System mikrobiomechaniczny do badania powstawania i regeneracji żylaków w aksonach neuronów centralnych

Ogólnym celem tej konfiguracji płynu pod ciśnieniem jest wytworzenie powtarzalnych i spójnych obrzęków wzdłuż aksonów hodowanych neuronów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie uszkodzeń mózgu, takie jak mechanizmy stojące za subkomórkowymi zmianami morfologicznymi w neuronach po urazie. Główną zaletą tej techniki jest to, że metoda ta powoduje spójne i powtarzalne zmiany morfologiczne, które z czasem wracają do normy.

Jest to bardzo ważna technika, którą opracowaliśmy w laboratorium. Dzieje się tak dlatego, że możemy nie tylko wykorzystać system do identyfikacji mechanizmu molekularnego rządzącego zmianą morfologii aksonów wywołaną stresem mechanicznym jako nową formą plastyczności neuronalnej, ale także wykorzystać system jako narzędzie przesiewowe do identyfikacji nowych leków i strategii leczenia łagodnego lub urazowego uszkodzenia mózgu. Aby rozpocząć tę procedurę, umieść jedno lub więcej pudełek z 12-milimetrowymi lub 25-milimetrowymi szkiełkami nakrywkowymi w szklanej zlewce zawierającej 70% kwasu azotowego i inkubuj szkiełka nakrywkowe w temperaturze pokojowej przez noc.

Następnego dnia przenieś wszystkie szkiełka nakrywkowe do czterolitrowej zlewki wypełnionej 2,5 litra podwójnie destylowanej wody. Potrząsaj zlewką zawierającą szkiełka nakrywkowe przez godzinę z prędkością 100 obr./min i nie zapomnij użyć gumek do przytrzymania zlewki podczas potrząsania. Następnie przenieść oczyszczone szkiełka nakrywkowe do suchej kolby z metalową pokrywą.

Szkiełka nakrywkowe pieczemy w piekarniku w temperaturze 225 stopni Celsjusza przez sześć godzin. Następnie pozwól im ostygnąć do temperatury pokojowej i przechowuj je w wysterylizowanym plastikowym pojemniku do czasu użycia. Teraz umieść jedno szkiełko nakrywkowe w każdym dołku 24-dołkowej płytki.

Dodaj 30 mikrolitrów roztworu powłoki szkiełka nakrywkowego na 12-milimetrowe szkiełko nakrywkowe i zamieszaj. Następnie dodaj jeden mililitr sterylnego PBS do każdej studzienki. Płytka może być zużyta natychmiast lub przechowywana w temperaturze czterech stopni Celsjusza w sterylnym PBS przez okres do jednego tygodnia.

W dniu sekcji należy usunąć PBS z płytki. Wysuszyć na powietrzu i umieścić płytkę w świetle UV na dwie do czterech godzin. Aby oddzielić neurony hipokampa do hodowli, rozmrozić roztwór enzymu proteazy i wstępnie podgrzać podłoże galwaniczne w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie spłucz wypreparowany hipokamp za pomocą SLDS. Następnie usuń go i dodaj dwa mililitry roztworu enzymu proteazy i inkubuj próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie umyj eksplantaty hipokampa dwukrotnie pięcioma do 10 mililitrami podłoża galwanicznego i dodaj pięć mililitrów podłoża galwanicznego.

Zdysocjuj eksplantaty hipokampa na pojedyncze komórki, generując mały wir za pomocą pipety z jednomililitrową plastikową końcówką. Pipetować w górę i w dół około 40 razy, unikając tworzenia się pęcherzyków tlenu, aż roztwór stanie się mętny i nie pozostaną żadne duże kawałki eksplantatu. Następnie odwiruj komórki pod ciśnieniem 1,125 razy większym niż grawitacja przez trzy minuty.

Usunąć supernatant z komórkami zanurzonymi w pożywce i ponownie zawiesić komórki w 145 mililitrach pożywki galwanicznej. Następnie dodaj jeden mililitr zawiesiny komórek na dołek do płytki 24-dołkowej. Inkubować komórki w pożywce galwanicznej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie do czterech godzin.

Następnie usuń podłoże galwaniczne i zastąp je świeżym medium konserwacyjnym. Po dwóch dniach zastąp połowę pożywki dwoma mikromolowymi RSC rozpuszczonymi w pożywce podtrzymującej, aby zahamować wzrost fibroblastów, komórek śródbłonka i gleju. Następnie, po wystawieniu komórek na działanie RSC przez dwa dni, zastąp pożywkę świeżą pożywką konserwacyjną.

Aby dokonać transfekcji w celu wizualizacji morfologii komórki, rozcieńczyć konstrukt z podstaw w ilości jednego mikrograma na mikrolitr w pożywce Opti-MEM i wirze. Następnie rozcieńczyć odczynnik do transfekcji za pośrednictwem liposomów w pożywce Opti-MEM i wirować. Następnie należy przygotować jedno rozcieńczenie konstrukcyjne i jedno rozcieńczenie transfekcyjne dla każdej studzienki.

Następnie należy przygotować mieszaninę jeden do jednego konstruktu i pożywki Opti-MEM oraz odczynnika do transfekcji i pożywki Opti-MEM oraz wiru. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Po 20 minutach usuń połowę pożywki z każdej studzienki i przenieś to podłoże do czystej stożkowej probówki.

Trzymaj probówkę w inkubatorze, a następnie dodaj 100 mikrolitrów mieszanki przygotowanej w poprzednim kroku do pozostałego podłoża w studzince. Pozwól komórkom inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 do 30 minut. Podczas inkubacji dodać jedną objętość świeżej pożywki do pożywki w stożkowej probówce i umieścić mieszaninę w tym samym inkubatorze.

Po inkubacji usunąć pożywki zawierające roztwór do transfekcji ze studzienek i zastąpić je mieszaniną jeden do jednego starego i świeżego podłoża do konserwacji w stożkowej probówce. W tej procedurze włóż pipetę do górnej części mikromanipulatora, aby utrzymać ją na miejscu. Przykręć metalową, płaską przymocowaną do ramienia mikromanipulatora tak, aby trzymała niewyciągnięty koniec pipety tuż nad miejscem, w którym przymocowana jest gumowa rurka.

Ustawić pipetę pod kątem 45 stopni w stosunku do powierzchni neuronu zawierającej szkiełka nakrywkowe. Włącz filtr fluorescencyjny. Otwórz przysłonę i upewnij się, że widać fluorescencyjną plamkę przechodzącą przez obiektyw.

Za pomocą mikromanipulatora przesuń pipetę do pozycji, która zrównuje końcówkę z plamką fluorescencyjną i opuść pipetę do pozycji tuż nad wysokością naczynia do hodowli komórkowej. Gdy znajdzie się na swoim miejscu, włącz przechodzące światło i wyłącz kwiatostan. Za pomocą pęsety przenieś jedno szkiełko nakrywkowe z komórkami skierowanymi w stronę pipety z płytki do hodowli komórkowej na naczynie do hodowli komórkowej zawierające 2 mililitry buforu Hanka w temperaturze pokojowej.

Używając precyzyjnego pokrętła ostrości i 20-krotnego obiektywu, ustaw ostrość na płaszczyźnie około czterech pełnych obrotów nad komórkami. Następnie za pomocą mikromanipulatora ustaw końcówkę pipety tak, aby była skupiona i znajdowała się pośrodku lewej strony płaszczyzny, patrząc przez okulary. Gdy pipeta znajdzie się na swoim miejscu, ustaw ostrość mikroskopu na płaszczyźnie, która zawiera obszar zainteresowania.

W obrazowaniu siedmiu div, transfekowane GFP mysie neurony hipokampa wykazywały akson przed i po zaciągnięciu, a także następujący po nim 10-minutowy okres rekonwalescencji. Oto kimogram przedstawiający obrazowanie poklatkowe tego samego neuronu. Czerwone strzałki wskazują żylaki, które powstały po 150 sekundach zaciągania się 190 mililitrami H2O, zaczynając od 30 sekund.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak rejestracja całych komórek, obrazowanie poklatkowe FRET i TIRF oraz obrazowanie wapnia, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak wpływ stresu mechanicznego na sygnalizację neuronalną i elektryczną oraz wapń, transport białek i interakcje. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się fotograficznym urazowym uszkodzeniem mózgu do wyjaśnienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw powstawania żylaków aksonów w żywych neuronach.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzać eksperymenty w celu zbadania mechanosensacji neuronów centralnych.