Kwantyfikacja histologiczna w celu określenia obciążenia grzybicą płuc w eksperymentalnej aspergilozie

Ogólnym celem tego protokołu jest ilościowe określenie obciążenia grzybiczego płuc u myszy z inwazyjną aspergilozą za pomocą analizy histologicznej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie patogenezy grzybów dotyczące ochronnych i szkodliwych mechanizmów odpowiedzi gospodarza oraz kluczowych czynników wirulencji grzybów. Główną zaletą tej techniki jest to, że istniejące próbki histologiczne można wykorzystać do uzyskania obciążenia grzybami z wynikami porównywalnymi do ilościowego zastosowania PCR DNA grzyba płuc.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w inwazyjną aspergilozę, może być również stosowana w innych badaniach nad chorobami, w których patogeny mogą być różnie barwione w tkankach gospodarza. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zaczęliśmy myśleć o alternatywnych metodach ilościowego określania obciążenia grzybicą płuc o mniejszej zmienności niż metody ilościowe DNA. Procedury infekcji i zbiorów zademonstruje Angar Tsoggeral, technik badawczy.

24 godziny przed zakażeniem należy zubożyć liczbę neutrofili u każdej eksperymentalnej myszy w wieku od siedmiu do 10 tygodni za pomocą 0,5 miligrama przeciwciała anty-mysiego Ly-6G w sterylnym roztworze soli fizjologicznej podawanej dootrzewnowo pod kątem 45 stopni do bocznego dolnego prawego kwadrantu każdego zwierzęcia i przywrócić myszy do ich klatek. Następnego ranka wlej 1,5 grama 0,5-milimetrowych szklanych kulek na płytkę z kulturą konidiów A.fumigatus i delikatnie przechylaj płytkę w przód iw tył, aż kulki pokryją się grzybem. Zbierz mieszaninę kulek pokrytych konidią do 15-mililitrowej stożkowej rurki i zawieś kulki w pięciu mililitrach DPBS.

Wiruj kulki, aby oderwać je od grzyba i policz konidia w 50-krotnym rozcieńczeniu supernatantu na hemocytometrze. Rozcieńczyć konidia do jednego razy 10 do 8 konidiów na mililitr stężenia DPBS i załadować 50 mikrolitrów roztworu konidiów na mysz do indywidualnych mikropipet. Po potwierdzeniu braku reakcji na uszczypnięcie palca u nogi, umieść pierwszą znieczuloną mysz na skośnej desce w pozycji leżącej na plecach i delikatnie przytrzymuj górne siekacze gumką, a dolne siekacze metalowym drutem.

Następnie użyj małych kleszczy, aby ostrożnie przytrzymać język przy pełnym wyprostowaniu i dostarczyć 50 mikrolitrów roztworu konidiów do podstawy języka. Trzymając język w pełnym wyprostu, nasłuchiwać przyspieszonego oddechu i wyraźnego kliknięcia zasysania przez 20 sekund lub do momentu całkowitego zassania zawiesiny. Następnie delikatnie zawróć mysz do klatki z monitorowaniem aż do pełnego leżenia i zainfekuj następne zwierzę.

Gdy wszystkie myszy zostaną zainfekowane, wstrzyknij podgrupie zwierząt środek przeciwgrzybiczy i powtórz zubożenie neutrofili u wszystkich zwierząt 24 godziny po zakażeniu. Trzy dni po podaniu grzyba umieść pierwszą mysz w pozycji leżącej na plecach na piankowej desce pokrytej podkładką chłonną. Upewnij się, że mysz została poddana eutanazji za pomocą szczypania palca u nogi i zdezynfekuj włosy 70% etanolem.

Po zabezpieczeniu kończyn za pomocą nożyczek ostrożnie otwórz górną jamę klatki piersiowej, odcinając klatkę piersiową, aby odsłonić płuca i serce. Przeciąć żyłę główną dolną schodzącą z serca, uważając, aby uniknąć przecięcia innych naczyń krwionośnych lub przebicia jakichkolwiek narządów, i użyj pięciomililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 25 trzymaną pod kątem 45 stopni, aby powoli przetoczyć pięć mililitrów zimnego DPBS do prawej komory serca. Po perfuzji z pięcioma mililitrami 10% formaliny w ten sam sposób ostrożnie odsłoń tchawicę i oderwij otaczające ją poduszeczki tłuszczowe, uważając, aby nie przebić tchawicy.

Podnieś odsłoniętą tchawicę za pomocą kleszczy i użyj igły o rozmiarze 25, aby zrobić otwór w górnej tchawicy. Ostrożnie włóż kaniulę przez otwór w kierunku płuc i luźno zawiąż nić chirurgiczną wokół tchawicy, aby zabezpieczyć kaniulę. Użyj jednomililitrowej strzykawki, aby napompować płuca jednym mililitrem 10% buforu formaliny przez kaniulę i szybko, ale ostrożnie wyjmij kaniulę.

Dokręć nić chirurgiczną, aby uszczelnić tchawicę i delikatnie pociągnij za nić, aby odłączyć tkankę łączną, umożliwiając pobranie płuc i tchawicy. Umieść chusteczki w 15-mililitrowej stożkowej probówce zawierającej 15 mililitrów 10% buforu formalinowego z jednym końcem nici na zewnątrz tuby. Następnie uszczelnij nakrętkę i odwróć probówkę, aby całkowicie zanurzyć próbkę i utrwalacz na co najmniej 24 godziny.

Aby zobrazować pobraną tkankę, najpierw otwórz odpowiedni program do kwantyfikacji obrazowania i użyj mikroskopu świetlnego, aby uzyskać co najmniej cztery odrębne pola zmodyfikowanego srebra metanaminowego Gomoriego lub szkiełka barwionego GMS pod obiektywem 10X. Upewnij się, że obrazy są reprezentatywne dla zakażonych dróg oddechowych w płucach i że wykazują podobną gęstość tkanki. Aby dodać podziałki liniowe do obrazów, w menu Edycja wybierz opcję Dodaj/Edytuj znaczniki kalibracji i wybierz grubość linii, kolor i rozmiar paska skali.

Kliknij obraz, w którym ma zostać umieszczony pasek skali, a następnie otwórz menu Edycja i wybierz opcję Scal i scal znaczniki kalibracji, aby dodać pasek skali do każdego obrazu i zapisać obrazy w odpowiednich folderach grup eksperymentalnych. Aby obliczyć obciążenie grzybami u każdego zwierzęcia, otwórz odpowiedni program do przetwarzania obrazu i otwórz pierwszy folder obrazów. W menu Obraz wybierz Typ i Stos RGB, aby przekonwertować obrazy.

Za pomocą strzałki w prawo wybierz drugi z trzech obrazów i naciśnij Control-Shift-T, aby otworzyć regulator ustawień menu Próg. Znajdź oryginalny obraz tiff lub jpg jako odniesienie i otwórz obraz za pomocą programu do przeglądania obrazów. Przy wyborze wartości progowej bardzo ważne jest, aby móc wyświetlić oryginalny obraz, tak aby wybrany obszar był reprezentatywny dla strzępek grzybów i aby zapewnić spójność między próbkami.

Przesuń górny suwak maksymalnie w lewo i dostosuj dolny suwak, aż wybrany czerwony obszar będzie reprezentatywny dla obrazu mikroskopowego. Kliknij Ustaw i OK, a następnie wybierz Analizuj i ustaw pomiary, sprawdzając obszar, ułamek obszaru, Limit do progu, Wyświetl etykietę i pozostawiając dolne ustawienia jako domyślne. Kliknij przycisk OK i wybierz opcję Analizuj i mierz.

Powinny pojawić się wyniki. Następnie wyeksportuj dane do programu do analizy danych w celu sporządzenia wykresu i analizy statystycznej, a następnie wprowadź średnią z czterech lub więcej procentów powierzchni dla każdej próbki płuc. Jak pokazuje ten reprezentatywny wykres przeżycia, myszy z niedoborem eozynofili z inwazyjną aspergilozą leczone środkiem przeciwgrzybiczym po zakażeniu wykazują zwiększoną przeżywalność w porównaniu ze zwierzętami typu dzikiego.

Reprezentatywne barwienie GMS od neutropenicznych myszy typu dzikiego i myszy z niedoborem eozynofili z inwazyjną aspergilozą ujawnia prawie całkowity klirens grzybów u myszy z nokautem leczonych przeciwgrzybiczo, który nie jest odwzajemniony u zwierząt typu dzikiego z leczeniem przeciwgrzybiczym lub bez. Co więcej, ilościowa PCR i ręczna mikroskopia świetlna Kwantyfikacja GMS, jak właśnie wykazano, potwierdzają, że leczenie środkami przeciwgrzybiczymi powoduje najbardziej znaczące zmniejszenie obciążenia grzybami między myszami typu dzikiego i z niedoborem eozynofili. Jednak u nieleczonych myszy tylko kwantyfikacja GMS określiła znaczny spadek myszy z niedoborem eozynofili w tym eksperymencie.

Gdy średnie obszary całych wycinków płuc wybarwionych GMS są obliczane pod czterokrotnym powiększeniem, różnice są podobne do wyników uzyskanych dla czterech reprezentatywnych pól 10X, chociaż z mniejszą istotnością statystyczną. Podobne wyniki przeżycia, obciążenia grzybami i usuwania grzybów obserwuje się również u myszy z niedoborem limfocytów T gamma-delta leczonych tym samym środkiem przeciwgrzybiczym. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zachować konsekwencję podczas robienia zdjęć odcinków histologicznych i dostosowywania wartości progowej w celu uzyskania porównywalnych wyników.

Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody obejmujące analizę histologiczną próbek z wyraźnymi różnicami między barwieniem docelowym a tłem, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania związane z patologią choroby w płucach i innych tkankach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zarażać myszy konidiami grzybiczymi przez mimowolne aspiracje i jak mierzyć wzrost grzybów w skrawkach tkanki płucnej za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu. Nie zapominaj, że praca z Aspergillus fumigatus i modyfikowaną metanaminą Gomori może być niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie środków ochrony osobistej i praca pod dobrze wentylowanym kapturem.