zastosowania do sił sondy na poziomie tkanki lub organizmu. Protokół przedstawiony w niniejszym artykule został opracowany w celu częściowego wypełnienia tej luki.

<table><tbody><tr><td>Zapłodnione Specyficzne, wolne od patogenów jaja kurze White Leghorn</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optyczna tomografia koherentna Mikroskop</td><td>Thorlabs</td><td>GAN220C1</td><td></td></tr><tr><td>Elastomer silikonowy</td><td>Smooth-On, Inc.</td><td>EcoFlex 00-50</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Leica</td><td>MZ8</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Medium (DMEM)</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyki</td><td>Sigma</td><td>P4083</td><td></td></tr><tr><td>Surowica dla piskląt</td><td>Sigma</td><td>C5405</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instrument</td><td>Model P-30</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna</td><td>Whatman</td><td>5202-110</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Comsol MultiPhysics</td><td></td> Oprogramowanie do grafiki komputerowej Comsol <td></td><td></td></tr><tr><td>3D</td><td>Mikroskop Rhino 5</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dołączony do OCT</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>FN1</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowa lustrzanka jednoobiektywowa</td><td>EOS&nbsp;</td><td>Buntownik T3i</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie roli sił fizycznych we wczesnej morfogenezie embrionalnej piskląt

Probing the Roles of Physical Forces in Early Chick Embryonic Morphogenesis

Rozwój embrionalny jest tradycyjnie badany z perspektywy genetyki biomolekularnej, ale fundamentalne znaczenie mechaniki w morfogenezie staje się coraz bardziej dostrzegane. W szczególności embrionalne serce i rurka mózgowa pisklęcia, które w miarę rozwoju ulegają drastycznym zmianom morfologicznym, są jednymi z głównych kandydatów do badania roli sił fizycznych w morfogenezie. Postępujące zgięcie brzuszne i skręt w prawo rurkowatego embrionalnego mózgu pisklęcia zachodzi na najwcześniejszym etapie asymetrii narządów lewo-prawych w rozwoju embrionalnym piskląt. Błona witelinowa (VM) ogranicza grzbietową stronę zarodka i jest zaangażowana w dostarczanie siły niezbędnej do wywołania skrętu rozwijającego się mózgu. Poniżej przedstawiamy połączenie nowych eksperymentów ex-ovo i modelowania fizycznego w celu zidentyfikowania mechaniki skręcania mózgu. Na 11. etapie Hamburgera-Hamiltona zarodki są pobierane i hodowane ex ovo (w pożywce). Maszyna wirtualna jest następnie usuwana za pomocą wyciągniętej rurki kapilarnej. Kontrolując poziom płynu i poddając zarodek działaniu granicy faz płyn-powietrze, napięcie powierzchniowe płynu w pożywce może być wykorzystane do zastąpienia mechanicznej roli VM. Przeprowadzono również eksperymenty mikrochirurgiczne w celu zmiany położenia serca, aby znaleźć wynikową zmianę w chiralności skrętu mózgu. Wyniki uzyskane w ramach tego protokołu ilustrują fundamentalne role mechaniki w sterowaniu morfogenezą.

W niniejszym badaniu VM zarodka w stadium HH11 usunięto od końca przedniego do zgięcia piersiowego. Zarodki obrazowano za pomocą systemu OCT. Na tym etapie skręcanie rurki mózgowej nie rozpoczęło się (Rysunek 1A). Po inkubacji do stadium HH15-16 zarodki z usuniętym VM wykazywały zmniejszone skręcanie rurki mózgowej, wynoszące około 35 stopni (Rysunek 1B), w porównaniu do zarodków kontrolnych, u których skręcanie wynosi około 90 s...

Tutaj prezentujemy protokół wprowadzający zestaw nowych eksperymentów ex-ovo i podejść do modelowania fizycznego do badania mechaniki morfogenezy podczas wczesnego skręcania mózgu u zarodków piskląt.

Badanie roli sił fizycznych we wczesnej morfogenezie embrionalnej piskląt

Embryonic development is traditionally studied from the perspective of biomolecular genetics, but the fundamental importance of mechanics in morphogenesis ...

Ogólnym celem tego eksperymentalnego protokołu jest zbadanie roli sił mechanicznych we wczesnym rozwoju embrionalnym mózgu poprzez eksperymenty ex ovo. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii i biomechaniki rozwoju, takie jak rola wskazówek mechanicznych w morfogenezie, czyli wytwarzaniu formy biologicznej. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona scharakteryzowanie roli sił mechanicznych w morfogenezie na poziomie tkanek i organizmów.Aby rozpocząć tę procedurę, użyj delikatnych chusteczek z 70% etanolem, aby oczyścić zapłodnione, wolne od specyficznych patogenów jaja kurze White Leghorn. Następnie ułóż jajka w orientacji wzdłużnej na uchwycie. Następnie ustaw inkubator jaj na temperaturę docelową 37,5 stopnia Celsjusza i utrzymuj wilgotność na poziomie od 48 do 55%Wilgotność jest kontrolowana poprzez dodanie odpowiedniej ilości wody do inkubatora.Inkubować jaja przez około 40 do 44 godzin do HH11 do 13. Następnie pozwól jajom ostygnąć w temperaturze pokojowej przez około 15 do 30 minut przed czyszczeniem 70% etanolem. Na tym etapie rozbij jajka od spodu, delikatnie rozsuń skorupkę i ostrożnie włóż zawartość na szalkę Petriego o wymiarach 150 na 15 milimetrów.Aby upewnić się, że strona zarodka jest podniesiona, utrzymuj jaja w tej samej orientacji, w jakiej były inkubowane podczas ich pękania. Usuń cienką albuminę za pomocą jednorazowej pipety Pasteura. Oddziel gęstą albuminę od żółtka za pomocą kleszczy o końcach.Upewnij się, że gęsta albumina została usunięta, lekko zeskrobując wierzch żółtka. Następnie, za pomocą kleszczyków z cienką końcówką, umieść pierścień z bibuły filtracyjnej na zarodku i wyśrodkuj go, dopasowując długą oś pierścienia do długiej osi zarodka. Następnie odetnij nożyczkami żółtko otaczające pierścień bibuły filtracyjnej.Następnie wyciągnij pierścień i zarodek z żółtka w kierunku ukośnym w kierunku miejsca, w którym żółtko zostało po raz pierwszy przecięte. Następnie opłucz zarodek w dwóch sekwencyjnych 100-milimetrowych naczyniach z PBS o temperaturze pokojowej. Następnie umieść pierścień z bibuły filtracyjnej na 35-milimetrowej szalce Petriego.Umieść zarodek grzbietową stroną do góry na drugiej bibule filtracyjnej na 35-milimetrowej szalce Petriego. Następnie umieść pierścień ze stali nierdzewnej na kanapce z bibuły filtracyjnej. Uważaj, aby nie uszkodzić zarodka.Teraz dodaj trzy mililitry wcześniej przygotowanego CCM do każdej szalki Petriego. Usuń błonę witelinową każdego zarodka, delikatnie przesuwając ciągniętą igłę kapilarną po górnej części zarodka. Następnie oderwij błonę witeliny, zaczynając od przedniego końca i przechodząc do struny grzbietowej.Następnie umieść osiem 35-milimetrowych szalek Petriego w jednej 150-milimetrowej szalce wyłożonej chusteczkami nasączonymi wodą, aby utrzymać wilgotność. Następnie umieść 150-milimetrową szalkę Petriego w zamykanej plastikowej torbie i napełnij worek mieszaniną gazów składającą się z 95% tlenu i 5% CO2. Zamknij worek i umieść go w inkubatorze o temperaturze 37,5 stopnia Celsjusza.Teraz wyjmij zarodek z inkubatora i użyj systemu OCT, aby je zobrazować i określić kąt skrętu cewy nerwowej. Przenieś zarodki do mikroskopu świetlnego i wizualizuj w 10-krotnym powiększeniu. Użyj pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby stopniowo usunąć 0,2 mililitra pożywki z szalki Petriego.Wykonuj zdjęcia w jasnym polu po każdej rundzie usuwania pożywki, aby zaobserwować wpływ interfejsu pożywka-powietrze na zarodek. Kontynuuj usuwanie pożywki, aż napięcie powierzchniowe w poprzek zarodka wywoła skręt. Zobrazuj zarodek ponownie za pomocą systemu OCT, aby ustalić ostateczny kąt skrętu do porównania w celu kontroli zarodków.Aby zmienić kierunek pętli serca, użyj kleszczy, aby odwrócić bibułę filtracyjną tak, aby zarodek stał się brzuszną stroną do góry. Następnie użyj wyciągniętej rurki kapilarnej, aby rozciąć szczelinę w błonie splanchnopleure i wywrzeć siłę mechaniczną, aby popchnąć serce z prawej strony na lewą. Zastosuj napięcie powierzchniowe płynu, aby utrzymać serce po lewej stronie.Następnie inkubuj zarodek przez kolejne 20 godzin, aby zobaczyć zmianę chiralności skrętu. Na zdjęciu pobrany zarodek z usuniętym VM w HH11. Ten sam zarodek inkubował przez 27 godzin po usunięciu VM, wykazując zmniejszone skręcanie.Oto ten sam zarodek, który uległ skręceniu mózgu po zastosowaniu napięcia powierzchniowego płynu, a tutaj jest zarodek kontrolny z normalnym skrętem mózgu w porównywalnym stadium. Podczas wykonywania tej procedury należy uważać, aby nie uszkodzić zarodka. Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić inne metody, takie jak analiza elementów skończonych, w celu obliczeniowego modelowania, w jaki sposób siły fizyczne mogą wpływać na morfologię.W związku z tym opracowana tutaj technika utorowała drogę do przyszłych badań nad mechaniką morfogenezy w zarodkach piskląt. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś zrozumieć, jak zbierać zarodki piskląt do hodowli in vitro, mikrochirurgicznie usuwać błonę witelinową, podsumowywać siłę dostarczaną przez błonę witeliny i monitorować morfologię zarodka za pomocą OCT i obrazowania w jasnym polu.

probing-roles-physical-forces-early-chick-embryonic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W niniejszym materiale wideo zaprezentowano dwukolorową hybrydyzację in situ w całym preparacie (whole mount in situ hybridization), metodę umożliwiającą wizualizację przestrzennego i czasowego wzorca ekspresji dwóch różnych genów w młodych embrionach kurczaka. Metoda ta została pierwotnie wprowadzona przez Davida Wilkinsona, Domingosa Henrique, Phila Inghama i Davida Ish-Horowicza.

Podwójna hybrydyzacja in situ całego preparatu wczesnych zarodków kurczego

Niniejszy artykuł opisuje znakowanie powierzchniowe oraz hodowlę tkanek ex ovo we wczesnym embrionie kurczaka. Przedstawiono techniki umożliwiające obrazowanie w jasnym polu, fluorescencyjne oraz z wykorzystaniem tomografii optycznej koherencyjnej w trybie time-lapse. Śledzenie znaczników powierzchniowych z wysoką rozdzielczością czasowo-przestrzenną pozwala na obliczenie wielkości kinematycznych, takich jak odkształcenia morfogenetyczne, zarówno w dwóch, jak i w trzech wymiarach.

Śledzenie deformacji tkankowych w procesach morfogenetycznych we wczesnym zarodku kurczaka

Poprzez szczepienie koralików nasączonych czynnikami wzrostu lub specyficznymi inhibitorami szlaków sygnałowych do rozwijających się zarodków, możliwe jest bezpośrednie testowanie ich efektów in vivo. W tym protokole kulki są szczepione w zawiązku kończyny w celu określenia wpływu tych cząsteczek na ekspresję genów i transdukcję sygnału.

Szczepienie kulek w rozwijających się kończynach zarodka kurczaka w celu identyfikacji szlaków transdukcji sygnału wpływających na ekspresję genów

Opisane są protokoły wykorzystujące nieprzepuszczalne bariery do blokowania zdarzeń indukcyjnych między tkankami głównej osi ciała a bokiem zarodka pisklęcia, wymagane do tworzenia kończyn. Koraliki nasączone potencjalnymi sygnałami indukcyjnymi są wykorzystywane do przezwyciężenia efektu umieszczania bariery, a analiza ekspresji genów to potwierdza.

Zastosowanie nieprzepuszczalnych barier w połączeniu z kulkami nasączonymi czynnikiem kandydującym do badania sygnałów indukcyjnych w pisklątku

Brak narzędzi do pomiaru właściwości materiału i parametrów rozciągania in vivo uniemożliwia walidację ich ról podczas rozwoju. Zastosowaliśmy mikroskopię sił atomowych (AFM) i śledzenie nanocząstek, aby określić ilościowo cechy mechaniczne nienaruszonej komórki żółtka zarodka danio pręgowanego podczas epibolii. Metody te są niezawodne i mają szerokie zastosowanie, unikając inwazyjnych interwencji.

AFM i mikroreologia w komórkach żółtka zarodka danio pręgowanego

Prezentujemy zestaw pęsety optycznej sprzężonej z mikroskopem z arkuszem świetlnym oraz jej implementację do badania mechaniki komórkowej bez koralików w zarodku Drosophila.

Sondowanie mechaniki komórkowej za pomocą pęsety optycznej bez koralików w zarodku Drosophila

Rekombinowane kończyny to potężny model eksperymentalny, który pozwala badać proces różnicowania komórek i generowania wzorców pod wpływem sygnałów embrionalnych. Protokół ten przedstawia szczegółową metodę generowania rekombinowanych kończyn z komórkami mezodermalnymi kończyn kurczaka, które można dostosować do innych typów komórek uzyskanych z różnych organizmów.

Test rekombinowanych kończyn kurczaka w celu zrozumienia morfogenezy, wzorca i wczesnych etapów różnicowania komórek

Test nasiąkniętych kulek polega na ukierunkowanym dostarczeniu odczynnika testowego w dowolnym momencie rozwoju w celu zbadania regulacji różnicowania i morfogenezy komórek. Przedstawiono szczegółowy protokół, mający zastosowanie do każdego doświadczalnego modelu zwierzęcego, dotyczący przygotowania trzech różnych rodzajów namoczonych koralików i wszczepienia ich w komórkę międzypalcową zarodka kurczaka.

Analiza różnicowania komórek, morfogenezy i wzorcowania podczas embriogenezy kurczaka przy użyciu testu z namoczonymi kulkami

Tutaj opisujemy protokoły dla trzech typów hodowli eksplantatów skóry embrionalnej ptaków, które mogą być użyte do badania interakcji tkankowych, obrazowania 4D filmu poklatkowego (3D plus czas), globalnych lub lokalnych zaburzeń funkcji molekularnych oraz charakterystyki biologii systemów.

Wykorzystanie eksplantatów ze skóry ptaków do badania wzorców tkanek i organogenezy

Ten protokół został opracowany do podłużnego monitorowania właściwości mechanicznych tkanki płytki nerwowej podczas neurulacji zarodka pisklęcia. Opiera się on na integracji mikroskopu Brillouin i systemu inkubacji na etapie, umożliwiającego mechaniczne obrazowanie na żywo tkanki płytki nerwowej w zarodkach piskląt hodowanych ex ovo.

Monitorowanie mechanicznej ewolucji tkanki podczas zamykania cewy nerwowej zarodka pisklęcia

Odkryj metodę ex ovo do badania sił mechanicznych w morfogenezie mózgu zarodków kurzych. Protokół umożliwia analizę wpływu naprężeń powierzchniowych na rozwój biologiczny.

Badanie roli sił fizycznych we wczesnej morfogenezie embrionalnej piskląt

Przeglądaj więcej filmów