Name: Metoda określania wpływu wzbogacania środowiska na bioróżnorodność biomu mikrobiomu jelita grubego w mysim modelu guza jelita grubego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Poznaj metodę oceny wpływu wzbogacenia środowiska na bioróżnorodność mikrobiomu jelita grubego w modelu mysiego guza. Protokół obejmuje normalizację mikrobiomu przed interwencją i analizę 16S rDNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy B. Dalleyowi z University of Utah Genomics za sekwencjonowanie biblioteki, oraz K. Boucherowi z University of Utah Biostatistics za porady statystyczne i dostęp do tych technicznych rdzeni wspierany przez National Cancer Institute award P30 CA042014. Opisany projekt był wspierany przez National Cancer Institute Grants P01 CA073992 i K01 CA128891 oraz Huntsman Cancer Foundation.

<ol><li>Bechard, A., Meagher, R., Mason, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+enrichment+reduces+the+likelihood+of+alopecia+in+adult+C57BL%2F6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science+%3A+JAALAS%22%5BJournal%5D)">Environmental enrichment reduces the likelihood of alopecia in adult C57BL/6J mice.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 50 (2), 171-174 (2011).</li>
<li>Jankowsky, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+enrichment+mitigates+cognitive+deficits+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Environmental enrichment mitigates cognitive deficits in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> J Neurosci. 25 (21), 5217-5224 (2005).</li>
<li>Kondo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+enrichment+ameliorates+a+motor+coordination+deficit+in+a+mouse+model+of+Rett+syndrome--Mecp2+gene+dosage+effects+and+BDNF+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Environmental enrichment ameliorates a motor coordination deficit in a mouse model of Rett syndrome--Mecp2 gene dosage effects and BDNF expression.</a> Eur J Neurosci. 27 (12), 3342-3350 (2008).</li>
<li>Reichmann, F., Painsipp, E., Holzer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+enrichment+and+gut+inflammation+modify+stress-induced+c-Fos+expression+in+the+mouse+corticolimbic+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Environmental enrichment and gut inflammation modify stress-induced c-Fos expression in the mouse corticolimbic system.</a> PLoS One. 8 (1), 54811(2013).</li>
<li>Cao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+and+genetic+activation+of+a+brain-adipocyte+BDNF%2Fleptin+axis+causes+cancer+remission+and+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Environmental and genetic activation of a brain-adipocyte BDNF/leptin axis causes cancer remission and inhibition.</a> Cell. 142 (1), 52-64 (2010).</li>
<li>Bice, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+Enrichment+Induces+Pericyte+and+IgA-Dependent+Wound+Repair+and+Lifespan+Extension+in+a+Colon+Tumor+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Environmental Enrichment Induces Pericyte and IgA-Dependent Wound Repair and Lifespan Extension in a Colon Tumor Model.</a> Cell reports. 19 (4), 760-773 (2017).</li>
<li>Moser, A. R., Pitot, H. C., Dove, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dominant+mutation+that+predisposes+to+multiple+intestinal+neoplasia+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A dominant mutation that predisposes to multiple intestinal neoplasia in the mouse.</a> Science. 247 (4940), 322-324 (1990).</li>
<li>Angus-Hill, M. L., Elbert, K. M., Hidalgo, J., Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+factor+4+functions+as+a+tumor+suppressor+whose+disruption+modulates+colon+cell+proliferation+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">T-cell factor 4 functions as a tumor suppressor whose disruption modulates colon cell proliferation and tumorigenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (12), 4914-4919 (2011).</li>
<li>Holmdahl, R., Malissen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+need+for+littermate+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The need for littermate controls.</a> Eur J Immunol. 42 (1), 45-47 (2012).</li>
<li>Ubeda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Familial+transmission+rather+than+defective+innate+immunity+shapes+the+distinct+intestinal+microbiota+of+TLR-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Familial transmission rather than defective innate immunity shapes the distinct intestinal microbiota of TLR-deficient mice.</a> J Exp Med. 209 (8), 1445-1456 (2012).</li>
<li>Spor, A., Koren, O., Ley, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+the+effects+of+the+environment+and+host+genotype+on+the+gut+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Unravelling the effects of the environment and host genotype on the gut microbiome.</a> Nat Rev Microbiol. 9 (4), 279-290 (2011).</li>
<li>Fujiwara, R., Watanabe, J., Sonoyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+changes+in+composition+of+intestinal+microbiota+in+neonatal+BALB%2Fc+mice+through+cluster+analysis+of+molecular+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Assessing changes in composition of intestinal microbiota in neonatal BALB/c mice through cluster analysis of molecular markers.</a> Br J Nutr. 99 (6), 1174-1177 (2008).</li>
<li>Castelhano-Carlos, M. J., Sousa, N., Ohl, F., Baumans, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+methods+in+newborn+C57BL%2F6+mice%3A+a+developmental+and+behavioural+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Identification methods in newborn C57BL/6 mice: a developmental and behavioural evaluation.</a> Lab Anim. 44 (2), 88-103 (2010).</li>
<li>Curley, J. P., Davidson, S., Bateson, P., Champagne, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+enrichment+during+postnatal+development+induces+transgenerational+effects+on+emotional+and+reproductive+behavior+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+behavioral+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Social enrichment during postnatal development induces transgenerational effects on emotional and reproductive behavior in mice.</a> Frontiers in behavioral neuroscience. 3, 25(2009).</li>
<li>National Research Council (U.S.). Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. <a target="_blank" href="NULL">Institute for Laboratory Animal Research (U.S.)</a>. , National Academies Press. Washington, D.C. 220(2011).</li>
<li>Silver, L. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSilver%2C+LM+%22Mouse+genetics+%3A+concepts+and+applications%22">Mouse genetics : concepts and applications</a>. , Oxford University Press. New York. (1995).</li>
<li>Chen, M., Kan, L., Ledford, B. T., He, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tattooing+Various+Combinations+of+Ears%2C+Tail%2C+and+Toes+to+Identify+Mice+Reliably+and+Permanently%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science+%3A+JAALAS%22%5BJournal%5D)">Tattooing Various Combinations of Ears, Tail, and Toes to Identify Mice Reliably and Permanently.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 55 (2), 189-198 (2016).</li>
<li>Truett, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+PCR-quality+mouse+genomic+DNA+with+hot+sodium+hydroxide+and+tris+%28HotSHOT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT).</a> Biotechniques. 29 (1), 52-54 (2000).</li>
<li>Cole, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+Database+Project%3A+data+and+tools+for+high+throughput+rRNA+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Ribosomal Database Project: data and tools for high throughput rRNA analysis.</a> Nucleic Acids Res. 42, 633-642 (2014).</li>
<li>Bosshard, P. P., Zbinden, R., Altwegg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turicibacter+sanguinis+gen.+nov.%2C+sp.+nov.%2C+a+novel+anaerobic%2C+Gram-positive+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Syst+Evol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Turicibacter sanguinis gen. nov., sp. nov., a novel anaerobic, Gram-positive bacterium.</a> Int J Syst Evol Microbiol. 52, Pt 4 1263-1266 (2002).</li>
<li>Chen, W., Liu, F., Ling, Z., Tong, X., Xiang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+intestinal+lumen+and+mucosa-associated+microbiota+in+patients+with+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human intestinal lumen and mucosa-associated microbiota in patients with colorectal cancer.</a> PLoS One. 7 (6), 39743(2012).</li>
<li>16S Metagenomic Sequencing Library Preparation: Preparing 16S ribosomal RNA Gene Amplicons for the Illumina MiSeq System. Illumina. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://suport.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf">https://suport.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf</a> (2017).</li>
<li>Illumina Experiment Manager. Illumina. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.illumina.com/informatics/research/experimental-design/illumina-experiment-manager.html">https://www.illumina.com/informatics/research/experimental-design/illumina-experiment-manager.html</a> (2017).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QIIME+allows+analysis+of+high-throughput+community+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data.</a> Nat Methods. 7 (5), 335-336 (2010).</li>
<li>Aronesty, E. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/319159822_ea-utils_Command-line_tools_for_processing_biological_sequencing_data">ea-utils: Command-line tools for processing biological sequencing data.</a> Expression Analysis. , Durham, NC. (2011).</li>
<li>Knight, R., Caporaso, J. G. QIIME: Multiple Paired Ends Script. QIIME. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://qiime.org/scripts/multiple_join_paired_ends.html">http://qiime.org/scripts/multiple_join_paired_ends.html</a> (2017).</li>
<li>Knight, R., Caporaso, J. G. QIIME: De-Novo OTU Picking Protocol. QIIME. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html">http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html</a> (2017).</li>
<li>Edgar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Search+and+clustering+orders+of+magnitude+faster+than+BLAST%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST.</a> Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PyNAST%3A+a+flexible+tool+for+aligning+sequences+to+a+template+alignment%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment.</a> Bioinformatics. 26 (2), 266-267 (2010).</li>
<li>DeSantis, T. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Greengenes%2C+a+chimera-checked+16S+rRNA+gene+database+and+workbench+compatible+with+ARB%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB.</a> Appl Environ Microbiol. 72 (7), 5069-5072 (2006).</li>
<li>Knight, R., Caporaso, J. G. QIIME: Multiple Split Libraries Fastq Script. QIIME. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://qiime.org/scripts/multiple_split_libraries_fastq.html">http://qiime.org/scripts/multiple_split_libraries_fastq.html</a> (2017).</li>
<li>Knight, R., Caporaso, J. G. QIIME: De Novo Otus Script. QIIME. , http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html (2017).</li>
<li>Knight, R., Caporaso, J. G. QIIME: Links to Sample Identification. QIIME. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://qiime.org/documentation/file_formats.html">http://qiime.org/documentation/file_formats.html</a> (2017).</li>
<li>Knight, R., Caporaso, J. G. QIIME: Validation of Mapping File. QIIME. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://qiime.org/scripts/validate_mapping_file.html">http://qiime.org/scripts/validate_mapping_file.html</a> (2017).</li>
<li>Knight, R., Caporaso, J. G. QIIME: Link of OTUs to Sample Description Using Mapping File. QIIME. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://qiime.org/scripts/make_otu_network.html">http://qiime.org/scripts/make_otu_network.html</a> (2017).</li>
<li>Knight, R., Caporaso, J. G. QIIME: Summarize Taxa Through Plots. QIIME. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://qiime.org/scripts/summarize_taxa_through_plots.html">http://qiime.org/scripts/summarize_taxa_through_plots.html</a> (2017).</li>
<li>Knight, R., Caporaso, J. G. QIIME: Biome Summarize Table Command. QIIME. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://qiime.org/documentation/summarizing_biom_tables.html">http://qiime.org/documentation/summarizing_biom_tables.html</a> (2017).</li>
<li>Moon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertically+transmitted+faecal+IgA+levels+determine+extra-chromosomal+phenotypic+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vertically transmitted faecal IgA levels determine extra-chromosomal phenotypic variation.</a> Nature. 521 (7550), 90-93 (2015).</li>
<li>Chakravorty, S., Helb, D., Burday, M., Connell, N., Alland, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+detailed+analysis+of+16S+ribosomal+RNA+gene+segments+for+the+diagnosis+of+pathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">A detailed analysis of 16S ribosomal RNA gene segments for the diagnosis of pathogenic bacteria.</a> J Microbiol Methods. 69 (2), 330-339 (2007).</li>
<li>Chen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+dietary+fiber+intake+and+structural+alteration+of+gut+microbiota+in+patients+with+advanced+colorectal+adenoma%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Nutr%22%5BJournal%5D)">Decreased dietary fiber intake and structural alteration of gut microbiota in patients with advanced colorectal adenoma.</a> Am J Clin Nutr. 97 (5), 1044-1052 (2013).</li>
<li>Zhu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+intestinal+lumen+microbiota+in+an+animal+model+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of the intestinal lumen microbiota in an animal model of colorectal cancer.</a> PLoS One. 9 (6), 90849(2014).</li>
<li>Evans, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+prevents+weight+gain+and+alters+the+gut+microbiota+in+a+mouse+model+of+high+fat+diet-induced+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Exercise prevents weight gain and alters the gut microbiota in a mouse model of high fat diet-induced obesity.</a> PLoS One. 9 (3), 92193(2014).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konfliktu interesów.

Procedura ta pozwala na analizę mikrobioty wyizolowanej z kału po wzbogaceniu środowiskowym zwierząt normalnych lub z nowotworami. Ponieważ są to duże eksperymenty, które obejmują hodowlę w celu uzyskania wielu zwierząt o różnej płci i genotypie, normalizacja mikrobiomu między zwierzętami przed rozpoczęciem eksperymentu jest niezbędna, aby uniknąć wpływu niezwiązanego z EE na różnorodność biologiczną mikrobiomu.
Aby zapewnić spójność między warunkami NE i EE, proces hodowli przeprowadza się w ...

Badania wzbogacające środowisko (EE) wykorzystują złożone parametry mieszkaniowe do wpływania na stymulację społeczną (duże klatki mieszkaniowe, większe grupy zwierząt), stymulację poznawczą (chaty, tunele, materiały do gniazdowania, platformy) i aktywność fizyczną (koła do biegania). EE zostało wykorzystane przez wiele laboratoriów do zrozumienia wpływu zwiększonej aktywności i poprawy interakcji społecznych i poznawczych na inicjację i postęp choroby przy użyciu szerokiej gamy modeli mysich, w tym łysienia wywołanego przez fryzjerstwo, chorobę Alzheimera, zespół Retta oraz kilka modeli nowotworów i chorób układu pokarmowego1,2,3,4,5,6.
Kilka modeli myszy zostało opracowanych do badania nowotworzenia jelita grubego u myszy. Być może najlepiej zdefiniowanym modelem jest mysz ApcMin. Mysz ApcMin została opracowana w laboratorium Williama Dove'a w 1990 roku7 i była używana jako mysi model mutacji w genie APC, które są powszechnie związane z ludzkim rakiem jelita grubego. W przeciwieństwie do ludzi będących nosicielami mutacji APC, myszy ApcMin rozwijają przede wszystkim guzy jelita cienkiego, z bardzo rzadkim występowaniem guzów jelita grubego. Jednak allel Tcf4Het z pojedynczą heterozygotyczną mutacją knockin-knockout w Tcf4 znacznie zwiększa nowotworzenie jelita grubego w połączeniu z allelem ApcMin8. Ostatnio ten mysi model nowotworzenia jelita grubego został wykorzystany do określenia wpływu EE na nowotworzenie jelita grubego6. W Bice i wsp. zdefiniowano fizjologiczne i fenotypowe skutki EE na samce i samice czterech różnych linii myszy (typu dzikiego (WT), Tcf4Het/+ Apc+/+, Tcf4+/+ ApcMin/+ i Tcf4Het/+ApcMin/+)). Być może najciekawszym odkryciem było to, że EE znacznie wydłuża życie zarówno samców, jak i samic zwierząt z guzem jelita grubego. Wykazano w tym, że EE może zmniejszyć przynajmniej niektóre objawy związane z nowotworzeniem jelita grubego i poprawić zdrowie zwierząt. Co ciekawe, ta poprawa długości życia u mężczyzn nie jest bezpośrednim wynikiem zmniejszonej nowotworzenia, a zamiast tego była związana z inicjacją reakcji na gojenie się ran nowotworowych, w tym poprawą różnorodności biologicznej mikrobiomu6.
Opublikowano kilka badań specyficznych dla EE, które przyniosły interesujące wyniki. Jednak z technicznego punktu widzenia ważne wyniki często nie są możliwe do przełożenia na inne laboratoria. Utrzymanie identycznych metodologii EE między różnymi laboratoriami jest niezwykle złożonym zagadnieniem, nie tylko ze względu na używane urządzenia wzbogacające i pomieszczenia, ale także między innymi ściółkę, żywność, wentylację, hodowlę, genetykę, aktywność w pomieszczeniu i wymagania protokołu dla zwierząt9,10,11. Jednym z przykładów jest integracja zwierząt, w której zwierzęta muszą być stabilnie zintegrowane z kolonią myszy, normalizując w ten sposób tło genetyczne i skład diety, aby uniknąć skutków niezwiązanych z leczeniem. Co więcej, wiele badań EE zostało zakończonych przed uświadomieniem sobie znaczenia mikrobiomu w chorobie oraz sposobu, w jaki powszechne praktyki hodowlane myszy mogą wpływać na skład mikrobiomu jelitowego10,12.
Strategia hodowlana i umieszczanie zwierząt w EE może zwiększyć stres, jeśli nie jest wykonywana prawidłowo. Ponieważ w badaniach EE wykorzystuje się dużą liczbę zarówno samców, jak i samic oraz wiele genotypów, konfiguracja eksperymentalna może być trudna, biorąc pod uwagę wymóg łączenia zwierząt z kilku miotów. W związku z tym opracowano strategię hodowli i odsadzania, która pozwoliła na łączenie zwierząt odsadzonych od maciory o prawidłowym genotypie z różnych miotów. Głównym powodem takiego stanu rzeczy była normalizacja mikrobioty wśród miotów i zmniejszenie stresu związanego z przenoszeniem zwierząt do środowiska doświadczalnego. Mikrobiom został przeniesiony z klasy dam<sup="xref">10. Aby zapewnić kolonii różnorodność mikrobiologiczną, samice zakupiono w Jackson Labs i włączono do kolonii na miesiąc przed rozpoczęciem eksperymentu9,10,12. Aby jeszcze bardziej znormalizować bioróżnorodność mikrobiomu między zwierzętami, samice były trzymane razem przed rozmnażaniem. Po rozrodzie, wspólne trzymanie się w pomieszczeniach odchowu i możliwość ucieczki od karmiących szczeniąt poprawiło poziom stresu związanego z opieką nad matką13,14, co prawdopodobnie przyczyniło się do normalizacji mikrobiomu. Aby zapobiec skutkom niezwiązanym z EE na mikrobiom, to wspólne trzymanie wszystkich zwierząt doświadczalnych zapobiegało walkom i dodatkowemu stresowi, który występował podczas łączenia kilku samców z różnych miotów w jedną klatkę doświadczalną. Wreszcie, w klatkach umieszczono równą liczbę zwierząt o wszystkich genotypach. Dało to możliwość poprawy różnorodności biologicznej mikrobioty we wszystkich genotypach i wyeliminowało wpływ koprofagii (skłonności zwierzęcia do spożywania stolca) lub możliwych różnic behawioralnych specyficznych dla genotypu do całego badania.
Ten protokół zapewnia strategię, która rozszerza poprzednie badania EE o znane aspekty badań nad mikrobiomem, w tym transmisję mikrobioty i integrację kolonii zwierzęcych w celu normalizacji mikrobioty, aby umożliwić bardziej jednolite populacje mikrobiomu między zwierzętami doświadczalnymi. Przestrzeganie tych środków ostrożności jest niezbędne ze względu na zdolność różnic w mikrobiocie niezwiązanych z leczeniem do mylenia wyników badania. Wyeliminowanie zmian mikrobioty niezwiązanych z EE umożliwi naukowcom precyzyjne określenie roli EE w składzie mikrobioty podczas rozwoju i progresji choroby.

<table><tbody><tr><td>Teklad Diets/Harlan Labs Chow</td><td>Harlan Labs</td><td>3980X</td><td>Standardowa napromieniowana karma opracowana przez dr Mario Capecchi we współpracy z Harlan Labs.</td></tr><tr><td>Pościel Cell-Sorb Plus</td><td>Fangman Specialties</td><td>82010</td><td>Autoklaw przed użyciem.</td></tr><tr><td>System do tatuowania AIMS dla noworodków</td><td>AIMS</td><td>NEO-9</td><td>https://animalid.com/neonate-rodent-tattoo-identification/32. Inne systemy i tusze do tatuażu klasy zwierzęcej mogą być używane z podobnymi wynikami, w tym zestaw Aramis Micro Tattoo Kit.</td></tr><tr><td>System mikroizolatorów myszy Zyfone One Cage 2100 AllerZone W komplecie z klatką, filtrem AllerZone i modułowym systemem dostarczania diety</td><td>Produkty laboratoryjne</td><td>82120ZF</td><td>Każda klatka EE wymaga jednej z każdego katalogu # 82120ZF, 82100ZF i 82101ZF, a także dwóch 82109ZF. Jedzenie jest tylko z jednej strony.</td></tr><tr><td>Zyfone One Cage 2100 Life Span Enrichment Device</td><td>Produkty laboratoryjne</td><td>82109ZF</td><td>Każda klatka EE wymaga jednej z każdego katalogu # 82120ZF, 82100ZF i 82101ZF, a także dwóch 82109ZF. Jedzenie jest tylko z jednej strony.</td></tr><tr><td>Zyfone One Cage 2100 Klatka 13-7/8" Długość X 19-1/16" Szerokość X 7-3/4" Głębokość</td><td>Produkty laboratoryjne</td><td>82100ZF</td><td>Każda klatka EE wymaga jednej z każdego katalogu # 82120ZF, 82100ZF i 82101ZF, a także dwóch 82109ZF. Jedzenie jest tylko z jednej strony.</td></tr><tr><td>Zyfone One Cage 2100 AllerZone Micro-Isolator filter top</td><td>Produkty laboratoryjne</td><td>82101ZF</td><td>Każda klatka EE wymaga jednej z każdego katalogu # 82120ZF, 82100ZF i 82101ZF, a także dwóch 82109ZF. Jedzenie jest tylko z jednej strony.</td></tr><tr><td>Tunnel</td><td>Bio-Serv</td><td>K3323 lub K3332</td><td>Połącz ze sobą klatki i użyj do wzbogacenia</td></tr><tr><td>Przelotka do połączenia tunelu z klatkami</td><td>Wyprodukowana przez University of Utah Machine Shop</td><td>n/a</td><td>Upewnij się, że materiał jest odporny na żucie i można go sterylizować w autoklawie</td></tr><tr><td>Koło do szybkiej jazdy</td><td>Bio-Serv</td><td>K3250 lub K3251</td><td>Do użytku z igloo myszy i podłogą</td></tr><tr><td>Mouse Igloo</td><td>Bio-Serv</td><td>K3328, K3570 lub K3327</td><td>Do użytku z kółkiem i podłogą Fast-track</td></tr><tr><td>Mouse Igloo floor</td><td>Bio-Serv</td><td>K3244</td><td>Do użytku z myszą Igloo i Fast-Track</td></tr><tr><td>Mouse Hut</td><td>Bio-Serv</td><td>K3272, K3102 lub K3271</td><td></td></tr><tr><td>Crawl Ball</td><td>Bio-Serv</td><td>K3330 lub K3329</td><td></td></tr><tr><td>Bio-hut</td><td>Bio-Serv</td><td>K3352</td><td>Chata z pulpy drzewnej używana do schronienia i gniazdowania</td></tr><tr><td>Folia samoprzylepna&nbsp;</td><td>VWR</td><td>60941-072</td><td>Służy do tymczasowego zakrycia wywierconego otworu w dużej klatce, aby zapobiec ucieczce myszy z</td></tr><tr><td>wentylowanego stojaka z przepływem laminarnym</td><td>Techniplast</td><td>Bio-C36</td><td>Szafka, której użyliśmy w tym badaniu, nie jest obecnie dostarczana. Bio-C36 jest bardzo podobny.</td></tr><tr><td>1,5 ml probówka do mikrofuzy - bez RNAzy i DNAzy</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Stool MiniKit</td><td>Qiagen</td><td>51504</td><td>Ten zestaw zawiera odczynniki do 50 preparatów DNA. Bufor do lizy stolca=ASL; Bufor do lizy chlorku guanidyny = AL; Przemywać bufor 1 chlorkiem guanidyny = AW1; Bufor płuczący 2= AW2; Bufor elucyjny z EDTA=AE</td></tr><tr><td>Łaźnia wodna (zdolny do podgrzania do 95)</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td>Do inkubacji próbek kału pod kątem 94 stopni w celu lizy komórek.</td></tr><tr><td>Łaźnia wodna (z możliwością podgrzania do 70 stopni)</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td>Do inkubacji próbek kału w 70 stopniach&nbsp;</td></tr><tr><td>Etanol (200 dowodów)</td><td>Fluorometr Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>: Qubit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA Zestaw do oznaczania szerokiego zakresu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32850</td><td></td></tr><tr><td>EB Buffer lub 10 mM Tris pH 8,5</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>Startery specyficzne dla eksperymentu</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Klasa PCR woda</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2X KAPA HiFi HotStart Ready Mix&nbsp;</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK2601</td><td>Do amplifikacji amplikonu (1,25 ml pozwala na 100 rxns).</td></tr><tr><td>Agaroza do uruchamiania żeli diagnostycznych</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TapeStation High Sensitivity D1000 Screen Tape Trace</td><td>Agilent</td><td>5067-5583</td><td>TapeStation lub instrumenty Bioanalyzer są powszechne w rdzeniach genomiki instytucjonalnej do analizy jakości biblioteki. Alternatywnie można użyć bioanalizatora DNA1000 chip (Agilent, 5067-1504).</td></tr><tr><td>Koraliki magnetyczne Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>Kulki magentyczne Do czyszczenia PCR - 5 ml wyczyści 250 reakcji PCR</td></tr><tr><td>Stojak magnetyczny</td><td>Life Technologies</td><td>AM10027</td><td></td></tr><tr><td>Przewodnik po przygotowaniu biblioteki</td><td>Illumina</td><td></td><td>Illumina. Przygotowanie biblioteki sekwencjonowania metagenomicznego 16S: Przygotowanie amplikonów genu rybosomalnego RNA 16S dla systemu Illumina MiSeq. https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf.</td></tr><tr>Unikalne oprogramowanie <td>Illumina</td><td>Illumina Experiment Manager</td> z <td>podwójnym indeksowaniem</td><td>Bezpłatnie dostępne pod adresem: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/experiment_manager/downloads.html</td></tr><tr><td>Nextera XT 96 Index Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1002</td><td>Służy do dodawania kodów kreskowych do amplikonów</td></tr><tr><td>MicroAmp Optyczna 96-dołkowa płytka reakcyjna</td><td>Applied Biosystems/ThermoFisher</td><td>N8010560</td><td></td></tr><tr><td>Oprawa do płytek indeksowych TruSeq</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1005</td><td></td></tr><tr><td>Samoprzylepna bezbarwna uszczelka płytowa</td><td>Applied Biosystems /ThermoFisher</td><td>4360954</td><td>Applied Biosystems/ThermoFisher Microamp folia samoprzylepna</td></tr><tr><td>Sekwencjonowanie przez MiSeq z odczynnikami v3 i podwójnymi odczytami 300 bp</td><td>Illumina</td><td>MS-102-3003</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw kontrolny PhiX</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K (600 mAU/ml)</td><td>Qiagen</td><td>19131</td><td>Równoważne 20 mg/ml proteinazy K. Dostarczane z zestawem QiaAmp</td></tr><tr><td>Narzędzia do analizy danych Narzędzia do oprogramowania</td><td>Qiime</td><td>QIIME</td><td>Instalacja może się różnić w zależności od systemu, a na stronie internetowej QIIME opisano kilka opcji (http://qiime.org/install/install.html). W tym badaniu wykorzystano pakiet oprogramowania MacQIIME 1.9.1 (opracowany przez Werner Lab, SUNY, http://www.wernerlab.org/software/macqiime</td></tr><tr><td>Krok 13.2.</td><td>Metoda łączenia Qiime</td><td>FastQ</td><td>&nbsp;( http://code.google.com/p/ea-utils &nbsp;). &nbsp; W tym badaniu zastosowano wiele sparowanych końców http://qiime.org/scripts/multiple_join_paired_ends.html. Aronesty, E. ea-utils: Narzędzia wiersza poleceń do przetwarzania danych sekwencjonowania biologicznego. Analiza ekspresji, Durham, Karolina Północna. (2011).</td></tr><tr><td>Krok 13.3.</td><td>Protokół</td><td>kompletacji Qiime De-Novo OTU</td><td>http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html.</td></tr><tr><td>Krok 13.3.1.</td><td></td><td>Otwarte jednostki taksonomiczne (OTU) przy użyciu Uclust</td><td>Edgar, R.C. Search i grupowanie o rzędy wielkości szybsze niż BLAST. Bioinformatyka. 26 (19), 2460-2461, doi:10.1093/bioinformatics/btq461 (2010).</td></tr><tr><td>Krok 13.3.1.</td><td>Pynast</td><td>Pynast</td><td>Caporaso, J.G. et al. PyNAST: elastyczne narzędzie do wyrównywania sekwencji do wyrównania szablonu. Bioinformatyka. 26 (2), 266-267, doi:10.1093/bioinformatics/btp636 (2010).&nbsp;</td></tr><tr><td>Krok 13.3.1.</td><td>Pynast</td><td>Pynast_Greengenes</td><td>DeSantis, T.Z. et al. Greengenes, sprawdzona przez chimerę baza danych genów 16S rRNA i stół warsztatowy kompatybilny z ARB. Appl Environ Microbiol. 72 (7), 5069-5072, doi:10.1128/AEM.03006-05 (2006). W tym badaniu wykorzystano wersję Greengenes 13_8</td></tr><tr><td>13.3.1. Uwaga:&nbsp;</td><td>Qiime</td><td>Wiele podzielonych bibliotek</td><td>http://qiime.org/scripts/multiple_split_libraries_fastq.html.</td></tr><tr><td>13.3.1. Uwaga:&nbsp;</td><td>Qiime</td><td>Pick de novo OTUs script</td><td>http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html&nbsp;</td></tr><tr><td>Krok 13.2.2.</td><td>Qiime</td><td>Utwórz plik mapowania</td><td>http://qiime.org/documentation/file_formats.html.</td></tr><tr><td>Krok 13.2.2.</td><td>Qiime</td><td>Zweryfikuj plik mapowania</td><td>http://qiime.org/scripts/validate_mapping_file.html.</td></tr><tr><td>Krok 13.3.3.</td><td>Qiime</td><td>Połącz OTU z przykładowym opisem do pliku mapowania</td><td>http://qiime.org/scripts/make_otu_network.html.</td></tr><tr><td>Krok 13.3.4.</td><td>Qiime</td><td>Podsumuj taksony za pomocą wykresów</td><td>http://qiime.org/scripts/summarize_taxa_through_plots.html.</td></tr><tr><td>Krok 13.3.5.</td><td>Tabela podsumowania biomu</td> <td>Qiime</td><td>http://biom-format.org/documentation/summarizing_biom_tables.html&nbsp; W tym badaniu wszystkie próbki zostały rozdzielone do 20 000 OTU, a następnie poddano analizie przy użyciu skryptu alfa rozrzedzającego w QIIME.</td></tr></tbody></table>

metoda określania wpływu wzbogacania środowiska na bioróżnorodność biomu mikrobiomu jelita grubego w mysim modelu guza jelita grubego

A Method to Define the Effects of Environmental Enrichment on Colon Microbiome Biodiversity in a Mouse Colon Tumor Model

Kilka ostatnich badań zilustrowało korzystny wpływ życia w wzbogaconym środowisku na poprawę chorób ludzkich. U myszy wzbogacenie środowiska (EE) zmniejsza nowotworzenie poprzez aktywację układu odpornościowego myszy lub wpływa na przeżycie zwierząt niosących nowotwór poprzez stymulację odpowiedzi naprawy rany, w tym poprawę różnorodności mikrobiomu, w mikrośrodowisku guza. Poniżej przedstawiono szczegółową procedurę oceny wpływu wzbogacenia środowiska na różnorodność biologiczną mikrobiomu w modelu guza jelita grubego u myszy. Opisano środki ostrożności dotyczące hodowli zwierząt oraz rozważania dotyczące genotypu zwierząt i integracji kolonii myszy, z których wszystkie ostatecznie wpływają na różnorodność biologiczną drobnoustrojów. Przestrzeganie tych środków ostrożności może umożliwić bardziej jednolitą transmisję mikrobiomu, a w konsekwencji złagodzić skutki niezależne od leczenia, które mogą zakłócić wyniki badania. Ponadto w tej procedurze zmiany mikrobioty są charakteryzowane za pomocą sekwencjonowania 16S rDNA wyizolowanego z kału pobranego z dystalnej części jelita grubego po długotrwałym wzbogaceniu środowiska. Brak równowagi mikrobioty jelitowej jest związany m.in. z patogenezą nieswoistych zapaleń jelit i raka jelita grubego, ale także z otyłością i cukrzycą. Co ważne, ten protokół analizy EE i mikrobiomu może być wykorzystany do badania roli patogenezy mikrobiomu w różnych chorobach, w których istnieją solidne modele myszy, które mogą podsumować chorobę człowieka.

Kilkadziesiąt badań wykazało, że praktyka medycyny ciała i umysłu (mind-body medicine) poprawia wyniki zdrowotne. Podobnie u myszy wzbogacenie środowiskowe poprawia wyniki, w tym wydłuża długość życia i usprawnia gojenie ran nowotworowych6. W związku z tym opracowano procedurę EE (environmental enrichment) w celu zdefiniowania roli mikrobioty w tym fenotypie, poprzedzając rozpoczęcie eksperymentu normalizacją mikrobiomu (Rycina 1). Co ...

Wzbogacenie środowiska (EE) to środowisko przetrzymywania zwierząt, które służy do ujawniania mechanizmów leżących u podstaw powiązań między stylem życia, stresem i chorobami. Protokół ten opisuje procedurę, która wykorzystuje mysi model nowotworzenia jelita grubego i EE w celu szczegółowego zdefiniowania zmian w różnorodności biologicznej mikrobioty, które mogą mieć wpływ na śmiertelność zwierząt.

Metoda określania wpływu wzbogacania środowiska na bioróżnorodność biomu mikrobiomu jelita grubego w mysim modelu guza jelita grubego

Several recent studies have illustrated the beneficial effects of living in an enriched environment on improving human disease. In mice, environmental ...

Głównym celem niniejszej publikacji jest przedstawienie metody normalizacji mikrobiomu gryzoni. W tej demonstracji wpływ wzbogacenia środowiska na mikrobiom jest badany podczas genezy guza jelita grubego. Protokół ten pokazuje, w jaki sposób normalizacja mikrobiomu przed interwencją wzbogacającą środowisko poprawia odtwarzalność eksperymentalną.Pokazujemy również, jak zmniejszyć stres zwierząt i poprawić interakcje przy użyciu wzbogaconego środowiska. Chociaż skupiliśmy się na wpływie wzbogacenia środowiska w modelu guza jelita grubego, metodę tę można łatwo zastosować, aby lepiej zrozumieć rolę mikrobiomu w etiologii choroby. Ustaw klatki w sterylnych warunkach, pracując pod wentylowanym kapturem.Kontrola w tym eksperymencie składa się z konwencjonalnych klatek z ściółką i tkanką laboratoryjną do zagnieżdżania, ale poza tym brakuje im urządzeń wzbogacających. Aby ustawić klatki do hodowli szczeniąt lub klatki wzbogacone środowiskowo, połącz dwie duże klatki autoklawowane ze sterylizowanym tunelem zabezpieczonym przelotką i dołącz wysterylizowaną platformę w każdej klatce, aby zwiększyć powierzchnię podłogi. W przypadku EE zapewnij również wysterylizowane koła jezdne, tunele, igloo, chaty, piłki do czołgania się i materiał do gniazdowania.Umieść zarówno klatkę wzbogaconą, jak i kontrolną w tym samym stojaku, aby zapewnić równą wentylację. Do hodowli połącz jednego buhaja i dwie potencjalne matki w normalnych klatkach. Każdego ranka sprawdzaj, czy nie ma zatyczek dopochwowych, które wskazują, że zwierzę kryło się w nocy.Jeśli czop nie jest widoczny, opór przed sondowaniem dopochwowym może wykryć zinternalizowaną zatyczkę. Jeśli samica ma czop dopochwowy, przenieś ją do dużej klatki do wychowu szczeniąt. W wzbogaconych ekologicznie klatkach z platformami można umieścić do 12 ciężarnych matek, pod warunkiem, że wszystkie mają urodzić w tym samym tygodniu.Gdy młode osiągną wiek od 21 do 28 dni, rozprowadź samce i samice według genotypu w środowiskach kontrolnych lub wzbogaconych środowiskach. Upewnij się, że w każdej klatce znajduje się pewna proporcja każdego genotypu. Nieulepszone klatki mogą pomieścić do pięciu myszy, podczas gdy ulepszone klatki wymagają co najmniej 20 myszy do stymulacji społecznej i mogą obsługiwać do 41 myszy.Zacznij zbierać stolec na jeden lub dwa dni przed eutanazją myszy. Zbieraj zawsze o tej samej porze dnia. Aby zebrać stolec od żywych zwierząt, ostrożnie przełóż zwierzę na czystą klatkę.Następnie zbierz wypróżniony stolec za pomocą sterylnych kleszczy i przenieś do sterylnej probówki do mikrofuge. Jeśli zwierzę nie wypróżni się natychmiast, umieść je w czystej klatce i poczekaj, aż zwierzę się wypróżni, co może potrwać do godziny. Aby pobrać stolec od zwierzęcia poddanego eutanazji, należy go wyciąć, aby uzyskać dostęp do okrężnicy.Następnie przetnij okrężnicę tuż pod jelitem ślepym i ułóż okrężnicę na kawałku bibuły filtracyjnej. Następnie użyj kleszczy, aby podnieść górną część rurki jelita grubego i otwórz światło za pomocą nożyczek. Przeciąć wzdłużnie dystalnie do proksymalnego, aby rozchylić okrężnicę wzdłuż.Następnie zbierz stolec z dystalnej części jelita grubego do sterylnej probówki do mikrofuge za pomocą sterylnych kleszczy. Próbki kału należy przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Oprócz stolca zbierz inne próbki tkanek z okrężnicy i jelita cienkiego, mikrosomów, tkanki tłuszczowej i tak dalej.Wykorzystaj komercyjny zestaw do wyizolowania drobnoustrojowego DNA ze stolca zgodnie z protokołem wykrywania patogenów w stolcu. W tym celu należy przenieść próbki z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na suchy lód i zważyć je. Następnie należy przeprowadzić test PCR, który amplifikuje DNA drobnoustrojów zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Następnie oczyść produkty reakcji za pomocą kulek magnetycznych. W celu oczyszczenia należy najpierw krótko odwirować płytkę amplikonową PCR, aby zebrać produkty reakcji. Następnie należy wirować kulki magnetyczne, aby równomiernie je rozproszyć i przenieść 20 mikrolitrowych porcji do każdej reakcji.Dokładnie wymieszać kulki z roztworem, powoli pipetując całą objętość 10 razy. Następnie pozwól koralikom osiąść na pięć minut. Następnie umieść płytkę PCR na stojaku magnetycznym i odczekaj dwie minuty, aż supernatanty znikną po magnetycznym zebraniu kulek.Następnie usunąć i wyrzucić supernatanty. Następnie, trzymając talerz nadal na magnesie, napełnij każdą studzienkę koralików 200 mikrolitrami świeżego 80% etanolu i odczekaj 30 sekund. Następnie ostrożnie usuń supernatant.Powtórz ten krok prania raz i pozostaw koraliki do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut. Teraz wymyj produkty reakcji z kulek, wyjmując płytkę ze stojaka magnetycznego i dodając 52,5 mikrolitra Tris do każdej studzienki. Całkowicie wymieszać kulki z roztworem, odpipetowując powoli całą objętość 10 razy.Następnie zbierz kulki na stojaku magnetycznym jak poprzednio i przenieś 50 mikrolitrów supernatantu na czystą płytkę PCR. Przykryj płytkę przezroczystym klejem i przechowuj ją w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do tygodnia. Zebrany supernatant należy wykorzystać do przeprowadzenia indeksowej reakcji PCR w celu dołączenia kodów kreskowych do sekwencji adaptera.Następnie oczyść produkty i przygotuj zindeksowaną bibliotekę do sekwencjonowania. U myszy wiadomo, że wzbogacenie środowiska poprawia długość życia i gojenie się ran nowotworowych. Aby określić rolę mikrobioty w tym fenotypie, zwierzęta hodowlane zostały włączone do kolonii myszy na co najmniej jeden miesiąc w celu normalizacji mikrobioty.Następnie były hodowane, a ich potomstwo wychowywano w wzbogaconym środowisku lub normalnym środowisku. Potomstwo było również nosicielem nowotworów lub typu dzikiego. Po 16 tygodniach zwierzęta poddano eutanazji i pobrano próbki kału w celu wyizolowania DNA drobnoustrojów.Następnie zastosowano PCR do amplifikacji podjednostki rybosomalnej 16S w próbkach w celu zbadania składników mikrobiomu. Produkty reakcji zostały następnie zidentyfikowane za pomocą indeksowania kodów kreskowych. Co ciekawe, ulepszone środowisko nie poprawia różnorodności biologicznej u zwierząt typu dzikiego, ale znacznie zwiększa bioróżnorodność u zwierząt z nowotworami.Świadczy to o czułości tej metody. Ten wzrost różnorodności biologicznej przypisano zwiększonej obecności gromady Proteobacteria ze znacznym wzrostem klas alphaproteobacteria i betaproteobacteria oraz spadkiem patogennych gammaproteobacteria. Największy wzrost klasy betaproteobakterii nastąpił w rodzaju Sutterella, prawdopodobnie komensalu biorącego udział w degradacji wydzielanej immunoglobuliny A.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zmienić praktyki hodowlane, aby znormalizować mikrobiom między zwierzętami doświadczalnymi, zanim zaczniesz interwencje, które Cię interesują. Wykonując tę procedurę, pamiętaj, że zwierzęta ustaliły swoje terytorium w środowisku. Z tego powodu zmiany w środowisku mogą powodować stres, który wpłynie na mikrobiom zwierzęcia.Nagła zmiana w zachowaniu zwierzęcia jest fizyczną oznaką stresu. Po tej procedurze można wyizolować określone drobnoustroje i dalej je scharakteryzować, aby przetestować wystarczalność zidentyfikowanego drobnoustroju na postęp choroby.

a-method-to-define-effects-environmental-enrichment-on-colon

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Przedstawiamy protokół, w którym podanie genotoksycznego czynnika azoksymetanu (AOM), a następnie trzy cykle podania prozapalnego dekstranu siarczanu sodu (DSS), pozwala na szybkie i powtarzalne wywołanie guzów okrężnicy u myszy, wykazujących podobieństwa morfologiczne i molekularne do nowotworów związanych z zapaleniem jelita grubego u ludzi.

Modelowanie raka związanego z zapaleniem jelita grubego z wykorzystaniem azoksymetanu (AOM) i dekstranu siarczanowego sodu (DSS)

Ten film opisuje protokół izolacji DNA z próbek kału myszy z guzem jelita grubego. Wyekstrahowane DNA jest amplifikowane za pomocą PCR, a produkt jest dalej czyszczony przy użyciu podejścia opartego na kulkach magnetycznych. Metodę tę można wykorzystać do określenia wpływu wzbogacenia środowiska na mikrobiotę jelita grubego i śmiertelność zwierząt.

Izolacja DNA drobnoustrojów kału: badanie wpływu wzbogacenia środowiska na różnorodność mikrobiomu w mysim modelu guza

W tym filmie opisujemy procedurę chirurgiczną polegającą na generowaniu pętli proksymalnej okrężnicy myszy lub segmentu pcLoop, po której następuje doświetlna iniekcja markerów fluorescencyjnych do segmentu w celu zbadania przepuszczalności nabłonka jelitowego.

Generowanie mysiego modelu pętli proksymalnej jelita grubego: procedura chirurgiczna mająca na celu wygenerowanie pętli proksymalnej jelita grubego i pomiar przepuszczalności jelit poprzez wykrycie markerów fluorescencyjnych w surowicy po wstrzyknięciu doświetlnym

Ten film pokazuje procedurę przeszczepu mikrobioty kałowej u myszy z niedoborem interleukiny-10 z zapaleniem jelita grubego. Skolonizowane drobnoustroje kałowe w jelitach uwalniają metabolity wtórne, wywołując uwalnianie cytokin przeciwzapalnych i zmniejszając stan zapalny jelita grubego.

Ocena skutków przeszczepu mikrobioty kałowej u myszy z niedoborem interleukiny-10

W ciągu ostatnich kilku lat, endoskopy nowej generacji stały się ważnymi diagnostycznymi pomocami badawczymi do oceny mysiego zapalenia jelita grubego i guzów jelita grubego. Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół endoskopowej oceny stanu zapalnego i guzów jelita grubego u myszy, a także nowatorski system punktacji, który wykorzystuje identyfikatory dziesiętne do dokumentowania endoskopowego nasilenia zapalenia jelita grubego i guzów jelita grubego.

Elastyczna kolonoskopia u myszy w celu oceny ciężkości zapalenia jelita grubego i guzów jelita grubego przy użyciu zwalidowanego systemu punktacji endoskopowej

Opisujemy metody długotrwałego monitorowania skuteczności terapii w leczeniu patologii jelita grubego u myszy za pomocą sztywnego endoskopu. Protokół ten może być z łatwością wykorzystany do scharakteryzowania odpowiedzi terapeutycznej pojedynczego guza u żywych myszy, a także do monitorowania potencjalnego nawrotu choroby.

Nieinwazyjna ocena skuteczności nowych terapii patologii jelitowych za pomocą seryjnego obrazowania endoskopowego żywych myszy

Wzbogacenie środowiska u myszy wymaga złożonej i wymagającej konfiguracji, a także kompleksowych technik hodowli i obsługi, aby zapewnić silne efekty metaboliczne i przeciwnowotworowe u myszy. Protokół ten zawiera szczegółowe procedury mające na celu odtworzenie wyżej wymienionych efektów u myszy.

Protokół trzymania myszy w wzbogaconym środowisku

W tym miejscu przedstawiamy protokół mający na celu ustanowienie indukowanego antybiotykiem, pseudo-wolnego od zarazków modelu zapalenia jelita grubego wywołanego siarczanem dekstranu sodu w celu zbadania roli mikrobioty jelitowej w regulacji pozytywnego wpływu Bacillus cereus na zapalenie jelita grubego.

Badanie łagodzącego wpływu podawania Bacillus cereus na zapalenie jelita grubego poprzez modulację mikrobioty jelitowej

Opisujemy protokół szczegółowo opisujący izolację mysich krypt okrężnicy w celu opracowania 3-wymiarowych kolonoidów. Ustalone okokrody mogą być następnie ostatecznie różnicowane, aby odzwierciedlić skład komórkowy nabłonka gospodarza przed otrzymaniem prowokacji zapalnej lub skierowaniem do utworzenia monowarstwy nabłonka.

Badanie nabłonkowego wpływu zapalenia jelit in vitro na ustalone mysie kolonoidy

Protokół ten opisuje niezbędne kroki kolonizacji myszy z pks+ Escherichia coli w warunkach niezapalnych, a także nieinwazyjne metody walidacji kolonizacji i oceny ekspansji pks+ E. coli w kału.

Kolonizacja przez myszą pks+ Escherichia coli w warunkach niezapalnych

Poznaj metodę oceny wpływu wzbogacenia środowiska na bioróżnorodność mikrobiomu jelita grubego w modelu mysiego guza. Protokół obejmuje normalizację mikrobiomu przed interwencją i analizę 16S rDNA.

Metoda określania wpływu wzbogacania środowiska na bioróżnorodność biomu mikrobiomu jelita grubego w mysim modelu guza jelita grubego (Wideo) | JoVE Journal

Metoda określania wpływu wzbogacania środowiska na bioróżnorodność biomu mikrobiomu jelita grubego w mysim modelu guza jelita grubego

Przeglądaj więcej filmów