Dwufotonowe obrazowanie przyżyciowe leukocytów podczas odpowiedzi immunologicznej w wątrobie myszy leczonej lipopolisacharydem
6 lutego 2018
Ustaliliśmy nowatorski protokół chirurgiczny do obrazowania dwufotonowego żywej wątroby myszy z minimalną inwazją. Dzięki tej technice zidentyfikowaliśmy szczegółową strukturę wątroby podczas endotoksemii wywołanej lipopolisacharydem. Przewidujemy, że metoda ta może być wykorzystana do określenia skuteczności różnych odczynników do migracji leukocytów wątrobowych.
Ogólnym celem tej procedury jest obserwacja morfologii i funkcjonalności leukocytów wewnątrz wątroby podczas wstrząsu septycznego. Główną zaletą tej techniki jest to, że można uzyskać bezpośrednie filmy leukocytów wewnątrz wątroby. Przed zabiegiem należy użyć 70% etanolu do dezynfekcji stołu operacyjnego i wszystkich narzędzi.
Następnie ustaw narzędzia do operacji wątroby i ustaw płytę grzewczą na 37 stopni Celsjusza. Po znieczuleniu myszy, którym wstrzyknięto LPS lub PBS zgodnie z protokołem tekstowym, nałóż niewielką ilość maści do oczu, aby zapobiec wysuszeniu siatkówki. Użyj maszynki do golenia i kremu do depilacji, aby usunąć włosy wokół brzucha.
Następnie użyj mokrej gazy, aby oczyścić brzuch. Wykonując wstrzyknięcie zadoczodołowe za pomocą strzykawki insulinowej, wstrzyknij 200 mikrolitrów roztworu czerwonego dekstranu Texas. Użyj markera, aby zaznaczyć prawy obszar podżebrowy od wyrostka ksyloidalnego do końca żebra.
Następnie nałóż jod powidonu na brzuch myszy, aby zapobiec wtórnej infekcji. Użyj kleszczy i nożyczek, aby przeciąć naskórek. Następnie za pomocą mikronożyczek i kleszczy otwórz jamę brzuszną i ostrożnie odsłonij wątrobę.
Użyj bawełnianych wacików, aby rozwinąć lewy płat boczny. Następnie wlej 500 mikrolitrów sterylnego PBS do jamy brzusznej, aby zapobiec wysuszeniu wątroby. Umieść mysz w odpowiedniej pozycji odleżynowej w specjalnie zaprojektowanej komorze i nałóż niewielką ilość kleju tkankowego na łóżko silikonowe.
Następnie użyj bawełnianych wacików, aby ostrożnie przymocować wątrobę. Tkanka wątroby jest niezwykle krucha. Nigdy nie używaj ostrych lub ciężkich narzędzi podczas odsłaniania i trzymania wątroby.
Kilka sekund później ponownie zwilż wątrobę 500 mikrolitrami sterylnego PBS, aby zapobiec jej wysuszeniu. Następnie umieść metalową ramę na wątrobie i użyj nakrętek, aby mocno ją przymocować. Zawsze umieszczaj nakrętki nośne przed umieszczeniem metalowej ramy.
Pomoże to zmniejszyć nacisk metalowej ramy. Aby przeprowadzić obrazowanie przyżyciowe wątroby, uruchom oprogramowanie Zen, aby włączyć laser. Ustaw długość fali na 880 nanometrów i ustaw kanały zielony i czerwony.
Następnie dostosuj moc lasera do intensywności fluorescencji. Umieść komorę na stoliku do obrazowania i umieść soczewkę obiektywu zanurzonego w wodzie o mocy 20 blisko szkła osłonowego. Zamocuj grzałkę z gumy silikonowej pod korpusem myszy, aby utrzymać temperaturę ciała.
Następnie narysuj 500 mikrolitrów wody destylowanej na metalowej ramie. A następnie umieść soczewkę obiektywu blisko wątroby. Dostosuj ostrość i określ głębokość i czas obszaru obrazowania.
W przypadku długotrwałego obrazowania należy wstrzyknąć połowę dawki wcześniej przygotowanej mieszaniny znieczulającego Zoletil i Rompun na każdą godzinę podczas obrazowania ze względów etycznych. Utrzymuj temperaturę ciała na poziomie 37 stopni Celsjusza i zawsze miej oko na mysz, ponieważ czasy znieczulenia są różne dla każdej myszy. Aby przeanalizować dane, otwórz Prędkość i zaimportuj nieprzetworzone dane z biblioteki.
Następnie usuń szum z obrazu i zrób migawkę. Na koniec dopasuj edytowane elementy do 100% i wyeksportuj pliki jako pliki JPEG lub TIF dla obrazów migawki i pliki AVI dla filmów. Analiza obrazowania przyżyciowego myszy kontrolnych wykazała, że niewielka liczba neutrofili krążyła w naczyniu krwionośnym.
Natomiast liczba neutrofili była znacznie zwiększona u myszy leczonych LPS. W stanie LPS wiele neutrofili krążyło w krwiobiegu, ale nie migrowały na zewnątrz naczynia. Jak widać na tych filmach, w porównaniu z myszami kontrolnymi, neutrofile u myszy leczonych LPS były mocniej przylegające do powierzchni światła naczynia, co powodowało, że neutrofile były częściej wykrywane w naczyniu.
Oprócz ruchliwości neutrofili, makrofagi otoczki wątroby lub LCM u myszy CX3CR1-GFP obserwowano na powierzchni tkanki wątroby, a nie głęboko w tkance. Ponadto LCM wykazywały niewielki ruch lub aktywację w wątrobie nawet u myszy leczonych LPS. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w 30 minut, jeśli jest wykonywana prawidłowo.
Podejmując się tego zabiegu, należy pamiętać o ustawieniu linii nacięcia od wyrostka mieczykowatego do końca prawego podżebrowego brzucha. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak wstrzyknięcie leczenia, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak sposób wątroba regeneruje się po uszkodzeniu i infekcji. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie medycyny do zbadania reakcji leukocytów podczas sepsy i przetestowania potencjalnych leków.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak odsłonić wątrobę przy minimalnym nacięciu brzucha. Nie zapominaj, że praca z lipopolisacharydem może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak sterylizacja i mycie rąk.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia nowy protokół chirurgiczny do obrazowania dwufotonowego żywej wątroby myszy przy minimalnej inwazyjności. Technika ta umożliwia obserwację zachowania leukocytów podczas endotoksemii indukowanej lipopolisacharydem.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Immunologia
- Techniki obrazowania na żywo
Wstęp
- Zrozumienie reakcji wątroby podczas wstrząsu septycznego jest kluczowe.
- Migracja leukocytów odgrywa istotną rolę w zapaleniu wątroby.
- Tradycyjne metody obrazowania mogą nie zapewniać wglądu w czasie rzeczywistym.
- Obrazowanie dwufotonowe oferuje wysoką rozdzielczość wizualizacji żywych tkanek.
Cel badania
- Obserwacja morfologii i funkcjonalności leukocytów w wątrobie.
- Ocena wpływu endotoksemii na zachowanie leukocytów w wątrobie.
- Opracowanie małoinwazyjnej techniki obrazowania żywych tkanek.
Zastosowane metody
- Przygotowanie i dezynfekcja instrumentów chirurgicznych.
- Podanie myszom środków znieczulających przed obrazowaniem.
- Aplikacja maści do oczu w celu ochrony siatkówki.
- Usunięcie sierści wokół brzucha w celu uzyskania dostępu chirurgicznego.
Główne wyniki
- Skuteczne obrazowanie dynamiki leukocytów w wątrobie.
- Identyfikacja zmian strukturalnych podczas endotoksemii.
- Rejestracja wideo zachowania leukocytów w czasie rzeczywistym.
- Potencjalne zastosowania w ocenie interwencji terapeutycznych.
Wnioski
- Nowoczesna technika obrazowania pogłębia naszą wiedzę na temat immunologii wątroby.
- Stanowi ona platformę dla przyszłych badań nad migracją leukocytów w wątrobie.
- Metoda ta może ułatwić ocenę skuteczności leczenia stanów zapalnych wątroby.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Obrazowanie intravitalne w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem dwufotonowego mikroskopu do badania dynamiki leukocytów w wątrobie myszy traktowanej LPS umożliwia bezpośrednią wizualizację zachowania komórek odpornościowych podczas ostrych reakcji zapalnych. Możliwość ta wspomaga analizę mechanistyczną i zwiększa pewność prognostyczną we wczesnych etapach badań nad immunologią i stanami zapalnymi. Podejście to jest strategicznie ukierunkowane na weryfikację celów terapeutycznych oraz testowanie hipotez terapeutycznych w modelach sepsy i niewydolności narządowej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią wizualizację rekrutacji i adhezji leukocytów w odpowiedzi na endotoksemię.
- Klaruje lokalizację i ruchliwość komórek odpornościowych w obrębie istotnych dla przebiegu choroby mikrośrodowisk wątrobowych.
- Umożliwia funkcjonalną walidację celów immunologicznych zaangażowanych w uszkodzenia narządów wywołane sepsą.
- Zwiększa pewność prognostyczną przy ustalaniu priorytetów dla interwencji immunomodulujących.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Ustanawia zwalidowane systemy obrazowania in vivo do ilościowej oceny dynamiki komórek odpornościowych.
- Umożliwia powtarzalny pomiar odpowiedzi neutrofili i makrofagów na związki kandydackie.
- Zapewnia zestandaryzowane wyniki obrazowania do porównań między różnymi badaniami i zespołami.
- Umożliwia przesiewowe badanie odczynników modulujących ruchliwość i morfologię leukocytów in situ.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami sepsy oraz ostrego zapalenia wątroby o znaczeniu klinicznym.
- Wspiera ciągłość translacyjną poprzez powiązanie zachowania komórkowego z efektami na poziomie narządowym.
- Umożliwia dostosowanie ryzyka w rozwoju terapii immunomodulacyjnych ukierunkowanych na uszkodzenia tkanek wywołane przez leukocyty.
- Zapewnia wgląd w mechanizmy niezbędny do przedklinicznej oceny skuteczności terapeutycznej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół obrazowania wpisuje się w kontinuum od etapu odkryć do badań przedklinicznych, umożliwiając weryfikację hipotez dotyczących zachowania komórek odpornościowych w żywej tkance. Stanowi on pomost między wczesnymi badaniami mechanistycznymi a późniejszymi testami skuteczności w modelach chorobowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotezy zerowej w zakresie rekrutacji i aktywacji komórek odpornościowych w odpowiedzi na wyzwanie endotoksyną.
- Przesiew: Dostarcza ilościowe, powtarzalne wyniki obrazowania do oceny wpływu związków na dynamikę leukocytów.
- Analityka: Zapewnia wysokotreściowe dane wideo i obrazowe do statystycznego porównania odpowiedzi immunologicznych w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Zachowuje istotność chorobową poprzez modelowanie ostrych odpowiedzi zapalnych in vivo.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje wielokrotnego użytku platformę dla zróżnicowanych badań celowanych w układ odpornościowy oraz ewaluacji leków.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad odpowiedzią immunologiczną.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przepływy pracy w obrazowaniu in vivo w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go w przypadku kandydatów immunomodulujących poprzez dostarczenie bezpośrednich odczytów funkcjonalnych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów i związków z uwzględnieniem ryzyka na podstawie zachowania komórek odpornościowych w czasie rzeczywistym.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie chirurgii małoinwazyjnej oraz mikroskopii dwufotonowej.
- Wymaga dostępu do zaawansowanej aparatury obrazowej i oprogramowania analitycznego.
- Konieczna jest rygorystyczna standaryzacja protokołów chirurgicznych i obrazowania pomiędzy zespołami.
- Może być wymagana adaptacja dla różnych szczepów myszy lub markerów komórek odpornościowych.
- Ograniczenia praktyczne obejmują kwestie dobrostanu zwierząt oraz złożoność techniczną obrazowania na żywo.
