Name: Osadzanie parafiny i cienkie cięcie biofilmów kolonii drobnoustrojów do analizy mikroskopowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Naucz się osadzania parafinowego i cienkiego cięcia biofilmów kolonii drobnoustrojów do analizy mikroskopowej. Ta metoda umożliwia wizualizację ekspresji genów w zachowanej morfologii biofilmu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez NSF CAREER AWARD 1553023 oraz nagrodę NIH/NIAID R01AI103369.

1. Wzrost biofilmów kolonii Pseudomonas aeruginosa
<ol>
	<li>Przygotowanie płyt średnio-dwuwarstwowych
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór 10 g/l tryptonu i 10 g/l agaru (patrz tabela materiałów) w wodzie dejonizowanej.</li>
		<li>Autoklaw przez 20 min. Schłodzić do 50-60 °C w łaźni wodnej.</li>
		<li>Wlać 45 ml roztworu agaru i tryptonu do kwadratowego naczynia o wymiarach 100 mm x 100 mm (patrz tabela materiałów) za pomocą stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Pozwól agarowi zastygnąć (~20-30 min). Wlej drugą, 15-mililitrową warstwę na wierzch pierwszej warstwy. Pozostaw do zestalenia się na noc, w razie potrzeby usuwając kondensację z pokrywek, wycierając niestrzępiącą się chusteczką.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykrywanie biofilmów kolonii
	<ol>
		<li>Szczepy z zamrażarek należy rozprowadzić na płytkach agarowych LB13 i inkubować w ciemności przez 12-16 godzin w temperaturze 37 °C i wilgotności względnej 80-100%.</li>
		<li>Dla każdego szczepu lub kontrpróby użyć pojedynczej kolonii do zaszczepienia 2 ml LB i inkubować w ciemności przez 12-16 godzin w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 250 obr./min.</li>
		<li>Subkultura przez rozcieńczenie w stosunku 1:100 do świeżego LB i inkubację w ciemności przez 2,5–3 godziny w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 250 obr./min.</li>
		<li>Zmierz gęstość optyczną za pomocą spektrofotometru i wyreguluj sterylnym LB, aby uzyskać zawiesinę komórek o średnicy zewnętrznej500 nm ~0,5.</li>
		<li>W zależności od pożądanej wielkości kolonii, odpipetuj 2,5-10 μl zawiesiny komórek na średniowarstwową płytkę (przygotowaną w kroku 1.1) i pozostaw miejsce do wyschnięcia na ~20 min. Pozostawienie uchylonej pokrywki Petriego w pobliżu otwartego ognia może ułatwić suszenie.</li>
		<li>Inkubuj kolonie punktowe w temperaturze 25 °C i wilgotności względnej 80-100%, w ciemności przez okres do 4 dni.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworu utrwalającego
<ol>
	<li>Roztwór utrwalający należy przygotować w dniu pobrania próbki. Rozcieńczyć 37% formaldehydu (FA) w 1x PBS do końcowego stężenia 4% FA. 
	UWAGA: FA jest lotny i toksyczny. Nosić sprzęt ochronny i pracować w dobrze wentylowanym dygestorium.</li>
	<li>Bezpośrednio przed użyciem rozpuścić chlorowodorek L-lizyny w 4% FA (przygotowanym w kroku 2.1) w temperaturze pokojowej do końcowego stężenia 50 mM HCl L-lizyny.</li>
</ol>
3. Bezpośrednie zastosowanie utrwalacza do biofilmu kolonii [opcjonalnie]
UWAGA: Odkryliśmy, że morfologia biofilmu jest najlepiej zachowana, gdy nakładka agarowa jest dodawana przed utrwaleniem. Jednak ten krok stanowi również zmianę warunków środowiskowych, która może wpływać na ekspresję genów. Wzorce ekspresji fluorescencyjnego reportera powinny być zatem weryfikowane przy użyciu oddzielnego protokołu, w którym etap utrwalania przeprowadza się przed dodaniem nakładki agarowej, jak opisano tutaj.
<ol>
	<li>W dniu utrwalenia, pracując w dobrze wentylowanym dygestorium, pipetować utrwalacz przygotowany w kroku 2 bezpośrednio do powierzchni agaru wokół krawędzi kolonii, umożliwiając mu dotarcie do obrzeży kolonii bez jej zanurzania. Zastosuj tylko tyle utrwalacza, ile jest potrzebne do pełnego otoczenia kolonii, około 500 μl. Pozwól utrwalaczowi dyfundować do kolonii i otaczającego agaru.</li>
	<li>Gdy utrwalacz zostanie w pełni wchłonięty przez kolonię i otaczające pożywki, około 20-30 minut, a resztki FA nie są już widoczne na płytce, powtórz krok 3.1. Pozwól temu utrwalaczowi dyfundować do kolonii i otaczającego agaru.</li>
	<li>Gdy utrwalacz zostanie w pełni wchłonięty przez kolonię i otaczające podłoże, powtórz krok 3.1, tym razem nakładając utrwalacz bezpośrednio na powierzchnię kolonii. Pozwól temu utrwalaczowi dyfundować do kolonii i otaczającego agaru, przechodząc do kroku 4 dopiero po wchłonięciu całego utrwalacza i przestanie być widoczny na płytce.</li>
</ol>
4. Nakładanie kolonii agarem
<ol>
	<li>W dniu utrwalenia przygotować 10 g/l roztworu agaru w wodzie dejonizowanej i sterylizować w autoklawie przez 10-20 minut do rozpuszczenia. Schłodzić w łaźni wodnej do temperatury 50 °C.</li>
	<li>Delikatnie wlej 15 ml roztworu agaru na pożywkę wzrostową i kolonię. Pozwól agarowi uformować żel w temperaturze pokojowej przez 5 minut (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
	<li>Użyj ostrej żyletki, aby wyciąć kwadratowy, 3-warstwowy uchwyt z kolonią laminowaną między dwiema górnymi warstwami. W przypadku przygotowywania wielu próbek należy upewnić się, że każdy uchwyt jest przycięty do porównywalnego rozmiaru.</li>
	<li>Delikatnie usuń nadmiar agaru z karkówki zawierającej kolonię.</li>
	<li>Aby podnieść dwie górne warstwy agaru (zawierające kolonię) z dolnej warstwy uchwytu (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C), zwilż płaską główkę szpatułki w 1x PBS lub wodzie i delikatnie włóż między górną i dolną warstwę. Laminowana kolonia powinna oddzielić się od dolnej warstwy. Uważaj, aby nie zniekształcić ani nie zgiąć laminowanej kolonii podczas podnoszenia jej z podstawy.</li>
</ol>
5. Fiksacja
<ol>
	<li>Pracując w dobrze wentylowanym dygestorio, natychmiast przenieś laminowaną kolonię (tj. 2-warstwowy uchwyt) do kasety do zatapiania (patrz Tabela materiałów), oznaczonej odpornym na chemikalia pisakiem do znakowania. Umieścić kasetę do zatapiania w szklanej paczce na szkiełka (patrz tabela materiałów) zawierającej utrwalacz przygotowany w krokach 2.1-2.2. Upewnij się, że w kasecie do osadzania nie ma pęcherzyków powietrza uwięzionych.</li>
	<li>Próbkę inkubować w utrwalaczu przez noc w ciemności w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
6. Przetwarzanie próbek: Mycie bufora, odwadnianie, oczyszczanie i infiltracja
<ol>
	<li>Po utrwaleniu przez noc przemyć próbkę dwukrotnie w 1x PBS przez 1 godzinę każdy. Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy zautomatyzować homogenizację odczynników za pomocą funkcji wirowania automatycznego procesora tkanek (patrz tabela materiałów) ustawionej na niskie ustawienie. Jeśli żaden procesor nie jest dostępny, przetwarzanie można uruchomić ręcznie.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z płukaniem buforem przez odwodnienie przez stopniowaną serię rozcieńczeń etanolu (EtOH) w 1x PBS (25%, 50%, 70%, 95%) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odwodnić w trzech praniach 100% EtOH przez 1 godzinę każde w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odwodnioną próbkę należy oczyścić w trzech przemycikach środkiem czyszczącym na bazie 100% oleju pomarańczowego (patrz tabela materiałów) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Oczyszczoną próbkę należy dwukrotnie naciekać stopionym woskiem parafinowym (patrz tabela materiałów), podgrzewanym do temperatury 55°C przez 2 godziny każdy.</li>
</ol>
7. Osadzanie próbki
<ol>
	<li>Napełnij formę woskową stopionym woskiem parafinowym podgrzanym do 55 °C. Za pomocą podgrzanej, płaskiej szpatułki szybko przenieś infiltrowany uchwyt z kasety do zatapiania do formy woskowej, upewniając się, że uchwyt spoczywa równolegle do podstawy formy. Unikaj wywierania nadmiernego nacisku na uchwyt. Formy woskowe mogą być drukowane na zamówienie w 3D lub są dostępne na rynku (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Pozostawić wosk do zestalenia się przez noc w temperaturze 4 °C. Próbki uformowane w stałym wosku mogą być przechowywane przez czas nieokreślony w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Gdy wosk zastygnie, wyciąć próbkę z formy i odciąć nadmiar wosku z okolic próbki za pomocą żyletki. Pozostawić nadmiar wosku rozciągający się od jednego końca próbki, równolegle do płaszczyzny przekroju, który może być użyty do zaciśnięcia go w mikrotomie (patrz tabela materiałów). Pozostaw również osłonkę wosku o grubości około 1 mm wokół próbki i wygładź jej powierzchnie.</li>
</ol>
8. Podział na sekcje
<ol>
	<li>Podgrzać łaźnię wodną do temperatury 42 °C. Zawiesić próbkę w mikrotomie tak, aby powierzchnia kolonii była ustawiona prostopadle do krawędzi ostrza (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Przycinaj próbkę w odstępach 50 μm, aż do osiągnięcia pożądanej płaszczyzny kolonii, z której zostaną pobrane skrawki.</li>
	<li>Przeciąć wstęgę o żądanej liczbie odcinków o grubości 10 μm za pomocą mikrotomu ustawionego na prędkość cięcia 75-80 obr./min i kąt przyłożenia 6-10°. Użyj pędzla z cienką końcówką, aby odłączyć wstążkę od ostrza.</li>
	<li>Używając kropli wody na końcówce pipety Pasteura (preferowanej) lub kleszczy, delikatnie przenieś wstążkę do łaźni wodnej. Uważaj, aby nie uwięzić pęcherzyków powietrza pod sekcją.</li>
	<li>Natychmiast włóż szkiełko do łaźni wodnej i umieść je pod wstążką pod kątem 45°.</li>
	<li>Przyłóż wąską krawędź wstążki do slajdu, tuż pod matową etykietą. Wstążka powinna przylegać.</li>
	<li>Wyciągnij zjeżdżalnię z łaźni wodnej, regulując kąt tak, aby stał się prostopadły do powierzchni wody i pozwalając, aby wstążka leżała płasko na zjeżdżalni na całej jej długości. Unikaj zatrzymywania nadmiaru wody pod wstążką.</li>
	<li>Delikatnie postaw szkiełko na chłonnej, niestrzępiącej się chusteczce, odprowadzając nadmiar wody z sekcji.</li>
	<li>Połóż szkiełko na ręczniku papierowym i pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez noc w ciemności. Szkiełka można przechowywać w nieskończoność w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
</ol>
9. Utrwalanie termiczne, nawadnianie i montaż
<ol>
	<li>Podgrzej wypoziomowaną płytę grzejną do 45 °C. Podgrzewaj szkiełko przez 30-60 min. Wosk stanie się na wpół stopiony i spłaszczy się na szkiełku.</li>
	<li>Delikatnie zdejmij szkiełko z płyty grzejnej i połóż je płasko na gładkiej, wyrównanej powierzchni o temperaturze pokojowej, uważając, aby stopiony wosk nie ciągnął się po żadnej stronie szkiełka, aż wosk zastygnie (~1 min).</li>
	<li>Za pomocą szklanej koperty do szkiełek odwoskować szkiełka w czterech płukaniach środka czyszczącego przez 5 minut każde, używając aspiratora Büchnera do usunięcia roztworu między praniami.</li>
	<li>Umyj szkiełka trzy razy w 100% EtOH przez 1 minutę każde.</li>
	<li>Ponownie uwodnić szkiełka w stopniowanej serii etanolu w odwrotnej kolejności przetwarzania (95%, 70%, 50% i 25%) przez 1 minutę każde, a następnie dwa 1-minutowe płukania w 1x PBS.</li>
	<li>Natychmiast zamontuj sekcje w podłożu montażowym buforowanym Tris (patrz Tabela materiałów) i nałóż szkiełko nakrywkowe, unikając wprowadzania pęcherzyków powietrza. Pozostawić podłoże montażowe do polimeryzacji przez noc w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po polimeryzacji uszczelnij szkiełko nakrywkowe do szkiełka za pomocą przezroczystego lakieru do paznokci. Zamknięte szkiełka mogą być przechowywane przez czas nieokreślony w ciemności w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>

<ol><li>Ray, V. A., Morris, A. R., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+semi-quantitative+approach+to+assess+biofilm+formation+using+wrinkled+colony+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A semi-quantitative approach to assess biofilm formation using wrinkled colony development.</a> J. Vis. Exp. (64), e4035(2012).</li>
<li>Friedman, L., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+involved+in+matrix+formation+in+Pseudomonas+aeruginosa+PA14+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms.</a> Mol. Microbiol. 51 (3), 675-690 (2004).</li>
<li>Okegbe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron-shuttling+antibiotics+structure+bacterial+communities+by+modulating+cellular+levels+of+c-di-GMP%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Electron-shuttling antibiotics structure bacterial communities by modulating cellular levels of c-di-GMP.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 114 (26), E5236-E5245 (2017).</li>
<li>Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell+fate+by+the+formation+of+an+architecturally+complex+bacterial+community%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community.</a> Genes Dev. 22 (7), 945-953 (2008).</li>
<li>Serra, D. O., Richter, A. M., Klauck, G., Mika, F., Hengge, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microanatomy+at+cellular+resolution+and+spatial+order+of+physiological+differentiation+in+a+bacterial+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Microanatomy at cellular resolution and spatial order of physiological differentiation in a bacterial biofilm.</a> MBio. 4 (2), e00103-e00113 (2013).</li>
<li>Serra, D. O., Richter, A. M., Hengge, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulose+as+an+architectural+element+in+spatially+structured+Escherichia+coli+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Cellulose as an architectural element in spatially structured Escherichia coli biofilms.</a> J. Bacteriol. 195 (24), 5540-5554 (2013).</li>
<li>McGlinn, E., Mansfield, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+gene+expression+in+mouse+embryos+and+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of gene expression in mouse embryos and tissue sections.</a> Methods Mol. Biol. 770, 259-292 (2011).</li>
<li>Choi, Y. S., Kim, Y. C., Baek, K. J., Choi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+Detection+of+Bacteria+within+Paraffin-embedded+Tissues+Using+a+Digoxin-labeled+DNA+Probe+Targeting+16S+rRNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA.</a> J. Vis. Exp. (99), e52836(2015).</li>
<li>James, G., Hunt, A. M. A. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-642-53833-9_3">Imaging Biofilms in Tissue Specimens.</a> Antibiofilm Agents. , 31-44 (2014).</li>
<li>Madsen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facultative+control+of+matrix+production+optimizes+competitive+fitness+in+Pseudomonas+aeruginosa+PA14+biofilm+models%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Facultative control of matrix production optimizes competitive fitness in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilm models.</a> Appl. Environ. Microbiol. 81 (24), 8414-8426 (2015).</li>
<li>Jo, J., Cortez, K. L., Cornell, W. -C., Price-Whelan, A., Dietrich, L. E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orphan+cbb3-type+cytochrome+oxidase+subunit+supports+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+growth+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">An orphan cbb3-type cytochrome oxidase subunit supports Pseudomonas aeruginosa biofilm growth and virulence.</a> bioRxiv. , 171538(2017).</li>
<li>Fong, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+dynamics+of+RbmA+governs+plasticity+of+Vibrio+cholerae+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Structural dynamics of RbmA governs plasticity of Vibrio cholerae biofilms.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysogeny+at+mid-twentieth+century%3A+P1%2C+P2%2C+and+other+experimental+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Lysogeny at mid-twentieth century: P1, P2, and other experimental systems.</a> J. Bacteriol. 186 (3), 595-600 (2004).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Dietrich, L. E. P., Teal, T. K., Price-Whelan, A., Newman, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox-active+antibiotics+control+gene+expression+and+community+behavior+in+divergent+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Redox-active antibiotics control gene expression and community behavior in divergent bacteria.</a> Science. 321 (5893), 1203-1206 (2008).</li>
<li>Zupančič, D., Terčelj, M., Štrus, B., Veranič, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+obtain+good+morphology+and+antigen+detection+in+the+same+tissue+section%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">How to obtain good morphology and antigen detection in the same tissue section?</a> Protoplasma. , (2017).</li>
<li>Priester, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+visualization+of+microbial+biofilms+by+staining+and+environmental+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Enhanced visualization of microbial biofilms by staining and environmental scanning electron microscopy.</a> J. Microbiol. Methods. 68 (3), 577-587 (2007).</li>
<li>Boyles, J., Anderson, L., Hutcherson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+fixative+for+the+preservation+of+actin+filaments%3A+fixation+of+pure+actin+filament+pellets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">A new fixative for the preservation of actin filaments: fixation of pure actin filament pellets.</a> J. Histochem. Cytochem. 33 (11), 1116-1128 (1985).</li>
<li>Blackburn, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+normal+and+abnormal+placentation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Examination of normal and abnormal placentation in the mouse.</a> Methods Mol. Biol. 136, 185-193 (2000).</li>
<li>Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde+crosslinking%3A+a+tool+for+the+study+of+chromatin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes.</a> J. Biol. Chem. 290 (44), 26404-26411 (2015).</li>
<li>Jennings, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pel+is+a+cationic+exopolysaccharide+that+cross-links+extracellular+DNA+in+the+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Pel is a cationic exopolysaccharide that cross-links extracellular DNA in the Pseudomonas aeruginosa biofilm matrix.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (36), 11353-11358 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Próbki tkanek zatapiające w parafinie i cienkowarstwowe są klasyczną techniką histologiczną, która umożliwia obrazowanie struktur mikromorfologicznych i jest powszechnie stosowana w tkankach eukariotycznych i została zastosowana z pewnym powodzeniem do próbek drobnoustrojów 8,9. Podczas gdy zatapianie w parafinie pozwala na silne zatrzymanie endogennego i immunofluorescencyjnego sygnału, osadzanie parafiny jest ogólnie preferowane, ponieważ zapewnia lepsze zachow...

Większość mikrobów ma zdolność do tworzenia biofilmów, społeczności komórek utrzymywanych razem przez samodzielnie wyprodukowane matryce. Biofilmy mogą być uprawiane w wielu typach konfiguracji fizycznych, z różnymi reżimami dostarczania składników odżywczych i substratów. Specyficzne testy tworzenia biofilmu mają tendencję do uzyskiwania powtarzalnych struktur wielokomórkowych, a wspólne architektury obserwuje się dla gatunków zróżnicowanych filogenetycznie na poziomie społeczności lub makroskopowym. Gdy mikroorganizmy są hodowane jako kolonie na stałym podłożu pod atmosferą, morfologia makroskopowa przekazuje informacje o zdolności do produkcji matrycy i często koreluje z innymi cechami 1,2,3. Wewnętrzna architektura kolonii drobnoustrojów może również dostarczyć wskazówek dotyczących chemii i fizjologii specyficznej dla biofilmu, ale była trudna do scharakteryzowania. Niedawne zastosowania technik krioempensji i kriosekcji kolonii bakteryjnych umożliwiły obrazowanie i wizualizację określonych cech w niespotykanej dotąd rozdzielczości 4,5,6. Jednak badania na tkankach zwierzęcych wykazały, że osadzanie parafiny zapewnia lepsze zachowanie morfologii w porównaniu z krioemtopowaniem 7 i zostało wykorzystane do wizualizacji bakterii w tkankach 8,9. W związku z tym opracowaliśmy protokół utrwalania, zatapiania parafiny i cienkiego cięcia biofilmów kolonii drobnoustrojów. W tym miejscu opiszemy przygotowanie cienkich odcinków biofilmu kolonii Pseudomonas aeruginosa PA14 10,11, ale z powodzeniem zastosowaliśmy tę technikę również do biofilmów tworzonych przez bakterie Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilis i Vibrio cholerae12.
Proces zatapiania parafiny i cienkiego cięcia biofilmów przebiega zgodnie z prostą logiką. Po pierwsze, biofilmy są otoczone warstwą agaru w celu zachowania morfologii podczas przetwarzania. Po drugie, otoczone biofilmy są zanurzane w utrwalaczu w celu usieciowania makrocząsteczek i zachowania mikromorfologii. Są one następnie odwadniane alkoholem, oczyszczane bardziej niepolarnym rozpuszczalnikiem, a następnie infiltrowane płynnym woskiem parafinowym. Po infiltracji próbki są umieszczane w blokach woskowych w celu podziału. Sekcje są cięte, montowane na szkiełkach, a następnie ponownie nawilżane, aby przywrócić je do bardziej natywnego stanu. Od tego momentu można je wybarwić lub pokryć podłożem montażowym do analizy mikroskopowej.
Ten protokół wytwarza cienkie odcinki biofilmów mikrobiologicznych nadające się do analizy histologicznej. Podstruktury biofilmu kolonii są widoczne, gdy cienkie skrawki przygotowane tą metodą są obrazowane za pomocą mikroskopii świetlnej. Biofilmy mogą być również hodowane na podłożach zawierających barwniki fluorescencyjne specyficzne dla poszczególnych cech lub barwione na etapie ponownego uwodnienia, bezpośrednio przed montażem (kroki 9.5-9.6). Wreszcie, mikroorganizmy mogą być modyfikowane tak, aby wytwarzały białka fluorescencyjne w sposób konstytutywny lub regulowany, umożliwiając raportowanie in situ dystrybucji komórek lub ekspresji genów w tych społecznościach. Użyliśmy tych metod do określenia głębokości biofilmu kolonii, rozmieszczenia komórek, rozmieszczenia macierzy, wzorców wzrostu i czasoprzestrzennej ekspresji genów.

<table><tbody><tr><td>Pipeta Pasteura 5 3/4"</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-6A Zakupiona</td><td>w uniwersyteckich sklepach biologicznych&nbsp;</td></tr><tr><td>Agar&nbsp;</td><td>Teknova&nbsp;</td><td>A7777</td><td></td></tr><tr><td>Kolba aspiratora Buchnera (próżniowego)&nbsp;</td><td>Pyrex</td><td>5340</td><td>Zakupiony w uniwersyteckich biosklepach&nbsp;</td></tr><tr><td>Chemicznie odporny pisak do znakowania</td><td>VWR</td><td>103051-182</td><td>Producent: Lakier do paznokci Leica</td></tr><tr><td>Clear&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Kupiony w sklepie</td></tr><tr><td>Congo Red Indicator Grade</td><td>VWR</td><td>AAAB24310-14</td><td>Producent: Alfa Aesar</td></tr><tr><td>Coomassie Blue&nbsp;</td><td>VWR</td><td>EM-3340</td><td>Producent: EMD Millipore</td></tr><tr><td>TRIS-buffered Mounting Medium (z DAPI)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>50 247 04</td><td>Producent: Mikroskopia elektronowa Nauki</td></tr><tr><td>Osadzanie formy&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Drukowana w 3D</td></tr><tr><td>wewnętrzna forma do osadzania (komercyjna)&nbsp;</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>70182</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 200P</td><td>Decon Labs, Inc.&nbsp;</td><td>2701</td><td>Zakupiony w biosklepach uniwersyteckich&nbsp;</td></tr><tr><td>Szczotka z cienką końcówką kupiona</td><td></td><td></td><td>w Sklepie, pędzel</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe do szkła 60x22mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-519-21C</td><td></td></tr><tr><td>Szklana koperta do nawilżania&nbsp;</td><td>Ted Pella</td><td>21043</td><td>20 slajdów&nbsp;</td></tr><tr><td>Histoclear-II, środek czyszczący na bazie olejku pomarańczowego&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>50 899 90150</td><td>Producent: National Diagnostics&nbsp;</td></tr><tr><td>Histosette, Kaseta do zatapiania</td><td>Fisher Scientific</td><td>15 182 701A</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek L-lizyny&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP386 100</td><td></td></tr><tr><td>Niskoprofilowe ostrza mikrotomu</td><td>Fisher Scientific</td><td>22 210 048</td><td>Producent: Turcja&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikropipeta&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89080-004</td><td>Zestaw promocyjny</td></tr><tr><td>końcówek do mikropipet&nbsp;</td><td>Zobacz sekcję komentarzy</td><td>Zobacz sekcję komentarzy</td><td>p10 (Fisher Scientific, 02 707 469), p200 (VWR, 89079-474), p1250 (VWR, 89079-486)</td></tr><tr><td>Mikrotom&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>905200U/00016050</td><td>Model: HM355S, Producent: Microm, NON-CATALOG, Vendor Catalog # 905200U/00016050</td></tr><tr><td>Formaldehyd, 37% Wodny (formalina)</td><td>Ricca Chemical</td><td>RSOF0010-500A</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast Xtra (wosk parafinowy)</td><td>VWR</td><td>15159-486</td><td>Producent: McCormick Scientific&nbsp;</td></tr><tr><td>Szalki Petriego kwadratowe 100x100x15mm</td><td>Laboratoryjne produkty jednorazowego użytku&nbsp;</td><td>D210-16</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu&nbsp;</td><td>Chemikalia EMD&nbsp;</td><td>PX1405-1</td><td>Składnik soli fizjologicznej buforowanej fosforanami, przygotowany we własnym zakresie&nbsp;</td></tr><tr><td>Fosforan potasu&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P380-500</td><td>Składnik soli fizjologicznej buforowanej fosforanami, przygotowany we własnym zakresie&nbsp;</td></tr><tr><td>Żyletki&nbsp;</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>Zakupiony w uniwersyteckich sklepach biologicznych&nbsp;</td></tr><tr><td>Podgrzewacz do slajdów&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0865259</td><td>NON-CATALOG, Katalog dostawcy # 12857D</td></tr><tr><td>Chlorek sodu&nbsp;</td><td>VWR</td><td>0241-1KG</td><td>Składnik soli fizjologicznej buforowanej fosforanami, przygotowany we własnym zakresie&nbsp;</td></tr><tr><td>Fosforan sodu&nbsp;</td><td>VWR</td><td>BDH9296.500,Składnik</td> <td>soli fizjologicznej buforowanej fosforanami, przygotowany we własnym zakresie&nbsp;</td></tr><tr><td>Szkiełka histologiczne Suprafrost&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna do flotacji tkanek&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0815797</td><td>Producent: Ted Pella, Katalog dostawców # 28156-B</td></tr><tr><td>Automatyczny procesor tkanek&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>813160U/Q#00009061</td><td>Model: STP120 Procesor tkanek</td></tr><tr><td>Trypton&nbsp;</td><td>Teknova&nbsp;</td><td>T9012</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Teknova&nbsp;</td><td>Y9010</td><td></td></tr></tbody></table> powiedział:

osadzanie parafiny i cienkie cięcie biofilmów kolonii drobnoustrojów do analizy mikroskopowej

Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis

Cięcie poprzez zatapianie parafiny jest szeroko rozpowszechnioną techniką w systemach eukariotycznych. W tym miejscu przedstawiamy metodę utrwalania, osadzania i cięcia nienaruszonych biofilmów kolonii drobnoustrojów za pomocą perfundowanego wosku parafinowego. Aby dostosować tę metodę do stosowania na biofilmach kolonijnych, opracowaliśmy techniki utrzymywania każdej próbki na podłożu wzrostowym i laminowania jej warstwą agaru, a także dodaliśmy lizynę do roztworu utrwalającego. Optymalizacje te poprawiają retencję próbek i zachowanie cech mikromorfologicznych. Tak przygotowane próbki są podatne na cienkie przekroje i obrazowanie za pomocą mikroskopii świetlnej, fluorescencyjnej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Zastosowaliśmy tę technikę do biofilmów kolonii Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilis i Vibrio cholerae. Wysoki poziom szczegółowości widoczny w próbkach generowanych tą metodą, w połączeniu z inżynierią szczepów reporterowych lub zastosowaniem określonych barwników, może dostarczyć ekscytujących informacji na temat fizjologii i rozwoju społeczności drobnoustrojów.

Metoda ta pozwala na przygotowanie cienkich przekrojów biofilmu, w których poszczególne cechy morfologiczne i strefy ekspresji genów można obrazować za pomocą DIC, mikroskopii fluorescencyjnej oraz TEM. Choć obrazowanie DIC z użyciem obiektywu imersyjnego 40X może być wystarczające do ukazania niektórych cech morfologicznych (Rysunek 2E), stwierdzono, że mikroskopia fluorescencyjna szczepów zmodyfikowanych do konstytutywnej ekspresji białka fluorescencyjnego ...

Opisujemy techniki utrwalania, zatapiania parafiny i cienkiego cięcia biofilmów kolonii mikroorganizmów. W przygotowanych próbkach za pomocą mikroskopii można uwidocznić podstrukturę biofilmu i wzorce ekspresji reporterowej.

Osadzanie parafiny i cienkie cięcie biofilmów kolonii drobnoustrojów do analizy mikroskopowej

Sectioning via paraffin embedding is a broadly established technique in eukaryotic systems. Here we provide a method for the fixation, embedding, and ...

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie skrawków biofilmu osadzonego w parafinie, które można wykorzystać do oceny rozkładu ekspresji genów zgłaszanej przez produkcję białek fluorescencyjnych w nienaruszonych natywnych morfologiach. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniu społeczności drobnoustrojów, takie jak ekspresja określonych genów w produkcji substancji egzopolimerowych rozmieszczonych w kontekście natywnej architektury biofilmu. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na analizę ekspresji genów w obrębie zachowanej morfologii przekrojów poprzecznych biofilmu, a jednocześnie jest podatna na dalsze zabiegi, takie jak barwienie odrębnych cech i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości, takie jak mikroskopia konfokalna lub elektronowa.Po przygotowaniu roztworu tryptonu agarowego zgodnie z protokołem tekstowym, za pomocą 50-mililitrowej stożkowej rurki wlej 45 mililitrów roztworu do naczynia o wymiarach 100 milimetrów na 100 milimetrów kwadratowych. Pozostaw agar do zestalenia się na około 20 do 30 minut. Wlej drugą 15-milimetrową warstwę na wierzch pierwszej warstwy, a następnie pozwól jej zastygnąć przez noc i, jeśli to konieczne, użyj niestr

paraffin-embedding-thin-sectioning-microbial-colony-biofilms-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Metoda zatapiania kolonii drożdży umożliwiająca wykonywanie przekrojów do mikroskopii świetlnej i elektronowej. Protokół ten pozwala na określenie rozmieszczenia komórek zsporulowanych i komórek pseudohifowych w obrębie kolonii, stanowiąc nowe narzędzie do zrozumienia organizacji typów komórek w obrębie społeczności grzybowej.

Metoda zatapiania kolonii drożdży

Poniższy film opisuje, jak zachować morfologię tkanki za pomocą utrwalania formaliny i zatapiania parafiny.

Konserwacja tkanek zatopionych w parafinie utrwalonej w formalinie (FFPE): metoda badania morfologii tkanek

Źródło: Bucher, T. i in., Metodologie badań biofilmów B. subtilis jako modelu do charakteryzacji inhibitorów biofilmu małocząsteczkowego. J. Vis. Exp.(2016)Ten film pokazuje przygotowanie dojrzałych kolonii biofilmu bakteryjnego do obrazowania w wysokiej rozdzielczości. Obejmuje etapy utrwalania, odwodnienia, montażu oraz nakładania powłok metalowych, aby zachować i zobrazować morfologię biofilmu.

Przygotowanie kolonii biofilmu bakteryjnego do analizy morfologicznej

Ten film opisuje metodę hodowli i jakościowej analizy biofilmów bakteryjnych na strzępkach grzybów za pomocą mikroskopii. Biofilmy bakteryjne często tworzą się na powierzchniach grzybów i obejmują liczne procesy interakcji bakteryjno-grzybiczych, takie jak współpraca metaboliczna, konkurencja lub drapieżnictwo.

Metoda przygotowania próbki w celu wizualizacji bakterii tworzących biofilm na strzępkach grzybów

To badanie przedstawia rozwój powtarzalnych metodologii badania inhibitorów biofilmu i ich wpływu na wielokomórkowość Bacillus subtilis.

Metodologie badania biofilmów B. subtilis jako modelu charakteryzującego małocząsteczkowe inhibitory biofilmu

Ten protokół opisuje nową metodę hodowli i jakościowej analizy biofilmów bakteryjnych na strzępkach grzybów za pomocą mikroskopii konfokalnej i elektronowej.

Nowa metoda jakościowej wieloskalowej analizy biofilmów bakteryjnych na koloniach grzybów nitkowatych z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej i elektronowej

Aby zobaczyć i określić ilościowo wewnętrzne cechy biofilmów Candida albicans, przygotowujemy nienaruszone próbki stałe, które są klarowane przez dopasowanie współczynnika załamania. Następnie można wykorzystać optyczną mikroskopię przekrojową do uzyskania trójwymiarowych danych obrazowych na całej grubości biofilmu.

Oczyszczanie i obrazowanie biofilmów Candida albicans

Tutaj udostępniamy szczegółowe, solidne i uzupełniające protokoły do wykonywania barwienia i obrazowania w rozdzielczości subkomórkowej stałych trójwymiarowych modeli hodowli komórkowych w zakresie od 100 μm do kilku milimetrów, umożliwiając w ten sposób wizualizację ich morfologii, składu typu komórki i interakcji.

Barwienie i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości trójwymiarowych modeli organoidów i sferoidów

Ten protokół ma na celu dostarczenie szczegółowych procedur zbierania, utrwalania i utrzymywania próbek roślin mykoheterotroficznych, stosując różne techniki mikroskopowe, takie jak skaningowa i transmisyjna mikroskopia elektronowa, mikroskopia świetlna, konfokalna i fluorescencyjna do badania kolonizacji grzybów w tkankach roślinnych i nasionach kiełkujących z grzybami mikoryzowymi.

Techniki mikroskopowe interpretacji kolonizacji grzybów w tkankach roślin mykoheterotroficznych i symbiotycznego kiełkowania nasion

Test tworzenia kolonii (CFC) to badanie in vitro, w którym komórki progenitorowe krwiotwórcze tworzą kolonie w podłożu półstałym. Do oceny zdolności progenitorów do proliferacji i różnicowania się wzdłuż różnych linii krwiotwórczych wykorzystuje się kombinację analizy morfologii kolonii, morfologii komórek oraz cytometrii przepływowej.

Test tworzenia kolonii (CFC) dla ludzkich komórek krwiotwórczych

Naucz się osadzania parafinowego i cienkiego cięcia biofilmów kolonii drobnoustrojów do analizy mikroskopowej. Ta metoda umożliwia wizualizację ekspresji genów w zachowanej morfologii biofilmu.

Osadzanie parafiny i cienkie cięcie biofilmów kolonii drobnoustrojów do analizy mikroskopowej

Przeglądaj więcej filmów