Pobieranie i przetwarzanie węzłów chłonnych od dużych zwierząt do analizy RNA: przygotowanie do badań transkryptomicznych węzłów chłonnych dużych gatunków zwierząt

Cześć, nazywam się dr Robert Schaut i jestem naukowcem w Narodowym Centrum Chorób Zwierząt w Ames w stanie Iowa. W tym filmie JoVE podzielimy się z Wami informacjami na temat pobierania i przetwarzania węzłów chłonnych od dużych zwierząt do wykorzystania w dalszych eksperymentach RNA. Na przykład eksperymenty te mogą obejmować ilościową reakcję PCR na produktach z odwrotną transkrypcją lub badania sekwencjonowania RNA transkryptomów.

Węzły chłonne są użytecznymi próbkami do oceny odpowiedzi immunologicznej gospodarza, ale mogą również stanowić źródło RNA patogenu do badań, takich jak w przypadku patogenów wewnątrzkomórkowych obecnych w komórkach odpornościowych wewnątrz węzłów chłonnych. Próbki pobrane od dużych zwierząt, w tym zarówno zwierząt gospodarskich, jak i dzikich zwierząt, są interesujące w badaniach nad chorobami odzwierzęcymi. Tutaj, w Narodowym Centrum Chorób Zwierząt, badamy zakażenia zwierząt gospodarskich gatunkami takimi jak brucella abortus, która powoduje brucelozę u bydła i żubrów, oraz E.Coli O157:H7 wydalana ze śladów jelitowych bydła.

Odzyskamy również próbki tkanek od gatunków dzikich zwierząt, takich jak jelenie i łosie. Od zwierząt zakażonych różnymi chorobami można pobrać szereg węzłów chłonnych. Badania tkanek tych naturalnych gatunków gospodarzy są na ogół bardziej istotne dla naturalnego postępu choroby niż modele mysie.

Jednak proces pobierania tkanek od dużych gatunków jest z konieczności bardziej skomplikowany niż od myszy, w tym dłuższe opóźnienie między eutanazją a pobraniem tkanek oraz większy rozmiar węzłów chłonnych. W tym miejscu przedstawimy protokół izolacji dużych węzłów chłonnych zwierząt do badania RNA, który będzie pouczający dla biologów molekularnych zaangażowanych w badania transkryptomiczne zakażeń dużych zwierząt, a także dla badaczy weterynaryjnych rozpoczynających badania transkryptomiczne. W tym filmie zademonstrujemy procedury na węzłach chłonnych u bydła.

Przed sekcją zwłok zalecamy skompletowanie następujących materiałów przeznaczonych do procedury izolacji tkanek. Probówki do mikrofug wypełnione około 1 ml środka do konserwacji tkanek RNA, takich jak RNAlater, jednorazowe skalpele, kleszcze do czyszczenia i autoklawu, igły do biopsji, pojemnik na ostre przedmioty na zużyte skalpele i igły oraz deska do krojenia lub jednorazowa taca, w zależności od poziomu zakaźności zaangażowanych materiałów. W tym przypadku zademonstrujemy kluczowe elementy zabiegu za pomocą węzłów chłonnych, które zazwyczaj pobieramy od bydła.

Są zarażone bakteriami wywołującymi brucelozę. Są to węzły chłonne przedłopatkowe i węzł chłonny przyuszny. Przeprowadzając sekcję zwłok dużych zwierząt w celu odzyskania RNA, dobrze jest, aby co najmniej trzech uczestników pracowało nad tkankami zwierzęcymi.

Sekcja pierwsza będzie odpowiedzialna za sekcje różnych części zwierzęcia na dużych zwierzętach, sekcja druga pobierze węzły chłonne z różnych odcinków zwierząt na głównym stole do sekcji zwłok, a sekcja trzecia będzie pracować przy osobnym stole, aby wyizolować skrawki z każdego węzła chłonnego i przenieść je do probówek z roztworem konserwującym. Zaczniemy od identyfikacji i usunięcia węzła chłonnego przedłopatkowego. Idealnie, badanie palpacyjne węzła chłonnego przed sekcją pomoże określić lokalizację węzła chłonnego.

Chociaż nie zawsze jest to możliwe do wykrycia, węzeł chłonny przedłopatkowy jest zwykle wyczuwalny palpacyjnie u zdrowego zwierzęcia. Zacznij od umieszczenia zwierzęcia w pozycji bocznej. Wyprostuj ramię, przesuwając przednią kończynę do tyłu na poziomie kolana.

Ten ruch cofnie ramię i pozwoli na łatwe badanie palpacyjne węzła chłonnego. Poczuj obecność węzła chłonnego, jak pokazano. Po zlokalizowaniu, przy nadal wyprostowanym ramieniu, użyj skalpela lub noża do sekcji zwłok, aby wykonać nacięcie skóry wzdłuż konturu ramienia.

Cofnij skórę, aby odsłonić punkt mięśni ramion i szyi. Czasami obserwuje się fragment podskórnej tkanki tłuszczowej, zwłaszcza u zwierząt nadmiernie kondycjonowanych. Węzeł chłonny przedłopatkowy często znajduje się z odcinkami podskórnej tkanki tłuszczowej.

Tutaj możesz zobaczyć trzy warstwy skóry, mięśnie i podskórną tkankę tłuszczową. Po raz kolejny zbadaj palpacyjnie lokalizację węzła chłonnego. W przeciwieństwie do podskórnej tkanki tłuszczowej, węzeł chłonny zachowa swój kształt po wykonaniu badania palpacyjnego.

Po zlokalizowaniu węzła chłonnego przedłopatkowego ostrożnie wypreparuj podskórną tkankę tłuszczową i wypreparuj węzeł chłonny. Wygląd tych węzłów chłonnych u żubrów, które wykorzystaliśmy w badaniach nad brucelozą ze względu na podatność żubrów w rejonie Greater Yellowstone na brucelozę, jest podobny. Tutaj pokazujemy wygląd węzła chłonnego przedłopatkowego, wypreparowanego z prawego ramienia bizona amerykańskiego.

Następnie przejdziemy do izolacji węzła chłonnego przyusznego. Gdy zwierzę znajduje się w pozycji leżącej bocznej, zlokalizuj staw skroniowo-żuchwowy. Za pomocą skalpela lub noża do sekcji zwłok ostrożnie wykonaj nacięcie na skórze.

Zacznij grzbietowo do stawu i rozciągaj się pionowo wzdłuż linii żuchwy. Odetnij skórę, aby odsłonić tkankę podskórną. Ślinianka przyuszna będzie widoczna, przede wszystkim ze względu na jej duży rozmiar, zrazikowany wygląd powierzchni i czerwone zabarwienie.

Za pomocą kleszczy i skalpela odsuń śliniankę przyuszną na bok, aby znaleźć węzeł chłonny ślinianki przyusznej znajdujący się tylko czaszkowo i przyśrodkowo do ślinianki. Podczas izolowania węzła chłonnego ślinianki przyusznej bardzo ważne jest oddzielenie tkanki węzła chłonnego od tkanki ślinianki przyusznej. Typy tkanek wyglądają inaczej, w tym w obrębie przekroju tkankowego.

Można to zaobserwować tutaj, gdy węzeł chłonny przyuszny znajduje się po lewej stronie, a ślinianka przyuszna po prawej. Pamiętaj, aby dokładnie zbadać tkankę węzła chłonnego ślinianki przyusznej pod kątem tekstury przed dalszym przetwarzaniem. W niektórych przypadkach może być konieczne wycięcie ślinianki przyusznej w celu zlokalizowania węzła chłonnego ślinianki przyusznej.

Oto przykład ślinianki przyusznej wyciętej z wołu, w której węzeł chłonny był osadzony w gruczole ślinowym i niewidoczny przed usunięciem gruczołu. Dodatkowe informacje na temat identyfikacji wybranych węzłów chłonnych znajdują się w pracy głównej. Po pobraniu węzłów chłonnych możesz wyciąć skrawki w celu konserwacji.

Użyj skalpela lub noża do sekcji zwłok, usuń część węzła chłonnego i wykonaj cięcie strzałkowe, aby otworzyć węzeł chłonny. Zbadaj wnętrze węzła chłonnego, szczególnie w próbkach pochodzących od zakażonych zwierząt, szukając asymetrii, zmian chorobowych, różnic kolorystycznych itp. W tym bydlęcym węźle chłonnym przedłopatkowym wiele cech jest widocznych gołym okiem.

Należą do nich pęcherzyki, które są domem dla limfocytów B i głębokie jednostki korowe, które są domem dla limfocytów T. Przyczyny te wydają się ciemniejsze niż zatoki szpikowe, które są jaśniejsze. Tutaj przedstawiono kolejny przykład niezainfekowanego węzła chłonnego.

Ten węzeł chłonny pochodzi od młodszego żubra. Zauważ, że mieszki włosowe są mniej wyraźne w tym przykładzie. Aby podzielić tkanki do przetworzenia, jedną z opcji jest pobranie małych fragmentów tkanek z każdego węzła chłonnego za pomocą skalpela w celu późniejszego odzyskania RNA.

Jednak jednym z głównych wyzwań związanych z porównywaniem profili ekspresji między próbkami jest duży rozmiar dużych węzłów chłonnych zwierząt w porównaniu z węzłami chłonnymi myszy, które można łatwo wyekstrahować w całości w celu ekstrakcji RNA. W rezultacie małe skrawki tkanek nie będą równomiernie uchwycić profilu komórek w węźle chłonnym. Zamiast tego, aby uchwycić komórki w poprzek profilu węzła chłonnego, wytnij klin w kształcie ciasta z węzła chłonnego, pokrój na małe kawałki nie grubsze niż 5 mm i umieść za pomocą kleszczy w probówkach zawierających RNAlater.

Alternatywnie można wykorzystać metodologie biopsji do wycięcia skrawków tkanki z każdego węzła chłonnego. Wybierz narzędzie do biopsji dziurkowania, jeśli chcesz pobrać określone sekcje, takie jak określone pęcherzyki z węzła, a następnie przenieść je za pomocą kleszczy do RNAlater. Po przeniesieniu próbek do RNAlater przenieś je z powrotem do laboratorium i przechowuj w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez noc, aby umożliwić penetrację tkanki.

Następnie usuń nadmiar RNApóźniej i przechowuj próbki tkanek w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Zaletą stosowania roztworu konserwującego RNA jest to, że ciekły azot nie jest wymagany podczas sekcji zwłok ani podczas pobierania próbek z pola. Przed uzyskaniem dostępu do próbek, należy wstępnie podtrzymać odczynnik Trizol do probówek w celu homogenizacji.

Po wyjęciu próbek z zamrażarki należy je natychmiast przenieść do odczynnika Trizol w celu późniejszego przetworzenia, w oparciu o zalecenia producenta. Tutaj kawałek 50-100 mg tkanki przenosi się do odczynnika Trizol. Należy w miarę możliwości ograniczyć rozmrażanie przed dodaniem Trizolu.

Przechowywanie na suchym lodzie może być stosowane, gdy wiele próbek jest wyjmowanych z zamrażarki w celu przetworzenia. Umieścić probówki na homogenizatorze i homogenizować w odczynniku Trizol. W tym przypadku stosuje się dwuminutowe ustawienie ekstrakcji RNA.

Po zakończeniu sprawdź, czy nie ma mętnego wyglądu. W razie potrzeby czynność powtórzyć. Postępuj zgodnie z protokołem producenta, aby wygenerować warstwy wodne i organiczne dla każdej próbki.

Usunąć górną przezroczystą fazę wodną za pomocą końcówki pipety. Przenieść do nowej probówki do mikrowirówki. Następnie wymieszaj z równą objętością 100% etanolu.

Dokładnie wymieszaj. Rurka często wydaje się mętna. Za pomocą końcówki do mikropipet przenieś ciecz do komercyjnej kolumny wirowej na bazie krzemionki w celu dalszego oczyszczenia, a następnie wymycia RNA.

Aby ocenić jakość RNA, załaduj jeden lub dwa litry eluowanej próbki RNA do spektrofotometru w celu analizy. Po zakończeniu procedury obserwujemy współczynniki absorbancji wynoszące około dwóch dla stosunku 260-280 i stosunku 260-230, co wskazuje na wysoką czystość przy minimalnym przeniesieniu chemicznym. Zanieczyszczenie fenolem można zaobserwować po spadku współczynnika absorbancji 260-230 nm.

Podczas procedury sekcji zwłok w przypadku zwierząt takich jak żubry zaobserwowaliśmy co najmniej 20-minutowy okres czasu między eutanazją a przekazaniem pierwszej próbki tkanki do środka konserwującego. W przeciwieństwie do tego, węzły chłonne myszy mogą zostać usunięte i zachowane po eutanazji w ciągu kilku minut. W związku z tym zależało nam na scharakteryzowaniu profilu degradacji węzłów chłonnych w czasie.

W głównym manuskrypcie zebraliśmy również podsumowanie profili stabilności RNA w szeregu innych typów tkanek, które zostały przetestowane w innych publikacjach. W reprezentatywnych eksperymentach, przeprowadzonych na węzłach chłonnych żubra, stabilność RNA była względnie stała w ciągu godziny po eutanazji. Tutaj przedstawiamy żelowy obraz całkowitego RNA oczyszczonego z kawałków tkanki węzła chłonnego nadsutkowego od bizona amerykańskiego.

Odkrycie to jest zgodne z wcześniejszymi danymi dla innych typów tkanek opracowanymi na podstawie literatury. Sugeruje to, że próbki o akceptowalnej jakości do dalszej analizy ekspresji genów mogą być pobierane nawet od bardziej wymagających gatunków, takich jak żubry i łosie. Jednak ważne jest, aby zdać sobie sprawę, że dłuższy czas między śmiercią a zachowaniem próbki może powodować zmiany w profilach ekspresji RNA, w tym wzrost degradacji z trzech głównych końców transkryptów mRNA.

Dlatego nadal ważne jest, aby wykorzystać szybki, usprawniony przepływ pracy do odzyskiwania tkanek w celu zmniejszenia dalszego opóźnienia, gdy zwierzę jest dostępne do sekcji zwłok, w celu uzyskania najbardziej biologicznie ważnych profili RNA. Ponadto zwracamy uwagę, że podczas całej procedury należy zachować ostrożność, aby uniknąć wprowadzenia zanieczyszczeń RNA do próbek w trakcie całego procesu, poza tymi, które są już obecne w tkankach. Obejmuje to stosowanie rękawic jako części innych wymaganych środków ochrony osobistej.

Poddajemy również końcowy produkt RNA do wielu probówek, aby w jak największym stopniu ograniczyć swobodne zatrzymywanie próbek RNA. Na przykład oddzielne podwielokrotności mogą być przechowywane do wykorzystania w testach kontroli jakości. Podsumowując, w tym filmie przedstawiliśmy ważne informacje do wykorzystania w identyfikacji, zbieraniu, reprezentatywnym pobieraniu próbek i przetwarzaniu węzłów chłonnych do dalszej analizy ekspresji genów.

Podczas gdy nasz reprezentatywny film został zademonstrowany na przykładach bydła i żubrów, pracowaliśmy również z węzłami chłonnymi innych dużych gatunków, w tym kóz i łosi. Mamy nadzieję, że ten film okaże się przydatny w Twojej pracy, niezależnie od tego, czy jesteś naukowcem weterynarii rozważającym zastosowanie metod transkryptomicznych w swojej pracy, czy biologiem molekularnym zainteresowanym zagłębieniem się w dziedzinę nauk o dużych zwierzętach.