Name: Izolacja mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkiej okostnej pęcherzyków płucnych i wpływ witaminy D na aktywność osteogenną komórek pochodzących z okostnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Poznaj izolację mezenchymalnych komórek macierzystych z okostnej pęcherzyków płucnych i wpływ witaminy D na ich aktywność osteogenną. Ta metoda umożliwia badanie potencjału różnicowania komórek w zastosowaniach stomatologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Protokół badania został zatwierdzony przez Institutional Review Board for Clinical Research of Chang Gung Memorial Hospital (IRB99-1828B, 100-3019C, 99-3814B, 102-1619C, 101-4728B i 103-4223C). Badanie to było wspierane przez Chang Gung Memorial Hospital (CMRPG392071, CMRPG3A1141, CMRPG3A1142 i NMRPG3C0151). Ten rękopis został zredagowany przez Wallace Academic Editing.

Protokół badania został zatwierdzony przez Institutional Review Board of Chang Gung Memorial Hospital. Wszyscy uczestnicy wyrazili pisemną świadomą zgodę.
1. Przygotowanie tkanek
<ol>
	<li>Pobieranie tkanek okostnej od pacjentów podczas zabiegu chirurgii stomatologicznej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Po odbiciu płata w znieczuleniu miejscowym należy pobrać fragment tkanki okostnej z kości wyrostka zębodołowego za pomocą separatora okostnej31.</li>
	<li>Po zbiorach należy przechowywać plastry tkanek okostnej o wielkości około 5 mm × 2 mm w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco z 300 j./ml penicyliny i 300 mg/ml streptomycyny. Przenieść tkanki do laboratorium w ciągu 24 godzin.</li>
	<li>Fragmenty tkanki okostnej pęcherzyków płucnych należy rozdrobnić skalpelami, aż zostaną dobrze rozdrobnione, a następnie utrzymać próbki w pożywce pasażowej 0 (składającej się z 300 U/ml penicyliny i 300 mg/ml streptomycyny, α-MEM i 5% płodowej surowicy bydlęcej [FBS]) hodowanej w inkubatorze w temperaturze 37 °C z wilgotnym powietrzem (5% dwutlenku węgla). W inkubatorze przygotuj miskę na wodę, aby utrzymać wilgotność.</li>
	<li>Zmień podłoże po 3 dniach, a następnie dwa razy w tygodniu.</li>
	<li>Gdy komórki osiągną subkonfluencję (80%), uwolnij przylegające komórki z 200 μl 0,25% trypsyny w inkubatorze (37 °C) na 3 minuty, a następnie użyj 4,5 ml pożywki do zakończenia reakcji.</li>
	<li>Ponownie umieść komórki w świeżym pasażu 1 pożywce (α-MEM, 10% FBS, 100 jednostek/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny). Płytka składa się z 5 × 103 komórek (zliczonych za pomocą hemocytometru).</li>
	<li>Wykonuj każde kolejne przejście po osiągnięciu przez komórki 80% konfluencji31. 
	UWAGA: Na początku podłoże będzie pomarańczowo-czerwone. Po około trzech dniach średni kolor powinien zmienić się na żółtawy odcień. Czas podwajania komórek wynosi około 30–40 godzin, co wymaga 7 dni na 3–5 pokoleń.</li>
	<li>Hodowla wyizolowanych PDC w α-MEM uzupełnionych 10% FBS, 100 U/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny w inkubatorze (37 °C, 5% CO2).</li>
	<li>Codziennie obserwuj wzrost komórek i wymieniaj pożywkę dwa razy w tygodniu. Używaj komórek od trzeciej do piątej generacji do wszystkich dalszych eksperymentów.</li>
</ol>
2. Cytometria przepływowa
<ol>
	<li>Zbierz 1 × 106 komórek poprzez trawienie trypsyny:
	<ol>
		<li>Dodaj 200 μl 0,25% trypsyny. Po 3 minutach użyć 4,5 ml pożywki hodowlanej zawierającej FBS, aby zakończyć reakcję trypsyny i zebrać przez odwirowanie (1500 obr./min, 5 min, 22 °C).</li>
		<li>Umyj granulki komórek trzy razy za pomocą 1x DPBS. Ponownie zawiesić komórki w 200 μl 1x bufor przepuszczalny. Policz komórki za pomocą hemocytometru.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbadaj wyrażone markery powierzchniowe PDC za pomocą cytometrii przepływowej (sortowanie komórek aktywowane fluorescencją)32. Użyj przeciwciał monoklonalnych (MAb) przeciwko CD19 (izotiocyjanian fluoresceiny (FITC)), CD34 (FITC), CD44 (fikoerytryna [PE]), CD45 (FITC), CD73 (PE), CD90 (allofikocyjanina [APC]), CD146 (PE), STRO-1 (Alex) i HLA-DR (FITC)32.
	<ol>
		<li>Dodać przeciwciała do próbek i hodować je w ciemności w temperaturze 4 °C przez 30 minut.</li>
		<li>Umyj komórki trzykrotnie 1x DPBS.</li>
		<li>Napraw komórki za pomocą 2% formaldehydu i kontynuuj analizę cytometrii przepływowej32.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przyczepność i żywotność komórek z różnicowaniem osteogennym, adipogennym i chondrogennym
Indukuj różnicowanie w komórkach na linie osteogenne, adipogenne i chondrogenne poprzez hodowlę komórek okostnej we wszystkich trzech przejściach na sześciodołkowych płytkach ze specyficznymi mediami różnicującymi.
<ol>
	<li>W celu różnicowania kościobiornego należy hodować komórki w α-MEM o gęstości 5000 komórek na studzienkę na sześciodołkowych płytkach hodowlanych.
	<ol>
		<li>Po osiągnięciu 80% konfluencji hoduj komórki w pożywkach zawierających α-MEM, 5% FBS, β-glicerofosforan (10 mM), 10−7 M deksametazon (0,1 mM) i 5 ml kwasu askorbinowego (100 mM). Hodowla kontroli negatywnej w pożywkach składających się z α-MEM i 5% FBS.</li>
		<li>Zmieniaj nośnik dwa razy w tygodniu.</li>
		<li>Po 4 tygodniach oceń potencjał komórek do różnicowania się w linię osteogenną, barwiąc komórki za pomocą testu von Kossa, który rozróżnia obecność zwapniałych osadów w culture33.
		<ol>
			<li>Dodaj 10% formaliny do utrwalenia. W ciągu 30 minut dodaj 5% azotanu srebra i poddaj działaniu światła ultrafioletowego (UV) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Dodaj 5% Na2SO4 cztery razy, pozostawiając 3 minuty na każdą reakcję. Na koniec umyj komórki dwukrotnie wodą destylowaną. 
			UWAGA: Barwienie von Kossa to reakcja wytrącania, w której jony srebra i fosforan reagują w obecności kwaśnego materiału; Ta technika barwienia nie jest specyficzna dla wapnia. W tym badaniu, gdy badane komórki potraktowano roztworem azotanu srebra, wapń – który jest redukowany przez silne światło UV – został zastąpiony srebrem, które stało się widoczne jako srebro metaliczne.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celu różnicowania adipogennego hoduj komórki o gęstości 5000 komórek na basenie na sześciodołkowych płytkach hodowlanych zawierających α-MEM.
	<ol>
		<li>Po osiągnięciu 80% konfluencji hoduj komórki w pożywkach zawierających α-MEM, 5% FBS, 0,5 mM 3-izobutylo-1-metyloksantyny (100 mg / ml), 1% penicyliny, 10-6 M deksametazonu (1 mM), insulinę (5 mg / ml) i indometacynę (60 mM).</li>
		<li>Hodowla kontroli negatywnej w pożywkach składających się z α-MEM i 5% FBS.</li>
		<li>Po 6–9 tygodniach użyj czerwonego oleju O, aby zabarwić komórki i podkreślić krople lipidów, określając w ten sposób obecność różnicowania adipogennego33:
		<ol>
			<li>Dodaj 10% formaliny do utrwalenia. W ciągu 30 minut zabarwić komórki 0,5% czerwienią olejową O w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a następnie trzykrotnie umyć komórki 60% izopropanolem przez 3 minuty za każdym razem; Na koniec umyj komórki wodą destylowaną. 
			UWAGA: Czerwień olejowa O jest barwnikiem diazowym lizochromowym (rozpuszczalnym w tłuszczach) używanym do barwienia obojętnych lipidów, głównie triacyloglicerolu, lipoprotein i estrów cholesterolu. Barwnik rozpuszcza się w kropelkach lipidów w komórce, zmieniając kolor kropelek lipidów na czerwony.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celu różnicowania chondrocytów, hoduj komórki na sześciodołkowych płytkach hodowlanych, z których każda zawiera 5000 komórek.
	<ol>
		<li>Dodać pożywkę różnicującą zawierającą α-MEM, 5% FBS, 10−7 M deksametazon (0,1 mM), pirogronian sodu (100 μg/ml), insulinę-transferynę-selen-A (1 × ITS), transformujący czynnik wzrostu-β (10 ng/ml) i 5 ml kwasu askorbinowego (100 μM).</li>
		<li>Hodowla kontroli negatywnej w pożywkach składających się z α-MEM i 5% FBS.</li>
		<li>Po 4-5 tygodniach użyj barwienia niebieskim Alcian, aby podkreślić kwaśne polisacharydy, takie jak glikozaminoglikany lub niektóre rodzaje mukopolisacharydów, w chrząstce komórek, aby określić obecność różnicowania chondrocytów33.
		<ol>
			<li>Dodaj 10% formaliny do utrwalenia. W ciągu 30 minut dodaj 3% kwasu octowego i odczekaj 2 minuty na reakcję. Następnie przemyć trzykrotnie wodą destylowaną, dodać 1% błękitu Alcian 8GX inkubowanego przez 30 min, a następnie przemyć wodą destylowaną. Na koniec dodaj 3% kwasu octowego i myj przez 3 min, a następnie umyj wodą destylowaną do końca. 
			UWAGA: Części komórki, które specyficznie barwią się tym barwnikiem, po barwieniu stają się niebieskie do niebiesko-zielonego i nazywane są "alcianofilnymi".</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Wpływ 25-dihydroksywitaminy D3 (1,25-(OH)2D3) na osteogenezę
<ol>
	<li>Podzielić PDC od P3 do P5 na sześć grup i hodować na płytkach 6-dołkowych z różnymi pożywkami hodowlanymi:</li>
	<li>grupa negatywna (α-MEM i 5% FBS);</li>
	<li>Grupa witamin C (α-MEM, 5% FBS, 10 mM β-glicerofosforanu i 10−7 M deksametazon + 100 uM witaminy C);</li>
	<li>i grupa 10−7 M 1,25-(OH)2D3 (α-MEM, 5% FBS, 10 mM β-glicerofosforan i 10−7 M deksametazon + 10−7 M 1,25-(OH)2D3).</li>
	<li>Dodać 2 ml pożywki do inkubatora (37 °C) w każdym dołku i zmieniać pożywkę dwa razy w tygodniu.</li>
</ol>
5. Odwrotna transkrypcja/Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym
<ol>
	<li>Po 7 dniach różnicowania osteoblastów, wyizolować całkowite RNA na lodzie za pomocą dostępnego w handlu odczynnika (patrz Tabela Materiałów):
	<ol>
		<li>Dodać 1 ml odczynnika izolacyjnego do każdej studzienki. Dodać 200 μl bromochloropropanu i pozostawić na 10 minut w celu wytworzenia warstwowego RNA, a następnie odwirować z prędkością 10 000 obr./min przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Po odwirowaniu dodać 500 μl 2-propanolu do 500 μl supernatantu zawierającego RNA. Wytrącić RNA na lodzie i odczekać 15 minut na reakcję.</li>
		<li>Po zabiegu odwirować z prędkością 12 000 obr./min przez 15 minut w temperaturze 4 °C, po czym RNA znajduje się na dnie probówki. Następnie usunąć sklarowany osad przy użyciu 1 ml 75% alkoholu do przemywania i odwirować z prędkością 7 500 obr./min przez 8 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Usunąć supernatant i użyć koncentratora próżniowego do wytworzenia RNA z dna cieczy. Odzyskać za pomocą wody.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwrotna transkrypcja RNA (1 μg) przy użyciu odwrotnej transkryptazy wirusa mieloblastozy ptaków. Ustawić reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) tak, aby przebiegała w temperaturze 25 °C przez 10 minut, następnie w temperaturze 50 °C przez 60 minut, a następnie w temperaturze 85 °C przez 5 minut, zanim ostatecznie utrzyma się w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zsyntetyzuj pierwszą nić komplementarnego DNA (cDNA). Wykonaj ilościową PCR (qPCR) przy użyciu 5 μl cDNA rozcieńczonego w stosunku 1:10. Przeprowadź ilościowy RT-PCR (QRT-PCR) przy użyciu starterów dla ALP, BSP, OCN, CBFA1 i kolagenu-1. 
	UWAGA: Aby uniknąć zanieczyszczenia DNA sygnałami, sekwencje do przodu i do tyłu każdego startera zostały zaprojektowane na odrębnych eksonach.</li>
	<li>Wykonaj qPCR przy użyciu komercyjnej mieszanki PCR Master Mix (patrz Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta. Ustaw termocykler na 50 °C na 2 minuty, następnie 95 °C na 10 minut, a następnie 40 cykli każdy w temperaturze 95 °C na 15 s, a następnie 60 °C na 60 s. 
	UWAGA: Protokół SYBR wymaga również etapu krzywej topnienia, który jest prowadzony w temperaturze 95 °C przez 15 s, 60 °C przez 60 s, a następnie 95 °C przez 15 s.</li>
	<li>Znormalizuj wartości progowe cyklu dla ALP, BSP, CBFA1, kolagenu-1 i OCN do wartości genu porządkowego GAPDH. 34</li>
	<li>Pary podkładów są wymienione w tabeli materiałów.</li>
</ol>
6. Aktywność fosfatazy alkalicznej
<ol>
	<li>Oceń aktywność enzymu ALP w komórkach za pomocą wcześniej opisanej techniki35, która przekształca fosforan p-nitrofenylu w p-nitrofenol; Fosforan p-nitrofenylowy jest substratem fosfatazy, który zmienia kolor na żółty po defosforylacji przez ALP, jak określono przy długości fali 405 nm. Normalizować całkowity utworzony p-nitrofenol na podstawie całkowitego białka określonego w teście Bradforda.</li>
	<li>Porównaj aktywność ALP kontrolnej (α-MEM, 5% FBS), witaminy C (α-MEM, 5% FBS, 10 mM β-glicerofosforanu, 10−7 M deksametazonu + 100 uM witaminy C), 1,25-(OH)2D3 (α-MEM, 5% FBS, 10 mM β-glicerofosforanu i 10−7 M deksametazonu + 10−8 M 1,25-(OH)2D3), i grupy Witamina C + 1,25-(OH)2D3 (α-MEM, 5% FBS, 10 mM β-glicerofosforanu, 10−7 M deksametazon + 100 uM Witamina C +1,25-(OH)2D3) po 1, 2, 3 i 4 tygodniach hodowli.</li>
	<li>Wykonaj procedurę ekstrakcji białka na lodzie:
	<ol>
		<li>Zeskrobać komórki z płytek 6-dołkowych i dodać 50 μl buforu do lizy. Następnie umieść komórki na lodzie na 30 minut, aby zniszczyć komórki i uwolnić białko.</li>
		<li>Po 30 minutach odwirować z prędkością 13000 obr./min w temperaturze 4 °C przez 15 min. Po odwirowaniu ekstrahować supernatant do przechowywania i użycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Niedawno opracowana metoda terapeutyczna, a mianowicie inżynieria tkankowa wykorzystująca MSC, ma wiele zalet. MSCs, które są obecne w kilku typach tkanek, są komórkami multipotencjalnymi, które mogą różnicować się w różne funkcjonalne komórki tkanki mezodermalnej37 i inne komórki, takie jak osteoblasty.
Okostna służy jako nisza dla komórek progenitorowych i jako bogate zaopatrzenie naczyniowe dla kości, którą otacza38. W naszym badaniu, z 34 bad...

Chociaż w ostatnich latach opracowano wiele odpowiednich technik, rekonstrukcja kości pozostaje ograniczona przez wiele ograniczeń, a oszacowanie zakresu koniecznej rekonstrukcji jest często niemożliwe. Augmentacja tkanek twardych jest wymagana do osiągnięcia zarówno celów estetycznych, jak i funkcjonalnych, a także korzystnego długoterminowego wskaźnika sukcesu. Metody powszechnie stosowane w takich procedurach obejmują autogenny i allogeniczny przeszczep kości, ksenograf i alloplastyczny przeszczep kości. Spośród różnych rodzajów przeszczepów kostnych za najskuteczniejsze uważa się autogenne przeszczepy kostne. Jednak zachorowalność w miejscu dawczym, upośledzone unaczynienie i ograniczona dostępność tkanek1 były głównymi wadami autogennego przeszczepu kości. Ponadto allogeniczne przeszczepy kostne i ksenoprzeszczepy są związane z przenoszeniem chorób. Obecnie syntetyczne przeszczepy kostne są szeroko stosowane w celu rozwiązania tych problemów. Jednak ze względu na brak potencjału osteogennego, wyniki kliniczne są bardzo zróżnicowane. Materiały takie jak celuloza są związane z wahaniami objętości, infekcjami i brakiem wytrzymałości.
Augmentacja kości za pomocą inżynierii tkankowej wzbudziła spore zainteresowanie. W tej technice mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) są początkowo wykorzystywane do promowania różnicowania osteoblastów, które są następnie przeszczepiane do miejsca utraty masy kostnej w celu naprawy kości. Procedura ta jest obecnie stosowana w terapii komórkowej. Osiągnięcie rekonstrukcji kości poprzez ekstrakcję ograniczonej ilości tkanki jest prostsze i mniej inwazyjne w porównaniu z innymi metodami.
Potencjalna rola MSCs jako narzędzia do terapii komórkowych mających na celu regenerację zębów jest coraz bardziej interesująca wśród różnych grup badawczych. Badania potwierdziły, że MSCs można odróżnić od następujących typów tkanek: szpik kostny, tkanka tłuszczowa, błona maziowa, perycyt, kość beleczkowa, ludzka pępowina i tkanki zębowe2,3. Częstymi źródłami MSCs są szpik kostny, tkanka tłuszczowa i tkanki zębowe. W porównaniu z MSCs pochodzącymi z tkanki tłuszczowej i szpiku kostnego, zaletą komórek macierzystych zęba jest łatwa dostępność i mniejsza zachorowalność po pobraniu. W porównaniu z embrionalnymi komórkami macierzystymi, MSCs pochodzące z tkanek zęba wydają się nieimmunogenne i nie wiążą się ze złożonymi problemami etycznymi3.
W 2006 roku Międzynarodowe Towarzystwo Terapii Komórkowej zaleciło stosowanie następujących standardów do identyfikacji MSC: Po pierwsze, MSC muszą być zdolne do przyczepiania się do plastiku. Po drugie, MSCs muszą być dodatnie dla antygenów powierzchniowych CD105, CD73 i CD90 oraz ujemne dla markerów monocytów, makrofagów i limfocytów B oprócz antygenów krwiotwórczych CD45 i CD344. Ostatnim kryterium jest to, że MSCs muszą być zdolne do różnicowania się w następujące trzy typy komórek w standardowych warunkach różnicowania in vitro: osteoblasty, adipocyty i chondrocyty4. Do tej pory wyizolowano i scharakteryzowano sześć typów ludzkich komórek macierzystych zębów. Pierwszy typ został wyizolowany z ludzkiej tkanki miazgi i nazwany postnatalnymi komórkami macierzystymi miazgi zębowej5. Następnie wyizolowano i scharakteryzowano trzy dodatkowe typy zębowych MSCs: komórki macierzyste z złuszczonych zębów mlecznych 6, więzadło przyzębia7 oraz brodawka wierzchołkowa8. Ostatnio zidentyfikowano również komórki macierzyste pęcherzyków zębowych 9, pochodzące z tkanek dziąsłowych 10, komórki macierzyste pączków zębowych (DBSC) 11 i MSC torbieli okołowierzchołkowej (hPCy-MSCs)12.
Friedenstein jako pierwszy zdefiniował MSCs13. MSCs wykazują wysoki potencjał proliferacyjny i mogą być manipulowane w celu odróżnienia się przed przeszczepieniem, co sugeruje, że są idealnymi kandydatami do procedur regeneracyjnych10.
Chociaż większość badań wykorzystywała szpik kostny jako źródło komórek macierzystych, ostatnio wykorzystano również komórki pochodzące z okostnej (PDC)14. Okostna jest łatwiej dostępna niż szpik kostny. Dlatego w tej technice wykorzystujemy okostną wyrostka zębodołowego, aby wyeliminować konieczność wykonywania dodatkowych nacięć podczas operacji i zmniejszyć zachorowalność pooperacyjną u pacjentów. Okostna jest tkanką łączną, która tworzy zewnętrzną wyściółkę kości długich i składa się z dwóch odrębnych warstw: zewnętrznej warstwy włóknistej złożonej z fibroblastów, kolagenu i włókien elastycznych15, oraz wewnętrznej warstwy kambium bogatej w komórki w bezpośrednim kontakcie z powierzchnią kości. Warstwa kambium zawiera mieszaną populację komórek, głównie fibroblasty16, osteoblasts17, pericytes18 oraz krytyczną subpopulację zidentyfikowaną jako MSCs19,20,21. Większość badań wykazała, że PDC są porównywalne, jeśli nie lepsze, do komórek macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego (bMSC) w gojeniu i regeneracji kości22,23,24. Okostna jest łatwo dostępna i wykazuje doskonałą skuteczność regeneracyjną. Jednak niewiele badań skupiało się na periosteum25,26,27.
Jeśli chodzi o naprawę kości, obecna praktyka kliniczna polega na przeszczepianiu komórek progenitorowych okostnej amplifikowanych w rusztowaniach wspomagających. Ostatnie badania koncentrowały się na pozyskiwaniu komórek macierzystych w uszkodzonych regionach i wykorzystywaniu komórek progenitorowych do regeneracji tkanek20. Dentyści przewidują również przyszłe zastosowanie regeneracji kości przyzębia w leczeniu periodontologicznym i implantach stomatologicznych. Jeśli chodzi o miejsce dawcze, okostna może być łatwo pobrana przez chirurgów stomatologów ogólnych. Wypada to korzystnie w porównaniu z komórkami zrębu szpiku, ponieważ dostęp do okostnej można uzyskać podczas rutynowej operacji jamy ustnej. W związku z tym celem tego badania jest ustalenie protokołu pobierania PDC oraz ocena morfologii, przyczepności, żywotności i proliferacji ludzkich komórek macierzystych okostnej.
Metabolity witaminy D wpływają na dynamiczną równowagę kostno-mineralną in vivo. Jedno z badań wykazało, że aktywna forma witaminy D 24R,25-(OH)2D3 jest niezbędna do różnicowania osteoblastycznego ludzkich MSCs (hMSCs)28. Homeostaza i naprawa kości są regulowane przez sieć metabolitów witaminyD3, z których 1,25-(OH)2D3 (kalcytriol) jest najbardziej aktywny biologicznie i ma znaczenie w regulacji zdrowia kości. Witamina D3 jest niezbędna do zwapnienia29. W jednym z badań z udziałem 2-dniowych białych myszy z Kunming, ciała embrionoidalne u myszy wykazały, że suplementy witaminy C i witaminy D skutecznie promowały różnicowanie osteoblastów pochodzących z ESC30. Wśród innych działań biologicznych, 1,25-(OH)2D3 stymuluje różnicowanie in vitro hMSC do osteoblastów, które można monitorować na podstawie wzrostu aktywności enzymu fosfatazy alkalicznej (ALP) lub ekspresji genu OCN.
Niewiele badań wykryło zależność między dawką a reakcją w skojarzonym leczeniu witaminą C i 1,25-(OH)2D3 u ludzkich PDC, ze szczególnym naciskiem na inżynierię tkanki kostnej. Dlatego w tym badaniu badamy optymalne stężenia dla pojedynczego lub skojarzonego leczenia 1,25-(OH)2D3 i witaminy C w celu indukowania różnicowania osteogennego ludzkich PDC. Celem tego protokołu jest ustalenie, czy populacja komórek wyizolowana z okostnej wyrostka zębodołowego zawiera komórki o fenotypie MSC i czy komórki te mogą być namnażane w hodowli (in vitro) i różnicowane w celu utworzenia pożądanej tkanki. Ponadto oceniamy zdolność PDC do różnicowania się w osteocyty, chondrocyty i adipocyty. Druga część badania ocenia wpływ witaminy C i 10−10, 10−9, 10−8 i 10−7 M 1,25-(OH)2D3 na aktywność osteogenną PDC. Głównym celem tego badania jest ocena funkcji witaminy C i 1,25-(OH)2D3 podczas różnicowania osteoblastycznego PDC przez aktywność ALP oraz genów proosteogennych, takich jak ALP, kolagen-1, OCN, BSP i CBFA1. Ponadto na podstawie tych ustaleń badanie to określa optymalne warunki osteoindukcyjne dla ludzkich PDC.

<table><tbody><tr><td>0,25% trypsyna-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 2-fosfo-L-askorbinowysól trisodowa</td><td>Sigma</td><td>49752</td><td></td></tr><tr><td>35-milimetrowe naczynia</td><td>hodowlane Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>3-izobutylo-1-metyloksantyna</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>6&nbsp; płytka dołkowa</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Fosfataza alkaliczna</td><td>ABI</td><td>Hs01029144_m1</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania aktywności fosfatazy alkalicznej Zestaw do oznaczania kolorymetrycznego</td><td>BioVision</td><td>K412-500</td><td></td></tr><tr><td>odwrotna transkryptaza wirusa mieloblastozy ptaków</td><td>Roche</td><td>10109118001</td><td></td></tr><tr><td>CD146</td><td>BD</td><td>561013</td><td></td></tr><tr><td>CD19</td><td>BD</td><td>560994</td><td></td></tr><tr><td>CD34</td><td>BD</td><td>560942</td><td></td></tr><tr><td>CD44</td><td>BD</td><td>561858</td><td></td></tr><tr><td>CD45</td><td>BD</td><td>561088</td><td></td></tr><tr><td>CD73</td><td>BD</td><td>561014</td><td></td></tr><tr><td>CD90</td><td>BD</td><td>561974</td><td></td></tr><tr><td>bankier komórkowy1</td><td>ZEAOAQ</td><td>11888</td><td></td></tr><tr><td>czynnik wiążący rdzeń alfa-1</td><td>ABI</td><td>Hs00231692_m1</td><td></td></tr><tr><td>deksametazon</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>ABI</td><td>Hs99999905_m1</td><td></td></tr><tr><td>HLA-DR</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr> 562008 <tr><td>indometacyna</td><td>Sigma</td><td>I7378</td><td></td></tr><tr><td>insulina</td><td>sigma</td><td>91077C</td><td></td></tr><tr><td>insulina&ndash; transferyna&ndash; selen-A</td><td>Sigma</td><td>I1884</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Fast 96-dołkowa płytka reakcyjna (0,1 ml)</td> <td>Żywotność</td><td>4346907</td><td></td></tr><tr><td>Optyczna folia samoprzylepna MicroAmp</td><td>Żywotność</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Niezbędne podłoże 1X Alfa Modyfikacja</td><td>Hyklon</td><td>SH30265.02</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Bufor przepuszczalny</td><td>eBioscience</td><td>00-8333-56</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>STRO-1</td><td>BioLegend</td><td>340103</td><td></td></tr><tr><td>SYBER Green PCR Master Mix</td><td>AppliedBiosystems</td><td>4309155</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Master Mix</td><td>Life</td><td>4304437</td><td></td></tr><tr><td>transformujący czynnik wzrostu-&beta;</td><td>Sigma</td><td>T7039&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik Trizol (do izolacji RNA)</td><td>Life</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glicerofosforan</td><td>Sigma</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>collagen-1</td><td>Invitrogen</td><td>forward primer 5' CCTCAAGGGCTCCAACGAG-3 reverse primer 5'-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3'OCN</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>starter do przodu 5'-GTGCAGCCTTTGTGTCCAAG-3' starter do odwróconego 5'-GTCAGCCAACTCGTCACAGT-3'BSP</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Podkład do przodu Invitrogen</td><td>5' AAAGTGAGAACGGGGAACCT-3' starter do tyłu 5'-GATGCAAAGCCAGAATGGAT-3'Komercyjne</td><td></td></tr> <tr><td>podkłady ALP Komercyjne startery</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>CBFA1</td></tr></tbody></table>

izolacja mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkiej okostnej pęcherzyków płucnych i wpływ witaminy d na aktywność osteogenną komórek pochodzących z okostnej

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) są obecne w różnych tkankach i mogą być zróżnicowane na wiele typów komórek, w tym osteoblasty. Wśród dentystycznych źródeł MSCs, okostna jest łatwo dostępną tkanką, która została zidentyfikowana jako zawierająca MSC w warstwie kambium. Jednak źródło to nie zostało jeszcze szeroko zbadane.
Wykazano, że witamina D3 i 1,25-(OH)2D3 stymulują in vitro różnicowanie MSC w osteoblasty. Ponadto witamina C ułatwia tworzenie kolagenu i wzrost komórek kostnych. Jednak żadne badanie nie zbadało jeszcze wpływu witaminyD3 i witaminy C na MSC.
Tutaj prezentujemy metodę izolowania MSCs z ludzkiej okostnej pęcherzyków płucnych i badamy hipotezę, że 1,25-(OH)2D3 może wywierać wpływ osteoindukcyjny na te komórki. Badamy również obecność MSCs w okostnej wyrostka zębodołowego człowieka oraz oceniamy adhezję i proliferację komórek macierzystych. Ocena zdolności witaminy C (jako kontroli) i różnych stężeń 1,25-(OH)2D3 (10−10, 10−9, 10−8 i 10−7 M) do zmiany kluczowych biomarkerów mRNA w izolowanych MSCs ekspresji mRNA fosfatazy alkalicznej (ALP), sialoproteiny kostnej (BSP), rdzeniowego czynnika wiążącego alfa-1 (CBFA1), kolagenu-1, i osteokalcyny (OCN) są mierzone za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-PCR).

W przypadku wszystkich analiz ilościowych dane przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe (SD). Wszystkie analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu testu t Studenta. W sumie uzyskano 34 próbki, a średni wiek uczestników wynosił 48,1 ± 12,3 y. Jedenaście z tych próbek pobrano od pacjentów płci męskiej, a 23 od pacjentek płci żeńskiej. Dwadzieścia osiem próbek pochodziło z obszarów zębów trzonowych i sześć z obszarów zębów przednich; 26 pobrano z szczęki, a 8 z żuchw...

Przedstawiamy protokół do zbadania biomarkerów ekspresji mRNA komórek pochodzących z okostnej (PDC) indukowanych przez witaminę C (witaminę C) i 1,25-dihydroksywitaminę D [1,25-(OH)2D3]. Ponadto oceniamy zdolność PDC do różnicowania się w osteocyty, chondrocyty i adipocyty.

Izolacja mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkiej okostnej pęcherzyków płucnych i wpływ witaminy D na aktywność osteogenną komórek pochodzących z okostnej

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Ogólnym celem tego badania jest zbadanie osteoindukcyjnego wpływu witaminy D na hodowane mezenchymalne komórki macierzyste, które zostały pobrane z okostnej wyrostka zębodołowego. Zastosowanie mezenchymalnych komórek macierzystych to ogromny postęp w stomatologii w ciągu ostatniej dekady. Zostały one z powodzeniem wyizolowane i wyhodowane z wielu części tkanki zęba.Celem jest jednak wyizolowanie i hodowla mezenchymalnych komórek macierzystych z okostnej pęcherzyków płucnych oraz zbadanie potencjału osteoindukcyjnego związku witaminy D. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej materii będą zmagać się z nową ideą tworzenia kości w mezenchymalnych komórkach macierzystych pochodzących z okostnej pęcherzyków płucnych. Personel laboratoryjny zademonstruje procedurę Pani Hsin-Wen Chi.Jest ona asystentką naukową z mojego laboratorium. Na początek pobierz tkanki okostnej od pacjentów podczas chirurgii stomatologicznej za pomocą separatora okostnej. Zbierz plasterki o wymiarach około dwóch na pięć milimetrów.Przechowuj plastry tkanek w DPBS z antybiotykami. W laboratorium użyj skalpela, aby dokładnie zmielić fragmenty tkanki okostnej pęcherzyków płucnych w ciągu 24 godzin od pobrania. Następnie hoduj tkankę na 35-milimetrowych szalkach Petriego w odpowiednim pożywce do hodowli.Użyj nawilżonego inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% gazowym dwutlenkiem węgla. Trzy dni później wyrzuć zebrane tkanki okostnej i zmień podłoże. Gdy komórki rozmnożą się do około 80% konfluencji, odłącz hodowane komórki, dodając trypsynę.I inkubacja kultury przez trzy minuty. Następnie dodaj 0,8 mililitra pożywki, aby zakończyć odłączanie. Po zebraniu i zliczeniu rozprowadź 5 000 komórek w jednym mililitrze na płytkę.Na tym etapie oznacz posiane komórki jako pasaż pierwszy. Hoduj te komórki i oddziel je ponownie po tym, jak rozmnożą się do 80% konfluencji. Pożywka z pasażem pierwszym ma początkowo kolor pomarańczowo-czerwony.Kiedy podłoże zacznie zmieniać kolor na pomarańczowy trzy dni później, zmień je. Gdy przejście jednej komórki osiągnie 80% konfluencji, utwórz komórki od drugiej do piątej generacji, powtarzając te same procedury, które są używane do przygotowania pokolenia zerowego do pierwszego pokolenia. Zmieniaj podłoże dwa razy w tygodniu.Cztery tygodnie później oceń potencjał komórek do różnicowania się w linię osteogenną, obserwując morfologię komórek pod mikroskopem. Wykonaj badania przesiewowe za pomocą testu von Kossa. Ten test odróżnia obecność zwapniałych osadów w twojej kulturze.Umyj komórki PBS i utrwal je przez 30 minut w jednym mililitrze 10% formaliny. Następnie usuń formalinę, a następnie umyj komórki i potraktuj je 5% azotanem srebra. Wystaw komórki na działanie światła UV przez godzinę.Następnie usuń azotan srebra i potraktuj komórki dwoma mililitrami 5% siarczanu sodu cztery razy przez trzy minuty za każdym razem. Roztwór należy wymieniać między zabiegami. Na koniec umyj komórki dwukrotnie wodą destylowaną.W 20 z 34 próbek tkanki okostnej udało się uzyskać kolonie komórek macierzystych pochodzących ze szpiku. Nie stwierdzono żadnych czynników związanych z dawcami, które miałyby istotny wpływ na sukces hodowli. Początkowo PDC tworzyły kolonie i kuliste klastry z mieszanką komórek okrągłych i wrzecionowatych.Po pierwszym pasażu komórki były jednorodnie podobne do fibroblastów o wrzecionowatym kształcie. Pod koniec różnicowania osteogennego test von Kossa wykazał możliwą obecność złogów wapnia i różnicowanie osteogenne. Wyniki te zdecydowanie wskazują, że wśród populacji komórek okostnej komórki progenitorowe mają potencjał do różnicowania się w komórki osteogenne.Osteogenne komórki prekursorowe potraktowano również kalcytriolem i zbadano za pomocą RTPCR w celu oceny poziomu ekspresji fosfatazy alkalicznej, która jest silnym wskaźnikiem wczesnego różnicowania osteogennego komórek. Zarówno leczenie witaminą C, jak i kalcytriolem, aktywnym metabolitem witaminy D, zwiększało ekspresję fosfatazy alkalicznej. Ponadto ekspresja poziomu mRNA kolagenu wzrosła w odpowiedzi na te same zabiegi.Stwierdzono, że ekspresja mRNA sialoproteiny kości wzrasta w komórkach traktowanych wyższym stężeniem kalcytriolu. Jednak ekspresja CBFA i mRNA ostowapnia nie reagowały na leczenie. Po obejrzeniu tego filmu widzowie powinni dobrze zrozumieć protokół mineralizacji i hodowli okostnej pęcherzyków płucnych człowieka.Po opanowaniu tego pościgu można go wykonać w ciągu czterech do pięciu tygodni, jeśli zostanie wykonany prawidłowo. Podczas prób tego eksperymentu ważne jest, aby użyć ostrożnej i sterylnej techniki, aby uniknąć zanieczyszczenia komórki.

isolation-mesenchymal-stem-cells-from-human-alveolar-periosteum

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) szczura wyizolowano z kości udowych i piszczeli, a następnie wzbogacono za pomocą magnetycznej separacji komórek. Ekspresję markerów powierzchniowych w posortowanych komórkach potwierdzono metodą cytometrii przepływowej. Komórki te hodowano również w gęstości klonalnej w celu utworzenia pojedynczych kolonii, które następnie oddzielono za pomocą cylindrów do klonowania.

Izolacja i namnażanie mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) szczura oraz separacja MSC pochodzących z pojedynczych kolonii

Opisana metoda obejmuje izolację i charakterystykę ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zęba (hDPSCs) z wykorzystaniem dysocjacji enzymatycznej miazgi (DPSC-ED) lub bezpośredniego wypływu komórek macierzystych z eksplantów tkanki miazgi (DPSC-OG). Następnie przeprowadzono porównawczą różnicowanie obu typów hDPSCs w odontoblasty in vitro.

Izolacja, charakterystyka i różnicowanie porównawcze ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zębowej pochodzących z zębów trwałych z wykorzystaniem dwóch różnych metod

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) mają potencjał różnicowania w kierunku linii osteoblastycznej, gdy są stymulowane przez rozpuszczalne czynniki lub określone biomateriały. W niniejszej pracy przedstawiono nowatorską opcję dostarczania MSCs z ludzkiej błony owodniowej (AM-hMSC), która wykorzystuje macierz kostną bydła Nukbone (NKB) jako rusztowanie.

Izolacja ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych i ich hodowla na porowatej macierzy kostnej

Niejednorodność transkrypcyjna w ludzkich komórkach zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej może być zdefiniowana na poziomie pojedynczej komórki za pomocą markerów powierzchni komórki i genów osteogennych.  Opisujemy protokół wykorzystujący cytometrię przepływową do izolacji subpopulacji komórek o zwiększonym potencjale osteogennym, który może być wykorzystany do poprawy rekonstrukcji szkieletu twarzoczaszki.

Izolacja i wzbogacenie ludzkich komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej w celu zwiększenia osteogenezy

Ten artykuł przedstawia metodę, która łączy przyleganie całego szpiku kostnego i sortowanie cytometrią przepływową do izolacji, hodowli, sortowania i identyfikacji mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego z żuchwy szczura.

Izolacja i hodowla mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego żuchwy u szczurów

Ten artykuł zawiera przewodnik krok po kroku, jak założyć pierwotną hodowlę komórek macierzystych miazgi zębowej przy użyciu metody hodowli eksplantatów i charakterystykę tych komórek w oparciu o wytyczne ICSCRT. Komórki wyizolowane za pomocą tego protokołu można uznać za mezenchymalne komórki macierzyste do dalszych zastosowań.

Pierwotna hodowla komórek macierzystych miazgi zębowej

Mezenchymalne komórki macierzyste ze szpiku kostnego szczęki pełnią znaczące funkcje w różnorodnym różnicowaniu, samoodnawianiu i modulacji immunologicznej. Stały się one kluczowym rezerwuarem komórek prekursorowych w terapii genowej, inżynierii tkankowej i medycynie regeneracyjnej. W tym miejscu przedstawiamy unikalną metodę izolacji mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego szczęki u szczurów.

Technika izolacji i hodowli mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego szpiku szczurów

To badanie przedstawia unikalną procedurę sekcji w celu zachowania integralności galarety Whartona (WJ), co skutkuje mniej uszkodzonym WJ oraz większą ilością i żywotnością pobranych mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC). Metoda ta wykazuje lepszą wydajność i zdolność proliferacyjną w porównaniu z konwencjonalnymi metodami ostrej sekcji.

Izolacja mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z pępowiny o wysokiej wydajności i niskich uszkodzeniach

Krążące komórki nowotworowe są izolowane z krwi pacjentów onkologicznych bez powodowania uszkodzeń komórkowych. Izolacja komórek nowotworowych jest realizowana przy użyciu bimolekularnej powierzchni E-selectiny oraz przeciwciał przeciwko markerom nabłonkowym. Powłoka z nanorurek specyficznie wspomaga adhezję komórek rakowych, co skutkuje wysoką czystością wychwytu.

Szybka izolacja żywych krążących komórek nowotworowych z próbek krwi pacjentów

Ten protokół opisuje rozwój, ekspansję i obrazowanie in vivo komórek NK pochodzących z hESC i iPSC.

Rozwój, ekspansja i monitorowanie in vivo ludzkich komórek NK z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC)

Poznaj izolację mezenchymalnych komórek macierzystych z okostnej pęcherzyków płucnych i wpływ witaminy D na ich aktywność osteogenną. Ta metoda umożliwia badanie potencjału różnicowania komórek w zastosowaniach stomatologicznych.

Izolacja mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkiej okostnej pęcherzyków płucnych i wpływ witaminy D na aktywność osteogenną komórek pochodzących z okostnej (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkiej okostnej pęcherzyków płucnych i wpływ witaminy D na aktywność osteogenną komórek pochodzących z okostnej

Przeglądaj więcej filmów