Osadzanie parafiny i cienkie cięcie biofilmów kolonii drobnoustrojów do analizy mikroskopowej

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie skrawków biofilmu osadzonego w parafinie, które można wykorzystać do oceny rozkładu ekspresji genów zgłaszanej przez produkcję białek fluorescencyjnych w nienaruszonych natywnych morfologiach. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniu społeczności drobnoustrojów, takie jak ekspresja określonych genów w produkcji substancji egzopolimerowych rozmieszczonych w kontekście natywnej architektury biofilmu. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na analizę ekspresji genów w obrębie zachowanej morfologii przekrojów poprzecznych biofilmu, a jednocześnie jest podatna na dalsze zabiegi, takie jak barwienie odrębnych cech i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości, takie jak mikroskopia konfokalna lub elektronowa.

Po przygotowaniu roztworu tryptonu agarowego zgodnie z protokołem tekstowym, za pomocą 50-mililitrowej stożkowej rurki wlej 45 mililitrów roztworu do naczynia o wymiarach 100 milimetrów na 100 milimetrów kwadratowych. Pozostaw agar do zestalenia się na około 20 do 30 minut. Wlej drugą 15-milimetrową warstwę na wierzch pierwszej warstwy, a następnie pozwól jej zastygnąć przez noc i, jeśli to konieczne, użyj niestrzępiącej się chusteczki, aby usunąć kondensację z pokrywek.

Następnie, aby dostrzec biofilmy kolonii, po wyhodowaniu izolowanej pojedynczej kolonii P.Aeruginosa z zamrożonego materiału zgodnie z protokołem tekstowym, pipetuj od 2,5 do 10 mikrolitrów zawiesiny komórkowej na średnią dwuwarstwową płytkę. Kolonie mogą być inkubowane w ciemności w temperaturze 25 stopni Celsjusza przy wilgotności względnej od 80 do 100% przez okres do czterech dni. Delikatnie wlej 15 mililitrów roztworu agaru na podłoże wzrostowe i kolonię i pozwól agarowi uformować żel w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Następnie za pomocą ostrej żyletki wytnij kwadratowy, trójwarstwowy uchwyt z kolonią laminowaną między dwiema górnymi warstwami. W przypadku przygotowywania wielu próbek należy upewnić się, że każdy uchwyt jest przycięty do porównywalnego rozmiaru. Delikatnie usuń nadmiar agaru z kolonii zawierającej karkówkę.

Następnie zwilż płaską główkę szpatułki w PBS lub wodzie i delikatnie włóż ją między górną i dolną warstwę agaru. Natychmiast przenieś laminowaną kolonię do kasety do zatapiania opisanej odpornym na chemikalia pisakiem do znakowania. Umieść kasetę do zatapiania w szklanej paczce ze szkiełkami zawierającymi wcześniej przygotowany utrwalacz.

Przetwórz próbki. Użyj 1X PBS, aby umyć je dwa razy po jednej godzinie. Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy zautomatyzować homogenizację odczynników za pomocą niskiego ustawienia funkcji wirowania automatycznego procesora tkanek.

Aby osadzić próbki, napełnij formę woskową stopionym woskiem parafinowym podgrzanym do 55 stopni Celsjusza, a następnie użyj podgrzanej płaskiej szpatułki, aby szybko przenieść infiltrowany uchwyt z kasety do zatapiania do formy woskowej, upewniając się, że uchwyt spoczywa równolegle do podstawy formy. Pozostaw wosk do zestalenia się przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Próbki uformowane w stałym wosku mogą być przechowywane w tej temperaturze przez czas nieokreślony.

Gdy wosk zastygnie, wytnij próbkę z formy i użyj żyletki, aby przyciąć nadmiar wosku z okolic próbki. Pozostaw trochę wosku wystającego z jednego końca próbki, który można użyć do zaciśnięcia go w mikrotomie. Ważne jest, aby przyciąć próbkę zatopioną w wosku w taki sposób, aby jej kształt ułatwiał zbieranie gładkich liniowych wstęg.

Drobne niedoskonałości w przycinaniu mogą powodować powstawanie artefaktów na wstążce i naruszać integralność sekcji. Następnie podgrzej łaźnię wodną do 42 stopni Celsjusza. Następnie zacisnąć próbkę w mikrotomie tak, aby powierzchnia kolonii była ustawiona prostopadle do krawędzi ostrza.

Przycinać próbkę w odstępach 50 mikrometrów, aż do osiągnięcia pożądanej płaszczyzny kolonii, z której zostaną pobrane skrawki, za pomocą mikrotomu ustawionego na prędkość cięcia od 75 do 80 obr./min i kąt odstępu od sześciu do 10 stopni. Wytnij wstęgę o żądanej liczbie odcinków o grubości 10 mikrometrów. Następnie użyj pędzla z cienką końcówką, aby odłączyć wstążkę od ostrza.

Teraz za pomocą kleszczy lub kropli wody na końcówce pipety Pasteura delikatnie przenieś wstążkę do łaźni wodnej. Natychmiast włóż szkiełko do łaźni wodnej i umieść je pod wstążką pod kątem 45 stopni. Dotknij wąskiej krawędzi wstążki slajdem tuż pod matową etykietą.

Wstążka powinna przylegać. Wyciągnij zjeżdżalnię z łaźni wodnej i wyreguluj kąt tak, aby była prostopadła do powierzchni wody, tak aby wstążka leżała płasko na zjeżdżalni na całej jej długości. Unikaj zatrzymywania nadmiaru wody pod wstążką.

Delikatnie postaw szkiełko na chłonnej, niestrzępiącej się chusteczce, odprowadzając nadmiar wody z sekcji. Następnie połóż szkiełko na ręczniku papierowym i pozostaw do wyschnięcia w ciemności w temperaturze pokojowej przez noc. Podgrzej wypoziomowaną płytę grzejną do 45 stopni Celsjusza i umieść szkiełko na talerzu na 30 do 60 minut.

Wosk stanie się na wpół stopiony i spłaszczy się na szkiełku. Delikatnie zdejmij szkiełko z płyty grzejnej i połóż je płasko na gładkiej, równej powierzchni o temperaturze pokojowej na około minutę, aż wosk stwardnieje. Upewnij się, że stopiony wosk nie ciągnie się po żadnej stronie szkiełka.

Umieszczając próbki w szklanym szkiełku pocztowym, odwoskować szkiełka w czterech płukaniach środka czyszczącego przez pięć minut każde. Użyj aspiratora Buchnera, aby usunąć roztwór między praniami. Użyj 100% etanolu do umycia szkiełek trzy razy po jednej minucie każda.

Następnie, po ponownym nawodnieniu szkiełek zgodnie z protokołem tekstowym, należy natychmiast zamontować sekcje w trójbuforowym podłożu montażowym i nałożyć szkiełko nakrywkowe. Agar nakładkowy wokół sekcji nie reaguje z utrwalaczem, więc nie przylega do szkiełka boćwinowego. Agar ten może się przemieścić podczas nawadniania i uszkodzić sekcję, dlatego należy uważać, aby nie wstrząsnąć roztworem podczas ponownego nawadniania.

Pozostawić medium montażowe do polimeryzacji w temperaturze pokojowej przez noc. Po polimeryzacji użyj przezroczystego lakieru do paznokci, aby uszczelnić szkiełko nakrywkowe do szkiełka. Na koniec przechowuj uszczelnione szkiełka na czas nieokreślony w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Podczas gdy obrazowanie DIC przy użyciu obiektywu z 40-krotnym zanurzeniem w oleju może być wystarczające do pokazania niektórych cech morfologicznych cienkich odcinków biofilmu, mikroskopia fluorescencyjna szczepów zaprojektowanych w celu konstytutywnej ekspresji białek fluorescencyjnych zapewnia lepszą wizualizację rozmieszczenia komórkowego w próbkach. Jak pokazano na tych panelach, obrazy poszczególnych sekcji mogą być łączone ze sobą, aby wygenerować przekrój całej kolonii i zapewniają kontekst dla lokalizacji cech strukturalnych w ogólnej morfologii na poziomie makroskopowym. Wykorzystanie szczepu zmodyfikowanego do ekspresji białka fluorescencyjnego pod kontrolą określonego promotora umożliwia wizualizację rozkładu ekspresji genów.

Ponadto kolonie mogą być hodowane na pożywce zawierającej barwniki lub barwniki mogą być dodawane po przekroju do specyficznych polisacharydów barwienia. Wreszcie, próbki można również przygotować i zobrazować w wyższej rozdzielczości za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej, jak pokazano tutaj. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o zmienności próbek i możliwości wprowadzenia artefaktów fluorescencyjnych i strukturalnych poprzez utrwalanie, cięcie lub rehydratację, co może wpłynąć na interpretację danych.

Procedura ta pozwala na ilościową analizę obrazu, taką jak korelacja profili ekspresji reporterów fluorescencyjnych z cechami morfologicznymi i osią Z biofilmu. Protokół ten można zastosować do różnych gatunków drobnoustrojów tworzących biofilm o znaczeniu medycznym i przemysłowym, takich jak Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae i Bacillus subtilis. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak hodować i przygotowywać biofilmy kolonii do cięcia poprzez zatapianie parafiny.