Rozmiar ma znaczenie: pomiar średnicy kapsułki u Cryptococcus neoformans
February 27th, 2018
Kapsułka polisacharydowa jest głównym czynnikiem wirulencji u Cryptococcus neoformans, a jej rozmiar koreluje ze zjadliwością szczepu. Pomiary średnicy kapsułki są wykorzystywane w testach fenotypowych i do oceny skuteczności terapeutycznej. Przedstawiono tutaj standardową metodę indukcji kapsułek, a także porównano dwie metody barwienia i pomiaru średnicy.
Ogólnym celem tej procedury jest zabarwienie kapsułki polisacharydowej szczepów C.neoformans w celu wizualizacji i pomiaru średnicy kapsułki. Metody te mogą pomóc naukowcom w indukcji, obrazowaniu i pomiarze wielkości kapsułki u Cryptococcus neoformans. Główną zaletą technik barwienia i obrazowania jest to, że są proste, szybkie i pozwalają na dokładny pomiar średnicy kapsułki.
Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ kroki oprogramowania mogą być mylące przy pierwszym użyciu. Średnica torebki Cryptococcus neoformans jest często używana jako miara zjadliwości. Możliwość zautomatyzowania tego procesu może zaoszczędzić znaczną ilość czasu poświęconego na analizę.
Aby wywołać produkcję kapsułek, najpierw inkubuj kolonię C.neoformans w bulionie dekstrozy z peptonem drożdżowym w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając przez 18-36 godzin, aż kultura znajdzie się w fazie logarytmicznej. Pod koniec hodowli drożdże należy zagnieździć przez odwirowanie i trzykrotnie umyć drożdże w PBS. Po ostatnim praniu ponownie zawieś drożdże dwa razy od 10 do piątej komórki na dwa mililitry stężenia DMEM i inkubuj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 18 godzin.
Następnego dnia zebrać komórki przez odwirowanie i usunąć wszystkie oprócz ostatnich 10 mikrolitrów supernatantu. Aby zabarwić drożdże atramentem indyjskim, ponownie zawieś osad w pozostałym supernatancie i przenieś cztery mikrolitry zawiesiny komórkowej i cztery mikrolitry atramentu indyjskiego na szklane szkiełko mikroskopowe. Delikatnie wymieszaj powstały roztwór, nie tworząc pęcherzyków.
Następnie umieść szkiełko nakrywkowe o grubości 1,5 i grubości 13 milimetrów na próbce komórek i uszczelnij krawędzie nietoksycznym uszczelniaczem. Aby zabarwić drożdże barwnikiem fluorescencyjnym, ponownie zawieś osad hodowlany na noc w 50 mikrolitrach PBS uzupełnionego 1% surowicą bydlęcą i inkubuj komórki w 55-60 mikrolitrach przeciwciała monoklonalnego 18B7 w kapsułkach kalkofluorowych i Alexa Fluor 488 przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w 10 mikrolitrach PBS plus albumina surowicy bydlęcej.
Następnie przenieś osiem mikrolitrów komórek na szklane szkiełko mikroskopowe, przykryj próbkę komórki szklanym szkiełkiem nakrywkowym o grubości 1,5 13 milimetra i uszczelnij krawędzie nietoksycznym uszczelniaczem. Aby zabarwić drożdże obydwoma barwnikami, najpierw inkubuj komórki za pomocą kapsułki fluorescencyjnej i barwienia ściany komórkowej, jak właśnie pokazano. Następnie dodaj cztery mikrolitry komórek barwionych fluorescencyjnie i cztery mikrolitry atramentu indyjskiego na szkiełko podstawowe i umieść szczelnie zapieczętowane szkiełko nakrywkowe na próbce komórek grzyba, jak pokazano.
Aby zobrazować komórki za pomocą mikroskopii świetlnej, wybierz obiektyw 100X i zobrazuj co najmniej 50 nienakładających się komórek na warunki z czasami ekspozycji zoptymalizowanymi w celu maksymalizacji kontrastu obrazu przy jednoczesnej minimalizacji rozmycia spowodowanego ruchami małych komórek. Aby zobrazować komórki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, otwórz oprogramowanie do obrazowania mikroskopu i wybierz odpowiednie długości fal wzbudzenia i emisji dla użytych fluoroforów. W panelu sterowania stosu Z wybierz przedostatnią opcję.
Korzystając z precyzyjnej kontroli ostrości na mikroskopie, najpierw ustaw ostrość poniżej najszerszego punktu ciała pojedynczej komórki drożdży i kapsułek dla wszystkich komórek w bieżącym polu view i kliknij najpierw ustaw. Następnie użyj precyzyjnej kontrolki ostrości, aby ustawić ostrość powyżej najszerszego punktu ciała komórki tej samej komórki i kapsułki dla wszystkich komórek w bieżącym polu view i kliknij ustaw ostatnią. Następnie otwórz zakładkę akwizycji i kliknij rozpocznij eksperyment, aby uzyskać stos Z dla bieżącej pozycji.
Aby ręcznie zmierzyć średnicę kapsułki i komórek, otwórz odpowiedni program do pomiaru komórek i wybierz obraz, który ma być mierzony. Wybierz pomiar i użyj kursora, aby narysować linię prostą przechodzącą przez najszerszy punkt całej komórki, aby zmierzyć całkowitą średnicę komórki. Kliknij ponownie przycisk zmierz i narysuj linię prostą przez ciało komórki, aby zmierzyć średnicę ciała komórki i otworzyć następną komórkę.
Gdy wszystkie komórki zostaną zmierzone, zapisz obrazy. Aby uzyskać automatyczny pomiar średnic kapsułki i komórek, najpierw otwórz odpowiedni program do edycji obrazu i odwróć wszystkie obrazy komórek poplamione atramentem indyjskim. Następnie, aby zaimportować zarówno oryginalne, jak i odwrócone obrazy do oprogramowania do pomiaru komórek, otwórz file menu w programie pomiarowym i wybierz import sekwencji, załaduj obraz, zdefiniuj sekwencję ręcznie, zwymiaruj kanał, import i zastosuj.
Aby wykryć i zamaskować ciało komórki, wybierz protokół fluorescencji analizatora kolonii dla pierwszego odwróconego obrazu, który Cię interesuje, a następnie kliknij przycisk Zastosuj. Wybierz ponownie protokół fluorescencji analizatora kolonii, aby podzielić obrazy odwróconych komórek C.neoformans z ich kapsułek i kliknij ponownie przycisk Zastosuj, aby utworzyć maskę zliczającą. Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby zmienić nazwę ciała komórki maski zliczającej i użyć protokołu proliferacji komórek na oryginalnym obrazie, aby wykryć i zamaskować kapsułkę.
Kliknij przycisk Zastosuj, aby utworzyć maskę zliczania dla oryginalnego obrazu i zmienić nazwę kapsułki maski zliczania. Aby utworzyć nową maskę na oryginalnym obrazie w celu oddzielenia sąsiadujących kapsuł od siebie, wybierz partycję kapsuły i kapsułkę dla regionu kapsuły. Aby wyeksportować dane, kliknij arkusz kalkulacyjny, a następnie kliknij ikonę eksportu do arkusza kalkulacyjnego.
Wybierz pomiary, które chcesz wyeksportować, a następnie zapisz dane. Wzrost wielkości kapsułki jest widoczny w większości szczepów po indukcji, chociaż niektóre szczepy wykazują naturalnie małe kapsułki. W tym reprezentatywnym eksperymencie konsekwentnie obserwowano znaczącą różnicę w wielkości kapsułki między największym szczepem a dwoma mniejszymi szczepami.
Różnice w wielkości kapsułki można również wykryć za pomocą barwników fluorescencyjnych. Przechwytywanie obrazu stosu Z zapewnia, że dla każdej komórki uzyskiwana jest maksymalna średnica kapsułki i korpusu komórki. Stosy mogą być następnie przetwarzane w celu uzyskania projekcji maksymalnej intensywności do ręcznego pomiaru torebki komórkowej drożdży i średnicy komórki.
Nie ma znaczącej różnicy w trakcie eksperymentu między pomiarami kapsułek przy użyciu którejkolwiek z metod barwienia, chociaż większą zmienność między eksperymentami obserwuje się w przypadku stosowania atramentu indyjskiego do pomiaru średnic kapsułek w porównaniu z barwieniem barwnikiem fluorescencyjnym. Znaczące różnice w pomiarach średnicy kapsułki między różnymi badaczami nie są zazwyczaj obserwowane niezależnie od zastosowanej metody, podczas gdy niewielkie, ale znaczące różnice w rozmiarze kapsułki można wykryć za pomocą metody pomiaru automatycznego. Aby pomiar automatyczny był skuteczny, komórki muszą być ostre, mieć średnią lub dużą kapsułkę i nie mogą być nadmiernie zgrupowane.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak indukować kapsułkę w Cryptococcus neoformans, barwić ją za pomocą atramentu indyjskiego lub barwienia fluorescencyjnego, obrazować kapsułkę i mierzyć ją za pomocą zautomatyzowanego oprogramowania.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia metodę barwienia i pomiaru kapsułki polisakcharydowej Cryptococcus neoformans, klucza czynnika wirulencji. Opisane techniki ułatwiają dokładną wizualizację i pomiar średnicy, co koreluje z wirulencją szczepu.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Mikrobiologia
- Patogenność
- Immunologia
Tło
- Kapsułka polisakcharydowa jest kluczowa dla wirulencji Cryptococcus neoformans.
- Średnica kapsułki jest istotnym wskaźnikiem wirulencji szczepu.
- Dokładne techniki pomiaru są niezbędne do oceny skuteczności terapeutycznej.
- Wizynalne demonstracje pomagają zrozumieć metodologię.
Cel badania
- Aby zapewnić standaryzowaną metodę indukcji kapsułki.
- Aby porównać różne techniki barwienia i pomiaru.
- Aby zwiększyć dokładność i efektywność pomiaru średnicy kapsułki.
Stosowane metody
- Indukcja kapsułki polisakcharydowej w szczepach C. neoformans.
- Techniki barwienia do wizualizowania.
- Pomiar średnicy kapsułki przy użyciu oprogramowania do przetwarzania obrazów.
- Porównanie różnych metod barwienia pod względem efektywności.
Główne wyniki
- Przedstawione metody pozwalają na proste i szybkie wizualizowanie kapsułki.
- Osiągnięto dokładny pomiar średnicy kapsułki.
- Automatyzacja procesu może znacząco skrócić czas analizy.
- Pomoce wizualne są kluczowe dla zrozumienia kroków oprogramowania.
Wnioski
- Przedstawione metody są skuteczne w badaniu wirulencji C. neoformans.
- Dokładny pomiar kapsułki jest niezbędny do oceny skuteczności terapeutycznej.
- Przyszłe badania mogą skorzystać na automatyzacji tych technik.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Accurate measurement of Cryptococcus neoformans capsule diameter provides a quantitative proxy for virulence assessment, supporting target validation in antifungal discovery. The ability to automate capsule size measurement enhances reproducibility and throughput in phenotypic screening campaigns. This method enables mechanistic de-risking by linking capsule modulation to therapeutic intervention efficacy.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of virulence-associated phenotypes through direct measurement of capsule diameter.
- Operational Value: Supports hypothesis testing of genetic or chemical modulators of capsule biosynthesis.
- Strategic Value: Facilitates target confidence by correlating capsule size with pathogenic potential.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a quantifiable readout for high-content screening of compounds affecting capsule formation.
- Operational Value: India ink staining with automated image analysis enables scalable, standardized capsule diameter measurement.
- Strategic Value: Improves assay reproducibility and reduces inter-operator variability in virulence phenotype assessment.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links capsule diameter changes to strain virulence, supporting predictive modeling of therapeutic efficacy.
- Operational Value: Fluorescent co-staining with confocal imaging allows for precise, resolution-enhanced capsule visualization.
- Strategic Value: Enables translational continuity from in vitro phenotype to in vivo pathogenicity assessment.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation through phenotypic screening to preclinical evaluation, where capsule diameter serves as a biomarker of virulence modulation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of capsule biosynthesis pathways as virulence determinants.
- Screening: Enables automated, quantitative measurement of capsule size for compound library screening.
- Analytics: Generates morphometric data (capsule and cell body diameter) for comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Connects in vitro capsule measurements to in vivo virulence models for risk-adjusted advancement.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for antifungal lead identification and mechanism-of-action studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in virulence assessment through direct, quantifiable phenotyping.
- Operational Value: Standardization via automated image analysis improves throughput and reduces manual measurement bias.
- Strategic Value: Increases predictive confidence in go/no-go decisions by linking capsule size to pathogenic potential.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of antifungal candidates based on virulence attenuation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbiological culture techniques and microscopy-based imaging.
- Dependent on access to light or fluorescence microscopy and image analysis software capable of morphometric segmentation.
- Necessitates standardization of capsule induction protocols across laboratories to ensure comparability.
- Automated measurement requires cells to be in focus with sufficient capsule size and minimal clustering for accurate segmentation.
- Inter-experiment variability is higher with India ink than fluorescent staining, necessitating careful protocol adherence.
