Analiza zachowania wzrostu Arabidopsis thaliana w różnych jakościach światła
2 lutego 2018
Tutaj prezentujemy protokół do badania zachowań związanych ze wzrostem roślin, a zwłaszcza fenotypów w powtarzalny sposób. Pokazujemy, jak zapewnić zmienne, a jednocześnie stabilne warunki oświetleniowe. Prawidłowe analizy zależą od wystarczającej liczby prób i prawidłowych ocen statystycznych.
Ogólnym celem tej wizualnej i molekularnej analizy fenotypu jest porównanie wzrostu roślin w różnych warunkach oświetleniowych i o różnych genotypach. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań roślin, takie jak aklimatyzacja do różnych warunków oświetleniowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że daje ona powtarzalne i policzalne wyniki.
Procedurę zademonstruje Franka Seiler, technik w moim laboratorium. Na początek oblicz odpowiednią wielkość próbki i przygotuj wymaganą liczbę doniczek o wymiarach sześć na siedem centymetrów z ziemią i posadź w każdej z nich pojedyncze nasiono. Następnie wernalizuj nasiona w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwa dni.
Ustaw wilgotność względną powietrza w komorze klimatycznej na 65%, a temperaturę na 22 i 16 stopni Celsjusza na 16-godzinny cykl dzienny i ośmiogodzinny cykl nocny. Następnie dostosuj światło na wszystkich poziomach do intensywności 200 mikromoli na centymetr kwadratowy i sekundę. Użyj wbudowanego spektrometru, aby stale monitorować wyjście spektralne.
Umieść rośliny w komorze klimatycznej i przykryj je przezroczystą górą, aż pojawią się dobrze rozwinięte kotalininy. Sprawdzaj wzrokowo rośliny i rejestruj dane dotyczące wzrostu fotograficznie w regularnych odstępach czasu. Aby zapewnić spójne obrazy, użyj statywu do aparatu i paska skali dla każdego zdjęcia.
Najpierw umieść roślinę w ciemności na kilka minut. Następnie ustaw fluorometr z modulacją impulsową i kamerę w odpowiedniej odległości od rośliny. Cała rozeta powinna być widoczna w oknie na żywo.
Uruchom oprogramowanie i wybierz opcję mini, która pojawi się w oknie wyboru jednostki. Następnie kliknij OK. Następnie wybierz niebieski w wyskakującym okienku i kliknij OK.
Wybierz opcję wideo na żywo i obróć pierścień regulacyjny soczewki obiektywu, aby ustawić ostrość obrazu, a następnie wybierz określony region rośliny. Aby wyjść z okna transmisji na żywo, kliknij pole wyjścia w prawym górnym rogu. Zdefiniuj obszar zainteresowania (AOI) z ustawieniami domyślnymi.
Na środku ekranu automatycznie pojawi się okrąg i czerwona ramka ze średnią wartością FT pikseli zawartych w AOI. Musisz usunąć ten obszar zainteresowania przed zdefiniowaniem własnego. Następnie zaakceptuj ustawienia domyślne w zakładce po prawej stronie.
Następnie kliknij dodaj w zakładce AOI i umieść okrąg w obszarze liścia. Powtórz ten proces pięć razy na liść, wybierając kilka liści na roślinę. Zaznacz odpowiednie pole z maksymalną wydajnością kwantową PS 2, aby wybrać obraz FV/FM.
Zastosuj nasyconą lampę błyskową, aby zmierzyć parametry fotosyntezy za pomocą analizy zaciskania fluorescencyjnego, naciskając przycisk F0, FM. Znajdź wyniki na karcie raportu. Zaznacz wszystkie odpowiednie pola i wyeksportuj je do odpowiedniego oprogramowania analitycznego.
W tym badaniu wykorzystano światła LED, aby zapewnić stabilną ilość i jakość światła w obserwacji i analizie wzrostu roślin i typów żył. Dane z roślin zebrano po 12, 21 i 28 dniach od uszycia. Na tym rysunku przedstawiono średnie wpływające wartości plonu kwantowego PS 2 dla 5 roślin i 5 roślin.
Dane z roślin uprawianych w symulowanym świetle słonecznym, wzbogaconym światłem niebieskim lub czerwonym zostały ocenione statystycznie. Rysunek ten przedstawia średnie wpływające wartości plonu kwantowego PS 2 dla 5 roślin i 5 dziennie. Średnie wartości dla roślin uprawianych w świetle niebieskim i czerwonym były znacznie wyższe niż tych uprawianych w symulowanym świetle słonecznym.
Po zainstalowaniu lampy LED mogą zapewnić stabilne lub zmienne warunki oświetleniowe, oszczędzając dużo energii w porównaniu z lampami fluorescencyjnymi. Podczas eksperymentu ważne jest, aby codziennie zajmować się roślinami. Po opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się badaniami nad roślinami do badania zachowań wzrostowych w różnych warunkach oświetleniowych o określonej długości fali.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak uprawiać i analizować rośliny pod kątem ich wizualnego i molekularnego typu żył w sposób ilościowy.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół badania dynamiki wzrostu roślin w zmiennych warunkach oświetlenia. Podkreślono w nim znaczenie powtarzalności oraz oceny statystycznej w analizie fenotypów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia roślin
- Analiza fenotypowa
- Wpływ warunków oświetleniowych
Wstęp
- Zrozumienie aklimatyzacji roślin do różnych warunków oświetleniowych jest kluczowe dla prowadzonych badań.
- Stabilne warunki oświetleniowe mogą zwiększyć wiarygodność badań wzrostu.
- Kwantyfikowalne wyniki są niezbędne do wyciągnięcia poprawnych wniosków naukowych.
- Lampy LED zapewniają energooszczędne opcje oświetlenia dla eksperymentów nad wzrostem roślin.
Cel badania
- Porównanie wzrostu roślin w różnych warunkach oświetleniowych.
- Analiza wpływu różnych genotypów na dynamikę wzrostu.
- Opracowanie powtarzalnej metody analizy fenotypowej.
Zastosowane metody
- Przygotowanie doniczek i wysiew nasion.
- Wernalizacja nasion w niskich temperaturach.
- Konfiguracja komory klimatycznej z kontrolowaną wilgotnością i temperaturą.
- Wykorzystanie fluorometru z modulacją impulsową do pomiaru parametrów fotosyntezy.
Główne wyniki
- Dane zebrane na wielu etapach wzrostu wykazały istotne różnice w wydajności kwantowej.
- Rośliny hodowane pod światłem niebieskim i czerwonym wykazały wyższą wydajność fotosyntetyczną niż te pod symulowanym światłem słonecznym.
- Lampy LED zapewniały stabilne warunki oświetleniowe przez cały czas trwania eksperymentu.
- Metoda ta umożliwia szczegółową analizę wizualną i molekularną fenotypów roślin.
Wnioski
- Niniejszy protokół umożliwia badaczom analizę wzrostu roślin w określonych warunkach oświetlenia.
- Zapewnia on ramy dla powtarzalnej i mierzalnej analizy fenotypów roślin.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej metodzie w celu zbadania dalszych aspektów biologii roślin.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowa analiza wzrostu Arabidopsis thaliana w kontrolowanych warunkach oświetlenia umożliwia rzetelną weryfikację hipotez w obszarze biologii roślin oraz w procesach biotechnologii rolniczej. Stabilne, programowalne środowiska LED i zestandaryzowane pomiary fenotypowe zwiększają pewność predykcyjną na etapie wstępnych odkryć i walidacji cech. Podejście to ogranicza niejednoznaczność eksperymentalną i zwiększa powtarzalność badań translacyjnych oraz rozwoju platform badawczych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia rygorystyczną analizę zależnych od światła ścieżek wzrostu oraz mechanizmów aklimatyzacji.
- Wspiera walidację funkcjonalną celów genetycznych lub molekularnych wpływających na rozwój roślin.
- Zwiększa pewność predykcyjną w wyborze cech i pozwala na ograniczanie ryzyka biologicznego w procesie ulepszania upraw.
Przesiewanie i rozwój testów
- Ustanawia powtarzalne, mierzalne testy fenotypowe dla dalszych etapów procesów przesiewowych.
- Standaryzuje zmienne środowiskowe w celu zapewnienia wiarygodności testów i porównywalności między badaniami.
- Generuje dane ilościowe, takie jak wydajność fotosyntezy i powierzchnia liścia, w celu obiektywnej oceny.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dopasowuje wyniki fenotypowe do punktów końcowych translacyjnych istotnych dla wydajności upraw i adaptacji do stresu.
- Zapewnia ciągłość od badań w środowisku kontrolowanym do oceny cech istotnych w warunkach polowych.
- Umożliwia dostosowany do ryzyka postęp w rozwoju cech kandydackich lub modyfikacji genetycznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół wpisuje się w kontinuum od odkrycia do walidacji, wspierając wczesne testowanie hipotez, opracowywanie testów analitycznych oraz translacyjną ocenę cech.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez zerowych i wyjaśnianie ścieżek sygnałowych dla cech wzrostu reagujących na światło.
- Przesiewanie: Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne testy fenotypowe z ilościowymi wynikami do analizy porównawczej.
- Analityka: Dostarcza wiarygodnych pomiarów parametrów fotosyntetycznych i wskaźników wzrostu do oceny statystycznej.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki z kontrolowanego środowiska z przedkliniczną walidacją cech w biotechnologii roślin uprawnych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje skalowalną, wielokrotnego użytku platformę do różnorodnych badań nad genotypami i odpowiedziami na czynniki środowiskowe.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w odkrywaniu cech.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, odtwarzalność i skalowalność analiz fenotypowych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową w procesach rozwoju cech.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój kandydackich cech lub celów.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu fizjologii roślin, fenotypowania oraz analizy statystycznej.
- Niezbędne są programowalne komory klimatyczne z oświetleniem LED oraz aparatura do obrazowania i fluorometrii.
- Wymagana jest standaryzacja protokołów środowiskowych i pomiarowych pomiędzy zespołami.
- Możliżna jest konieczność adaptacji metody dla różnych gatunków roślin lub końcowych punktów pomiarowych cech.
- Moc statystyczna zależy od wystarczającej wielkości próby i liczby powtórzeń, zgodnie z opisem w protokole.
