Chemiczna amputacja i regeneracja gardła w wypławku Schmidtea mediterranea

Ogólnym celem tej procedury amputacji jest selektywne i całkowite usunięcie gardła z wypławków bez uszkadzania innych narządów. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie regeneracji. Na przykład w jaki sposób komórki macierzyste rozpoznają brakujące narządy i inicjują ich regenerację.

Główną zaletą tej techniki jest to, że jest bardzo precyzyjna i że inne narządy nie są uszkadzane podczas tego procesu. Pierwszy raz wpadłem na pomysł tej metody, kiedy znieczulałem wypławki azydkiem sodu. Zauważyłem, że ekspozycja na azydek sodu powodowała wyskakiwanie gardła.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ amputacja wymaga odpowiedniego doboru zwierząt, a także uważnej obserwacji ruchu i morfologii zwierząt. Procedurę zademonstruje Divya Shiroor, doktorantka z mojego laboratorium. Przed rozpoczęciem procedury użyj plastikowej pipety transferowej, aby wybrać robaki, które były karmione pięć do siedmiu dni wcześniej na czystą szalkę Petriego.

Umieść płaską linijkę pod szalką Petriego, aby potwierdzić, że każdy wypławk ma co najmniej 6 milimetrów długości, gdy pełzają po szalce. Następnie przenieś do 20 wybranych robaków na 35-milimetrową szalkę Petriego i użyj pipety transferowej, aby usunąć całą wodę z wypławki z naczynia. Umieść naczynie pod mikroskopem stereoskopowym i dostosuj powiększenie tak, aby można było oglądać wiele zwierząt.

Dodaj do naczynia pięć mililitrów świeżo przygotowanego 100-milimolowego roztworu azydku sodu. Monitoruj zwierzęta bez przesuwania naczynia przez trzy do czterech minut, aby obserwować wytłaczanie gardła. Gdy co najmniej połowa zwierząt w naczyniu całkowicie rozciągnie gardło, użyj plastikowej pipety transferowej, aby kilka razy zassać i na siłę dozować robaki wokół naczynia.

Jeśli jakiekolwiek gardła są w pełni rozciągnięte, to energiczne pipetowanie spowoduje ich oderwanie. Alternatywnie użyj pary cienkich kleszczy, aby chwycić gardło, jednocześnie podnosząc wypławkę w górę w kierunku łąkotki. Gdy zwierzę jest podnoszone, napięcie powierzchniowe spowoduje oderwanie się gardła.

Podczas poruszania gardłem należy uważać, aby nie spowodować przypadkowych obrażeń zwierząt. Wypławki są bardzo miękkie i łatwo ulegają uszkodzeniu, zwłaszcza gdy znajdują się w azydku sodu. Użyj pipety transferowej, aby przenieść około 15 amputowanych zwierząt do nowego naczynia zawierającego świeżą wodę z wypławkami i trzykrotnie spłucz robaki świeżą wodą z wypławków.

Upewnij się, że całkowicie wypłukałeś azydek sodu. Nawet śladowe ilości substancji chemicznej mogą powodować lizę u zwierząt. Następnie wysiaduj robaki w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez siedem dni.

Dzień po amputacji umieść robaki z powrotem pod mikroskopem, aby ustalić, czy po grzbietowej stronie robaka widoczna jest ciemna plama. Aby nakarmić robaki, przenieś odpowiednią objętość pasty wątrobowej do probówki do mikrowirówki i krótko odwiruj probówkę, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza. Po oszacowaniu objętości granulki pasty dodaj wodę płaśnikową do jednej piątej jego objętości.

W oparciu o całkowitą objętość w tubie dodaj dwa procent czerwonego barwnika spożywczego. Dokładnie wymieszaj próbkę żywności, aż barwnik zostanie równomiernie rozprowadzony w paście i ponownie krótko odwiruj probówkę. Przenieś amputowane zwierzęta na nową szalkę Petriego i umieść w ciemności na około godzinę.

Pod koniec inkubacji przyciąć około pół centymetra od końca końcówki pipety P200 i użyć zmodyfikowanej końcówki do przeniesienia 25 mikrolitrów czerwonej pasty wątrobowej do naczynia. Pozwól zwierzętom karmić się przez 30 minut. Następnie umieść robaki na białym tle, aby ocenić liczbę zwierząt, które wydają się czerwone.

Po około 6 minutach w roztworze azydku sodu można zobaczyć białą końcówkę gardła. Kilka minut później zwierzęta aktywnie kurczą się i mocno wyrzucają gardło ze swoich ciał. Po około 11 minutach ekspozycji na azydek zwierzęta rozluźniają się, w którym to momencie charakterystyczny dzwonkowaty kształt gardła staje się wyraźnie widoczny.

Jest teraz gotowy do amputacji. Usunięcie tej dużej, niepigmentowanej masy tkanki powoduje pojawienie się ciemnej plamy na grzbietowej stronie amputowanych zwierząt. Aby dokładniej monitorować regenerację gardła, zwierzęta można przez noc barwić fluorescencyjnie sprzężoną streptawidyną.

Łącząc barwniki spożywcze z pastą z wątroby, można odróżnić zwierzęta, które jedzą, od zwierząt, które nie jedzą. Liczba czerwonych zwierząt może być następnie określona ilościowo, aby ocenić odsetek zwierząt z funkcjonalnym gardłem. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w 20 lub 30 minut.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o uważnej obserwacji ruchu wypławków, aby określić, kiedy należy rozpocząć amputację. Selektywne amputacje mogą pomóc odpowiedzieć na pytania, w jaki sposób komórki macierzyste inicjują odpowiednie decyzje dotyczące linii, aby przeprowadzić regenerację. Ten film powinien zapewnić dobre zrozumienie, jak przeprowadzić selektywne usuwanie gardła za pomocą azydku sodu.

Praca z azydkiem sodu może być bardzo niebezpieczna. Pamiętaj, aby zawsze obchodzić się z nim w rękawiczkach, odpowiednio wyrzucać odpady i posprzątać miejsce pracy po eksperymencie.