Name: Wykorzystanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek hepatocytów pochodzących z komórek macierzystych do odkrywania leków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: Poznaj metodę różnicowania ludzkich komórek iPSC w hepatocyty do badań przesiewowych w chorobach wątroby. Ta technika umożliwia generowanie nieograniczonych ilości komórek od pacjentów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health (DK55743, DK087377, DK102716 i HG006398 do S.A.D.). Chcielibyśmy podziękować dr Behshadowi Pournasrowi, dr Jamesowi Heslopowi i Ran Jingowi za ich wkład.

1. Hodowla ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych
<ol>
	<li>Powlekanie rekombinowanego ludzkiego białka fuzyjnego E-kadheryny Fc (E-cad-Fc) lub innych matryc odpowiednich do hodowli hPSC6
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć E-cad-Fc do 15 μg/ml roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami firmy Dulbecco zawierającym wapń i magnez (DPBS (+)).</li>
		<li>Pokryć 100-milimetrowe zawiesiny kultur tkankowych 5 ml rozcieńczonego E-cad-Fc i inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę. Usunąć substrat i zastąpić 5 ml pożywki (np. mTeSR1 zwanej dalej M-podłożem)7. 
		nuta: Pożywka hodowlana używana w tym protokole jest przygotowywana zgodnie z opublikowanymi protokołami7. Opisano jednak kilka innych preparatów pożywek lub które są dostępne na rynku, które prawdopodobnie są zgodne z tą procedurą.</li>
		<li>Pobrać fiolkę z kriokonserwowanymi iPSC z ciekłego azotu. Rozmrozić w temperaturze 37 °C, aż pozostanie mały kryształek lodu. Delikatnie pipetować komórki do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 4 ml pożywki M.</li>
		<li>Wirować przy 300 x g przez 5 min. Usunąć supernatant i delikatnie ponownie zawiesić komórki za pomocą 5 ml pożywki uzupełnionej 10 μM Y-27632, selektywnym inhibitorem kinazy białkowej (ROCK) związanej z Rho, zwiniętej cewki.</li>
		<li>Usunąć pożywkę M z kroku 1.1.2 i przenieść 5 ml komórek z kroku 1.1.4 na 100-milimetrowe płytki do hodowli tkankowych w zawiesinie E-cad-Fc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrzymanie ludzkich komórek iPS w kulturze
	<ol>
		<li>Gdy iPSC osiągną około 80% konflufluacji, usuń pożywkę hodowlaną i przemyj raz DPBS bez wapnia i magnezu (-). Zassać DPBS (-) i dodać wystarczającą ilość 0,02% roztworu EDTA, aby pokryć płytki, a następnie inkubować do 3 minut w temperaturze pokojowej. 
		nuta: Przy 80% konfluencji płytka powinna zawierać około 2 x 107 komórek. Ważne jest, aby nie przerastać komórek i zapewnić, że komórki zachowują niezróżnicowaną morfologię. Pluripotencję komórek można określić przez barwienie markerem komórek macierzystych Tra-1-60 lub równoważnym8.</li>
		<li>Gdy tylko komórki zaczną się uwalniać, usuń 0,02% roztwór EDTA i zalej naczynie 10 ml pożywki M, aby uwolnić komórki. Pomóc w odłączaniu iPSC, delikatnie pipetując. 
		nuta: Średni czas inkubacji komórek do odłączenia wynosi około 3 minut, ale należy go określić empirycznie dla każdej linii iPSC. Komórki powinny zostać uwolnione w postaci małych skupisk zawierających około 5 - 10 iPSC na klaster.</li>
		<li>Przenieść 1/10 zawieszonych komórek na świeżą zawiesinę 100 mm pokrytą E-cad-Fc, naczynie do hodowli tkankowej zawierające 5 ml pożywki M. Inkubować kultury w temperaturze 37 °C w temperaturze 4%O2/5% CO2 i codziennie zmieniać pożywkę. 
		nuta: Chociaż iPSC są rutynowo hodowane w fizjologicznych warunkach tlenowych w celu promowania pluripotencji, iPSC mogą być również hodowane przy użyciu tlenu z otoczenia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Różnicowanie ludzkich iPSC do komórek hepatocytów na płytkach 96-dołkowych
Uwaga: Ta sekcja opisuje różnicowanie iPSC w formacie, który jest zgodny z badaniami przesiewowymi. Dzięki takiemu podejściu możliwe jest nakłonienie ludzkich iPSC do różnicowania się i tworzenia komórek podobnych do hepatocytów w ciągu 20 dni. Chociaż jest to odpowiednie dla większości testów, długość hodowli można wydłużyć, aby poprawić dojrzałość komórek.
<ol>
	<li>Powlekanie 96-dołkowych płytek do hodowli tkankowych matrycą błony podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostu
	<ol>
		<li>Przygotować wywar, rozcieńczając matrycę do 2 mg/ml lodowato zimnym, sterylnym podłożem do hodowli tkankowych DMEM/F12. Podzielić matrycę na 250 μl podwielokrotności i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu, gdy będzie to wymagane. Schłodzić 10 ml DMEM/F12 na lodzie przez 30 minut. Pobrać 250 μl podwielokrotności 2 mg/ml wywaru o matrycy i rozmrozić na lodzie.</li>
		<li>Połączyć matrycę z 10 ml zimnego DMEM/F12, delikatnie mieszając za pomocą wstępnie schłodzonej pipety, aby uzyskać końcowe stężenie 0,05 mg/ml.</li>
		<li>Przenieść 100 μl rozcieńczonej matrycy do każdego dołka 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Inkubować w temperaturze 37 °C, 4%O2/5% CO2 przez co najmniej 1 godzinę. Odrzucić matrycę i zastąpić ją 50 μl pożywki M na studzienkę. Przechowywać w temperaturze 37 °C, 4% O2/5% CO2 do czasu, gdy będzie potrzebny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Komórki płytkowe do różnicowania
	<ol>
		<li>Hoduj iPSC na płytkach o średnicy 100 mm, aż komórki zbliżą się do 80% konfluencji. Upewnij się, że płytka zawiera około 2 x 107 komórek. Określ liczbę komórek za pomocą cytometru przepływu komórek lub hemocytometru. 
		nuta: Dzięki doświadczeniu jakość komórek iPSC można ocenić za pomocą mikroskopii; jednak blisko 98% komórek powinno wyrażać markery pluripotencji, takie jak epitop TRA-1-60, mierzony za pomocą FACS lub barwienia immunologicznego. Ważne jest, aby komórki aktywnie się dzieliły i nie były przerośnięte.</li>
		<li>Aby zebrać iPSC z każdej płytki o średnicy 100 mm, należy odessać pożywkę hodowlaną i przepłukać 5 ml DPBS (-). Zastąp płukanie 3 ml roztworu do oddzielania komórek (np. akutazy) i inkubuj przez około 2 minuty w temperaturze 37 °C, 4% O2/5% CO2, 
		nuta: Ważne jest, aby śledzić odklejanie komórek za pomocą mikroskopii. Nie trawić nadmiernie z akutazą. Celem jest uwolnienie komórek w postaci małych skupisk przy minimalnym traktowaniu.</li>
		<li>Gdy tylko komórki zaczną się odłączać, zbierz je, dodając 7 ml pożywki M. Pipetuj kilka razy, aby zdysocjować kolonie komórek na małe skupiska po około 3 - 6 komórek (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A).</li>
		<li>Zebrać iPSC do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wirować przy 300 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 5 ml M-pożywki.</li>
		<li>Równomiernie rozprowadzić komórki na 96-dołkowych płytkach pokrytych matrycą, pipetując 50 μl komórek zawiesiny do każdej studzienki. Aby ustawić każdą 96-dołkową płytkę, użyj jednej 100-milimetrowej płytki iPSC z komórkami o zbiegu około 80%, która zawiera około 5 x 106 komórek w celu ustawienia różnicowania. Użyj pipety wielokanałowej, aby przyspieszyć ten proces. Hodować komórki przez noc w temperaturze 37 °C, 4%O2/5% CO2, 
		nuta: Ważne jest, aby w każdym dołku zdeponować równą liczbę komórek, aby zapewnić powtarzalne różnicowanie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Indukuj różnicowanie komórek
	<ol>
		<li>Zbadaj 96-dołkowe płytki pod mikroskopem, aby upewnić się, że komórki pokrywają co najmniej 70% powierzchni każdej pojedynczej studzienki. Jeśli pokrycie jest mniejsze niż 70%, zastąpić pożywkę świeżą i inkubować przez dodatkowe 24 godziny w temperaturze 37 °C, 4% O2/5% CO2, 
		nuta: Inkubacja komórek przez ponad 48 godzin po posiewie bez indukowania różnicowania zwykle zmniejsza efektywność różnicowania. Różnicowanie będzie również zachodzić przy użyciu tlenu w otoczeniu, chociaż może to mieć wpływ na wydajność.</li>
		<li>W okresie od 1 do 2 dnia różnicowania należy zastąpić pożywkę hodowlaną RPMI uzupełnionym o 2% witaminy B27 (bez insuliny), 100 ng/ml aktywiny A, 10 ng/ml BMP4 i 20 ng/ml FGF2. Dodać 100 μl pożywki do studzienki i inkubować w temperaturze 37 °C, w temperaturze otoczeniaO 2/5% CO2 z codzienną wymianą pożywki przez 2 dni. 
		nuta: Praca z dużą liczbą płytek 96-dołkowych wymaga użycia pipety lub robota ze wspomaganiem. Pipety 12- i 96-kanałowe idealnie nadają się do codziennej wymiany podłoża.</li>
		<li>Na dzień 3 do dnia 5 różnicowania zastąpić pożywkę hodowlaną RPMI uzupełnioną 2% B27 (bez insuliny) i 100 ng/ml aktywiny A. Hoduj komórki w temperaturze 37 °C, w otoczeniu O2/5% CO2 z codzienną zmianą pożywki przez 3 dni.</li>
		<li>W 5 dniu różnicowania, przed zastąpieniem świeżą pożywką, należy potraktować każdą studzienkę 100 μl 0,02% roztworu EDTA przez 30 s, a następnie usunąć i zastąpić świeżą pożywką hodowlaną. 
		nuta: Jeśli różnicowanie do endodermy jest skuteczne, monowarstwa różnicujących się komórek jest podatna na złuszczanie się z płytki. Krótka kuracja 0,02% roztworem EDTA pomaga złagodzić odwarstwienie komórek. Leczenie to nie wpływa na różnicowanie do hepatocytów.</li>
		<li>W celu różnicowania między dniami od 6 do 10 należy zastąpić pożywkę hodowlaną RPMI/2% B27 (z insuliną) uzupełnioną 20 ng/ml BMP4 i 10 ng/ml FGF2 i inkubować w temperaturze 37 °C, 4% O2/5% CO2 przez 5 dni z dzienną zmianą pożywki. Ten etap indukuje komórki do różnicowania się w komórki progenitorowe wątroby.</li>
		<li>W celu różnicowania między dniami od 11 do 15 należy zastąpić pożywkę hodowlaną RPMI/2% B27 (z insuliną) uzupełnioną 20 ng/ml HGF. Inkubować w temperaturze 37 °C, 4% O,2/5% CO2 przez 5 dni z codzienną wymianą podłoża.</li>
		<li>W celu różnicowania między dniami od 16 do 20 należy zastąpić pożywkę hodowlaną pożywką do hodowli komórek hepatocytów (HCM) uzupełnioną 20 ng/ml onkostatyny-M (OSM). Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, w temperaturze otoczenia O2/5% CO2 z codzienną zmianą pożywki przez 5 dni. 
		nuta: Odtwarzalność różnicowania między poszczególnymi studzienkami można skutecznie określić, mierząc względny poziom albuminy, AFP lub APOB wydzielanej do pożywki za pomocą testu ELISA (patrz 3.2).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Badania przesiewowe małych cząsteczek
Uwaga: Poniżej opisano procedurę używaną do identyfikacji związków, które mogą być użyte do obniżenia poziomu APOB w pożywce komórek hepatocytów pochodzących z rodzinnych hipercholesterolemii iPSC. Opis modelu i jego zastosowania w identyfikacji leków obniżających poziom cholesterolu został szczegółowo opisany wcześniej5,9. W bieżącym przykładzie przebadano 1000 związków z biblioteki South Carolina Compound Collection (SC3). Każdy związek został przebadany w stężeniu 2 μg/ml.
<ol>
	<li>Leczenie iPSC - hepatocytów pochodzących z małych cząsteczek
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć główną bibliotekę związków, aby wytworzyć płytki z materiałami roboczymi związkami o stężeniu 20 μg/ml w 2% DMSO i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Przygotuj wystarczającą liczbę 96-dołkowych płytek hepatocytów pochodzących z iPSC, aby umożliwić przetestowanie każdego związku. 
		nuta: Liczba związków, które mają być przesiewane, będzie dyktować liczbę wymaganych płytek 96-dołkowych. Ogólnie rzecz biorąc, dla każdego związku należy przygotować jedną studzienkę oraz dodatkowe studzienki dla wszelkich próbek kontrolnych. Często unika się najbardziej zewnętrznych dołków płyty, aby zmniejszyć możliwość wystąpienia efektów krawędziowych, które mogą zniekształcić interpretację. Trafienia można zidentyfikować za pomocą metody z-score bez konieczności stosowania powtórzeń. Jeżeli uwzględniono kontrpróby, bardziej odpowiednie jest zastosowanie testu t.</li>
		<li>Po zakończeniu różnicowania (dzień 20, patrz 2.3.7) zastąpić pożywkę hodowlaną 100 μl świeżego HCM uzupełnionego 20 ng/ml Oncostatin-M. Inkubować w temperaturze 37 °C, 4% O,2/5% CO2 dokładnie przez 24 godziny. Pobrać pożywkę hodowlaną na świeżą 96-dołkową płytkę i przechowywać w temperaturze -20 °C. Użyć tej próbki do obliczenia poziomu APOB w pożywce przed dodaniem leku.</li>
		<li>Do każdej studzienki dodać 90 μl świeżego HCM uzupełnionego 20 ng/ml Oncostatin-M. Dodać po 10 μl każdego związku z zapasu roboczego po wymieszaniu przez pipetowanie. Dodać DMSO do 0,2% do studzienek kontrolnych w celu dopasowania do końcowego stężenia w próbkach poddanych działaniu substancji i inkubować w temperaturze 37 °C, temperaturze otoczenia O2/5% CO2 przez dokładnie 24 godziny. Zebrać pożywkę hodowlaną i przechowywać w temperaturze -20 °C. Użyć tej próbki do określenia poziomu APOB po poddaniu działaniu związków.</li>
		<li>Opcjonalnie - pozostałe komórki mogą być przetwarzane w celu barwienia immunologicznego, żywotności komórek lub analiz poziomów mRNA przy użyciu standardowych metod. 
		nuta: To badanie przesiewowe zostało zaprojektowane w celu identyfikacji leków, które miały szybki wpływ na poziomy APOB. Jednak w zależności od modelu choroby, dalszych testów lub mechanizmu działania leku, korzystne może być traktowanie próbki przez wiele dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ poziomy APOB za pomocą testu ELISA
	<ol>
		<li>Określić stężenie apolipoproteiny B (APOB) zarówno w próbkach przed, jak i po leczeniu farmakologicznym za pomocą ludzkiego zestawu rozwojowego APOB ELISA, zgodnie z protokołami producenta.</li>
		<li>Przygotowanie następujących rozwiązań
		<ol>
			<li>Bufor do płukania, składający się z 0,05% Tween 20 w PBS, pH 7,4. Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.</li>
			<li>Bufor do inkubacji, składający się z 0,05% Tween 20 i 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS, pH 7,4. Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotować przeciwciało APOB (mAB 20/17) rozcieńczając do 2 μg/ml w PBS, pH 7,4. Dodać 100 μl rozcieńczonego przeciwciała do dołka i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
		<li>Usunąć przeciwciało z płytek testowych i przemyć każdą studzienkę dwukrotnie 200 μl PBS o pH 7,4.</li>
		<li>Dodać 200 μl/basenik 0,05% Tween 20, 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS, pH 7,4 i inkubować na platformie wstrząsającej przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przygotuj 8-punktową krzywą wzorcową, używając 0,05% Tween 20 i 0,1% BSA w PBS, pH 7,4 o następujących stężeniach APOB: 300 ng/mL, 200 ng/mL, 175 ng/ml, 150 ng/mL, 125 ng/mL, 100 ng/mL, 75 ng/ml i 50 ng/mL.</li>
		<li>Rozcieńczyć badane próbki w stosunku 1:4 0,05% Tween 20 i 0,1% BSA w PBS, pH 7,4.</li>
		<li>Po 1 godzinie blokowania buforem inkubacyjnym wyrzucić bufor i przemyć płytki testowe pięciokrotnie 200 μl 0,05% Tween 20 w PBS, pH 7,4.</li>
		<li>Całkowicie usunąć resztki buforu płuczącego i przenieść 90 μl rozcieńczonych próbek i wzorców APOB na płytki testowe. Inkubować w temperaturze pokojowej na wytrząsarce przez 1 godzinę.</li>
		<li>Odrzucić próbkę i przemyć 200 μl 0,05% Tween 20 w PBS, pH 7,4 na studzienkę. Powtórz pranie w sumie 5 razy. Dodać 100 μl na studzienkę mAB LDL 11-biotyny rozcieńczonej 1:1,000 w 0,05% Tween 20 i 0,1% BSA w PBS, pH 7,4. Inkubować w temperaturze pokojowej na platformie wytrząsającej przez 1 godzinę.</li>
		<li>Wyrzucić odczynnik i przemyć 5 razy 200 μl na bufor do płukania studzienki. Dodać 100 μl przeciwciała Streptawidyna-HRP na studzienkę (rozcieńczenie 1:1 000 przy użyciu buforu inkubacyjnego), a następnie inkubować w temperaturze pokojowej na platformie wstrząsającej przez 1 godzinę.</li>
		<li>Wyrzucić odczynnik i przemyć 200 μl 0,05% Tween 20 w PBS, pH 7,4 na studzienkę. Powtórz pranie w sumie 5 razy. Całkowicie usunąć resztki buforu płuczącego z płytek testowych i dodać 100 μl roztworu substratu tetrametylobenzydyny (TMB) na studzienkę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 8 minut.</li>
		<li>Nie usuwając substratu TMB, bezpośrednio dodać 100 μl roztworu zatrzymującego (1N HCl) na studzienkę.</li>
		<li>Oznaczyć absorbancję przy długości fali 450 nm za pomocą czytnika płytek.</li>
		<li>Krzywą standardową można ustalić przy użyciu metody czteroparametrowej regresji logistycznej, a następnie użyć do zdefiniowania stężenia APOB w każdej próbce10.</li>
		<li>Zbadaj stosunek APOB przed lekiem do post-leku w każdej próbce, aby zidentyfikować związki, które mogą obniżyć poziomy APOB w pożywce.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Swinney, D. C., Anthony, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+were+new+medicines+discovered%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">How were new medicines discovered?</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).</li>
<li>Zeilinger, K., Freyer, N., Damm, G., Seehofer, D., Knospel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+sources+for+in+vitro+human+liver+cell+culture+models%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Biol+Med+%28Maywood%22%5BJournal%5D)">Cell sources for in vitro human liver cell culture models.</a> Exp Biol Med (Maywood. 241 (15), 1684-1698 (2016).</li>
<li>Robinton, D. A., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+research+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy.</a> Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).</li>
<li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+pathogenesis+and+treatment+of+familial+dysautonomia+using+patient-specific+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs.</a> Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).</li>
<li>Cayo, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drug+Screen+using+Human+iPSC-Derived+Hepatocyte-like+Cells+Reveals+Cardiac+Glycosides+as+a+Potential+Treatment+for+Hypercholesterolemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A Drug Screen using Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Reveals Cardiac Glycosides as a Potential Treatment for Hypercholesterolemia.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 478-489 (2017).</li>
<li>Nagaoka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-cadherin-coated+plates+maintain+pluripotent+ES+cells+without+colony+formation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">E-cadherin-coated plates maintain pluripotent ES cells without colony formation.</a> PLoS One. 1, e15(2006).</li>
<li>Ludwig, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-independent+culture+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Feeder-independent culture of human embryonic stem cells.</a> Nat Methods. 3 (8), 637-646 (2006).</li>
<li>International Stem Cell Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+embryonic+stem+cell+lines+by+International+Stem+Cell+Initiative%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Characterization of human embryonic stem cell lines by International Stem Cell Initiative.</a> Nat Biotechnol. 25 (7), 803-816 (2007).</li>
<li>Cayo, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JD+induced+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocytes+faithfully+recapitulate+the+pathophysiology+of+familial+hypercholesterolemia%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">JD induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes faithfully recapitulate the pathophysiology of familial hypercholesterolemia.</a> Hepatology. 56 (6), 2163-2171 (2012).</li>
<li>DeSilva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+the+bioanalytical+method+validation+of+ligand-binding+assays+to+support+pharmacokinetic+assessments+of+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Recommendations for the bioanalytical method validation of ligand-binding assays to support pharmacokinetic assessments of macromolecules.</a> Pharm Res. 20 (11), 1885-1900 (2003).</li>
<li>Rowland, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+integrins+in+human+induced+pluripotent+stem+cell+growth+on+Matrigel+and+vitronectin%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin.</a> Stem Cells Dev. 19 (8), 1231-1240 (2010).</li>
<li>Nagaoka, M., Si-Tayeb, K., Akaike, T., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+human+pluripotent+stem+cells+using+completely+defined+conditions+on+a+recombinant+E-cadherin+substratum%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Culture of human pluripotent stem cells using completely defined conditions on a recombinant E-cadherin substratum.</a> BMC Dev Biol. 10, 60(2010).</li>
<li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+differentiation+of+hepatocytes+from+human+embryonic+stem+cells+exhibiting+markers+recapitulating+liver+development+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo.</a> Stem Cells. 26 (4), 894-902 (2008).</li>
<li>Mallanna, S. K., Cayo, M. A., Twaroski, K., Gundry, R. L., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+Cell-Surface+N-Glycoproteome+of+Human+Hepatocytes+Reveals+Markers+for+Selecting+a+Homogeneous+Population+of+iPSC-Derived+Hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Mapping the Cell-Surface N-Glycoproteome of Human Hepatocytes Reveals Markers for Selecting a Homogeneous Population of iPSC-Derived Hepatocytes.</a> Stem Cell Reports. 7 (3), 543-556 (2016).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li>Zhang, X. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illustration+of+SSMD%2C+z+score%2C+SSMD%2A%2C+z%2A+score%2C+and+t+statistic+for+hit+selection+in+RNAi+high-throughput+screens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens.</a> J Biomol Screen. 16 (7), 775-785 (2011).</li>
<li>Lorenz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPSC-Derived+Neural+Progenitors+Are+an+Effective+Drug+Discovery+Model+for+Neurological+mtDNA+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human iPSC-Derived Neural Progenitors Are an Effective Drug Discovery Model for Neurological mtDNA Disorders.</a> Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).</li>
<li>Rashid, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+inherited+metabolic+disorders+of+the+liver+using+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells.</a> J Clin Invest. 120 (9), 3127-3136 (2010).</li>
<li>Lu, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+progenitor+cells+of+biliary+origin+with+liver+repopulation+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Hepatic progenitor cells of biliary origin with liver repopulation capacity.</a> Nat Cell Biol. 17 (8), 971-983 (2015).</li>
<li>Ogawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+cholangiocytes+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of cholangiocytes from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 33 (8), 853-861 (2015).</li>
<li>Sampaziotis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholangiocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+for+disease+modeling+and+drug+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation.</a> Nat Biotechnol. 33 (8), 845-852 (2015).</li>
<li>Mallanna, S. K., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+hepatocytes+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of hepatocytes from pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 26 (Unit 1G 4), (2013).</li>
<li>Song, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+hepatocyte-like+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Res. 19 (11), 1233-1242 (2009).</li>
<li>Cai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+functional+hepatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells.</a> Hepatology. 45 (5), 1229-1239 (2007).</li>
<li>Si-Tayeb, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+generation+of+human+hepatocyte-like+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells.</a> Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).</li>
<li>Pashos, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+Population+Cohorts+of+hiPSCs+and+Derived+Hepatocyte-like+Cells+Reveal+Functional+Genetic+Variation+at+Blood+Lipid-Associated+Loci%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Diverse Population Cohorts of hiPSCs and Derived Hepatocyte-like Cells Reveal Functional Genetic Variation at Blood Lipid-Associated Loci.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 558-570 (2017).</li>
<li>Davidson, M. D., Ware, B. R., Khetani, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-derived+liver+cells+for+drug+testing+and+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Discov+Med%22%5BJournal%5D)">Stem cell-derived liver cells for drug testing and disease modeling.</a> Discov Med. 19 (106), 349-358 (2015).</li>
<li>Choi, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+drug+screening+and+gene+correction+for+treating+liver+disease+using+patient-specific+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Efficient drug screening and gene correction for treating liver disease using patient-specific stem cells.</a> Hepatology. 57 (6), 2458-2468 (2013).</li>
<li>Tafaleng, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+model+personalized+variations+in+liver+disease+resulting+from+alpha1-antitrypsin+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells model personalized variations in liver disease resulting from alpha1-antitrypsin deficiency.</a> Hepatology. 62 (1), 147-157 (2015).</li>
<li>Jing, R., Duncan, C. B., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+screen+reveals+that+HSP90beta+promotes+the+conversion+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+endoderm+to+a+hepatic+fate+and+regulates+HNF4A+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A small-molecule screen reveals that HSP90beta promotes the conversion of induced pluripotent stem cell-derived endoderm to a hepatic fate and regulates HNF4A turnover.</a> Development. 144 (10), 1764-1774 (2017).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Odkrywanie leków w oparciu o cele, w ramach których identyfikowane są małe cząsteczki wpływające na aktywność określonego białka, było przedmiotem wielu istniejących badań przesiewowych. Chociaż podejście to dostarczyło wielu farmaceutyków, badania przesiewowe oparte na odwróceniu fenotypu, klasyczna farmakologia, były bardziej skuteczne w identyfikacji pierwszych w swojej klasie związków, które były klinicznie skuteczne1. Wadą odkrywania leków fenotypowych jest to, że zależy ono od dostępności od...

Sukces w identyfikowaniu leków, które mogą być użyte do zwalczania rzadkiej choroby, zależy od opracowania testów, które mogą być wykorzystane do badań przesiewowych. Hipotezy lub badania przesiewowe oparte na celach (farmakologia odwrotna) są przydatne, ale wymagają szczegółowego zrozumienia molekularnych podstaw choroby. Badania przesiewowe fenotypowe (farmakologia klasyczna) pozwalają uniknąć konieczności szczegółowego zrozumienia szlaków biochemicznych, ale opierają się na opracowaniu modeli, które dokładnie odzwierciedlają patofizjologię choroby. Pomimo entuzjazmu dla podejść opartych na celach, analizy zatwierdzonych przez FDA leków pierwszej w swojej klasie pokazują, że badania fenotypowe były znacznie bardziej udane1. Ogólnym celem tej metody jest stworzenie platformy do wysokoprzepustowych badań przesiewowych, które można wykorzystać do identyfikacji małych cząsteczek w leczeniu metabolicznej choroby wątroby. Opisano kilka modeli in vitro, w tym pierwotne hepatocyty, komórki wątrobiaka i komórki progenitorowe wątroby2. Jednak większość z tych modeli ma ograniczenia i istnieje zapotrzebowanie na nowe modele, które mogą dokładnie podsumować patofizjologię metabolicznych niedoborów wątroby w hodowli. Ostatnio ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste w połączeniu z edycją genów dały możliwość modelowania nawet najrzadszych chorób rzadkich w hodowli bez konieczności bezpośredniego dostępu do pacjentów3. Chociaż wykorzystanie specyficznych dla pacjenta iPSC jako narzędzia do odkrywania małych cząsteczek do leczenia rzadkich chorób wątroby jest koncepcyjnie uzasadnione, istnieje tylko kilka doniesień wykazujących wykonalność tego podejścia4. Jednak niedawno stworzyliśmy platformę, która wykorzystała hepatocyty pochodzące z iPSC, aby skutecznie zidentyfikować leki, które można ponownie wykorzystać do leczenia niedoborów metabolizmu wątroby5.
Ten protokół wyjaśnia proces różnicowania ludzkich iPSC do komórek podobnych do hepatocytów na 96-dołkowych płytkach i używania ich do badania przesiewowego biblioteki małych cząsteczek. Opisano w nim również analizę punktu końcowego na przykładzie hipercholesterolemii jako przykładu metabolicznej choroby wątroby. Takie podejście powinno być przydatne do badania roli i zastosowania małych cząsteczek w kontekście zakaźnych chorób wątroby, metabolicznych chorób wątroby, toksyczności leków i innych zaburzeń wątroby.

<table><tbody><tr><td>Sterylne szalki do hodowli tkankowych 100 mm x 20 mm&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 20 mm sterylne zawiesinowe naczynia do hodowli</td><td>Corning</td><td>430591</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka do hodowli tkankowej&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Albumina antyludzka</td><td>Dako</td><td>A 0001</td><td></td></tr><tr><td>Anty-ludzka FOXA2(6C12)</td><td>Novus Biologiczna</td><td>H00003170-M12</td><td></td></tr><tr><td>Anty-ludzka HNF4 alfa</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-6556</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-ludzkie Oct-3/4</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9081</td><td></td></tr><tr><td>Anty-ludzkie SOX17</td><td>R& D</td><td>AF1924</td><td></td></tr><tr><td>Anty-ludzki TRA-1-60 FITC sprzężony</td><td>z miliporem</td><td>FCMAB115F</td><td></td></tr><tr><td>aktywiną A Rekombinowane białko ludzkie&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>PHC9563</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplement, bez insuliny&nbsp;</td><td>Suplement Invitrogen</td><td>0050129SA</td><td></td></tr><tr><td>B-27, bez surowicy&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>BMP4 Rekombinowane białko ludzkie&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>PHC9533</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do dysocjacji komórek StemPro&nbsp; Akumulator&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo Test żywotności komórek luminescencyjnych&nbsp;</td><td>Promega</td><td>7572</td><td></td></tr><tr><td>DPBS+(wapń, magnez)</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>DPBS-(bez wapnia, bez magnezu)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw rozwojowy ELISA dla ludzi APOB Zestaw rozwojowy ELISA</td><td>Mabtech</td><td>3715-1H-20</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik wzrostu fibroblastów 2 (FGF2)</td>Pożywka do hodowli hepatocytów <td>PHG0023</td><td></td> <td>Invitrogen</td></tr><tr><td>(zestaw HCM Bullet)&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>CC-3198</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik wzrostu hepatocytów&nbsp; (HGF)</td><td>Invitrogen</td><td>PHC0321</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>MEM Roztwór aminokwasów endogennych</td><td>Invitrogen</td><td>11140076</td><td></td></tr><tr><td>Onkostatyna M (OSM) Rekombinowane białko ludzkie&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>PHC5015</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka z pluripotencjalnych komórek macierzystych bez pożywki: mTesR1&nbsp;</td><td>STEMCELL technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Matryca błony podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostu&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A1413301</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, HEPES&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>22400105</td><td></td></tr><tr><td>StemAdhere Zdefiniowana matryca dla hPSC (E-cad-Fc)</td><td>Primorigen Biosciences</td><td>S2071</td><td></td></tr><tr><td>TMB-ELISA Substrate Solution</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>34022</td><td></td></tr><tr><td>Anty-TRA-1-60 FITC sprzężony</td><td>z miliporem</td><td>FCMAB115F</td><td></td></tr><tr><td>versenem (EDTA) 0,02%&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>17-711E</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 Inhibitor ROCK</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72302</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek hepatocytów pochodzących z komórek macierzystych do odkrywania leków

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

Zdolność do różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) w komórki podobne do hepatocytów (HLC) stwarza nowe możliwości badania wrodzonych błędów w metabolizmie wątrobowym. Jednak, aby zapewnić platformę wspierającą identyfikację małych cząsteczek, które mogą być potencjalnie stosowane w leczeniu chorób wątroby, procedura wymaga formatu hodowli, który jest kompatybilny z badaniami przesiewowymi tysięcy związków. W tym miejscu opisujemy protokół wykorzystujący całkowicie zdefiniowane warunki hodowli, które umożliwiają powtarzalne różnicowanie ludzkich iPSC do komórek podobnych do hepatocytów na 96-dołkowych płytkach do hodowli tkankowych. Podajemy również przykład wykorzystania platformy do badań przesiewowych związków pod kątem ich zdolności do obniżania poziomu apolipoproteiny B (APOB) wytwarzanej z hepatocytów pochodzących z iPSC generowanych od pacjenta z hipercholesterolemią rodzinną. Dostępność platformy, która jest kompatybilna z odkrywaniem leków, powinna umożliwić naukowcom zidentyfikowanie nowych metod leczenia chorób wątroby.

Generowanie komórek-podobnych do hepatocytów: Rycina 1 przedstawia ramy czasowe zmian zachodzących podczas różnicowania ludzkich iPSC w komórki podobne do hepatocytów. Hodowla iPSC na E-Cad-Fc daje kolonie o średnicy około 2 mm, które wykazują ekspresję markera pluripotencji OCT4 (Rycina 1A-B). Morfologia komórek hodowanych na matrycy z E-kadheryny będzie się nie...

Przedstawiony tutaj protokół opisuje platformę do identyfikacji małych cząsteczek w leczeniu chorób wątroby. Przedstawiono szczegółowy opis szczegółowy różnicowania iPSC w komórki o charakterystyce hepatocytów na płytkach 96-dołkowych oraz wykorzystania komórek do badań przesiewowych w poszukiwaniu małych cząsteczek o potencjalnej aktywności terapeutycznej.

Wykorzystanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek hepatocytów pochodzących z komórek macierzystych do odkrywania leków

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest różnicowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w komórki podobne do hepatocytów w sposób odpowiedni do wysokoprzepustowych badań przesiewowych. Komórki wątroby są trudne do wyhodowania w laboratorium, jednak można je wytworzyć z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, co stanowi platformę przesiewową do identyfikacji metod leczenia chorób wątroby. Główną zaletą tej techniki jest to, że od każdego pacjenta z chorobą wątroby można wygenerować nieograniczoną liczbę hepatocytów, które podsumowują chorobę w laboratorium.Procedura jest stosunkowo łatwa do ustalenia, nawet bez rozległej wiedzy z zakresu biologii komórek macierzystych. Jego powtarzalność pozwala naukowcom na badanie przesiewowe tysięcy związków bez konieczności stosowania skomplikowanej robotyki. Ray Liu, doktor habilitowany, i Paige Lamprecht, doktorantka, zademonstrują dziś tę procedurę.Najpierw rozcieńczyć białko fuzyjne Ecad do 15 mikrogramów na mililitr solą fizjologiczną buforowaną fosforanami Dulbecco lub DPBS, która zawiera wapń i magnez. Pokryj 100-milimetrowe zawiesiny kultur tkankowych pięcioma mililitrami rozcieńczonej matrycy i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę. Po inkubacji usunąć substrat i zastąpić go pięcioma mililitrami pożywki hodowlanej iPSC.Pobrać fiolkę z kriokonserwowanymi ludzkimi indukowanymi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi z ciekłego azotu. Rozmrozić w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż pozostanie mały kryształek lodu. Następnie delikatnie odpipetuj komórki do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów zawierającej cztery mililitry pożywki hodowlanej.Odwirować komórki w temperaturze 300 G przez pięć minut. Usuń supernatant i delikatnie ponownie zawiesij komórki za pomocą pięciu mililitrów pożywki uzupełnionej dziesięcioma mikromolami Y-27632, selektywnego inhibitora kinazy białkowej zawierającej zwiniętą cewkę związaną z Rho. Teraz usuń pożywkę hodowlaną z pokrytych Ecad dziesięciomilimetrowych naczyń do hodowli tkankowych zawiesiny i dodaj pięć mililitrów komórek.Gdy iPSC osiągną około 80% konfluencji, usuń pożywkę hodowlaną i przemyj raz DPBS bez wapnia i magnezu. Zassać DPBS i dodać wystarczającą ilość 0,02% roztworu EDTA, aby przykryć naczynia. Następnie inkubuj komórki przez maksymalnie trzy minuty w temperaturze pokojowej.Gdy tylko komórki zaczną się uwalniać, usuń 0,02% roztwór EDTA i zalej naczynie dziesięcioma mililitrami pożywki M, aby uwolnić komórki. Wspomaganie odłączania iPSC poprzez delikatne pipetowanie. Przenieść 1/10 zawieszonych komórek na świeże naczynie do hodowli tkankowej pokrytej Ecad, zawierające pięć mililitrów pożywki M.Inkubuj kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 4% tlenu i 5% dwutlenku węgla, codziennie zmieniając pożywkę. Pobrać jedną fiolkę z 250 mikrolitrami lodowatego bulionu o stężeniu dwóch miligramów na mililitr i rozmrozić na lodzie. Następnie połącz rozmrożoną matrycę z dziesięcioma mililitrami zimnego DMEM/F12, delikatnie mieszając za pomocą wstępnie schłodzonej pipety, aby uzyskać końcowe stężenie 0,05 miligrama na mililitr.Przenieść 100 mikrolitrów rozcieńczonej matrycy do każdego dołka 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 4% tlenu i 5% dwutlenku węgla przez co najmniej godzinę. Po inkubacji odrzucić matrycę i zastąpić ją 50 mikrolitrami pożywki M na studzienkę, powtarzając tę samą procedurę powlekania z resztą płytek.Teraz hoduj iPSC na 100-milimetrowych szalkach, aż komórki zbliżą się do 80% konfluencji. Aby zebrać iPSC z każdej 100-milimetrowej płytki, należy odessać pożywkę hodowlaną i przepłukać pięcioma mililitrami DPBS. Zastąp płukanie trzema mililitrami roztworu do odrywania komórek, takiego jak Accutase.Następnie inkubuj przez około dwie minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 4% tlenu i 5% dwutlenku węgla. Gdy tylko komórki zaczną się odłączać, zbierz je, dodając siedem mililitrów pożywki M. Odpipetuj kilka razy, aby zdysocjować kolonie komórkowe na małe skupiska po około trzy do sześciu komórek.Następnie zbierz iPSC do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 mililitrów i wiruj pod ciśnieniem 300 G przez pięć minut. Po zakończeniu usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w pięciu mililitrach pożywki M. Równomiernie rozprowadź komórki na 96-dołkowych płytkach pokrytych matrycą, pipetując 50 mikrolitrów komórek zawiesinowych do każdej studzienki za pomocą pipety wielokanałowej.Następnie hoduj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 4% tlenu i 5% dwutlenku węgla i powtórz procedury wysiewu komórek z resztą płytek. Zbadaj 96-dołkowe płytki pod mikroskopem, aby upewnić się, że komórki pokrywają co najmniej 70% powierzchni każdej pojedynczej studzienki. Od pierwszego do drugiego dnia różnicowania należy zastąpić pożywkę hodowlaną 100 mikrolitrami pożywki różnicującej na bazie RPMI na dołek.Następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w otaczającym tlenie i 5% dwutlenku węgla przez dwa dni z codzienną wymianą pożywki. W trzecim do piątym dniu różnicowania zastąp pożywkę hodowlaną 100 mikrolitrami pożywki różnicującej na bazie RPMI, uzupełnionej 2% B27 i 100 nanogramów na mililitr aktywnego NA. Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w otaczającym tlenie i 5% dwutlenku węgla przez trzy dni z codzienną zmianą podłoża. W piątym dniu różnicowania potraktuj każdą studzienkę 100 mikrolitrami 0,02% roztworu EDTA przez 30 sekund i natychmiast usuń roztwór.Dodaj 100 mikrolitrów świeżej pożywki różnicującej na bazie RPMI i powtórz tę samą procedurę dla pozostałych płytek. W celu różnicowania między szóstym a dziesiątym dniem, zastąp pożywkę hodowlaną 100 mikrolitrami pożywki różnicującej na bazie RPMI. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 4% tlenu i 5% dwutlenku węgla przez pięć dni z codzienną wymianą podłoża.W celu różnicowania między dniami od 11 do 15 należy zastąpić pożywkę hodowlaną 100 mikrolitrami pożywki różnicującej na bazie RPMI, uzupełnionej 2% B27 i 20 nanogramami na mililitr HGF. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 4% tlenu i 5% dwutlenku węgla przez pięć dni z codzienną wymianą podłoża. W celu różnicowania między dniami od 16 do 20 należy zastąpić pożywkę hodowlaną pożywką do hodowli komórek hepatocytów uzupełnioną 20 nanogramami na mililitr onkostatyny-M.Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w otaczającym tlenie i 5% dwutlenku węgla przez pięć dni z codzienną zmianą podłoża. Po zakończeniu różnicowania w 20 dniu zastąpić pożywkę hodowlaną 100 mikrolitrami świeżej pożywki do hodowli komórek hepatocytów uzupełnionej 20 nanogramami na mililitr onkostatyny-M. Po inkubacji przez 24 godziny pobrać pożywkę hodowlaną na świeżą 96-dołkową płytkę i przechowywać w temperaturze 20 stopni Celsjusza.Powtórz tę samą procedurę zbierania dla pozostałych płytek. Dodać 90 mikrolitrów świeżej pożywki do hodowli komórek hepatocytów uzupełnionej onkostatyną-M do każdego dołka 96-dołkowej płytki. Dodaj dziesięć mikrolitrów każdego wybranego związku z wcześniej przygotowanego roboczego roztworu podstawowego.Dodać DMSO do 0,2% do studzienek kontrolnych, aby dopasować końcowe stężenie w traktowanych próbkach. Po inkubacji przez 24 godziny zebrać pożywkę hodowlaną na świeżą 96-dołkową płytkę i przechowywać w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Powtórz tę samą procedurę zbierania dla pozostałych płytek.Po pięciu dniach leczenia komórki wykazują ekspresję białek, które są charakterystycznie eksprymowane w endodermie definicyjnej. Po kolejnych pięciu dniach różnicowania endoderma przekształca się w los wątrobowy, a komórki wyrażają FOXA2 i HNF 4a. Po dodaniu HGF komórki wyrażają białka znajdujące się w hepatocytach płodowych, a po zakończeniu różnicowania komórki przyjmują prostopadłościenną morfologię z jądrem zawierającym wydatne jąderka i dużą cytoplazmą z wieloma kropelkami lipidów.Barwienie immunologiczne w celu wykrycia HNF 4a i albuminy w 20 dniu różnicowania pokazuje, że dystrybucja tych białek hepatocytów jest podobna we wszystkich studzienkach. Komórki iPS wykorzystano do badań przesiewowych pod kątem związków obniżających poziom APOB, aby zapewnić przykład wykorzystania hepatocytów pochodzących z iPSC do badań przesiewowych małych cząsteczek. Współczynnik Z testu APOB wynosi 0,73, co potwierdza przydatność wykorzystania platformy do odkrywania leków.Stosunek APOB po i przed lekiem określono dla każdego związku. Identyfikacja trafień została osiągnięta za pomocą analizy z-score. Zidentyfikowano 24 potencjalne trafienia o współczynniku APOB od 0,86 do 0,44.Po wykluczeniu związków, które miały negatywny wpływ na żywotność komórek, stwierdzono, że dwa związki są powtarzalne w obniżaniu APOB. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu 25 dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o codziennym przygotowywaniu świeżej pożywki.Nieprawidłowe stężenie składników spowodowane degradacją zmieni zdolność komórek do różnicowania. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się odkrywaniem leków do zbadania możliwości leczenia chorób wątroby przy użyciu ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak hodować i utrzymywać ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste oraz przeprowadzać różnicowanie wątroby w postaci sprasowanej o małej powierzchni w celu przeprowadzenia wysokoprzepustowych badań przesiewowych.Nie zapominaj, że praca z ludzkimi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze nosić środki ochrony osobistej, takie jak rękawice i fartuch laboratoryjny.

using-human-induced-pluripotent-stem-cell-derived-hepatocyte-like

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Ten artykuł skupi się na generowaniu ludzkiej endodermy wątrobowej z populacji ludzkich embrionalnych komórek macierzystych.

Solidna generacja komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich embrionalnych populacji komórek macierzystych

Przedstawiona tutaj metoda opisuje skalowalny i gotowy do stosowania w dobrej praktyce produkcyjnej (GMP) system różnicowania do generowania ludzkich komórek hepatocytowych z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Służy jako opłacalny i ustandaryzowany system do generowania ludzkich komórek podobnych do hepatocytów do podstawowych i stosowanych badań nad ludzką wątrobą.

Zdefiniowane i skalowalne generowanie komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje półautomatyczne podejście do produkcji komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w formacie płytki 96-dołkowej. Proces ten jest szybki i opłacalny, co pozwala na produkcję partii komórek podobnych do hepatocytów o gwarantowanej jakości do podstawowych i stosowanych badań na ludziach.

Półautomatyczna produkcja komórek podobnych do hepatocytów z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje monowarstwową, pozbawioną surowicy metodę efektywnego generowania komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) w ciągu 18 dni. Obejmuje to sześć etapów, w których hPSC sekwencyjnie różnicują się w pośrednie typy komórek, takie jak prymitywna smuga, ostateczna endoderma, tylne jelito przednie i progenitorzy zawiązków wątroby, zanim utworzą komórki podobne do hepatocytów.

Skuteczne różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w komórki wątroby

Ten protokół opisuje podejście do produkcji hepatosfer z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu zdefiniowanego systemu hodowli i samoorganizacji komórek. Protokół ten jest powtarzalny w wielu liniach komórkowych, jest opłacalny i pozwala na produkcję stabilnych ludzkich hepatosfer do zastosowań biomedycznych.

Produkcja trójwymiarowych ludzkich hepatosfer bez surowicy z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Celem tego artykułu jest dostarczenie ustandaryzowanego podejścia do indukowania różnicowania ludzkich komórek progenitorowych wątroby od pluripotencjalnych komórek macierzystych. Opracowanie tej procedury z gotowymi do użycia preparatami pożywek oferuje użytkownikowi łatwy system do generowania ludzkich komórek wątroby do badań biomedycznych i translacji.

Specyfikacja progenitorów wątroby z pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu zdefiniowanego systemu różnicowania

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół różnicowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) w funkcjonalne komórki podobne do hepatocytów (HLC) poprzez ciągłe uzupełnianie Activiny A i CHIR99021 podczas różnicowania hESC do ostatecznej endodermy (DE).

Skuteczna metoda ukierunkowanej indukcji komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy niegenetyczną metodę generowania ludzkich autologicznych sferoid wątroby przy użyciu komórek jednojądrzastych wyizolowanych z krwi obwodowej w stanie ustalonym.

Sferoidy ludzkiej wątroby z krwi obwodowej w badaniach nad chorobami wątroby

Protokół ten opisuje wytwarzanie szybkich i powtarzalnych endodermalnych organoidów wątrobowych (eHEPO). Dzięki temu protokołowi eHEPO mogą być produkowane w ciągu 2 tygodni i rozwijać się w dłuższej perspektywie (ponad 1 rok) bez utraty swojego zróżnicowania i funkcjonalności.

Wytwarzanie funkcjonalnych endodermalnych organoidów wątroby

Hepatocyty pochodzące z pluripotencjalnych komórek macierzystych mogą być oczyszczane poprzez sortowanie komórek, przy użyciu kombinacji barwienia mitochondriów i aktywowanej cząsteczki adhezyjnej komórek leukocytów (ALCAM, znanej również jako CD166).

Zastosowanie barwienia żywych mitochondriów w sortowaniu komórek w celu oczyszczenia hepatocytów pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Poznaj metodę różnicowania ludzkich komórek iPSC w hepatocyty do badań przesiewowych w chorobach wątroby. Ta technika umożliwia generowanie nieograniczonych ilości komórek od pacjentów.

Wykorzystanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek hepatocytów pochodzących z komórek macierzystych do odkrywania leków (Wideo) | JoVE Journal

Wykorzystanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek hepatocytów pochodzących z komórek macierzystych do odkrywania leków

Przeglądaj więcej filmów