Name: Chemiczna amputacja i regeneracja gardła w wypławku Schmidtea mediterranea (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Poznaj metodę chemicznej amputacji gardła u wypławka Schmidtea mediterranea przy użyciu azotku sodu. Technika umożliwia precyzyjne badanie regeneracji tkanek i aktywacji komórek macierzystych bez uszkadzania innych narządów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Alejandro Sánchezowi Alvarado, który wspierał początkową optymalizację i rozwój tej techniki. Prace w laboratorium Carolyn Adler są wspierane przez fundusze start-upowe Uniwersytetu Cornella.

1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Przygotowanie wody z płaśników17
	<ol>
		<li>Utrzymuj wypławki w 1X roztworze soli Montjuïc. Aby przygotować wodę płaską, należy przygotować indywidualne roztwory podstawowe 1 M CaCl2, 1 M MgSO4, 1 M MgCl2, 1 M KCl i 5 M NaCl w wodzie ultraczystej. Sterylizacja za pomocą filtra butelkowego 0,2 μm do długotrwałego przechowywania. 
		nuta: Do przygotowania soli Montjuïc należy używać wyłącznie ultraczystej wody dejonizowanej (o rezystywności 18,2 MΩ w temperaturze 25 °C).</li>
		<li>Aby przygotować 1 l zapasu 5X roztworu soli, połącz 5 ml 1 M CaCl2, 5 ml 1 M MgSO4, 0,5 ml MgCl2, 0,5 ml KCl i 1,6 ml roztworów 5 M NaCl w 900 ml ultraczystej wody. Do tego roztworu dodaj 0,504 g NaHCO3 i wymieszaj. Dostosuj pH do 7,0 za pomocą kwasu solnego.</li>
		<li>Rozcieńczyć ten 5-krotny roztwór podstawowy do 1-krotnego stężenia roboczego w ultraczystej wodzie w sterylnym pojemniku, takim jak balon o dużej pojemności (patrz tabela materiałów). Użyj tego rozwiązania 1X do utrzymania bezpłciowych wypławków. 
		nuta: Jako alternatywę dla roztworu soli Montjuïc należy użyć lokalnie zakupionej wody źródlanej lub ultraczystej wody zawierającej dostępną w handlu mieszankę soli akwariowej (patrz Tabela Materiałów) o stężeniu 0,5 g/L18.</li>
		<li>Aby zapobiec infekcji bakteryjnej w hodowli statycznej19, utrzymuj wypławki w wodzie zawierającej antybiotyk. Przygotować 50 mg/ml roztworu podstawowego siarczanu gentamycyny w ultraczystej wodzie i sterylizować filtrem. Do pojemników, w których trzymane są zwierzęta, dodać siarczan gentamycyny do końcowego stężenia 50 μg/ml (rozcieńczenie 1:1000).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie pasty z wątroby
	<ol>
		<li>Ponieważ wypławki rozwijają się na diecie składającej się z ekologicznej, karmionej trawą wątroby wołowej, kup świeżą wątrobę i przetwórz ją w ciągu 24 godzin. Usuń błoniastą kapsułkę otaczającą wątrobę, delikatnie ją obierając. Pokrój wątrobę w ~1-centymetrową kostkę i użyj ostrza, aby zeskrobać i wyrzucić wszystkie żyły i tętnice wątrobowe.</li>
		<li>Maceruj kawałki wątroby za pomocą młynka spożywczego lub robota kuchennego, a następnie przepuść je przez sitko z siatki drucianej. Połączyć w woreczkach cukierniczych i rozlać do strzykawek lub szalek Petriego o średnicy 35 mm. Przed karmieniem delikatnie odwirować, aby usunąć pęcherzyki powietrza.</li>
		<li>Porcje wątroby należy przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do roku i rozmrozić przed użyciem. Po rozmrożeniu resztki wątroby należy jednokrotnie zamrozić lub przechowywać w temperaturze 4 °C do 24 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrzymanie zwierząt
	<ol>
		<li>Wypławki będą rosły i kurczyły się do różnych rozmiarów w zależności od częstotliwości karmienia. Karm wypławki co drugi tydzień (raz na 14 dni). W przypadku długotrwałych kultur masowych należy używać plastikowych pojemników o różnych rozmiarach (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Aby nakarmić zwierzęta, użyj metalowej szpatułki lub plastikowej pipety transferowej, aby umieścić kroplę wątroby wielkości ziarnka grochu w pudełku. Pozwól zwierzętom jeść przez 1-2 godziny. Usuń resztki jedzenia przed czyszczeniem pudełka.</li>
		<li>Czyść robaki dwa razy w tygodniu, jeśli są karmione (raz bezpośrednio po karmieniu i raz dwa dni później) lub raz w tygodniu, jeśli nie są karmione. Aby wyczyścić, spuść wodę do plastikowej zlewki, ostrożnie wylewając wodę, zachowując wypławki w pudełku. Wytrzyj powierzchnię pudełka ręcznikiem papierowym, a następnie powtarzaj ze wszystkich stron, aż pudełko będzie czyste.</li>
		<li>Zastąp wodę (do około 3/4 objętości pudełka) i dodaj gentamycynę do końcowego stężenia 50 μg/ml. Przechowuj zwierzęta w ciemnej szafie lub w inkubatorze o temperaturze 20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybór robaków
	<ol>
		<li>Wybierz robaki, które były karmione 5-7 dni wcześniej. 
		nuta: Znacznie trudniej jest amputować gardła robakom, które były ostatnio karmione (1-2 dni przed amputacją). Karmione zwierzęta są również bardziej wrażliwe na azydek sodu.</li>
		<li>Wybierz robaki o długości około 6 mm. Aby oszacować rozmiar robaka, przenieś go na szalkę Petriego za pomocą plastikowej pipety transferowej. Umieść płaską 6-calową linijkę lub papier milimetrowy o wymiarach 5 mm x 5 mm pod szalką Petriego i zmierz długość robaka podczas jego pełzania. 
		nuta: Robaki o długości mniejszej niż 6 mm są trudniejsze do amputacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie azydku sodu
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór o stężeniu 100 mM, rozpuszczając proszek azydku sodu w wodzie z wypławkami. 
		ostrożność: Azydek sodu jest toksyczny i należy obchodzić się z nim ostrożnie. Nie wyrzucaj azydku sodu do odpływu. Po użyciu należy go zebrać oddzielnie w celu utylizacji jako odpad niebezpieczny.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Amputacja gardła
<ol>
	<li>Umieść robaki na szalce Petriego o średnicy 35 mm. Ostrożnie usuń całą wodę z wypławków z naczynia za pomocą plastikowej pipety transferowej. 
	nuta: W naczyniu tej wielkości można wygodnie umieścić maksymalnie 20 robaków o średnicy 6 mm.</li>
	<li>Umieść naczynie pod mikroskopem i dostosuj powiększenie tak, aby można było oglądać jednocześnie wiele robaków (np. powiększenie 10X). Zastąp wodę płaską 100 mM roztworem azydku sodu. 
	nuta: Na szalkę Petriego o średnicy 35 mm wystarczy około 5 ml azydku sodu. Rozwiązanie powinno całkowicie zanurzyć wypławki. W razie potrzeby dostosuj objętość roztworu dla większych potraw.</li>
	<li>Monitoruj zwierzęta pod mikroskopem i powstrzymaj się od przesuwania naczynia przez pierwsze 3-4 minuty.</li>
	<li>Obserwuj wygięcie gardła przez mikroskop; gardło będzie wystawać z torebki gardłowej i rozciągać się całkowicie (około 1 mm długości), jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 1B. 
	nuta: Ważne jest, aby poczekać, aż gardło całkowicie się rozciągnie, zanim przejdziesz dalej. Gdy gardło wyłoni się ze zwierzęcia, pełne wyprostowanie trwa około 1 minuty.</li>
	<li>Użyj plastikowej pipety transferowej, aby spryskać zwierzęta wokół naczynia. Wciągnij zwierzęta do pipety i kilka razy na siłę wypuść je do naczynia. Jeśli gardło jest całkowicie rozciągnięte, energiczne pipetowanie spowoduje jego odłączenie.</li>
	<li>Alternatywnie, chwyć gardło albo pionowo wzdłuż jego długości, albo poziomo wzdłuż jego obwodu za pomocą pary cienkich kleszczyków (patrz Tabela Materiałów), jak pokazano na Rysunek 1C. Z gardłem ściśniętym w kleszczach podnieś zwierzę w górę w kierunku łąkotki. Gdy zwierzę jest podnoszone, napięcie powierzchniowe spowoduje odłączenie gardła od zwierzęcia. 
	nuta: Ta metoda może być stosowana do usuwania gardła mniejszych zwierząt (o długości 1-3 mm), w przypadku których silne wirowanie nie jest wystarczające. Unikaj szturchania lub w inny sposób ranienia ciała zwierzęcia.</li>
	<li>Za pomocą pipety transferowej przenieś amputowane zwierzęta do nowego naczynia zawierającego świeżą wodę z pławiki.</li>
	<li>Po przeniesieniu należy dokładnie opłukać amputowane zwierzęta w wodzie z wypławkami, całkowicie wymieniając wodę trzy razy. Przenieść do nowego naczynia zawierającego wodę z wypławki z 50 μg/ml gentamycyny. 
	nuta: Pełna wymiana buforu podczas tych trzech płukań jest niezbędna, aby zapewnić usunięcie azydku sodu.</li>
	<li>Następnego dnia zastąp wodę w naczyniu świeżą wodą z wypławki zawierającą 50 μg/ml gentamycyny. Następnie powtarzaj co drugi dzień.</li>
</ol>
3. Ocena usunięcia gardła po amputacji
<ol>
	<li>Zbadaj zwierzęta pod mikroskopem (z powiększeniem 10-20x), aby ustalić, czy po udanym usunięciu gardła pojawiła się ciemna plama, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 2A.</li>
	<li>Alternatywnie, utrwalaj i wybielaj zwierzęta zgodnie z protokołem opisanym przez Pearsona i wsp.20. Moczyć zwierzęta przez noc w 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) lub fluorescencyjnie sprzężonej streptawidynie (1 mg/ml rozcieńczony w stosunku 1:500 w 1X buforowanym fosforanem soli fizjologicznej zawierającej 0,3% Triton-X). Zamontuj zwierzęta na szkiełkach w 80% glicerolu / 20% 1X Sól fizjologiczna buforowana fosforanem i zobrazuj pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2B). 
	nuta: Wszystkie obrazy w tym rękopisie zostały wykonane za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego z obiektywem 1,0X.</li>
</ol>
4. Ocena regeneracji gardła poprzez pomiar zachowań żywieniowych
<ol>
	<li>Przygotowanie wątroby
	<ol>
		<li>Przenieść wymaganą ilość pasty z wątroby do mikrowirówki lub stożkowej probówki. Krótko zakręć, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Oszacuj objętość wątroby, a następnie dodaj wodę z wypławki do 1/5 jej objętości i 2% całkowitej objętości w czerwonym barwniku spożywczym. Na przykład do 1000 μl pasty z wątroby dodaj 200 μl wody z wyplanarii i 24 μl barwnika spożywczego.</li>
		<li>Za pomocą plastikowego tłuczka, końcówki pipety lub metalowej szpatułki dokładnie wymieszaj, aż barwnik spożywczy zostanie równomiernie rozprowadzony w paście wątrobowej. Zakręć ponownie na krótko. Pasta z wątroby może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez 24 godziny lub zamrożona w porcjach w temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania.</li>
		<li>W przypadku badania na maksymalnie 25 zwierzętach należy przygotować 25 μl pasty z wątroby na danie (około 1 μl pasty z wątroby na zwierzę).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Karmienie zwierząt
	<ol>
		<li>Siedem dni po amputacji chemicznej przenieś zwierzęta na nową szalkę Petriego. W przypadku badania na 10-15 zwierzętach należy użyć szalki o średnicy 35 mm; więcej niż 15 zwierząt powinno zostać przebadanych na szalce Petriego o średnicy 60 mm. Trzymaj zwierzęta w ciemności, w spokoju, przez około 1 godzinę przed karmieniem.</li>
		<li>Za pomocą nożyczek zwiększ szerokość końcówki pipety P200, odcinając około 1/2 cm od wąskiego końca. Do naczynia wlej 25 μl czerwonej pasty z wątroby. 
		nuta: Przycięcie końcówki ułatwia pipetowanie lepkiej pasty z wątroby. Aby wątroba nie unosiła się na powierzchni, podczas dozowania dotknij końcówką dna naczynia.</li>
		<li>Pozwól zwierzętom karmić się przez 30 minut.</li>
		<li>Oceń liczbę zwierząt, które jadły, umieszczając je na białym tle lub badając je pod mikroskopem w powiększeniu 10-20X.</li>
		<li>Po karmieniu wyjmij wątrobę z naczynia i oczyść.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Tanaka, E. M., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+basis+for+animal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">The cellular basis for animal regeneration.</a> Dev. Cell. 21, 172-185 (2011).</li>
<li>Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Molecular+and+Cellular+Choreography+of+Appendage+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Molecular and Cellular Choreography of Appendage Regeneration.</a> Cell. 165, 1598-1608 (2016).</li>
<li>Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitroreductase-mediated+cell%2Ftissue+ablation+in+zebrafish%3A+a+spatially+and+temporally+controlled+ablation+method+with+applications+in+developmental+and+regeneration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies.</a> Nat. Protoc. 3, 948-954 (2008).</li>
<li>White, D. T., Mumm, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nitroreductase+system+of+inducible+targeted+ablation+facilitates+cell-specific+regenerative+studies+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish.</a> Methods. 62, 232-240 (2013).</li>
<li>Smith-Bolton, R. K., Worley, M. I., Kanda, H., Hariharan, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+growth+in+Drosophila+imaginal+discs+is+regulated+by+Wingless+and+Myc%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Regenerative growth in Drosophila imaginal discs is regulated by Wingless and Myc.</a> Dev. Cell. 16, 797-809 (2009).</li>
<li>Smith-Bolton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Imaginal+Discs+as+a+Model+of+Epithelial+Wound+Repair+and+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Drosophila Imaginal Discs as a Model of Epithelial Wound Repair and Regeneration.</a> Adv. Wound Care. 5, 251-261 (2016).</li>
<li>Newmark, P. A., Sánchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Not+your+father%27s+planarian%3A+a+classic+model+enters+the+era+of+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Not your father's planarian: a classic model enters the era of functional genomics.</a> Nat. Rev. Genet. 3, 210-219 (2002).</li>
<li>Reddien, P. W., Sánchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+planarian+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of planarian regeneration.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 20, 725-757 (2004).</li>
<li>Wagner, D. E., Wang, I. E., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonogenic+neoblasts+are+pluripotent+adult+stem+cells+that+underlie+planarian+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Clonogenic neoblasts are pluripotent adult stem cells that underlie planarian regeneration.</a> Science. 332, 811-816 (2011).</li>
<li>Scimone, M. L., Kravarik, K. M., Lapan, S. W., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neoblast+specialization+in+regeneration+of+the+planarian+Schmidtea+mediterranea%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Neoblast specialization in regeneration of the planarian Schmidtea mediterranea.</a> Stem Cell Reports. 3, 339-352 (2014).</li>
<li>van Wolfswinkel, J. C., Wagner, D. E., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+reveals+functionally+distinct+classes+within+the+planarian+stem+cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis reveals functionally distinct classes within the planarian stem cell compartment.</a> Cell Stem Cell. 15, 326-339 (2014).</li>
<li>Adler, C. E., Seidel, C. W., McKinney, S. A., Sánchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+amputation+of+the+pharynx+identifies+a+FoxA-dependent+regeneration+program+in+planaria%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Selective amputation of the pharynx identifies a FoxA-dependent regeneration program in planaria.</a> Elife. 3, e02238(2014).</li>
<li>Adler, C. E., Sánchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHRED-1+is+a+divergent+neurexin-1+homolog+that+organizes+muscle+fibers+and+patterns+organs+during+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">PHRED-1 is a divergent neurexin-1 homolog that organizes muscle fibers and patterns organs during regeneration.</a> Dev. Biol. 427, 165-175 (2017).</li>
<li>Wong, M. C., Martynovsky, M., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cell+migration+using+Caenorhabditis+elegans+as+a+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of cell migration using Caenorhabditis elegans as a model system.</a> Methods Mol. Biol. 769, 233-247 (2011).</li>
<li>Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C+elegans+chemotaxis+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">C elegans chemotaxis assay.</a> J. Vis. Exp. , e50069(2013).</li>
<li>Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+microsurgery+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 107, 177(2012).</li>
<li>Tasaki, J., Uchiyama-Tasaki, C., Rouhana, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Stem+Cell+Motility+In+Vivo+Based+on+Immunodetection+of+Planarian+Neoblasts+and+Tracing+of+BrdU-Labeled+Cells+After+Partial+Irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Stem Cell Motility In Vivo Based on Immunodetection of Planarian Neoblasts and Tracing of BrdU-Labeled Cells After Partial Irradiation.</a> Methods Mol. Biol. 1365, 323-338 (2016).</li>
<li>Roberts-Galbraith, R. H., Brubacher, J. L., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+genomics+screen+in+planarians+reveals+regulators+of+whole-brain+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A functional genomics screen in planarians reveals regulators of whole-brain regeneration.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Arnold, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+shifts+in+endogenous+microbiota+impede+tissue+regeneration+via+distinct+activation+of+TAK1%2FMKK%2Fp38%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Pathogenic shifts in endogenous microbiota impede tissue regeneration via distinct activation of TAK1/MKK/p38.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Pearson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde-based+whole-mount+in+situ+hybridization+method+for+planarians%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde-based whole-mount in situ hybridization method for planarians.</a> Dev. Dyn. 238, 443-450 (2009).</li>
<li>LoCascio, S. A., Lapan, S. W., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eye+Absence+Does+Not+Regulate+Planarian+Stem+Cells+during+Eye+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Eye Absence Does Not Regulate Planarian Stem Cells during Eye Regeneration.</a> Dev. Cell. 40, 381-391 (2017).</li>
<li>Nishimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+dopaminergic+neurons+after+6-hydroxydopamine-induced+lesion+in+planarian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Regeneration of dopaminergic neurons after 6-hydroxydopamine-induced lesion in planarian brain.</a> J. Neurochem. 119, 1217-1231 (2011).</li>
<li>Wilson, D. F., Chance, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Azide+inhibition+of+mitochondrial+electron+transport.+I.+The+aerobic+steady+state+of+succinate+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Azide inhibition of mitochondrial electron transport. I. The aerobic steady state of succinate oxidation.</a> Biochim. Biophys. Acta. 131, 421-430 (1967).</li>
<li>Duncan, H. M., Mackler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+Transport+Systems+of+Yeast%3A+III.+Preparation+and+properties+of+cytochrome+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Electron Transport Systems of Yeast: III. Preparation and properties of cytochrome oxidase.</a> J. Biol. Chem. 241, 1694-1697 (1966).</li>
<li>Buchan, J. R., Yoon, J. H., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress-specific+composition%2C+assembly+and+kinetics+of+stress+granules+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Stress-specific composition, assembly and kinetics of stress granules in Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Cell Sci. 124, 228-239 (2011).</li>
<li>Cebrià, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+the+nervous+system+in+the+model+planarian+Schmidtea+mediterranea%3A+An+immunocytochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Organization of the nervous system in the model planarian Schmidtea mediterranea: An immunocytochemical study.</a> Neurosci. Res. 61, 375-384 (2008).</li>
<li>Shimoyama, S., Inoue, T., Kashima, M., Agata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+Neuropeptide-Coding+Genes+Involved+in+Planarian+Pharynx+Extension%5BTitle%5D)+AND+%22Zoolog.+Sci%22%5BJournal%5D)">Multiple Neuropeptide-Coding Genes Involved in Planarian Pharynx Extension.</a> Zoolog. Sci. 33, 311-319 (2016).</li>
<li>Ito, H., Saito, Y., Watanabe, K., Orii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epimorphic+regeneration+of+the+distal+part+of+the+planarian+pharynx%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Epimorphic regeneration of the distal part of the planarian pharynx.</a> Dev. Genes Evol. 211, 2-9 (2001).</li>
<li>Bueno, D., Espinosa, L., Baguñà, J., Romero, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planarian+pharynx+regeneration+in++tail+fragments+monitored+with+cell-specific+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Planarian pharynx regeneration in tail fragments monitored with cell-specific monoclonal antibodies.</a> Dev. Genes Evol. 206, 425-434 (1997).</li>
<li>Hyman, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHyman%2C+L+%22The+invertebrates%3A+Platyhelminthes+and+Rhynchocoela%2C+the+acoelomate+Bilateria%22">The invertebrates: Platyhelminthes and Rhynchocoela, the acoelomate Bilateria</a>. , McGraw-Hill. (1951).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten opisuje metodę selektywnej ablacji gardła za pomocą azydku sodu. Inne badania nad celowaną ablacją u wypławków wykorzystywały zmodyfikowaną operację w celu usunięcia fotoreceptorów21 lub leczenie farmakologiczne w celu ablacji neuronów dopaminergicznych22. Jedną z istotnych zalet amputacji chemicznej w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że nie wymaga ona operacji. Sztywna budowa gardła w porównaniu z resztą ciała wypławka ułatwia jego całkowite usunięc...

Regeneracja to zjawisko, które występuje w całym królestwie zwierząt, z możliwościami regeneracyjnymi od pełnej regeneracji ciała u niektórych bezkręgowców do bardziej ograniczonych zdolności u kręgowców1. Wymiana funkcjonalnych tkanek jest złożonym procesem i często wiąże się z jednoczesnym przywróceniem wielu typów komórek. Na przykład, aby zregenerować kończynę salamandry, osteoblasty, chondrocyty, neurony, mięśnie i komórki nabłonkowe muszą zostać wymienione2. Te nowo wygenerowane typy komórek muszą być również odpowiednio zorganizowane, aby ułatwić nowe funkcje kończyn. Zrozumienie tych złożonych procesów wymaga technik, które koncentrują się na regeneracji określonych typów komórek i ich integracji z narządami.
Jedną ze strategii stosowanych w celu uproszczenia badania reakcji regeneracyjnych jest celowana ablacja albo określonych typów komórek, albo większych zbiorów tkanek. Na przykład u danio pręgowanego ekspresja nitroreduktazy w określonych typach komórek prowadzi do ich zniszczenia po zastosowaniu metronidazolu3,4. U larw Drosophila ekspresja genów proapoptotycznych pod promotorami specyficznymi dla tkanek może selektywnie ablować określone regiony imaginalnej tarczy5,6. Obie te strategie powodują szybkie, ale kontrolowane uszkodzenia i zostały wykorzystane do analizy mechanizmów molekularnych i komórkowych odpowiedzialnych za regenerację.
W tym manuskrypcie opisujemy metodę selektywnej ablacji całego organu zwanego gardłem u wypławka Schmidtea mediterranea. Wypławki to klasyczny model regeneracji, znany ze swojej płodnej zdolności regeneracyjnej, w którym nawet drobne fragmenty mogą odrosnąć całe zwierzęta 7,8. Mają dużą, heterogeniczną populację komórek macierzystych składającą się zarówno z komórek pluripotencjalnych, jak i progenitorów z ograniczeniami linii9,10,11. Komórki te namnażają się i różnicują, zastępując wszystkie brakujące tkanki, w tym gardło, układ nerwowy, trawienny i wydalniczy oraz komórki mięśniowe i nabłonkowe9,10,12. Chociaż wiemy, że te komórki macierzyste inicjują regenerację, nie rozumiemy w pełni mechanizmów molekularnych, które napędzają je do zastąpienia wszystkich tych różnych typów komórek. Zdefiniowane metody ranienia, które wywołują precyzyjne reakcje komórek macierzystych, mogą pomóc w określeniu tego złożonego procesu.
Gardło to duża, cylindryczna rurka potrzebna do odżywiania, zawierająca neurony, mięśnie, komórki nabłonkowe i wydzielnicze13,29. Zwykle ukryty w torbie po brzusznej stronie zwierzęcia, rozciąga się przez pojedynczy otwór ciała zwierzęcia po wyczuciu obecności pokarmu. Aby selektywnie amputować gardło, moczymy wypławki w substancji chemicznej zwanej azydkiem sodu, powszechnie stosowanym środkiem znieczulającym w C. elegans14,15,16. Jego zastosowanie u wypławków zostało po raz pierwszy zgłoszone przez Adlera i wsp., w 2014 roku12. W ciągu kilku minut od wystawienia na działanie azydku sodu wypławki wypychają gardło, a przy delikatnym pobudzeniu gardło odrywa się od zwierzęcia. Tę całkowitą i selektywną utratę gardła nazywamy "amputacją chemiczną". Tydzień po amputacji przywracane jest w pełni funkcjonalne gardło12. Ponieważ gardło jest niezbędne do karmienia, regenerację funkcjonalną można zmierzyć, monitorując zachowania związane z karmieniem. Poniżej opisujemy protokół amputacji chemicznej oraz oceny regeneracji gardła i przywrócenia zachowań żywieniowych.

<table><tbody><tr><td>Dwuwodny chlorek wapnia (CaCl2)</td><td>Fisher Chemical</td><td>C79-3</td><td>Montju&iuml; c roztwór soli</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu bezwodny (MgSO4)</td><td>Fisher Chemical</td><td>M65-3</td><td>Montju&iuml; c roztwór soli</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu sześciowodny (MgCl2)</td><td>Acros/VWR</td><td>41341-5000</td><td>Montju&iuml; c roztwór soli</td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Acros Organics/VWR</td><td>196770010</td><td>Montju&iuml; c roztwór soli</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Acros Organics/VWR</td><td>207790050</td><td>Montju&iuml; c roztwór soli</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu (NaHCO3)</td><td>Acros Organics/VWR</td><td>123360010</td><td>Montju&iuml; c roztwór soli</td></tr><tr><td>Nalgene autoklawowalny kopolimer polipropylenu lowboy z króćcem</td><td>ThermoFisher Scientific/VWR</td><td>2324-0015</td><td>Przechowywanie wody planarii</td></tr><tr><td>Natychmiastowa sól morska oceaniczna</td><td>Spektrum marek</td><td>Amazon</td><td>Woda Planaria</td></tr><tr><td>Siarczan gentamycyny</td><td>Gemini Bio-produkty</td><td>400-100P</td><td>Woda Planaria</td></tr><tr><td>Żyletki</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>71970</td><td>Mielenie wątroby&nbsp;</td></tr><tr><td>Jednorazowe woreczki cukiernicze-16", 12 sztuk</td><td>Wilton</td><td>Amazon</td><td>Porcje wątroby</td></tr><tr><td>5 ml strzykawki</td><td>BD/VWR</td><td>309647</td><td>Porcje wątroby</td></tr><tr><td>szalki Petriego-35mm/60mm</td><td>Greiner Bio-One/VWR</td><td>82050-536/82050-544</td><td></td></tr><tr><td>Pojemniki plastikowe (różne rozmiary)</td><td>Ziploc</td><td>Amazon</td><td>Trzymanie wypławków w kulturze statycznej</td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta transferowa</td><td>Globe Scientific</td><td>138030</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze - Pęseta Dumont, Typ 5</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki&nbsp;</td><td>72700-D (0203-5-PO)</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>62247</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna, koniugat Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher</td><td>S11223</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP229-1</td><td></td></tr></tbody></table>

chemiczna amputacja i regeneracja gardła w wypławku schmidtea mediterranea

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Planarias to płazińce, które są niezwykle skuteczne w regeneracji. Zdolność tę zawdzięczają dużej liczbie komórek macierzystych, które mogą szybko zareagować na każdy rodzaj urazu. Typowe modele urazów u tych zwierząt usuwają duże ilości tkanek, które uszkadzają wiele narządów. Aby przezwyciężyć to szerokie uszkodzenie tkanki, opisujemy tutaj metodę selektywnego usuwania pojedynczego narządu, gardła, w wypławku Schmidtea mediterranea. Osiągamy to poprzez moczenie zwierząt w roztworze zawierającym inhibitor oksydazy cytochromowej azydek sodu. Krótka ekspozycja na azydek sodu powoduje wytłoczenie gardła ze zwierzęcia, co nazywamy "amputacją chemiczną". Amputacja chemiczna usuwa całe gardło i generuje małą ranę w miejscu, w którym gardło przyczepia się do jelita. Po intensywnym płukaniu wszystkie amputowane zwierzęta regenerują w pełni funkcjonalne gardło w ciągu około tygodnia. Komórki macierzyste w pozostałej części ciała napędzają regenerację nowego gardła. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół amputacji chemicznej i opisujemy zarówno histologiczne, jak i behawioralne metody oceny udanej amputacji i regeneracji.

Ekspozycja na azydek sodu zaburza prawidłową motorykę planariów, powodując, że zwierzęta rozciągają się i wiercą. Ruchy te wymuszają wysunięcie się gardła z brzusznej strony ciała zwierzęcia, a po około 6 min w roztworze azydku sodu widoczna jest biała końcówka gardła (Rysunek 1B-panel lewy). Po kilku minutach zwierzęta aktywnie kurczą się i całkowicie wysuwają gardło, gwałtownie wypychając je z ciała (Rysunek 1B<...

Wypławka Schmidtea mediterranea jest doskonałym modelem do badania komórek macierzystych i regeneracji tkanek. Niniejsza publikacja opisuje metodę selektywnego usuwania jednego narządu, gardła, poprzez wystawienie zwierząt na działanie chemicznego azydku sodu. Protokół ten określa również metody monitorowania regeneracji gardła.

Chemiczna amputacja i regeneracja gardła w wypławku Schmidtea mediterranea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...

Ogólnym celem tej procedury amputacji jest selektywne i całkowite usunięcie gardła z wypławków bez uszkadzania innych narządów. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie regeneracji. Na przykład w jaki sposób komórki macierzyste rozpoznają brakujące narządy i inicjują ich regenerację.Główną zaletą tej techniki jest to, że jest bardzo precyzyjna i że inne narządy nie są uszkadzane podczas tego procesu. Pierwszy raz wpadłem na pomysł tej metody, kiedy znieczulałem wypławki azydkiem sodu. Zauważyłem, że ekspozycja na azydek sodu powodowała wyskakiwanie gardła.Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ amputacja wymaga odpowiedniego doboru zwierząt, a także uważnej obserwacji ruchu i morfologii zwierząt. Procedurę zademonstruje Divya Shiroor, doktorantka z mojego laboratorium. Przed rozpoczęciem procedury użyj plastikowej pipety transferowej, aby wybrać robaki, które były karmione pięć do siedmiu dni wcześniej na czystą szalkę Petriego.Umieść płaską linijkę pod szalką Petriego, aby potwierdzić, że każdy wypławk ma co najmniej 6 milimetrów długości, gdy pełzają po szalce. Następnie przenieś do 20 wybranych robaków na 35-milimetrową szalkę P

chemical-amputation-regeneration-pharynx-planarian-schmidtea

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Atrakcyjnym modelem do badania różnicowania się komórek macierzystych w żywym organizmie jest płaskonic z rzędu Planarioidea. Regenerację bada się za pomocą prostych eksperymentów z amputacją, które można łatwo przeprowadzić w podstawowym laboratorium i które poddaje się manipulacjom farmakologicznym oraz genetycznym (in vivo RNAi), zgodnie ze szczegółowymi protokołami zawartymi w niniejszym artykule.

Badania farmakologiczne i funkcjonalne badania genetyczne w celu manipulacji regeneracją planarii Dugesia japonica

Opisano skuteczną metodę przeszczepiania tkanek o określonym i powtarzalnym rozmiarze pomiędzy planariami. Uwzględniono również opis tego, w jaki sposób technikę unieruchamiania stosowaną podczas transplantacji można zaadaptować, przy użyciu osłon ołowianych, do częściowego napromieniowania żywych zwierząt.

Unieruchomienie planarii, częściowe napromieniowanie i transplantacja tkanek

Tutaj pokazujemy, jak indukować i monitorować regenerację u ukwiału gwiazdkowego Nematostella vectensis, modelowego antozoana parzydełkowego.  Pokazujemy, jak amputować i kategoryzować regenerację za pomocą morfologicznego systemu oceny stopnia zaawansowania, a także używamy tego systemu, aby ujawnić wymóg autofagii w regeneracji struktur polipowych.

Indukowanie całkowitej regeneracji polipów z pęcherza brzusznego ukwiału gwiazdkowego Nematostella vectensis

Ten protokół pokazuje, jak konsekwentnie wycinać wypławki oczu (panewki wzrokowe) bez naruszania otaczających tkanek. Za pomocą igły insulinowej i strzykawki można dokonać ablacji jednego lub obu oczu, aby ułatwić badania nad mechanizmami regulującymi regenerację oczu, ewolucją regeneracji wzroku i neuronalnymi podstawami zachowań wywołanych światłem.

Test ablacji chirurgicznej do badania regeneracji oka u wypławków

Tutaj prezentujemy protokół amputacji terminalnego paliczka dorosłej myszy w celu zbadania powstawania blastema u ssaków i kostnienia wewnątrzbłoniastego, analizowany za pomocą immunohistochemii fluorescencyjnej i sekwencyjnej tomografii mikrokomputerowej in vivo.

Amputacja i regeneracja palców dorosłych myszy : prosty model do badania powstawania blastemy i kostnienia śródbłoniastego u ssaków

Wypławki słodkowodne wykazują trzy chody (ślizganie się, perystaltyka i zgniatanie), które można rozróżnić za pomocą ilościowej analizy behawioralnej. Opisujemy metodę wywoływania zgniecania za pomocą różnych szkodliwych bodźców, ich kwantyfikację oraz odróżnienie od perystaltyki i ślizgu. Korzystając z knockdownu genów, demonstrujemy specyfikę zgniatania jako ilościowego odczytu fenotypowego.

Zgniatanie wypławków jako ilościowy odczyt behawioralny dla wyczuwania szkodliwych bodźców

Celem niniejszej pracy było ujednolicenie bezpiecznego i powtarzalnego podejścia chirurgicznego do przeprowadzenia całkowitej poprzecznej amputacji żuchwy u Ambystoma mexicanum w celu badania regeneracji tkanki czaszkowo-twarzowej.

Projektowanie i standaryzacja modelu urazu żuchwy w celu badania regeneracji tkanek czaszkowo-twarzowych w modelu Ambystoma mexicanum

Protokół ten stanowi zoptymalizowany, szczegółowy przewodnik po wykorzystaniu planarialnej Schmidtea mediterranea jako modelu do badania interakcji gospodarz-patogen podczas infekcji grzybiczej. Metoda opiera się na wcześniejszej procedurze infekowania planarii ludzkim patogenem grzybowym Candida albicans, dostarczając szczegółowych wskazówek mających na celu zwiększenie powtarzalności i spójności eksperymentów.

Zoptymalizowany protokół dla zakażenia Candida albicans w Schmidtea mediterranea do badania patogenezy grzybów i obrony gospodarza

Opisujemy szczegółowe etapy wysokoprzepustowego testu chemicznego u nicieni Caenorhabditis elegans używanych do oceny toksyczności linii zarodkowej. W tym teście zaburzenie funkcji linii zarodkowej po narażeniu na działanie substancji chemicznych jest monitorowane za pomocą fluorescencyjnego reportera specyficznego dla zarodków aneuploidalnych.

Kompleksowa ocena toksyczności chemicznej linii rozrodczej z wykorzystaniem nicienia Caenorhabditis elegans

Krwinki Drosophila, czyli hemocyty, krążą między miejscami rezydentnymi a krążeniem.  U larwy hemocyty rezydentne (siedzące) lokalizują się w mikrośrodowiskach indukcyjnych, kieszeniach krwiotwórczych, podczas gdy krążące hemocyty poruszają się swobodnie w hemolimfie. Celem tego protokołu jest standaryzowana izolacja i kwantyfikacja tych dwóch, behawioralnie odrębnych, ale wymiennych populacji hemocytów.

Oznaczanie populacji krwinek larwy Drosophila melanogaster

Poznaj metodę chemicznej amputacji gardła u wypławka Schmidtea mediterranea przy użyciu azotku sodu. Technika umożliwia precyzyjne badanie regeneracji tkanek i aktywacji komórek macierzystych bez uszkadzania innych narządów.

Chemiczna amputacja i regeneracja gardła w wypławku Schmidtea mediterranea

Przeglądaj więcej filmów