Niezbędny wychwyt metali przez bakterie Gram-ujemne: fluorescencja rentgenowska, radioizotopy i frakcjonowanie komórek

Ogólnym celem tej techniki jest ekstrakcja peryplazmatycznej zawartości bakteryjnej poprzez frakcjonowanie komórek w celu charakterystyki biofizycznej, w tym fluorescencji rentgenowskiej, krystalografii rentgenowskiej i wychwytu radiometali. Metoda ta może pomóc nam zrozumieć kluczowe zależności biologiczne, w tym relacje struktura-funkcja systemów transportowych ABC oraz sposób, w jaki rozpoznają one swoje substraty i transportują je do komórki przez dwuwarstwę lipidową. Główną zaletą tej techniki jest oddzielna ocena zawartości komórek i ekstrakcja białka z jego rodzimego środowiska przy minimalnym zanieczyszczeniu krzyżowym.

Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy próbowaliśmy usunąć substrat YfeA, zdając sobie sprawę, że zamiast używać sztucznego podejścia, możemy użyć komórki do produkcji białka apo. Oprócz zapewnienia wglądu w wiązanie substratu i transport przez przedziały komórek bakteryjnych, metody takie jak ten test radioznacznikowy mają zastosowanie do systemów eukariotycznych, które również mają solidne techniki frakcjonowania. Najpierw rozmrozić wcześniej przygotowaną rezawiesinę subkultury bakteryjnej w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie rozmrożone komórki osadzać w temperaturze 4 000 razy większej niż grawitacja przez 20 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnie ponownie zawieś komórki w 50 mililitrach lodowatego buforu o wysokiej zawartości soli, zasysając za pomocą automatycznej pipety i 25-mililitrowej końcówki. Inkubować zawiesinę nad lodem przez 20 minut, od czasu do czasu inwersję w celu wymieszania.

Po inkubacji osadzaj komórki pod ciśnieniem 4 500 razy większym niż grawitacja przez 20 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Ponownie zawieś komórki w 15 mililitrach lodowatego buforu o niskiej zawartości soli, zasysając za pomocą automatycznej pipety i 25-mililitrowej końcówki. Następnie inkubować zawiesinę nad lodem przez 20 minut, od czasu do czasu odwracając w celu wymieszania.

Szok osmotyczny powoduje pęknięcie zewnętrznej błony Gram-ujemnej w wyniku nagłego spadku stężenia soli w środowisku. Delikatne obchodzenie się z komórkami ma kluczowe znaczenie, aby uniknąć inicjowania niepożądanego dalszego pękania błony wewnętrznej, zanieczyszczenia krzyżowego cytoplazmy peryplazmy oraz destabilizacji lub agregacji uwolnionych białek peryplazmatycznych. Następnie osadzaj sferoplasty pod ciśnieniem 4 500 razy większym niż grawitacja przez 20 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Następnie odzyskaj supernatant zawierający peryplazmę. Ponownie zawiesić granulowane sferoplasty w buforowanym fosforanowym roztworze soli fizjologicznej, zasysając za pomocą automatycznej pipety i 25-mililitrowej końcówki. Następnie poddaj komórki lizie w trzech cyklach francuskiej prasy ciśnieniowej przy 1 500 psi.

Teraz rozpylaj szczątki komórkowe pod ciśnieniem 50 000 razy większym od grawitacji przez 20 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Odzyskać supernatant zawierający cytoplazmę. Po frakcjonowaniu i oczyszczeniu frakcji peryplazmatycznej wymieszać 1,5 mikrolitra oczyszczonego białka z PEG 4000, chlorkiem sodu, buforem Bis-Tris i azydkiem sodu w układzie kropli siedzącej lub wiszącej, zasysając pipetą i końcówką o pojemności 10 mikrolitrów.

Inkubuj krople krystalizacji o temperaturze 293 kelwinów przez dwa do czterech tygodni. Po inkubacji zbierz kryształy i błyskawicznie zamroź je w basenie ciekłego azotu w celu wysyłki do synchrotronu. W przypadku analizy fluorescencji rentgenowskiej przesuń próbkę poza wiązkę i przejdź do zakładki Hutch w oprogramowaniu.

Użyj podtytułu Energia, aby ustawić energię na 10 kiloelektronowoltów. Następnie przenieś próbkę z powrotem do wiązki i przejdź do zakładki Skanowanie. Przejdź do zakładki Interaktywne.

Wybierz opcję Optymalizuj sygnał fluorescencji. Wprowadź cztery sekundy pod podnagłówkiem Czas i wybierz opcję Weź widmo fluorescencji. Widmo jest automatycznie wykreślane do wyświetlenia na karcie Wykres.

Można wybrać elementy będące przedmiotem zainteresowania, które posłużą do analizy regionów energetycznych odpowiadających ich szczytowym poziomom emisji. W celu analizy absorpcji energii metalu należy wyprowadzić próbkę z belki. Przejdź do zakładki Skanowanie, a następnie przejdź do zakładki Układ okresowy pierwiastków i wybierz krawędź K interesujących Cię pierwiastków.

Następnie przejdź do zakładki Budka. Użyj podtytułu Energia, aby ustawić energię na wartość z poprzedniego kroku w kiloelektronowoltach. Przenieś próbkę do belki.

Przejdź do zakładki Skanowanie. Przejdź do zakładki Auto i wprowadź dwie sekundy pod podnagłówkiem Czas. Teraz wybierz Rozpocznij skanowanie i wyświetl skanowanie MAD za pomocą karty Wykres i wybierz skanowanie krawędzi, aby określić krawędź absorpcji energii.

Następnie wybierz gotowe z fluorescencją. Po przygotowaniu subkultury z radioaktywnym znacznikiem, podwielokrotność jednego mililitra do pojedynczych 1,5-mililitrowych probówek wirówkowych przez zasysanie pipetą i jednomililitrową końcówką. Odłóż na bok trzy powtórzone standardy.

Nie będziesz ich ponownie potrzebować do końca eksperymentu. Umieść pozostałe probówki w termomikserze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i wiruj raz razy grawitacji. Po inkubacji odwirować probówki pod ciśnieniem 15 000 razy większym niż grawitacja przez 30 sekund za pomocą wirówki stołowej, najlepiej schłodzonej do 4 stopni Celsjusza.

Po odrzuceniu supernatantów ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze lodowatego buforu o wysokiej zawartości soli, zasysając pipetą i jednomililitrową końcówką i natychmiast umieścić na lodzie na 20 minut. Po odwirowaniu ponownie zawiesić komórki w lodowatym buforze o niskiej zawartości soli, zasysając pipetą i jednomililitrową końcówką i inkubować na lodzie przez 20 minut. Po zagnieżdżeniu komórek pod ciśnieniem 15 000 razy grawitacji przez 30 sekund, zbierz każdy z supernatantów do nowych 1,5-mililitrowych probówek wirówkowych.

Zmierz radioaktywność w każdej frakcji i wzorcu. Ilość promieniotwórczości w wzorcach należy wykorzystać do określenia całkowitej ilości promieniotwórczości pierwotnie dodanej do każdej próbki. Pobrano chromatogramy filtracji żelowej i żelowej SDS-PAGE w celu oceny jakości oczyszczania białek z preparatywnego frakcjonowania peryplazmowego.

Liniowy gradient elucji dla chromatografii anionowymiennej znacznie poprawia wzbogacenie YfeA z 8% frakcji peryplazmowej do 49% produktu wymiany anionowej. Skład ten poprawia się do 61% przez filtrację żelową, a objętości elucji białka apo i białka holo są identyczne. Oczyszczone apo i holo YfeA krystalizują w tych samych warunkach krystalizacji, chociaż obrazy morfologii kryształów apo i holo YfeA pokazują różnice we wzroście kryształów między stanami apo i holo YfeA.

Biorąc pod uwagę, że jest głównym substratem związanym z rekombinowanym YfeA, widma fluorescencji rentgenowskiej mogą różnicować próbkę zawierającą silny sygnał cynkowy współmierny do holo YfeA, który wskazuje na zanieczyszczenie krzyżowe, lub słabszy sygnał sugerujący apo YfeA i minimalne zanieczyszczenie krzyżowe. 60-minutowy obraz frakcjonowania wychwytu metali promieniotwórczych, porównujący frakcje peryplazmatyczne i cytoplazmatyczne komórek E. coli eksprymujących tylko YfeA, pełny transporter YfeABCDE i żaden ze składników YfeABCDE ujawnia konsekwencje ekspresji pojedynczego rekombinowanego białka lub kompleksu białkowego na wychwyt metalu. Po opanowaniu przedział peryplazmatyczny można wyekstrahować z całych komórek przez frakcjonowanie.

Białko dodatkowo oczyszczone przez chromatografię i białko będące przedmiotem zainteresowania w krystalizacji spada w ciągu około czterech godzin i 30 minut, jeśli procedury są wykonywane prawidłowo. Podczas próby procedury frakcjonowania i oczyszczania ważne jest, aby utrzymać próbkę nad lodem podczas frakcjonowania i w temperaturze 4 stopni Celsjusza podczas oczyszczania. Warunki te poprawią jakość frakcjonowania i stabilność oczyszczonego białka.

Zgodnie z tą procedurą można wprowadzić inne metale, takie jak miedź lub gal, w celu zmierzenia konkurencyjnego hamowania lub szybkości transportu substratów niekanonicznych oraz w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące specyficzności substratów i kluczowych aminokwasów funkcjonalnych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak frakcjonować komórki E. coli i przeprowadzać analizy biofizyczne zawartości przedziału komórkowego, takiego jak peryplazma, bez zanieczyszczenia cytoplazmy. Nie zapominaj, że praca z radioaktywnością może być niezwykle niebezpieczna, a środki ostrożności, takie jak odpowiednia gospodarka odpadami i stosowanie minimalnej ilości odczynnika radioaktywnego, powinny być zawsze brane pod uwagę podczas wykonywania tej procedury.