Wykorzystanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek hepatocytów pochodzących z komórek macierzystych do odkrywania leków

Ogólnym celem tego eksperymentu jest różnicowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w komórki podobne do hepatocytów w sposób odpowiedni do wysokoprzepustowych badań przesiewowych. Komórki wątroby są trudne do wyhodowania w laboratorium, jednak można je wytworzyć z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, co stanowi platformę przesiewową do identyfikacji metod leczenia chorób wątroby. Główną zaletą tej techniki jest to, że od każdego pacjenta z chorobą wątroby można wygenerować nieograniczoną liczbę hepatocytów, które podsumowują chorobę w laboratorium.

Procedura jest stosunkowo łatwa do ustalenia, nawet bez rozległej wiedzy z zakresu biologii komórek macierzystych. Jego powtarzalność pozwala naukowcom na badanie przesiewowe tysięcy związków bez konieczności stosowania skomplikowanej robotyki. Ray Liu, doktor habilitowany, i Paige Lamprecht, doktorantka, zademonstrują dziś tę procedurę.

Najpierw rozcieńczyć białko fuzyjne Ecad do 15 mikrogramów na mililitr solą fizjologiczną buforowaną fosforanami Dulbecco lub DPBS, która zawiera wapń i magnez. Pokryj 100-milimetrowe zawiesiny kultur tkankowych pięcioma mililitrami rozcieńczonej matrycy i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę. Po inkubacji usunąć substrat i zastąpić go pięcioma mililitrami pożywki hodowlanej iPSC.

Pobrać fiolkę z kriokonserwowanymi ludzkimi indukowanymi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi z ciekłego azotu. Rozmrozić w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż pozostanie mały kryształek lodu. Następnie delikatnie odpipetuj komórki do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów zawierającej cztery mililitry pożywki hodowlanej.

Odwirować komórki w temperaturze 300 G przez pięć minut. Usuń supernatant i delikatnie ponownie zawiesij komórki za pomocą pięciu mililitrów pożywki uzupełnionej dziesięcioma mikromolami Y-27632, selektywnego inhibitora kinazy białkowej zawierającej zwiniętą cewkę związaną z Rho. Teraz usuń pożywkę hodowlaną z pokrytych Ecad dziesięciomilimetrowych naczyń do hodowli tkankowych zawiesiny i dodaj pięć mililitrów komórek.

Gdy iPSC osiągną około 80% konfluencji, usuń pożywkę hodowlaną i przemyj raz DPBS bez wapnia i magnezu. Zassać DPBS i dodać wystarczającą ilość 0,02% roztworu EDTA, aby przykryć naczynia. Następnie inkubuj komórki przez maksymalnie trzy minuty w temperaturze pokojowej.

Gdy tylko komórki zaczną się uwalniać, usuń 0,02% roztwór EDTA i zalej naczynie dziesięcioma mililitrami pożywki M, aby uwolnić komórki. Wspomaganie odłączania iPSC poprzez delikatne pipetowanie. Przenieść 1/10 zawieszonych komórek na świeże naczynie do hodowli tkankowej pokrytej Ecad, zawierające pięć mililitrów pożywki M.

Inkubuj kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 4% tlenu i 5% dwutlenku węgla, codziennie zmieniając pożywkę. Pobrać jedną fiolkę z 250 mikrolitrami lodowatego bulionu o stężeniu dwóch miligramów na mililitr i rozmrozić na lodzie. Następnie połącz rozmrożoną matrycę z dziesięcioma mililitrami zimnego DMEM/F12, delikatnie mieszając za pomocą wstępnie schłodzonej pipety, aby uzyskać końcowe stężenie 0,05 miligrama na mililitr.

Przenieść 100 mikrolitrów rozcieńczonej matrycy do każdego dołka 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 4% tlenu i 5% dwutlenku węgla przez co najmniej godzinę. Po inkubacji odrzucić matrycę i zastąpić ją 50 mikrolitrami pożywki M na studzienkę, powtarzając tę samą procedurę powlekania z resztą płytek.

Teraz hoduj iPSC na 100-milimetrowych szalkach, aż komórki zbliżą się do 80% konfluencji. Aby zebrać iPSC z każdej 100-milimetrowej płytki, należy odessać pożywkę hodowlaną i przepłukać pięcioma mililitrami DPBS. Zastąp płukanie trzema mililitrami roztworu do odrywania komórek, takiego jak Accutase.

Następnie inkubuj przez około dwie minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 4% tlenu i 5% dwutlenku węgla. Gdy tylko komórki zaczną się odłączać, zbierz je, dodając siedem mililitrów pożywki M. Odpipetuj kilka razy, aby zdysocjować kolonie komórkowe na małe skupiska po około trzy do sześciu komórek.

Następnie zbierz iPSC do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 mililitrów i wiruj pod ciśnieniem 300 G przez pięć minut. Po zakończeniu usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w pięciu mililitrach pożywki M. Równomiernie rozprowadź komórki na 96-dołkowych płytkach pokrytych matrycą, pipetując 50 mikrolitrów komórek zawiesinowych do każdej studzienki za pomocą pipety wielokanałowej.

Następnie hoduj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 4% tlenu i 5% dwutlenku węgla i powtórz procedury wysiewu komórek z resztą płytek. Zbadaj 96-dołkowe płytki pod mikroskopem, aby upewnić się, że komórki pokrywają co najmniej 70% powierzchni każdej pojedynczej studzienki. Od pierwszego do drugiego dnia różnicowania należy zastąpić pożywkę hodowlaną 100 mikrolitrami pożywki różnicującej na bazie RPMI na dołek.

Następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w otaczającym tlenie i 5% dwutlenku węgla przez dwa dni z codzienną wymianą pożywki. W trzecim do piątym dniu różnicowania zastąp pożywkę hodowlaną 100 mikrolitrami pożywki różnicującej na bazie RPMI, uzupełnionej 2% B27 i 100 nanogramów na mililitr aktywnego NA. Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w otaczającym tlenie i 5% dwutlenku węgla przez trzy dni z codzienną zmianą podłoża. W piątym dniu różnicowania potraktuj każdą studzienkę 100 mikrolitrami 0,02% roztworu EDTA przez 30 sekund i natychmiast usuń roztwór.

Dodaj 100 mikrolitrów świeżej pożywki różnicującej na bazie RPMI i powtórz tę samą procedurę dla pozostałych płytek. W celu różnicowania między szóstym a dziesiątym dniem, zastąp pożywkę hodowlaną 100 mikrolitrami pożywki różnicującej na bazie RPMI. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 4% tlenu i 5% dwutlenku węgla przez pięć dni z codzienną wymianą podłoża.

W celu różnicowania między dniami od 11 do 15 należy zastąpić pożywkę hodowlaną 100 mikrolitrami pożywki różnicującej na bazie RPMI, uzupełnionej 2% B27 i 20 nanogramami na mililitr HGF. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 4% tlenu i 5% dwutlenku węgla przez pięć dni z codzienną wymianą podłoża. W celu różnicowania między dniami od 16 do 20 należy zastąpić pożywkę hodowlaną pożywką do hodowli komórek hepatocytów uzupełnioną 20 nanogramami na mililitr onkostatyny-M.

Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w otaczającym tlenie i 5% dwutlenku węgla przez pięć dni z codzienną zmianą podłoża. Po zakończeniu różnicowania w 20 dniu zastąpić pożywkę hodowlaną 100 mikrolitrami świeżej pożywki do hodowli komórek hepatocytów uzupełnionej 20 nanogramami na mililitr onkostatyny-M. Po inkubacji przez 24 godziny pobrać pożywkę hodowlaną na świeżą 96-dołkową płytkę i przechowywać w temperaturze 20 stopni Celsjusza.

Powtórz tę samą procedurę zbierania dla pozostałych płytek. Dodać 90 mikrolitrów świeżej pożywki do hodowli komórek hepatocytów uzupełnionej onkostatyną-M do każdego dołka 96-dołkowej płytki. Dodaj dziesięć mikrolitrów każdego wybranego związku z wcześniej przygotowanego roboczego roztworu podstawowego.

Dodać DMSO do 0,2% do studzienek kontrolnych, aby dopasować końcowe stężenie w traktowanych próbkach. Po inkubacji przez 24 godziny zebrać pożywkę hodowlaną na świeżą 96-dołkową płytkę i przechowywać w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Powtórz tę samą procedurę zbierania dla pozostałych płytek.

Po pięciu dniach leczenia komórki wykazują ekspresję białek, które są charakterystycznie eksprymowane w endodermie definicyjnej. Po kolejnych pięciu dniach różnicowania endoderma przekształca się w los wątrobowy, a komórki wyrażają FOXA2 i HNF 4a. Po dodaniu HGF komórki wyrażają białka znajdujące się w hepatocytach płodowych, a po zakończeniu różnicowania komórki przyjmują prostopadłościenną morfologię z jądrem zawierającym wydatne jąderka i dużą cytoplazmą z wieloma kropelkami lipidów.

Barwienie immunologiczne w celu wykrycia HNF 4a i albuminy w 20 dniu różnicowania pokazuje, że dystrybucja tych białek hepatocytów jest podobna we wszystkich studzienkach. Komórki iPS wykorzystano do badań przesiewowych pod kątem związków obniżających poziom APOB, aby zapewnić przykład wykorzystania hepatocytów pochodzących z iPSC do badań przesiewowych małych cząsteczek. Współczynnik Z testu APOB wynosi 0,73, co potwierdza przydatność wykorzystania platformy do odkrywania leków.

Stosunek APOB po i przed lekiem określono dla każdego związku. Identyfikacja trafień została osiągnięta za pomocą analizy z-score. Zidentyfikowano 24 potencjalne trafienia o współczynniku APOB od 0,86 do 0,44.

Po wykluczeniu związków, które miały negatywny wpływ na żywotność komórek, stwierdzono, że dwa związki są powtarzalne w obniżaniu APOB. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu 25 dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o codziennym przygotowywaniu świeżej pożywki.

Nieprawidłowe stężenie składników spowodowane degradacją zmieni zdolność komórek do różnicowania. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się odkrywaniem leków do zbadania możliwości leczenia chorób wątroby przy użyciu ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak hodować i utrzymywać ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste oraz przeprowadzać różnicowanie wątroby w postaci sprasowanej o małej powierzchni w celu przeprowadzenia wysokoprzepustowych badań przesiewowych.

Nie zapominaj, że praca z ludzkimi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze nosić środki ochrony osobistej, takie jak rękawice i fartuch laboratoryjny.