Name: Pobieranie i przetwarzanie węzłów chłonnych od dużych zwierząt do analizy RNA: przygotowanie do badań transkryptomicznych węzłów chłonnych dużych gatunków zwierząt (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 53 s
Description: Poznaj metody pobierania i przetwarzania węzłów chłonnych od dużych zwierząt do analizy RNA. Protokół zapewnia spójność próbek i zachowanie integralności RNA dla badań transkryptomicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Jamesowi Fosse za jego doskonałą pracę nad wszystkimi filmami i przetwarzaniem wideo; Michaelowi Marti za znakomitą pracę nad generowaniem zdigitalizowanych zdjęć bydła; Lilia Walther za pomoc w ekstrakcji RNA i biegach z bioanalizatorem; Mitch Palmer i Carly Kanipe za pomocny przegląd i opinie na temat obrazów węzłów chłonnych; oraz personelowi opieki nad zwierzętami i weterynarzom w Narodowym Centrum Chorób Zwierząt za ich ciężką pracę i pomoc w hodowli zwierząt i przygotowaniach do sekcji zwłok.

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów. Wszystkie badania są finansowane z funduszy krajowych Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych, Służby Badań Rolniczych. Wszystkie odniesienia do konkretnych produktów są podane w celu odtworzenia eksperymentalnego i nie stanowią żadnego poparcia dla tych produktów przez rząd federalny.

Większość badań transkryptomicznych i związanych z nimi protokołów koncentruje się na próbkach pobranych od myszy, szczurów lub pośmiertnych ludzi. Jednak badania na zwierzętach gospodarskich i dzikich dają szeroki zakres możliwości charakterystyki odpowiedzi immunologicznej na chorobę, zarówno w odniesieniu do medycyny weterynaryjnej, jak i, w odniesieniu do chorób odzwierzęcych, do zdrowia publicznego ludzi. Protokół ten zawierał zarys kluczowych zagadnień dotyczących ekstrakcji RNA o wysokiej integralności z tkanek du...

Analiza sekwencjonowania RNA transkryptomu węzłów chłonnych stwarza możliwość charakterystyki odpowiedzi immunologicznej zwierząt na różnorodne patogeny. Choć metodologia ta była szeroko wykorzystywana u myszy, w ostatnim czasie analizy te zaczęto rozszerzać na większe ssaki.1,2Węzły chłonne zwierząt hodowlanych/dużych zwierząt mogą być wykorzystywane do charakterystyki odpowiedzi gospodarza na infekcję, nie tylko w badaniach nad szczepionkami lub podatnością genetyczną oraz w identyfikacji celów dla rozwoju leków, ale także jako systemy modelowe dla badań nad zoonozami u ludzi. Na przykład w przypadku brucelozy (bakteryjnej choroby odzwierzęcej, która każdego roku dotyka pół miliona ludzi na świecie), mimo znacznie wyższych kosztów, badania na owcach lub kozach są bardziej relewantne dla infekcji u ludzi oraz rozwoju ludzkich szczepionek niż modele zwierząt laboratoryjnych. Modele infekcji u myszy odwzorowują zakażenie układu retikuloendotelialnego, ale nie charakterystycznych objawów klinicznych.3. 
W eksperymentach na dużych zwierzętach, w porównaniu do badań na zwierzętach laboratoryjnych, proces pobierania tkanek wiąże się z koniecznością dłuższego czasu oczekiwania między eutanazją a zbiorem tkanek, co stanowi potencjalne wyzwanie dla zachowania wysokiej jakości RNA. Nienaruszony RNA jest niezbędny do wygenerowania biologicznie istotnych danych transkryptomicznych. Uzyskanie wysokiej jakości RNA z próbek tkanek jest szczególnie krytyczne w przypadku badań nad patogenami dużych zwierząt prowadzonych w placówkach izolacyjnych. Takie badania są z natury trudniejsze do przeprowadzenia, ponieważ wymagają nie tylko zatwierdzonych placówek i wysoko wykwalifikowanego personelu, ale wiążą się również ze znacznymi kosztami finansowymi, które w zależności od zakresu prac mogą wynosić od dziesiątek do setek tysięcy dolarów. Tego typu badania wymagają również współpracy oraz wiedzy interdyscyplinarnej do ich ukończenia, co potęguje ich złożoność. Dlatego też szkolenie, opracowanie i przestrzeganie usprawnionego systemu pobierania i konserwacji próbek przynosi znaczące korzyści dla późniejszych badań molekularnych tkanek pochodzących od zainfekowanych zwierząt.
Pobieranie większych węzłów chłonnych stwarza dodatkowe wyzwania w zakresie kolekcji tkanek w porównaniu do analogicznego pobierania węzłów chłonnych u myszy. Przygotowanie do wycięcia próbki wymaga podstawowej znajomości anatomii węzła chłonnego, w tym odpowiednich struktur wewnętrznych. Budowa węzła chłonnego składa się z grudek chłonnych otoczonych zatokami wypełnionymi limfą. Struktury te są zamknięte w twardej, włóknistej torebce4. Grudka chłonna jest „podstawową jednostką anatomiczną i funkcjonalną węzła chłonnego” i składa się z mieszków, głębokiej warstwy korowej oraz sznurów i zatok rdzeniowych4 (Rycina 1A). Limfocyty B i T znajdują się odpowiednio w mieszkach oraz w głębokich jednostkach korowych. Struktury te stanowią rusztowanie 3D i ułatwiają interakcje między limfocytami a antygenem lub komórkami prezentującymi antygen.
Makroskopowo na przekroju można zidentyfikować mieszki i głębokie jednostki korowe, ponieważ zawierają one gęstszą sieć retikularną i wydają się ciemniejsze niż zatoki, które składają się z delikatniejszej sieci retikularnej i mają jaśniejszy kolor (Rysunek 1B). Zgodnie z przyjętą konwencją patolodzy określają obszary węzłów chłonnych jako korę powierzchowną (mieszki), parakorę (głębokie jednostki korowe) oraz rdzeń (sznury i zatoki rdzeniowe). Właściwa ocena wszystkich trzech regionów jest uznawana za najlepszą praktykę w rutynowych wytycznych badania patomorfologicznego węzłów chłonnych5. Należy zauważyć, że istnieje znaczna zmienność w konsystencji, wielkości i kolorze węzłów chłonnych, nawet u jednego zwierzęcia. Wraz z wiekiem zwierząt ich węzły chłonne mają tendencję do zmniejszania się i stają się twardsze niż u młodszych osobników, co zazwyczaj wynika ze wzrostu ilości tkanki łącznej i redukcji prawidłowej struktury limfoidalnej6,7.
<img alt="Schemat anatomiczny węzła chłonnego oraz przekrój tkanki z zaznaczeniem struktur kory, przykory i rdzenia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57195/57195fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1. Anatomia węzła chłonnego. (A) Ten schemat przedstawia anatomię węzła chłonnego, obrazując kluczowe struktury. (BZdjęcie przedstawia węzeł chłonny bydlęcy przekrojony w poprzek. Zaznaczono odpowiednie struktury/warstwy widoczne gołym okiem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57195/57195fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
W zależności od pytania badawczego, do pobrania i analizy wybiera się różne węzły chłonne. Węzły chłonne obwodowe to te zlokalizowane głęboko w tkance podskórnej. U bydła do obwodowych lub powierzchownych węzłów chłonnych często wykorzystywanych w praktyce klinicznej i eksperymentalnej należą węzły: przyuszne, podżuchwowe, zakątkowe, przedłopatkowe, przedudowe (przedpiszczelowe) oraz powierzchowne pachwinowe (nadwymionowe u samic, mosznowe u samców) (Rycina 2). W Tabeli 1 przedstawiono właściwości kluczowych powierzchownych węzłów chłonnych, zgodnie z opisem dla systemu bydła8. Poniżej, jako punkt wyjścia do badań, zaprezentowano kilka potencjalnych planów pobierania węzłów chłonnych w przypadku zakaźnych chorób bakteryjnych bydła.
Brucella abortus/Brucella melitensis: Standardowe sekcje zwłok bydła zakażonego B. abortus oraz kóz zakażonych B. melitensis w Narodowym Ośrodku Chorób Zwierząt (National Animal Disease Center) obejmują pobranie tkanek z węzłów chłonnych nadwymieniowych, przylopatkowych i przyusznych, zarówno w celu ich rozcierania do oznaczania liczby bakterii, jak i do przygotowania RNA do profilowania ekspresji RNA gospodarza. B. abortus może być regularnie wyizolowana z każdego z tych węzłów chłonnych u bydła zakażonego eksperymentalnie9. Obecność bakterii w każdym z tych typów węzłów chłonnych może być wykryta u kóz zakażonych B. melitensis do co najmniej dziewięciu miesięcy po zakażeniu przy użyciu metod opartych na RNA z naszych badań (Boggiatto et al., niepublikowane). Salmonella sp.: Węzły chłonne przylopatkowe, podbiodrowe (przedudowe) i krezkowe okazały się przydatne podczas profilowania tusz bydlęcych pod kątem zapadalności na Salmonella10,1,12 i mogłyby stanowić potencjalne zainteresowanie dla badań transkryptomicznych. E. coli O157:H7: Węzły chłonne krezkowe (w lokalizacjach środkowej i dystalnej części jelita cienkiego) mogą być miejscami okazjonalnego wyizolowania bakterii u zakażonych cieląt (ale nie u zakażonego dorosłego bydła)13. Leptospiroza (Leptospira sp.): Przewlekła persistencja bakterii została zaobserwowana w węzłach chłonnych drenujących gruczoł mlekowy14. Mycobacterium bovis: U bydła bakterie te wyizolowano po zakażeniu eksperymentalnym z węzłów chłonnych śródpiersnych i tchawkopowietrznych cieląt15. Dodatkowo RNA z węzłów chłonnych wykorzystywano do badania odpowiedzi gospodarzy dużych zwierząt na wirusy, takie jak wirus zespołu rozrodczo-oddechowego świń2. Rycina 2 przedstawia lokalizację części tych głównych węzłów chłonnych w organizmie bydła.
<img alt="Schemat węzłów chłonnych krowy; przyuszny, podżuchwowy, za gardłowy, przedłopatkowy, przedudowy, nadwymiowy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57195/57195fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rycina 2: Schemat przedstawiający wybrane lokalizacje węzłów chłonnych w Bos taurus. Ponumerowane węzły chłonne zostały opisane. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57195/57195fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
W niniejszej pracy oraz towarzyszącym jej filmie przedstawiamy protokół izolacji węzłów chłonnych dużych zwierząt do badań nad RNA, opracowany z myślą o biologach molekularnych zajmujących się badaniami transkrypcyjnymi infekcji u dużych zwierząt. W pierwszej kolejności przedstawiamy przegląd procedury izolacji węzłów chłonnych, wykorzystując jako przykłady pobieranie próbek z tkanek bydła i żubra. Towarzyszy temu, jak pokazano w filmie, schemat powtarzalnego pobierania tkanek do izolacji RNA. Następnie opisujemy kluczowe kwestie dotyczące przetwarzania zainfekowanego węzła chłonnego, koncentrując się na bezpieczeństwie, powtarzalności oraz jakości RNA.
Preparatyka RNA z tkanki z użyciem zakwaszonego odczynnika fenolowo-guanidynian izotiocyjanianowego opiera się na oryginalnej metodzie Chomczynskiego i Sacchiego16,17, z oczyszczaniem na kolumnach wirowych opartych na krzemionce w obecności czynników chaotropowych na podstawie pierwotnych prac Vogueleinstena i Gillespii18. Badamy również możliwość odzyskania RNA do analiz transkryptomicznych z węzłów chłonnych bydła utrwalonych alternatywnymi metodami. Na koniec analizujemy wpływ zmiennej czasu na jakość RNA podczas sekcji zwłok dużych zwierząt, w tym przedstawiamy reprezentatywny eksperyment obrazujący wpływ wydłużenia czasu między eutanazją a pobraniem próbek na profil odzyskanego RNA z węzłów chłonnych żubrów i bydła. Artykuł ten będzie przydatny nie tylko dla biologów molekularnych, ale także dla badaczy z zakresu weterynarii rozpoczynających badania transkryptomiczne.

<table><tbody><tr><td>Roztwór do konserwacji RNA (do wszystkich eksperymentów używaliśmy RNALater)</td><td>ThermoFisher</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml lub 2 ml polipropylenowe probówki wirówkowe&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe skalpele</td><td>Daigger Scientific</td><td>EF7281</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze do tkanek, ząb szczura</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-460-117</td><td>Dostępne inne kleszczyki do tkanek, w tym zakrzywiona końcówka, zwężająca się krawędź itp., W zależności od preferencji użytkownika</td></tr><tr><td>Igły do biopsji 3 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9949469</td><td></td></tr><tr><td>Pojemnik na ostre przedmioty (mały i przenośny do sekcji zwłok)</td><td>Stericycle</td><td>8900SA</td><td>1 qt. rozmiar pokazany tutaj</td></tr><tr><td>Deski do krojenia lub tace jednorazowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-002-24A</td><td>Dostępne w różnych rozmiarach, w zależności od preferencji użytkownika Środki</td></tr><tr><td></td><td></td><td>ochrony osobistej</td><td>Różni się w zależności od patogenu (rękawice, maski oddechowe, gogle itp.)</td></tr><tr><td>Odczynnik do ekstrakcji RNA na bazie fenolu (do wszystkich eksperymentów użyliśmy odczynnika TRIzol)</td><td>Zestaw</td><td></td> do ekstrakcji RNA na bazie kolumny krzemionkowej ThermoFisher 15596026 <td></td></tr><tr><td>(do wszystkich eksperymentów użyliśmy zestawu PureLink RNA Mini)</td><td>ThermoFisher</td><td>12183018A</td><td>Zaprojektowany do tkanek do 100 mg</td></tr><tr><td>100% etanolu (200 proof dla biologii molekularnej)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator tkankowy z dołączonymi probówkami homogenizacyjnymi (do wszystkich eksperymentów używaliśmy dysocjatora gentleMACS)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza (Ogólne, do elektroforezy żelowej)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>1X</td><td>TBE Fisher Scientific</td><td>BP24301</td><td>Może również wykonać od podstaw w laboratorium</td></tr><tr><td>Dejonizowany formamid</td><td>EMD Millipore</td><td>S4117</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114391</td><td></td></tr><tr><td>Cyjanol ksylenowy&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy)</td>Spektrofotometr <td>UV-Vis Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>(użyliśmy spektrofotometru NanoDrop)</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie do ilościowej oceny RNA (użyliśmy Bioanalizatora, z powiązanymi komponentami i protokołami)</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji RNA FFPE (użyliśmy zestawu do izolacji całkowitych kwasów nukleinowych RecoverAll do tkanek utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie)</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1975</td><td></td></tr><tr><td>Rozsiewacz z tworzywa sztucznego (rozsiewacz w kształcie litery L)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-665-231</td><td>Potrzebny tylko do badania sterylności próbek od zakażonych zwierząt</td></tr><tr><td>Noże do sekcji zwłok</td><td>Koncepcje hodowlane</td><td>WI-0009209</td><td></td></tr></tbody></table>

pobieranie i przetwarzanie węzłów chłonnych od dużych zwierząt do analizy rna: przygotowanie do badań transkryptomicznych węzłów chłonnych dużych gatunków zwierząt

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

Duże zwierzęta (zarówno żywe, jak i dzikie) służą jako ważne rezerwuary patogenów odzwierzęcych, w tym Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella i E. coli, i są przydatne do badania patogenezy i/lub rozprzestrzeniania się bakterii w naturalnych gospodarzach. Ze względu na kluczową funkcję węzłów chłonnych w odpowiedzi immunologicznej gospodarza, tkanki węzłów chłonnych służą jako potencjalne źródło RNA do dalszych analiz transkryptomicznych w celu oceny czasowych zmian w ekspresji genów w komórkach w trakcie infekcji. W artykule przedstawiono przegląd procesu pobierania węzłów chłonnych, pobierania próbek tkanek i dalszego przetwarzania RNA u zwierząt gospodarskich na przykładzie bydła (Bos taurus), z dodatkowymi przykładami z bizona amerykańskiego (Bison bison). Protokół zawiera informacje o lokalizacji, identyfikacji i usunięciu węzłów chłonnych z wielu kluczowych miejsc w organizmie. Dodatkowo przedstawiono metodologię pobierania próbek z biopsji, która pozwala na spójność pobierania próbek od wielu zwierząt. Omówiono kilka kwestii związanych z konserwacją próbek, w tym generowanie RNA odpowiedniego dla dalszych metodologii, takich jak sekwencjonowanie RNA i RT-PCR. Ze względu na duże opóźnienia nieodłącznie związane z badaniami przebiegu czasowego dużych zwierząt i myszy, przedstawiono reprezentatywne wyniki z tkanek węzłów chłonnych żubra i bydła w celu opisania przebiegu degradacji w tym typie tkanki, w kontekście przeglądu wcześniejszych prac metodologicznych dotyczących degradacji RNA w innych tkankach. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten będzie przydatny zarówno dla badaczy weterynarii rozpoczynających projekty transkryptomu na dużych próbkach zwierzęcych, jak i dla biologów molekularnych zainteresowanych poznaniem technik pobierania próbek tkanek in vivo i przetwarzania in vitro.

Zastosowanie uwag przedstawionych w niniejszym artykule (kroki 1 - 4 protokołu) pomoże w odzyskaniu z próbek dużych zwierząt RNA nadającego się do dalszych analiz w badaniach ekspresji genów gospodarza. Jakość RNA dla zastosowań w dalszych etapach ocenia się za pomocą wielu standardowych pomiarów. W spektrofotometrii stosunek A260/A280 pozwala ocenić stopień zanieczyszczenia białkami, natomiast stosunek A260/A230 stanowi inny sposób oceny czystości, pozwalający wykryć zanieczys...

Ten protokół zawiera przegląd procedur izolacji RNA do transkryptomicznego profilowania tkanek węzłów chłonnych od dużych zwierząt, w tym etapy identyfikacji i wycinania węzłów chłonnych od zwierząt gospodarskich i dzikich, podejścia do pobierania próbek w celu zapewnienia spójności wśród wielu zwierząt, oraz rozważania oraz reprezentatywne wyniki dotyczące konserwacji i przetwarzania po pobraniu do analizy RNA.

Pobieranie i przetwarzanie węzłów chłonnych od dużych zwierząt do analizy RNA: przygotowanie do badań transkryptomicznych węzłów chłonnych dużych gatunków zwierząt

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...

Cześć, nazywam się dr Robert Schaut i jestem naukowcem w Narodowym Centrum Chorób Zwierząt w Ames w stanie Iowa. W tym filmie JoVE podzielimy się z Wami informacjami na temat pobierania i przetwarzania węzłów chłonnych od dużych zwierząt do wykorzystania w dalszych eksperymentach RNA. Na przykład eksperymenty te mogą obejmować ilościową reakcję PCR na produktach z odwrotną transkrypcją lub badania sekwencjonowania RNA transkryptomów.Węzły chłonne są użytecznymi próbkami do oceny odpowiedzi immunologicznej gospodarza, ale mogą również stanowić źródło RNA patogenu do badań, takich jak w przypadku patogenów wewnątrzkomórkowych obecnych w komórkach odpornościowych wewnątrz węzłów chłonnych. Próbki pobrane od dużych zwierząt, w tym zarówno zwierząt gospodarskich, jak i dzikich zwierząt, są interesujące w badaniach nad chorobami odzwierzęcymi. Tutaj, w Narodowym Centrum Chorób Zwierząt, badamy zakażenia zwierząt gospodarskich gatunkami takimi jak brucella abortus, która powoduje brucelozę u bydła i żubrów, oraz E.Coli O157:H7 wydalana ze śladów jelitowych bydła.Odzyskamy również próbki tkanek od gatunków dzikich zwierząt, takich jak jelenie i łosie. Od zwierząt zakażonych różnymi chorobami można pobrać szereg węzłów chłonnych. Badania tkanek tych naturalnych gatunków gospodarzy są na ogół bardziej istotne dla naturalnego postępu choroby niż modele mysie.Jednak proces pobierania tkanek od dużych gatunków jest z konieczności bardziej skomplikowany niż od myszy, w tym dłuższe opóźnienie między eutanazją a pobraniem tkanek oraz większy rozmiar węzłów chłonnych. W tym miejscu przedstawimy protokół izolacji dużych węzłów chłonnych zwierząt do badania RNA, który będzie pouczający dla biologów molekularnych zaangażowanych w badania transkryptomiczne zakażeń dużych zwierząt, a także dla badaczy weterynaryjnych rozpoczynających badania transkryptomiczne. W tym filmie zademonstrujemy procedury na węzłach chłonnych u bydła.Przed sekcją zwłok zalecamy skompletowanie następujących materiałów przeznaczonych do procedury izolacji tkanek. Probówki do mikrofug wypełnione około 1 ml środka do konserwacji tkanek RNA, takich jak RNAlater, jednorazowe skalpele, kleszcze do czyszczenia i autoklawu, igły do biopsji, pojemnik na ostre przedmioty na zużyte skalpele i igły oraz deska do krojenia lub jednorazowa taca, w zależności od poziomu zakaźności zaangażowanych materiałów. W tym przypadku zademonstrujemy kluczowe elementy zabiegu za pomocą węzłów chłonnych, które zazwyczaj pobieramy od bydła.Są zarażone bakteriami wywołującymi brucelozę. Są to węzły chłonne przedłopatkowe i węzł chłonny przyuszny. Przeprowadzając sekcję zwłok dużych zwierząt w celu odzyskania RNA, dobrze jest, aby co najmniej trzech uczestników pracowało nad tkankami zwierzęcymi.Sekcja pierwsza będzie odpowiedzialna za sekcje różnych części zwierzęcia na dużych zwierzętach, sekcja druga pobierze węzły chłonne z różnych odcinków zwierząt na głównym stole do sekcji zwłok, a sekcja trzecia będzie pracować przy osobnym stole, aby wyizolować skrawki z każdego węzła chłonnego i przenieść je do probówek z roztworem konserwującym. Zaczniemy od identyfikacji i usunięcia węzła chłonnego przedłopatkowego. Idealnie, badanie palpacyjne węzła chłonnego przed sekcją pomoże określić lokalizację węzła chłonnego.Chociaż nie zawsze jest to możliwe do wykrycia, węzeł chłonny przedłopatkowy jest zwykle wyczuwalny palpacyjnie u zdrowego zwierzęcia. Zacznij od umieszczenia zwierzęcia w pozycji bocznej. Wyprostuj ramię, przesuwając przednią kończynę do tyłu na poziomie kolana.Ten ruch cofnie ramię i pozwoli na łatwe badanie palpacyjne węzła chłonnego. Poczuj obecność węzła chłonnego, jak pokazano. Po zlokalizowaniu, przy nadal wyprostowanym ramieniu, użyj skalpela lub noża do sekcji zwłok, aby wykonać nacięcie skóry wzdłuż konturu ramienia.Cofnij skórę, aby odsłonić punkt mięśni ramion i szyi. Czasami obserwuje się fragment podskórnej tkanki tłuszczowej, zwłaszcza u zwierząt nadmiernie kondycjonowanych. Węzeł chłonny przedłopatkowy często znajduje się z odcinkami podskórnej tkanki tłuszczowej.Tutaj możesz zobaczyć trzy warstwy skóry, mięśnie i podskórną tkankę tłuszczową. Po raz kolejny zbadaj palpacyjnie lokalizację węzła chłonnego. W przeciwieństwie do podskórnej tkanki tłuszczowej, węzeł chłonny zachowa swój kształt po wykonaniu badania palpacyjnego.Po zlokalizowaniu węzła chłonnego przedłopatkowego ostrożnie wypreparuj podskórną tkankę tłuszczową i wypreparuj węzeł chłonny. Wygląd tych węzłów chłonnych u żubrów, które wykorzystaliśmy w badaniach nad brucelozą ze względu na podatność żubrów w rejonie Greater Yellowstone na brucelozę, jest podobny. Tutaj pokazujemy wygląd węzła chłonnego przedłopatkowego, wypreparowanego z prawego ramienia bizona amerykańskiego.Następnie przejdziemy do izolacji węzła chłonnego przyusznego. Gdy zwierzę znajduje się w pozycji leżącej bocznej, zlokalizuj staw skroniowo-żuchwowy. Za pomocą skalpela lub noża do sekcji zwłok ostrożnie wykonaj nacięcie na skórze.Zacznij grzbietowo do stawu i rozciągaj się pionowo wzdłuż linii żuchwy. Odetnij skórę, aby odsłonić tkankę podskórną. Ślinianka przyuszna będzie widoczna, przede wszystkim ze względu na jej duży rozmiar, zrazikowany wygląd powierzchni i czerwone zabarwienie.Za pomocą kleszczy i skalpela odsuń śliniankę przyuszną na bok, aby znaleźć węzeł chłonny ślinianki przyusznej znajdujący się tylko czaszkowo i przyśrodkowo do ślinianki. Podczas izolowania węzła chłonnego ślinianki przyusznej bardzo ważne jest oddzielenie tkanki węzła chłonnego od tkanki ślinianki przyusznej. Typy tkanek wyglądają inaczej, w tym w obrębie przekroju tkankowego.Można to zaobserwować tutaj, gdy węzeł chłonny przyuszny znajduje się po lewej stronie, a ślinianka przyuszna po prawej. Pamiętaj, aby dokładnie zbadać tkankę węzła chłonnego ślinianki przyusznej pod kątem tekstury przed dalszym przetwarzaniem. W niektórych przypadkach może być konieczne wycięcie ślinianki przyusznej w celu zlokalizowania węzła chłonnego ślinianki przyusznej.Oto przykład ślinianki przyusznej wyciętej z wołu, w której węzeł chłonny był osadzony w gruczole ślinowym i niewidoczny przed usunięciem gruczołu. Dodatkowe informacje na temat identyfikacji wybranych węzłów chłonnych znajdują się w pracy głównej. Po pobraniu węzłów chłonnych możesz wyciąć skrawki w celu konserwacji.Użyj skalpela lub noża do sekcji zwłok, usuń część węzła chłonnego i wykonaj cięcie strzałkowe, aby otworzyć węzeł chłonny. Zbadaj wnętrze węzła chłonnego, szczególnie w próbkach pochodzących od zakażonych zwierząt, szukając asymetrii, zmian chorobowych, różnic kolorystycznych itp. W tym bydlęcym węźle chłonnym przedłopatkowym wiele cech jest widocznych gołym okiem.Należą do nich pęcherzyki, które są domem dla limfocytów B i głębokie jednostki korowe, które są domem dla limfocytów T. Przyczyny te wydają się ciemniejsze niż zatoki szpikowe, które są jaśniejsze. Tutaj przedstawiono kolejny przykład niezainfekowanego węzła chłonnego.Ten węzeł chłonny pochodzi od młodszego żubra. Zauważ, że mieszki włosowe są mniej wyraźne w tym przykładzie. Aby podzielić tkanki do przetworzenia, jedną z opcji jest pobranie małych fragmentów tkanek z każdego węzła chłonnego za pomocą skalpela w celu późniejszego odzyskania RNA.Jednak jednym z głównych wyzwań związanych z porównywaniem profili ekspresji między próbkami jest duży rozmiar dużych węzłów chłonnych zwierząt w porównaniu z węzłami chłonnymi myszy, które można łatwo wyekstrahować w całości w celu ekstrakcji RNA. W rezultacie małe skrawki tkanek nie będą równomiernie uchwycić profilu komórek w węźle chłonnym. Zamiast tego, aby uchwycić komórki w poprzek profilu węzła chłonnego, wytnij klin w kształcie ciasta z węzła chłonnego, pokrój na małe kawałki nie grubsze niż 5 mm i umieść za pomocą kleszczy w probówkach zawierających RNAlater.Alternatywnie można wykorzystać metodologie biopsji do wycięcia skrawków tkanki z każdego węzła chłonnego. Wybierz narzędzie do biopsji dziurkowania, jeśli chcesz pobrać określone sekcje, takie jak określone pęcherzyki z węzła, a następnie przenieść je za pomocą kleszczy do RNAlater. Po przeniesieniu próbek do RNAlater przenieś je z powrotem do laboratorium i przechowuj w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez noc, aby umożliwić penetrację tkanki.Następnie usuń nadmiar RNApóźniej i przechowuj próbki tkanek w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Zaletą stosowania roztworu konserwującego RNA jest to, że ciekły azot nie jest wymagany podczas sekcji zwłok ani podczas pobierania próbek z pola. Przed uzyskaniem dostępu do próbek, należy wstępnie podtrzymać odczynnik Trizol do probówek w celu homogenizacji.Po wyjęciu próbek z zamrażarki należy je natychmiast przenieść do odczynnika Trizol w celu późniejszego przetworzenia, w oparciu o zalecenia producenta. Tutaj kawałek 50-100 mg tkanki przenosi się do odczynnika Trizol. Należy w miarę możliwości ograniczyć rozmrażanie przed dodaniem Trizolu.Przechowywanie na suchym lodzie może być stosowane, gdy wiele próbek jest wyjmowanych z zamrażarki w celu przetworzenia. Umieścić probówki na homogenizatorze i homogenizować w odczynniku Trizol. W tym przypadku stosuje się dwuminutowe ustawienie ekstrakcji RNA.Po zakończeniu sprawdź, czy nie ma mętnego wyglądu. W razie potrzeby czynność powtórzyć. Postępuj zgodnie z protokołem producenta, aby wygenerować warstwy wodne i organiczne dla każdej próbki.Usunąć górną przezroczystą fazę wodną za pomocą końcówki pipety. Przenieść do nowej probówki do mikrowirówki. Następnie wymieszaj z równą objętością 100% etanolu.Dokładnie wymieszaj. Rurka często wydaje się mętna. Za pomocą końcówki do mikropipet przenieś ciecz do komercyjnej kolumny wirowej na bazie krzemionki w celu dalszego oczyszczenia, a następnie wymycia RNA.Aby ocenić jakość RNA, załaduj jeden lub dwa litry eluowanej próbki RNA do spektrofotometru w celu analizy. Po zakończeniu procedury obserwujemy współczynniki absorbancji wynoszące około dwóch dla stosunku 260-280 i stosunku 260-230, co wskazuje na wysoką czystość przy minimalnym przeniesieniu chemicznym. Zanieczyszczenie fenolem można zaobserwować po spadku współczynnika absorbancji 260-230 nm.Podczas procedury sekcji zwłok w przypadku zwierząt takich jak żubry zaobserwowaliśmy co najmniej 20-minutowy okres czasu między eutanazją a przekazaniem pierwszej próbki tkanki do środka konserwującego. W przeciwieństwie do tego, węzły chłonne myszy mogą zostać usunięte i zachowane po eutanazji w ciągu kilku minut. W związku z tym zależało nam na scharakteryzowaniu profilu degradacji węzłów chłonnych w czasie.W głównym manuskrypcie zebraliśmy również podsumowanie profili stabilności RNA w szeregu innych typów tkanek, które zostały przetestowane w innych publikacjach. W reprezentatywnych eksperymentach, przeprowadzonych na węzłach chłonnych żubra, stabilność RNA była względnie stała w ciągu godziny po eutanazji. Tutaj przedstawiamy żelowy obraz całkowitego RNA oczyszczonego z kawałków tkanki węzła chłonnego nadsutkowego od bizona amerykańskiego.Odkrycie to jest zgodne z wcześniejszymi danymi dla innych typów tkanek opracowanymi na podstawie literatury. Sugeruje to, że próbki o akceptowalnej jakości do dalszej analizy ekspresji genów mogą być pobierane nawet od bardziej wymagających gatunków, takich jak żubry i łosie. Jednak ważne jest, aby zdać sobie sprawę, że dłuższy czas między śmiercią a zachowaniem próbki może powodować zmiany w profilach ekspresji RNA, w tym wzrost degradacji z trzech głównych końców transkryptów mRNA.Dlatego nadal ważne jest, aby wykorzystać szybki, usprawniony przepływ pracy do odzyskiwania tkanek w celu zmniejszenia dalszego opóźnienia, gdy zwierzę jest dostępne do sekcji zwłok, w celu uzyskania najbardziej biologicznie ważnych profili RNA. Ponadto zwracamy uwagę, że podczas całej procedury należy zachować ostrożność, aby uniknąć wprowadzenia zanieczyszczeń RNA do próbek w trakcie całego procesu, poza tymi, które są już obecne w tkankach. Obejmuje to stosowanie rękawic jako części innych wymaganych środków ochrony osobistej.Poddajemy również końcowy produkt RNA do wielu probówek, aby w jak największym stopniu ograniczyć swobodne zatrzymywanie próbek RNA. Na przykład oddzielne podwielokrotności mogą być przechowywane do wykorzystania w testach kontroli jakości. Podsumowując, w tym filmie przedstawiliśmy ważne informacje do wykorzystania w identyfikacji, zbieraniu, reprezentatywnym pobieraniu próbek i przetwarzaniu węzłów chłonnych do dalszej analizy ekspresji genów.Podczas gdy nasz reprezentatywny film został zademonstrowany na przykładach bydła i żubrów, pracowaliśmy również z węzłami chłonnymi innych dużych gatunków, w tym kóz i łosi. Mamy nadzieję, że ten film okaże się przydatny w Twojej pracy, niezależnie od tego, czy jesteś naukowcem weterynarii rozważającym zastosowanie metod transkryptomicznych w swojej pracy, czy biologiem molekularnym zainteresowanym zagłębieniem się w dziedzinę nauk o dużych zwierzętach.

collection-processing-lymph-nodes-from-large-animals-for-rna-analysis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Izolacja komórek zrębu węzłów chłonnych to wieloetapowa procedura obejmująca trawienie enzymatyczne i mechaniczną dezagregację w celu uzyskania fibroblastycznych komórek siatkowatych, limfatycznych i komórek śródbłonka krwi. W opisanej procedurze krótkie trawienie jest połączone z automatyczną dezagregacją mechaniczną w celu zminimalizowania degradacji markerów powierzchniowych żywotnych komórek zrębu węzłów chłonnych.

Izolacja komórek zrębu mysich węzłów chłonnych

Tutaj opisujemy minimalnie inwazyjną technikę laparoskopową do seryjnego pobierania próbek wątroby i krezkowych węzłów chłonnych (MLN) u makaków, która pozwala na zwiększenie częstotliwości pobierania próbek i zmniejsza ryzyko powikłań chirurgicznych w porównaniu do wykonywania laparotomii.

Technika laparoskopowa do seryjnego pobierania węzłów chłonnych wątroby i krezki u makaków

Celem tego artykułu jest przedstawienie krok po kroku procedury pobierania różnych białych tkanek tłuszczowych od myszy, przetwarzania próbek tłuszczu i ekstrakcji RNA.

Pobieranie i przetwarzanie tkanki tłuszczowej myszy do analizy RNA

Tutaj prezentujemy protokół zoptymalizowany do przetwarzania kodujących (mRNA) i niekodujących (ncRNA) bibliotek sekwencyjnych RNA zredukowanych globiną z pojedynczej próbki krwi pełnej.

Identyfikacja klas kodujących i niekodujących RNA wyrażonych we krwi pełnej świń

To jest protokół optymalnego przygotowania tkanek do analiz genomicznych, transkryptomicznych i proteomicznych nietoperzy złapanych na wolności. Obejmuje protokoły chwytania i preparacji nietoperzy, konserwacji tkanek i hodowli komórek tkanek nietoperzy.

Pobieranie tkanek od nietoperzy do analiz -omicznych i pierwotnej hodowli komórkowej

Tutaj opisujemy prostą i tanią metodę, która pozwala na ilościowe określenie komórek nowotworowych adhezji do kriosekcji węzłów chłonnych (LN). Komórki nowotworowe przylegające do LN są łatwo identyfikowane za pomocą mikroskopii świetlnej i potwierdzane metodą opartą na fluorescencji, dając wskaźnik adhezji, który ujawnia powinowactwo wiązania komórek nowotworowych do miąższu LN.

Kwantyfikacja adhezji komórek nowotworowych w kriosekcjach węzłów chłonnych

Ten artykuł opisuje przebieg techniki wykorzystywane do testowania nowych kandydatów na mediatory przerzutów czerniaka i ich mechanizm(y) działania.

Solidna platforma odkrywcza do identyfikacji nowych mediatorów przerzutów czerniaka

Ten protokół opisuje szczegółowe, niskonakładowe przygotowanie próbki do sekwencjonowania pojedynczego jądra, w tym sekcję górnych zwojów szyjnych i gwiaździstych myszy, dysocjację komórek, krioprezerwację, izolację jądra i kodowanie kreskowe hashtagów.

Izolacja i multipleksowanie jądra o niskim poziomie wejściowym z przeciwciałami kodowymi zwojów współczulnych myszy do sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra

Limfocyty T i ILC2 wykazujące ekspresję IL-9 są indukowane podczas infekcji N. brasiliensis, jednak ich charakterystyka została w dużej mierze przeoczona w zakażonym jelicie ze względu na ich niską częstotliwość i różnicową kinetykę. Protokół ten opisuje izolację tych komórek z różnych narządów docelowych i potwierdzenie ich tożsamości za pomocą cytometrii przepływowej na różnych etapach infekcji.

Strategia badania komórek limfoidalnych wytwarzających IL-9 w modelu zakażenia Nippostrongylus brasiliensis

Protokół ten opisuje procedurę przeżycia dla bezpiecznej i dobrze tolerowanej obustronnej limfadenektomii nerki u myszy.

Grzybicza limfadenektomia nerek u myszy

Protokół ten opisuje procedurę przeżycia dla bezpiecznej i dobrze tolerowanej mysiej krezki limfadenektomii na każdym z czterech stacji wzdłuż łańcucha węzłów chłonnych krezki. Procedura ta jest adaptowalna, aby umożliwić selektywne zakłócenie komunikacji limfatycznej z dalszym jelitem grubym, bliższym i/lub jelitem cienkim.

Mysia krezkowa limfadenektomia w celu selektywnego zakłócenia komunikacji limfatycznej z jelitem specyficznym dla regionu

Poznaj metody pobierania i przetwarzania węzłów chłonnych od dużych zwierząt do analizy RNA. Protokół zapewnia spójność próbek i zachowanie integralności RNA dla badań transkryptomicznych.

Pobieranie i przetwarzanie węzłów chłonnych od dużych zwierząt do analizy RNA: przygotowanie do badań transkryptomicznych węzłów chłonnych dużych gatunków zwierząt (Wideo) | JoVE Journal

Pobieranie i przetwarzanie węzłów chłonnych od dużych zwierząt do analizy RNA: przygotowanie do badań transkryptomicznych węzłów chłonnych dużych gatunków zwierząt

Przeglądaj więcej filmów