Metoda określania wpływu wzbogacania środowiska na bioróżnorodność biomu mikrobiomu jelita grubego w mysim modelu guza jelita grubego
28 lutego 2018
Wzbogacenie środowiska (EE) to środowisko przetrzymywania zwierząt, które służy do ujawniania mechanizmów leżących u podstaw powiązań między stylem życia, stresem i chorobami. Protokół ten opisuje procedurę, która wykorzystuje mysi model nowotworzenia jelita grubego i EE w celu szczegółowego zdefiniowania zmian w różnorodności biologicznej mikrobioty, które mogą mieć wpływ na śmiertelność zwierząt.
Głównym celem niniejszej publikacji jest przedstawienie metody normalizacji mikrobiomu gryzoni. W tej demonstracji wpływ wzbogacenia środowiska na mikrobiom jest badany podczas genezy guza jelita grubego. Protokół ten pokazuje, w jaki sposób normalizacja mikrobiomu przed interwencją wzbogacającą środowisko poprawia odtwarzalność eksperymentalną.
Pokazujemy również, jak zmniejszyć stres zwierząt i poprawić interakcje przy użyciu wzbogaconego środowiska. Chociaż skupiliśmy się na wpływie wzbogacenia środowiska w modelu guza jelita grubego, metodę tę można łatwo zastosować, aby lepiej zrozumieć rolę mikrobiomu w etiologii choroby. Ustaw klatki w sterylnych warunkach, pracując pod wentylowanym kapturem.
Kontrola w tym eksperymencie składa się z konwencjonalnych klatek z ściółką i tkanką laboratoryjną do zagnieżdżania, ale poza tym brakuje im urządzeń wzbogacających. Aby ustawić klatki do hodowli szczeniąt lub klatki wzbogacone środowiskowo, połącz dwie duże klatki autoklawowane ze sterylizowanym tunelem zabezpieczonym przelotką i dołącz wysterylizowaną platformę w każdej klatce, aby zwiększyć powierzchnię podłogi. W przypadku EE zapewnij również wysterylizowane koła jezdne, tunele, igloo, chaty, piłki do czołgania się i materiał do gniazdowania.
Umieść zarówno klatkę wzbogaconą, jak i kontrolną w tym samym stojaku, aby zapewnić równą wentylację. Do hodowli połącz jednego buhaja i dwie potencjalne matki w normalnych klatkach. Każdego ranka sprawdzaj, czy nie ma zatyczek dopochwowych, które wskazują, że zwierzę kryło się w nocy.
Jeśli czop nie jest widoczny, opór przed sondowaniem dopochwowym może wykryć zinternalizowaną zatyczkę. Jeśli samica ma czop dopochwowy, przenieś ją do dużej klatki do wychowu szczeniąt. W wzbogaconych ekologicznie klatkach z platformami można umieścić do 12 ciężarnych matek, pod warunkiem, że wszystkie mają urodzić w tym samym tygodniu.
Gdy młode osiągną wiek od 21 do 28 dni, rozprowadź samce i samice według genotypu w środowiskach kontrolnych lub wzbogaconych środowiskach. Upewnij się, że w każdej klatce znajduje się pewna proporcja każdego genotypu. Nieulepszone klatki mogą pomieścić do pięciu myszy, podczas gdy ulepszone klatki wymagają co najmniej 20 myszy do stymulacji społecznej i mogą obsługiwać do 41 myszy.
Zacznij zbierać stolec na jeden lub dwa dni przed eutanazją myszy. Zbieraj zawsze o tej samej porze dnia. Aby zebrać stolec od żywych zwierząt, ostrożnie przełóż zwierzę na czystą klatkę.
Następnie zbierz wypróżniony stolec za pomocą sterylnych kleszczy i przenieś do sterylnej probówki do mikrofuge. Jeśli zwierzę nie wypróżni się natychmiast, umieść je w czystej klatce i poczekaj, aż zwierzę się wypróżni, co może potrwać do godziny. Aby pobrać stolec od zwierzęcia poddanego eutanazji, należy go wyciąć, aby uzyskać dostęp do okrężnicy.
Następnie przetnij okrężnicę tuż pod jelitem ślepym i ułóż okrężnicę na kawałku bibuły filtracyjnej. Następnie użyj kleszczy, aby podnieść górną część rurki jelita grubego i otwórz światło za pomocą nożyczek. Przeciąć wzdłużnie dystalnie do proksymalnego, aby rozchylić okrężnicę wzdłuż.
Następnie zbierz stolec z dystalnej części jelita grubego do sterylnej probówki do mikrofuge za pomocą sterylnych kleszczy. Próbki kału należy przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Oprócz stolca zbierz inne próbki tkanek z okrężnicy i jelita cienkiego, mikrosomów, tkanki tłuszczowej i tak dalej.
Wykorzystaj komercyjny zestaw do wyizolowania drobnoustrojowego DNA ze stolca zgodnie z protokołem wykrywania patogenów w stolcu. W tym celu należy przenieść próbki z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na suchy lód i zważyć je. Następnie należy przeprowadzić test PCR, który amplifikuje DNA drobnoustrojów zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
Następnie oczyść produkty reakcji za pomocą kulek magnetycznych. W celu oczyszczenia należy najpierw krótko odwirować płytkę amplikonową PCR, aby zebrać produkty reakcji. Następnie należy wirować kulki magnetyczne, aby równomiernie je rozproszyć i przenieść 20 mikrolitrowych porcji do każdej reakcji.
Dokładnie wymieszać kulki z roztworem, powoli pipetując całą objętość 10 razy. Następnie pozwól koralikom osiąść na pięć minut. Następnie umieść płytkę PCR na stojaku magnetycznym i odczekaj dwie minuty, aż supernatanty znikną po magnetycznym zebraniu kulek.
Następnie usunąć i wyrzucić supernatanty. Następnie, trzymając talerz nadal na magnesie, napełnij każdą studzienkę koralików 200 mikrolitrami świeżego 80% etanolu i odczekaj 30 sekund. Następnie ostrożnie usuń supernatant.
Powtórz ten krok prania raz i pozostaw koraliki do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut. Teraz wymyj produkty reakcji z kulek, wyjmując płytkę ze stojaka magnetycznego i dodając 52,5 mikrolitra Tris do każdej studzienki. Całkowicie wymieszać kulki z roztworem, odpipetowując powoli całą objętość 10 razy.
Następnie zbierz kulki na stojaku magnetycznym jak poprzednio i przenieś 50 mikrolitrów supernatantu na czystą płytkę PCR. Przykryj płytkę przezroczystym klejem i przechowuj ją w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do tygodnia. Zebrany supernatant należy wykorzystać do przeprowadzenia indeksowej reakcji PCR w celu dołączenia kodów kreskowych do sekwencji adaptera.
Następnie oczyść produkty i przygotuj zindeksowaną bibliotekę do sekwencjonowania. U myszy wiadomo, że wzbogacenie środowiska poprawia długość życia i gojenie się ran nowotworowych. Aby określić rolę mikrobioty w tym fenotypie, zwierzęta hodowlane zostały włączone do kolonii myszy na co najmniej jeden miesiąc w celu normalizacji mikrobioty.
Następnie były hodowane, a ich potomstwo wychowywano w wzbogaconym środowisku lub normalnym środowisku. Potomstwo było również nosicielem nowotworów lub typu dzikiego. Po 16 tygodniach zwierzęta poddano eutanazji i pobrano próbki kału w celu wyizolowania DNA drobnoustrojów.
Następnie zastosowano PCR do amplifikacji podjednostki rybosomalnej 16S w próbkach w celu zbadania składników mikrobiomu. Produkty reakcji zostały następnie zidentyfikowane za pomocą indeksowania kodów kreskowych. Co ciekawe, ulepszone środowisko nie poprawia różnorodności biologicznej u zwierząt typu dzikiego, ale znacznie zwiększa bioróżnorodność u zwierząt z nowotworami.
Świadczy to o czułości tej metody. Ten wzrost różnorodności biologicznej przypisano zwiększonej obecności gromady Proteobacteria ze znacznym wzrostem klas alphaproteobacteria i betaproteobacteria oraz spadkiem patogennych gammaproteobacteria. Największy wzrost klasy betaproteobakterii nastąpił w rodzaju Sutterella, prawdopodobnie komensalu biorącego udział w degradacji wydzielanej immunoglobuliny A.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zmienić praktyki hodowlane, aby znormalizować mikrobiom między zwierzętami doświadczalnymi, zanim zaczniesz interwencje, które Cię interesują. Wykonując tę procedurę, pamiętaj, że zwierzęta ustaliły swoje terytorium w środowisku. Z tego powodu zmiany w środowisku mogą powodować stres, który wpłynie na mikrobiom zwierzęcia.
Nagła zmiana w zachowaniu zwierzęcia jest fizyczną oznaką stresu. Po tej procedurze można wyizolować określone drobnoustroje i dalej je scharakteryzować, aby przetestować wystarczalność zidentyfikowanego drobnoustroju na postęp choroby.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowy protokół oceny wpływu wzbogacenia środowiskowego (EE) na bioróżnorodność mikrobiomu jelitowego w mysim modelu nowotworu okrężnicy. Metoda ta kładzie nacisk na normalizację mikrobiomu przed interwencją EE w celu poprawy powtarzalności eksperymentalnej oraz bada, w jaki sposób EE wpływa na skład mikrobiomu, szczególnie u myszy z nowotworami.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Badania nad mikrobiomem
- Biologia nowotworów
- Hodowla zwierząt
- Biologia molekularna
Wstęp
- Wykazano, że wzbogacenie środowiskowe przynosi korzyści w przebiegu chorób u ludzi oraz w modelach zwierzęcych.
- EE może ograniczać tumorigenezę i poprawiać przeżywalność u myszy poprzez modulację odpowiedzi odpornościowych oraz naprawę ran.
- Mikrobiom jelitowy jest zaangażowany w patogenezę raka jelita grubego, nieswoistych zapaleń jelit, otyłości oraz cukrzycy.
- Normalizacja mikrobiomu oraz staranna opieka nad zwierzętami są kluczowe dla uzyskania powtarzalnych wyników w badaniach nad mikrobiomem.
Cel badania
- Dostarczenie powtarzalnego protokołu oceny wpływu EE na różnorodność mikrobiomu jelitowego w mysim modelu guza okrężnicy.
- Wykazanie znaczenia normalizacji mikrobiomu przed interwencjami eksperymentalnymi.
- Charakterystyka zmian mikrobioty z wykorzystaniem sekwencjonowania 16S rDNA po długotrwałej ekspozycji na EE.
Zastosowane metody
- Utworzenie środowisk kontrolnych i wzbogaconych dla myszy, w tym specyficzna konfiguracja klatek i urządzenia do wzbogacenia środowiskowego.
- Strategie hodowli w celu zapewnienia odpowiedniego rozkładu genotypów i normalizacji mikrobiomu.
- Pobieranie próbek kału od zwierząt żywych oraz uśmierconych w warunkach sterylnych.
- Izolacja mikrobiologicznego DNA z próbek kału przy użyciu komercyjnych zestawów.
- Amplifikacja 16S rDNA metodą PCR, a następnie oczyszczanie za pomocą kulek magnetycznych i kodowanie kreskowe (barcoding) w celu sekwencjonowania.
- Analiza składu mikrobiomu i bioróżnorodności po sekwencjonowaniu.
Główne wyniki
- Wzbogacenie środowiskowe znacząco zwiększyło różnorodność biologiczną mikrobiomu u myszy z guzami, ale nie u zwierząt typu dzikiego.
- Wzrost różnorodności biologicznej wynikał głównie z większej liczebności Proteobacteria, zwłaszcza alphaproteobacteria i betaproteobacteria, przy jednoczesnym spadku liczebności patogennych gammaproteobacteria.
- Rodzaj Sutterella, prawdopodobnie komensalny, wykazał największy wzrost wśród betaproteobacteria.
- Właściwa normalizacja mikrobiomu oraz praktyki hodowlane ograniczyły zmienne zakłócające i poprawiły powtarzalność.
Wnioski
- Protokół ten umożliwia rzetelną ocenę wpływu EE na mikrobiom jelitowy w modelach chorobowych.
- Normalizacja mikrobiomu przed interwencją jest niezbędna dla uzyskania wiarygodnych wyników.
- Podejście to można dostosować do badania roli mikrobiomu w różnych chorobach z wykorzystaniem modeli mysich.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Normalizacja mikrobiomu w przedklinicznych modelach mysich ma kluczowe znaczenie dla redukcji zmiennych zakłócających i zwiększenia wiarygodności prognostycznej badań nad wzbogaceniem środowiskowym w badaniach onkologicznych. Metoda ta umożliwia rzetelną ocenę wpływu czynników środowiskowych na modulację różnorodności mikrobiomu, co bezpośrednio wpływa na niezawodność modeli istotnych dla przebiegu choroby oraz odkrywanie biomarkerów translacyjnych. Integracja protokołów normalizacji i wzbogacania mikrobiomu wzmacnia wczesne etapy odkrywania leków i selekcję portfela projektów poprzez wyjaśnienie mechanizmów biologicznych leżących u podstaw progresji nowotworu.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia rygorystyczną analizę roli mikrobiomu w tumorigenzie i progresji choroby.
- Wspiera biologiczną redukcję ryzyka poprzez kontrolowanie środowiskowych i mikrobiologicznych czynników zakłócających.
- Zwiększa pewność predykcyjną w wiązaniu wzbogacenia środowiskowego z efektami zapośredniczonymi przez układ odpornościowy i mikrobiom.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów w modelach mysich istotnych dla danej choroby.
Przesiewy i opracowanie testów
- Przygotowuje ustandaryzowane kohorty zwierzęce do późniejszych analiz mikrobiomu i testów immunologicznych.
- Zwiększa powtarzalność i wydajność ilościową dzięki kontrolowanemu pobieraniu próbek oraz sekwencjonowaniu 16S rDNA.
- Umożliwia wiarygodną ocenę interwencji modulujących mikrobiom w badaniach onkologicznych.
- Wspiera skalowalność testów i ponowne wykorzystanie platformy w wielu modelach chorób.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Uspójnia modele przedkliniczne z przebiegiem chorób u ludzi poprzez analizę patogenezy sterowanej przez mikrobiom.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną terapii celujących w mikrobiom.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o solidne i powtarzalne dane dotyczące mikrobiomu.
- Wspiera identyfikację biomarkerów translacyjnych powiązanych z modulacją środowiskową i mikrobiologiczną.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół wpisuje się w kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych poprzez ustanowienie standaryzowanych warunków mikrobiomu przed interwencjami w zakresie wzbogacania środowiskowego w mysich modelach nowotworowych.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia testowanie hipotez dotyczących interakcji między mikrobiomem a środowiskiem w procesie tumorigenezy.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe odczyty mikrobiomu do porównywania warunków eksperymentalnych.
- Analityka: Dostarcza dane z sekwencjonowania 16S rDNA w celu wsparcia analizy statystycznej zmian w różnorodności mikrobiologicznej.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki przedkliniczne z chorobami ludzi poprzez modelowanie mechanizmów zależnych od mikrobiomu.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje wielokrotnego użytku schemat postępowania, który można dostosować do różnych modeli mysich istotnych dla danej choroby.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach z zakresu onkologii mikrobiomu.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje hodowlę zwierząt i przetwarzanie próbek w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie decyzji typu go/no-go i zwiększa efektywność kapitałową poprzez minimalizację zmiennych zakłócających.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację programów interwencji środowiskowych i ukierunkowanych na mikrobiom z uwzględnieniem korekty ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie hodowli zwierząt, analizy mikrobiomu oraz technik biologii molekularnej.
- Wymaga dostępu do sterylnych pomieszczeń dla zwierząt, aparatury do PCR oraz infrastruktury sekwenconowania.
- Wymaga rygorystycznej standaryzacji protokołów rozrodu, wzbogacania środowiskowego oraz pobierania próbek pomiędzy zespołami.
- Metoda jest adaptowalna do różnych genotypów myszy i modeli chorób, przy zachowaniu uwagi w kwestii integracji kolonii i kontroli środowiskowej.
- Potencjalne ograniczenia obejmują zmiany w mikrobiomie indukowane stresem oraz konieczność starannego zarządzania środowiskiem.
