Izolacja mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkiej okostnej pęcherzyków płucnych i wpływ witaminy D na aktywność osteogenną komórek pochodzących z okostnej

Ogólnym celem tego badania jest zbadanie osteoindukcyjnego wpływu witaminy D na hodowane mezenchymalne komórki macierzyste, które zostały pobrane z okostnej wyrostka zębodołowego. Zastosowanie mezenchymalnych komórek macierzystych to ogromny postęp w stomatologii w ciągu ostatniej dekady. Zostały one z powodzeniem wyizolowane i wyhodowane z wielu części tkanki zęba.

Celem jest jednak wyizolowanie i hodowla mezenchymalnych komórek macierzystych z okostnej pęcherzyków płucnych oraz zbadanie potencjału osteoindukcyjnego związku witaminy D. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej materii będą zmagać się z nową ideą tworzenia kości w mezenchymalnych komórkach macierzystych pochodzących z okostnej pęcherzyków płucnych. Personel laboratoryjny zademonstruje procedurę Pani Hsin-Wen Chi.Jest

ona asystentką naukową z mojego laboratorium. Na początek pobierz tkanki okostnej od pacjentów podczas chirurgii stomatologicznej za pomocą separatora okostnej. Zbierz plasterki o wymiarach około dwóch na pięć milimetrów.

Przechowuj plastry tkanek w DPBS z antybiotykami. W laboratorium użyj skalpela, aby dokładnie zmielić fragmenty tkanki okostnej pęcherzyków płucnych w ciągu 24 godzin od pobrania. Następnie hoduj tkankę na 35-milimetrowych szalkach Petriego w odpowiednim pożywce do hodowli.

Użyj nawilżonego inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% gazowym dwutlenkiem węgla. Trzy dni później wyrzuć zebrane tkanki okostnej i zmień podłoże. Gdy komórki rozmnożą się do około 80% konfluencji, odłącz hodowane komórki, dodając trypsynę.

I inkubacja kultury przez trzy minuty. Następnie dodaj 0,8 mililitra pożywki, aby zakończyć odłączanie. Po zebraniu i zliczeniu rozprowadź 5 000 komórek w jednym mililitrze na płytkę.

Na tym etapie oznacz posiane komórki jako pasaż pierwszy. Hoduj te komórki i oddziel je ponownie po tym, jak rozmnożą się do 80% konfluencji. Pożywka z pasażem pierwszym ma początkowo kolor pomarańczowo-czerwony.

Kiedy podłoże zacznie zmieniać kolor na pomarańczowy trzy dni później, zmień je. Gdy przejście jednej komórki osiągnie 80% konfluencji, utwórz komórki od drugiej do piątej generacji, powtarzając te same procedury, które są używane do przygotowania pokolenia zerowego do pierwszego pokolenia. Zmieniaj podłoże dwa razy w tygodniu.

Cztery tygodnie później oceń potencjał komórek do różnicowania się w linię osteogenną, obserwując morfologię komórek pod mikroskopem. Wykonaj badania przesiewowe za pomocą testu von Kossa. Ten test odróżnia obecność zwapniałych osadów w twojej kulturze.

Umyj komórki PBS i utrwal je przez 30 minut w jednym mililitrze 10% formaliny. Następnie usuń formalinę, a następnie umyj komórki i potraktuj je 5% azotanem srebra. Wystaw komórki na działanie światła UV przez godzinę.

Następnie usuń azotan srebra i potraktuj komórki dwoma mililitrami 5% siarczanu sodu cztery razy przez trzy minuty za każdym razem. Roztwór należy wymieniać między zabiegami. Na koniec umyj komórki dwukrotnie wodą destylowaną.

W 20 z 34 próbek tkanki okostnej udało się uzyskać kolonie komórek macierzystych pochodzących ze szpiku. Nie stwierdzono żadnych czynników związanych z dawcami, które miałyby istotny wpływ na sukces hodowli. Początkowo PDC tworzyły kolonie i kuliste klastry z mieszanką komórek okrągłych i wrzecionowatych.

Po pierwszym pasażu komórki były jednorodnie podobne do fibroblastów o wrzecionowatym kształcie. Pod koniec różnicowania osteogennego test von Kossa wykazał możliwą obecność złogów wapnia i różnicowanie osteogenne. Wyniki te zdecydowanie wskazują, że wśród populacji komórek okostnej komórki progenitorowe mają potencjał do różnicowania się w komórki osteogenne.

Osteogenne komórki prekursorowe potraktowano również kalcytriolem i zbadano za pomocą RTPCR w celu oceny poziomu ekspresji fosfatazy alkalicznej, która jest silnym wskaźnikiem wczesnego różnicowania osteogennego komórek. Zarówno leczenie witaminą C, jak i kalcytriolem, aktywnym metabolitem witaminy D, zwiększało ekspresję fosfatazy alkalicznej. Ponadto ekspresja poziomu mRNA kolagenu wzrosła w odpowiedzi na te same zabiegi.

Stwierdzono, że ekspresja mRNA sialoproteiny kości wzrasta w komórkach traktowanych wyższym stężeniem kalcytriolu. Jednak ekspresja CBFA i mRNA ostowapnia nie reagowały na leczenie. Po obejrzeniu tego filmu widzowie powinni dobrze zrozumieć protokół mineralizacji i hodowli okostnej pęcherzyków płucnych człowieka.

Po opanowaniu tego pościgu można go wykonać w ciągu czterech do pięciu tygodni, jeśli zostanie wykonany prawidłowo. Podczas prób tego eksperymentu ważne jest, aby użyć ostrożnej i sterylnej techniki, aby uniknąć zanieczyszczenia komórki.