Name: Dwufotonowe obrazowanie przyżyciowe leukocytów podczas odpowiedzi immunologicznej w wątrobie myszy leczonej lipopolisacharydem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Poznaj dwufotonowe obrazowanie przyżyciowe leukocytów w wątrobie myszy podczas endotoksemii wywołanej lipopolisacharydem. Ta metoda pozwala obserwować dynamikę komórek odpornościowych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez grant z Narodowej Fundacji Badawczej Korei (NRF) ufundowany przez rząd Korei (MSIP; grant nr 2016R1A2B4008199 dla Y-M. H.), oraz Ministerstwa Zdrowia i Opieki Społecznej, Republika Korei (numer grantu: HI14C1324).

Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Yonsei University College of Medicine, Korea. Myszy z zielonym białkiem fluorescencyjnym LysM (GFP; gfp/+) 8 i CX3Cr1-GFP (gfp/+)9 myszy w wieku 8-12 tygodni wykorzystano do obrazowania przyżyciowego. Wszystkie narzędzia chirurgiczne zostały autoklawowane i zdezynfekowane 70% alkoholem.
1. Specjalnie zaprojektowana komora obrazowania wątroby myszy z narzędziami pomocniczymi
<ol>
	<li>Konstrukcja komory do obrazowania wątroby myszy
	<ol>
		<li>Wykonaj komorę o następującym rozmiarze do obrazowania wątroby myszy (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1): komora wewnętrzna (120 mm długości × 160 mm szerokości × 30 mm wysokości), komora zewnętrzna (100 mm długości × 100 mm szerokości × 24 mm wysokości), (Ф 3 mm × 30 mm wysokości), nakrętki (Ф 4 mm) i nakrętki w kształcie skrzydełek (Ф 4 mm).</li>
		<li>Odmierz utwardzacz i bazę elastomerową w stosunku 1:9, aby uzyskać łącznie 120 g silikonu.</li>
		<li>Umieść płynną mieszaninę silikonu w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml i dobrze wymieszaj. Następnie umieścić kolbę w eksykatorze i usuwać pęcherzyki powietrza przez około 1 godzinę pod próżnią przez pompę.</li>
		<li>Wlej płynną mieszankę silikonu do specjalnie zaprojektowanej komory myszy o wysokości do 10 mm i pozwól jej utwardzić się przez kilka dni (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie preparatów nakrywkowych i łoża mocującego wątrobę
	<ol>
		<li>Na metalowej ramie przymocuj szkło nakrywkowe za pomocą kleju silikonowego. Pozostaw do wyschnięcia na 1 dzień (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
		<li>Aby skutecznie utrzymać wodę destylowaną do soczewki zanurzeniowej w wodzie, niezbędna jest półtrwała struktura blokująca wodę. Zrób okrągły klej silikonowy o grubości 1 mm i utwardź go przez noc.</li>
		<li>Wymieszać utwardzacz i bazę elastomerową, a następnie wlać do płytki 6-dołkowej na wysokości około 8-10 mm. Przeprowadzić proces utwardzania zgodnie z opisem w 1.1.2-1.1.4.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie LPS
<ol>
	<li>Przygotować sterylną sól fizjologiczną buforowaną fosforanem 1× (PBS) w celu rozcieńczenia proszku LPS z serotypu enteritidis Salmonella enterica. (1× PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4).</li>
	<li>Podgrzej PBS w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C i ostrożnie otwórz butelkę z proszkiem LPS (25 mg).</li>
	<li>Za pomocą pomocy do pipetowania wlać sterylny PBS (5 ml) do butelki z proszkiem LPS i delikatnie wymieszać lub zawiesić roztwór, aby przygotować roztwór podstawowy. 
	UWAGA: Po upłynnieniu proszku LPS ostre wirowanie może powodować powstawanie pęcherzyków. Unikaj robienia bąbelków, aby zminimalizować straty podczas robienia porcji w probówkach o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Przechowywać podstawowy roztwór LPS w temperaturze -20 °C i rozcieńczyć go do 1 mg/ml roztworu LPS do wstrzykiwań.</li>
	<li>Wstrzyknąć 1 mg/ml roztwór LPS (20 mg/kg) do otrzewnej nieznieczulonej myszy za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml. W przypadku zwierzęcia kontrolnego wstrzyknąć taką samą objętość PBS.</li>
	<li>Odczekaj 2 godziny, aby uzyskać wystarczającą odpowiedź zapalną.</li>
</ol>
3. Przygotowanie teksańsko-czerwonego dekstranu do barwienia naczyń krwionośnych
<ol>
	<li>Przygotuj dwie stożkowe probówki o pojemności 15 ml i 10 ml sterylnego PBS.</li>
	<li>Rozcieńczyć deszek Texas-Red Dextran w proszku (25 mg) w 3 ml PBS i dobrze wymieszać. Przenieść mieszaninę do pustej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Przenieść pozostały PBS (7 ml) do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej mieszaninę dekstranu (3 ml).</li>
	<li>Podłącz filtr strzykawkowy 0,45 μm do końcówki strzykawki o pojemności 10 ml. Filtr strzykawkowy powinien zastąpić igłę.</li>
	<li>Przefiltrować mieszaninę dekstranu (10 ml). Równomiernie docisnąć strzykawkę, aby uniknąć rozlania.</li>
	<li>Dozować 500 μl roztworu dekstranu o stężeniu 2,5 mg/ml w probówce o pojemności 1,5 ml z zablokowanym światłem i przechowywać w temperaturze -20 °C. Po rozmrożeniu przechowywać w temperaturze 4°C.</li>
</ol>
4. Proces chirurgiczny
<ol>
	<li>Przed zabiegiem należy zdezynfekować stół operacyjny i wszystkie narzędzia przy użyciu 70% alkoholu. Następnie ustaw narzędzia do operacji wątroby i ustaw płytę grzewczą na 37 °C (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A, B).</li>
	<li>W celu znieczulenia należy wstrzyknąć myszom 30 mg/kg tiletaminy/zolazepamu i 10 mg/kg ksylazyny. Roztwory te można mieszać i rozcieńczać w PBS w celu jednoczesnego wstrzykiwania. Potwierdź znieczulenie, delikatnie naciskając palec u nogi myszy. Kontynuuj następny krok, gdy nie ma odruchu.</li>
	<li>Nałóż niewielką ilość maści do oczu, aby zapobiec wysuszeniu siatkówki myszy.</li>
	<li>Usuń owłosienie na ciele w okolicy brzucha za pomocą kremu do depilacji (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C).</li>
	<li>Wstrzyknąć 200 μl roztworu dekstranu Texas-Red (stężenie 2,5 mg/ml) przez żyłę ogonową lub wstrzyknięcie zaoczodołowe za pomocą strzykawki insulinowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D).</li>
	<li>Zaznacz markerem prawy obszar podżebrowy. Linię należy narysować od wyrostka mieczykowatego do końca żebra. Przetnij naskórek kleszczami i nożyczkami (<silna klasa="xfig">Rysunek 2E, F).</li>
	<li>Otwórz jamę brzuszną za pomocą mikronożyczek i kleszczy i ostrożnie odsłaniaj wątrobę. Lewy płat boczny należy rozwinąć za pomocą wacików bawełnianych (<silna klasa="xfig">Rysunek 2G, H).</li>
	<li>Wlać 500 μl sterylnego PBS do jamy brzusznej, aby zapobiec wysuszeniu wątroby.</li>
	<li>Umieść mysz w pozycji prawoodleżynowej w specjalnie zaprojektowanej komorze i nałóż niewielką ilość kleju tkankowego na łóżko silikonowe. Następnie ostrożnie przymocuj wątrobę za pomocą bawełnianych wacików (<silna klasa="xfig">Rysunek 2I). 
	UWAGA: Ponieważ tkanka wątroby jest wyjątkowo krucha, nie należy jej mechanicznie wyciągać. Delikatnie rozwałkuj go za pomocą bawełnianych wacików.</li>
	<li>Kilka sekund później ponownie zwilż wątrobę 500 μl sterylnego PBS, aby uniknąć wysuszenia wątroby. Umieść metalową ramkę na wątrobie i mocno przymocuj ją nakrętkami (<silna klasa="xfig">Rysunek 2J).</li>
</ol>
5. Obrazowanie wątroby w trybie przyżyciowym za pomocą mikroskopii dwufotonowej
<ol>
	<li>Uruchom oprogramowanie ZEN (Carl Zeiss), aby włączyć laser, ustaw długość fali na 880 nm i ustaw kanały zielony i czerwony. Dostosuj moc lasera w zależności od intensywności fluorescencji (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3A). Informacje o filtrze emisji są następujące: Zielony/Alexa488, 500-550 nm i Czerwony/Alexa 555, 575-610 nm.</li>
	<li>Umieść komorę na stoliku do obrazowania i umieść soczewkę obiektywu zanurzonego w wodzie 20X blisko szkła osłonowego.</li>
	<li>Zamocuj grzałkę z gumy silikonowej pod korpusem myszy, aby utrzymać temperaturę jej ciała (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B).</li>
	<li>Upuść 500 μl wody destylowanej na metalową ramkę, a następnie przyciągnij soczewkę obiektywu do wątroby (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3C).</li>
	<li>Dostosuj ostrość i określ głębokość i czas obszaru obrazowania.</li>
	<li>Przeprowadzanie obrazowania.</li>
	<li>W przypadku długotrwałego obrazowania należy wstrzykiwać pół dawki mieszaniny tiletaminy/zolazepamu i ksylazyny co godzinę podczas obrazowania. Na tym etapie niezbędne jest utrzymanie temperatury ciała myszy na poziomie 37 °C. Zawsze miej oko na mysz, ponieważ czas znieczulenia różni się u każdej myszy. 
	UWAGA: Ta metoda nie nadaje się do rekonwalescencji po operacji i obrazowaniu. Etycznie poświęcamy mysz zaraz po operacji.</li>
	<li>Sprawdzaj odruchy pedałowania co 30 minut, aby zapewnić stabilne znieczulenie.</li>
</ol>
6. Analiza danych
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie do analizy danych Volocity, a następnie zaimportuj surowe dane z biblioteki do oprogramowania.</li>
	<li>Usuń szum z obrazu, aby dopasować go do sytuacji i zrób migawkę. 
	UWAGA: Aby uzyskać gładkie obrazy, użyj filtra "Fine" (Dokładny) lub "Mediana". Ponadto użyj funkcji "Poprawa kontrastu", aby ciemne lub rozmyte obrazy były wyraźniejsze.</li>
	<li>Dopasuj edytowane elementy do 100% i wyeksportuj jako pliki JPEG lub TIFF w przypadku obrazów migawki i pliki AVI w przypadku filmów.</li>
</ol>

<ol><li>Girard, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fuels%2C+hormones%2C+and+liver+metabolism+at+term+and+during+the+early+postnatal+period+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Fuels, hormones, and liver metabolism at term and during the early postnatal period in the rat.</a> J Clin Invest. 52 (12), 3190-3200 (1973).</li>
<li>Marques, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+liver+biology+in+vivo+using+conventional+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy.</a> Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).</li>
<li>Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+Microscopy+Imaging+of+the+Liver+following+Leishmania+Infection%3A+An+Assessment+of+Hepatic+Hemodynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics.</a> J Vis Exp. (101), e52303(2015).</li>
<li>Honda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+neutrophil+recruitment+in+hepatic+ischemia-reperfusion+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of neutrophil recruitment in hepatic ischemia-reperfusion injury in mice.</a> Transplantation. 95 (4), 551-558 (2013).</li>
<li>Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+spinning-disk+confocal+microscopy+for+the+intravital+analysis+of+platelet+dynamics+in+response+to+systemic+and+local+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation.</a> PLoS One. 6 (9), e25109(2011).</li>
<li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+through+an+abdominal+imaging+window+reveals+a+pre-micrometastasis+stage+during+liver+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis.</a> Sci Transl Med. 4 (158), 158ra145(2012).</li>
<li>Sierro, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Liver+Capsular+Network+of+Monocyte-Derived+Macrophages+Restricts+Hepatic+Dissemination+of+Intraperitoneal+Bacteria+by+Neutrophil+Recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A Liver Capsular Network of Monocyte-Derived Macrophages Restricts Hepatic Dissemination of Intraperitoneal Bacteria by Neutrophil Recruitment.</a> Immunity. 47 (2), 374-388 (2017).</li>
<li>Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+green+fluorescent+granulocytes+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96 (2), 719-726 (2000).</li>
<li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+fractalkine+receptor+CX%283%29CR1+function+by+targeted+deletion+and+green+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).</li>
<li>Heymann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+intravital+multiphoton+microscopy+imaging+of+immune+cells+in+healthy+and+diseased+liver+using+CXCR6.Gfp+reporter+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Wątroba była aktywnie badana przez wiele grup 3,10, ze względu na znaczenie jej funkcji. Na przykład Heymann i wsp. zasugerowali delikatną metodę z użyciem agarozy. Chociaż metoda ta okazała się bardzo precyzyjna, ustawienie agarozy wymaga czasu. Jednak dzięki naszej metodologii wszystkie procedury można przeprowadzić w ciągu 30 minut, minimalizując inne czynniki zakłócające. Po drugie, stabilizacja wątroby jest niezwykle ważna, ponieważ bicie serca może zakłócać...

Wątroba jest głównym organem metabolicznym u ssaków; działa jako wieża kontrolna dla energii, hormonów i detoksykacji1. Ze względu na jego znaczenie naukowcy przeprowadzili wiele eksperymentów in vitro i in vivo, aby wyjaśnić zmiany w wątrobie podczas stanu zapalnego. Mikroskopia przyżyteczna została wykorzystana do uchwycenia obrazów na żywo z liver2 . Rzeczywiście, wprowadzono różne metody obrazowania wątroby2,3,4,5,6. Jednakże, aby opracować bardziej uproszczone podejście chirurgiczne i osiągnąć stabilizację narządu docelowego i komórek odpornościowych, zaprojektowaliśmy prosty protokół, który może pomóc naukowcom zminimalizować wysiłek związany z obrazowaniem przyżyciowym.
W tym badaniu wprowadziliśmy stabilną i nowatorską komorę obrazowania oraz technikę chirurgiczną, które mogą być wykorzystane do zminimalizowania krwawienia i możliwych infekcji. Potwierdziliśmy, że wątroba pozostała nienaruszona przez ponad 2 godziny. Dzięki tej metodzie udało nam się zidentyfikować morfologie LCMs7 i neutrofili w warunkach septycznych. Ponieważ metoda ta minimalizuje fizyczne i biologiczne czynniki zakłócające, takie jak drżenie i nieoczekiwany stan zapalny podczas zabiegu chirurgicznego, przewidujemy, że metoda ta może być stosowana do obserwacji ostrych reakcji komórek odpornościowych w wątrobie w odpowiedzi na odczynniki takie jak LPS.

<table><tbody><tr><td>Specjalnie zaprojektowana komora</td><td>Instrumenty Live Cell Specjalnie</td><td></td><td>zaprojektowany rozmiar</td></tr><tr><td>Metalowa prowadnica pokrywy</td><td>Instrumenty Live Cell</td><td></td><td>Specjalnie zaprojektowany rozmiar</td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>#72204-03</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowych</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolba Erlenmeyera</td><td>DURAN</td><td>21 216 36</td><td></td></tr><tr><td>Płytka do hodowli komórkowej (typ płaski)</td><td>HYUNDAI Micro Co.</td><td>H31006</td><td></td></tr><tr><td>Eksykator</td><td>ADARSH</td><td>55204</td><td></td></tr><tr><td>High Q BOND SE 5 mL</td><td>BJM LAB</td><td></td><td>Do produkcji półtrwałej zapory</td></tr><tr><td>Elastyczne grzejniki z gumy silikonowej</td><td>SERIA OMEGA</td><td>SRFR / SRFG, M1250/0800</td><td></td></tr><tr><td>Zasilacz prądu stałego</td><td>Toyotech</td><td>DP30-03A</td><td></td></tr><tr><td>Solanka</td><td></td><td></td> buforowana fosforanami <td>Domowa roboty</td></tr><tr><td>Lipopolisacharydy (LPS) z serotypu enterylostycznego Salmonella enteria</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6011</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red Dextran</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1830</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Polipropylen o wysokiej czystości rurka stożkowa</td><td>FALCON</td><td>14-959-49B</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &mu; Filtr m (Filtr strzykawkowy Minisart)</td><td>Sartorius</td><td>16555k</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Micro Tube, Bursztynowy</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-X</td><td>Do strzykawki blokującej światło</td></tr><tr><td>1 ml</td><td>Korea Vaccine</td><td>KV-S01</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 3 ml Korea</td><td>Vaccine</td><td>KV-S03</td><td></td></tr><tr><td>10 ml strzykawka</td><td>Korea Vaccine</td><td>KV-S10</td><td></td></tr><tr><td>0,3 ml strzykawka insulinowa</td><td>Becton Dickinson</td><td>324900</td><td></td></tr><tr><td>Krem do depilacji 100 ml</td><td>Natur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ciała Wacik bawełniany</td><td>ABDI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zoletil 50 5 mL</td><td>Virbac</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rompun 10 mL</td><td>Bayer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płyta grzewcza</td><td>Instrumenty Live Cell</td><td>PH-S-10</td><td>Specjalnie zaprojektowany</td></tr><tr><td>rozmiar kontrolera DC</td><td>Instrumenty</td> <td>do żywych komórekCU-301</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do mikrodesekcji</td><td>Aparat Harvard</td><td>72-5418</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Roboz</td><td>RS-5882</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Roboz</td><td>RS-5137</td><td></td></tr><tr><td>Vet bond</td><td>Oprogramowanie 3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>ZEN (Black Edition)</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Program dla LSM 7 MP</td></tr><tr><td>LSM 7 MP</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program do analizy</td> <td>objętości</td><td>PerkinElmer</td><td></td></tr></tbody></table>

dwufotonowe obrazowanie przyżyciowe leukocytów podczas odpowiedzi immunologicznej w wątrobie myszy leczonej lipopolisacharydem

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

Sepsa to rodzaj ciężkiej infekcji, która może powodować niewydolność narządów i uszkodzenie tkanek. Chociaż wskaźniki śmiertelności i zachorowalności związane z sepsą są niezwykle wysokie, żadne bezpośrednie leczenie ani mechanizm związany z narządami nie zostały szczegółowo zbadane w czasie rzeczywistym. Wątroba jest kluczowym narządem, który zarządza toksynami i infekcjami w organizmie człowieka. W tym przypadku naszym celem było wykonanie obrazowania przyżyciowego wątroby myszy po indukcji endotoksemii w celu śledzenia ruchliwości komórek odpornościowych, takich jak neutrofile i makrofagi torebki wątroby (LCM). W związku z tym zaprojektowaliśmy nowatorską metodę chirurgiczną do ekspozycji wątroby za pomocą minimalnie inwazyjnej operacji. Myszom wstrzyknięto dootrzewnowo lipopolisacharyd (LPS), powszechną endotoksynę. Stosując nasze nowatorskie podejście chirurgiczne do ekspozycji i obrazowania przyżyciowego wątroby myszy, stwierdziliśmy, że rekrutacja neutrofili w wątrobie myszy z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) traktowanym LPS była zwiększona w porównaniu z wątrobą traktowaną solą fizjologiczną buforowaną fosforanami. Po leczeniu LPS liczba neutrofili znacznie wzrosła z czasem. Dodatkowo, używając myszy CX3Cr1-GFP, z powodzeniem zwizualizowaliśmy makrofagi rezydujące w wątrobie zwane LCM. Dlatego, aby zbadać skuteczność nowych odczynników w kontrolowaniu ruchliwości immunologicznej in vivo, określenie ruchliwości i morfologii neutrofili i LCM w wątrobie może pozwolić nam zidentyfikować efekt terapeutyczny w niewydolności narządów i uszkodzeniach tkanek spowodowanych aktywacją leukocytów w sepsi.

Opracowano prostą i bardzo stabilną komorę obrazowania. Dno komory pokryto silikonem, co zapobiegało przesuwaniu się ciała i organów myszy. Ponadto, dzięki odpowiedniej elastyczności silikonu, możliwe było uniknięcie spodziewanych uszkodzeń wywołanych naciskiem szkiełka nakrywki (Rycina 1A, C). Następnie zastosowano klej bezpieczny dla tkanek (Vet bond), aby unieruchomić wypreparowaną wątrobę na okrągłym podłożu silikonowym. Metoda ta pozwoli...

Ustaliliśmy nowatorski protokół chirurgiczny do obrazowania dwufotonowego żywej wątroby myszy z minimalną inwazją. Dzięki tej technice zidentyfikowaliśmy szczegółową strukturę wątroby podczas endotoksemii wywołanej lipopolisacharydem. Przewidujemy, że metoda ta może być wykorzystana do określenia skuteczności różnych odczynników do migracji leukocytów wątrobowych.

Dwufotonowe obrazowanie przyżyciowe leukocytów podczas odpowiedzi immunologicznej w wątrobie myszy leczonej lipopolisacharydem

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...

Ogólnym celem tej procedury jest obserwacja morfologii i funkcjonalności leukocytów wewnątrz wątroby podczas wstrząsu septycznego. Główną zaletą tej techniki jest to, że można uzyskać bezpośrednie filmy leukocytów wewnątrz wątroby. Przed zabiegiem należy użyć 70% etanolu do dezynfekcji stołu operacyjnego i wszystkich narzędzi.Następnie ustaw narzędzia do operacji wątroby i ustaw płytę grzewczą na 37 stopni Celsjusza. Po znieczuleniu myszy, którym wstrzyknięto LPS lub PBS zgodnie z protokołem tekstowym, nałóż niewielką ilość maści do oczu, aby zapobiec wysuszeniu siatkówki. Użyj maszynki do golenia i kremu do depilacji, aby usunąć włosy wokół brzucha.Następnie użyj mokrej gazy, aby oczyścić brzuch. Wykonując wstrzyknięcie zadoczodołowe za pomocą strzykawki insulinowej, wstrzyknij 200 mikrolitrów roztworu czerwonego dekstranu Texas. Użyj markera, aby zaznaczyć prawy obszar podżebrowy od wyrostka ksyloidalnego do końca żebra.Następnie nałóż jod powidonu na brzuch myszy, aby zapobiec wtórnej infekcji. Użyj kleszczy i nożyczek, aby przeciąć naskórek. Następnie za pomocą mikronożyczek i kleszczy otwórz jamę brzuszną i ostrożnie odsłonij wątrobę.Użyj bawełnianych wacików, aby rozwinąć lewy płat boczny. Następnie wlej 500 mikrolitrów sterylnego PBS do jamy brzusznej, aby zapobiec wysuszeniu wątroby. Umieść mysz w odpowiedniej pozycji odleżynowej w specjalnie zaprojektowanej komorze i nałóż niewielką ilość kleju tkankowego na łóżko silikonowe.Następnie użyj bawełnianych wacików, aby ostrożnie przymocować wątrobę. Tkanka wątroby jest niezwykle krucha. Nigdy nie używaj ostrych lub ciężkich narzędzi podczas odsłaniania i trzymania wątroby.Kilka sekund później ponownie zwilż wątrobę 500 mikrolitrami sterylnego PBS, aby zapobiec jej wysuszeniu. Następnie umieść metalową ramę na wątrobie i użyj nakrętek, aby mocno ją przymocować. Zawsze umieszczaj nakrętki nośne przed umieszczeniem metalowej ramy.Pomoże to zmniejszyć nacisk metalowej ramy. Aby przeprowadzić obrazowanie przyżyciowe wątroby, uruchom oprogramowanie Zen, aby włączyć laser. Ustaw długość fali na 880 nanometrów i ustaw kanały zielony i czerwony.Następnie dostosuj moc lasera do intensywności fluorescencji. Umieść komorę na stoliku do obrazowania i umieść soczewkę obiektywu zanurzonego w wodzie o mocy 20 blisko szkła osłonowego. Zamocuj grzałkę z gumy silikonowej pod korpusem myszy, aby utrzymać temperaturę ciała.Następnie narysuj 500 mikrolitrów wody destylowanej na metalowej ramie. A następnie umieść soczewkę obiektywu blisko wątroby. Dostosuj ostrość i określ głębokość i czas obszaru obrazowania.W przypadku długotrwałego obrazowania należy wstrzyknąć połowę dawki wcześniej przygotowanej mieszaniny znieczulającego Zoletil i Rompun na każdą godzinę podczas obrazowania ze względów etycznych. Utrzymuj temperaturę ciała na poziomie 37 stopni Celsjusza i zawsze miej oko na mysz, ponieważ czasy znieczulenia są różne dla każdej myszy. Aby przeanalizować dane, otwórz Prędkość i zaimportuj nieprzetworzone dane z biblioteki.Następnie usuń szum z obrazu i zrób migawkę. Na koniec dopasuj edytowane elementy do 100% i wyeksportuj pliki jako pliki JPEG lub TIF dla obrazów migawki i pliki AVI dla filmów. Analiza obrazowania przyżyciowego myszy kontrolnych wykazała, że niewielka liczba neutrofili krążyła w naczyniu krwionośnym.Natomiast liczba neutrofili była znacznie zwiększona u myszy leczonych LPS. W stanie LPS wiele neutrofili krążyło w krwiobiegu, ale nie migrowały na zewnątrz naczynia. Jak widać na tych filmach, w porównaniu z myszami kontrolnymi, neutrofile u myszy leczonych LPS były mocniej przylegające do powierzchni światła naczynia, co powodowało, że neutrofile były częściej wykrywane w naczyniu.Oprócz ruchliwości neutrofili, makrofagi otoczki wątroby lub LCM u myszy CX3CR1-GFP obserwowano na powierzchni tkanki wątroby, a nie głęboko w tkance. Ponadto LCM wykazywały niewielki ruch lub aktywację w wątrobie nawet u myszy leczonych LPS. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w 30 minut, jeśli jest wykonywana prawidłowo.Podejmując się tego zabiegu, należy pamiętać o ustawieniu linii nacięcia od wyrostka mieczykowatego do końca prawego podżebrowego brzucha. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak wstrzyknięcie leczenia, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak sposób wątroba regeneruje się po uszkodzeniu i infekcji. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie medycyny do zbadania reakcji leukocytów podczas sepsy i przetestowania potencjalnych leków.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak odsłonić wątrobę przy minimalnym nacięciu brzucha. Nie zapominaj, że praca z lipopolisacharydem może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak sterylizacja i mycie rąk.

two-photon-intravital-imaging-leukocytes-during-immune-response

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W niniejszej pracy opisujemy nieinwazyjną metodę mikroskopii dwufotonowej (2P) służącą do badania homingu leukocytów w poduszce stopy myszy. Omówiamy aspekty techniczne przygotowania tkanki do obrazowania i przeprowadzamy czytelnika przez typowy eksperyment – od początkowej konfiguracji, przez wykonanie, aż po gromadzenie danych.

Nieinwazyjne obrazowanie homingu i migracji leukocytów in vivo

Ostatnie postępy w mikroskopii dwufotonowej umożliwiły obrazowanie in situ żywych tkanek w modelach zwierzęcych w czasie rzeczywistym, co zwiększyło nasze możliwości badania zachowania komórek zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych. W niniejszym materiale przedstawiamy przygotowania niezbędne do przeprowadzenia obrazowania przyżyciowego węzła chłonnego podkolanowego myszy.

Obrazowanie intravitalne węzła chłonnego podkolanowego myszy

Ten artykuł opisuje szczegółową metodę dynamicznego pomiaru i kwantyfikacji prędkości przepływu krwi w poszczególnych naczyniach krwionośnych układu krwionośnego wątroby myszy przy użyciu obrazowania pod mikroskopem przyżyciowym w połączeniu ze specyficzną metodologią pozyskiwania i analizy obrazów.

Obrazowanie pod mikroskopem przyżyciowym wątroby po zakażeniu Leishmania: ocena hemodynamiki wątroby

Stabilne przyżyciowe obrazowanie komórek odpornościowych w wątrobie w wysokiej rozdzielczości jest wyzwaniem. W tym miejscu zapewniamy wysoce czułą i wiarygodną metodę badania migracji i interakcji komórka-komórka komórek odpornościowych w wątrobie myszy przez długi czas (około 6 godzin) za pomocą wielofotonowej laserowej mikroskopii skaningowej w połączeniu z monitorowaniem intensywnej terapii.

Długoterminowe przyżyciowe obrazowanie mikroskopii wielofotonowej komórek odpornościowych w zdrowej i chorej wątrobie przy użyciu myszy reporterowych CXCR6.Gfp

To uproszczone zastosowanie mikroskopii przyżyciowej żył krezkowych u myszy może być używane w różnych modelach zapalenia do obserwacji interakcji leukocytów-śródbłonka i płytek krwi-leukocytów.

Mikroskopia przyżyciowa interakcji leukocytów-śródbłonka i płytek krwi-leukocytów w żyłach krezkowych u myszy

Szczegółowo opisujemy protokół monitorowania zachowania neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych w stanie stacjonarnym i stanach zapalnych za pomocą mikroskopii konfokalnej przyżyciowej na znieczulonych myszach.

Obrazowanie neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych za pomocą mikroskopii przyżyciowej na znieczulonych myszach w czasie rzeczywistym

Tutaj opisujemy podejście do mikroskopii świetlnej w celu wizualizacji nacieku leukocytów CD45+ w mysim modelu aseptycznego, piorunującego zapalenia mięśnia sercowego, które jest indukowane przez leczenie myszami CD11c.DTR toksyną dyfterytową dotchawiczą.

Ilościowa wizualizacja nacieku leukocytów w mysim modelu piorunującego zapalenia mięśnia sercowego za pomocą mikroskopii świetlnej

Opisujemy zarówno testy infekcji in vitro, jak i in vivo, które mogą być użyte do analizy aktywności czynników kodujących gospodarza.

Wykorzystanie patogenu bakteryjnego do badania odpowiedzi gospodarza na poziomie komórkowym i organizmowym

Opisujemy metodę wizualizacji IELs γδ znakowanych GFP za pomocą obrazowania przyżyciowego mysiego jelita cienkiego za pomocą mikroskopii konfokalnej z odwróconym wirującym dyskiem. Technika ta umożliwia śledzenie żywych komórek w błonie śluzowej przez okres do 4 godzin i może być wykorzystana do badania różnych interakcji jelitowych między układem odpornościowym a nabłonkiem.

Obrazowanie przyżyciowe limfocytów śródnabłonkowych w jelicie cienkim myszy

Tutaj prezentujemy protokół do dożylnego obrazowania przeszczepionego lewego płuca myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej. Stanowi to cenne narzędzie do badania dynamiki i interakcji komórkowych w czasie rzeczywistym po przeszczepie płuc u myszy.

Przyżyciowa mikroskopia dwufotonowa przeszczepionego płuca myszy

Poznaj dwufotonowe obrazowanie przyżyciowe leukocytów w wątrobie myszy podczas endotoksemii wywołanej lipopolisacharydem. Ta metoda pozwala obserwować dynamikę komórek odpornościowych w czasie rzeczywistym.

Dwufotonowe obrazowanie przyżyciowe leukocytów podczas odpowiedzi immunologicznej w wątrobie myszy leczonej lipopolisacharydem

Przeglądaj więcej filmów