Name: System mikrobiomechaniczny do badania powstawania i regeneracji żylaków w aksonach neuronów centralnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Poznaj metodę indukowania żylaków w aksonach neuronów hipokampalnych przy użyciu układu z płynem pod ciśnieniem. Technika ta pozwala badać plastyczność neuronalną i mechanizmy urazów mózgu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi użytkowania zwierząt. Prace te były częściowo wspierane przez granty z National Institutes of Health (R01NS093073 i R21AA024873) dla C. Gu.

<ol><li>Nikić, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reversible+form+of+axon+damage+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis.</a> Nat. Med. 17, 495-499 (2011).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+axon+degeneration+after+injury+and+in+development+by+the+endogenous+calpain+inhibitor+calpastatin%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Regulation of axon degeneration after injury and in development by the endogenous calpain inhibitor calpastatin.</a> Neuron. 80 (5), 1175-1189 (2013).</li>
<li>Debanne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Information+processing+in+the+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Information processing in the axon.</a> Nat. Rev. Neurosci. 5, 304-316 (2004).</li>
<li>Gu, Y., Jukkola, P., Wang, Q., Esparza, T., Zhao, Y., Brody, D., Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarity+of+varicosity+initiation+in+central+neuron+mechanosensation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Polarity of varicosity initiation in central neuron mechanosensation.</a> J Cell Biol. 216 (7), 2179-2199 (2017).</li>
<li>Chung, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mild+axonal+stretch+injury+in+vitro+induces+a+progressive+series+of+neurofilament+alterations+ultimately+leading+to+delayed+axotomy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Mild axonal stretch injury in vitro induces a progressive series of neurofilament alterations ultimately leading to delayed axotomy.</a> J. Neurotrauma. 22 (10), 1081-1091 (2005).</li>
<li>Staal, J. A., Dickson, T. C., Chung, R. S., Vickers, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclosporin-A+treatment+attenuates+delayed+cytoskeletal+alterations+and+secondary+axotomy+following+mild+axonal+stretch+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cyclosporin-A treatment attenuates delayed cytoskeletal alterations and secondary axotomy following mild axonal stretch injury.</a> Dev. Neurobiol. 67 (14), 1831-1842 (2007).</li>
<li>Tang-Schomer, M. D., Johnson, V. E., Baas, P. W., Stewart, W., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+interruption+of+axonal+transport+due+to+microtubule+breakage+accounts+for+the+formation+of+periodic+varicosities+after+traumatic+axonal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Partial interruption of axonal transport due to microtubule breakage accounts for the formation of periodic varicosities after traumatic axonal injury.</a> Exp. Neurol. 233 (1), 364-372 (2012).</li>
<li>Donkin, J. J., Vink, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cerebral+edema+in+traumatic+brain+injury%3A+therapeutic+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cerebral edema in traumatic brain injury: therapeutic developments.</a> Curr Opin Neurol. 23 (3), 293-299 (2010).</li>
<li>Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+of+rodent+hippocampal+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Myelination of rodent hippocampal neurons in culture.</a> Nat Protoc. 7 (10), 1774-1782 (2012).</li>
<li>Wang, Q., Zhang, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/0960-1317/23/1/015002">Micromechanical stimulator for localized cell loading: fabrication and strain analysis.</a> J. Micromech. Microeng. 23, 015002(2013).</li>
<li>Lu, Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelastic+properties+of+individual+glial+cells+and+neurons+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (47), 17759-17764 (2006).</li>
<li>Elkin, B. S., Azeloglu, E. U., Costa, K. D., Morrison, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+heterogeneity+of+the+rat+hippocampus+measured+by+atomic+force+microscope+indentation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Mechanical heterogeneity of the rat hippocampus measured by atomic force microscope indentation.</a> J. Neurotrauma. 24 (5), 812-822 (2007).</li>
<li>Franze, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+branch+retraction+is+caused+by+a+threshold-dependent+mechanical+impact%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Neurite branch retraction is caused by a threshold-dependent mechanical impact.</a> Biophys. J. 97 (7), 1883-1890 (2009).</li>
<li>Campàs, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+cell-generated+mechanical+forces+within+living+embryonic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues.</a> Nat. Methods. 11 (2), 183-189 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Procedura tego testu mikrobiomechanicznego jest prosta. Przyniesie wiarygodne wyniki, jeśli wszystkie jego kroki zostaną starannie wykonane. Istnieje kilka kluczowych kroków, które, jeśli zostaną niewłaściwie wykonane, utrudnią pomyślne zebranie danych. Krytyczne kroki rozpoczynają się przed faktycznym zastosowaniem bodźca zaciągania się. Staranna sekcja, hodowla i pielęgnacja pierwotnej kultury neuronów są najważniejsze. Jeśli wyhodowane neurony nie są zdrowe, nie będą reagować konsekwentnie, ponieważ mogły być już przy...

Powstawanie żylaków, czyli obrzęk/koraliki wzdłuż aksonów, jest charakterystyczną cechą neurodegeneracji obserwowaną w wielu zaburzeniach lub urazach ośrodkowego układu nerwowego, w tym w stwardnieniu rozsianym, chorobie Alzheimera, chorobie Parkinsona i urazowym uszkodzeniu mózgu1,2. Pomimo znaczącego fizjologicznego wpływu żylaków aksonów na propagację potencjału czynnościowego i przekaźnictwo synaptyczne3, sposób generowania żylaków pozostaje nieznany. Niedawno, korzystając z nowo opracowanego testu mikrobiomechanicznego na hodowanych neuronach hipokampa od gryzoni, odkryliśmy, że bodźce mechaniczne mogą wywoływać żylaki w tych neuronach o bardzo intrygujących cechach. Po pierwsze, indukcja żylaków jest szybka (<10 s) i proces ten jest nieoczekiwanie odwracalny. Po drugie, inicjacja żylaków zależy od siły ciśnienia zaciągania się: im wyższe ciśnienie, tym szybsza inicjacja. Po trzecie, inicjacja żylaków zależy od wieku neuronów. Aksony młodszych neuronów wydają się bardziej wrażliwe na stres mechaniczny w porównaniu ze starszymi neuronami. Po czwarte, żylaki tworzą się wzdłuż aksonów neuronów hipokampa, podczas gdy dendryty i początkowe segmenty aksonów tych neuronów nie wykazują żadnych zmian w tych samych warunkach zaciągania się. W ten sposób nasze badanie ujawniło nową cechę polaryzacji neuronów. Wyniki uzyskane w przypadku systemu in vitro są istotne z fizjologicznego punktu widzenia. Korzystając z modelu in vivo łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu (mTBI), wykazaliśmy, że żylaki aksonów rozwinęły się w sposób wieloogniskowy w korze somatosensorycznej myszy natychmiast po uderzeniu w czaszkę, zgodnie z naszymi wynikami in vitro<klasa sup = "xref">4. Ważne jest, aby pamiętać, że nasze barwienie i obrazowanie myszy mTBI zapewnia jedynie szybki obraz zmian morfologicznych neuronów, ponieważ wykonanie obrazowania poklatkowego in vivo morfologii neuronów podczas uderzenia mechanicznego jest nadal niewykonalne.
Ten system zaciągania płynami pozwolił nam nie tylko uchwycić unikalne cechy związane z powstawaniem żylaków wywołanych naprężeniami mechanicznymi, ale także określić mechanizm leżący u ich podstaw. Testując różne roztwory zewnątrzkomórkowe, blokery i otwieracze różnych kandydatów na mechanowrażliwe kanały jonowe oraz elektrofizjologię komórkową, stwierdziliśmy, że kanał TRPV4 z podrodziny kanałów kationowych o potencjale przejściowym V (TRPV4), który jest przepuszczalny dla Ca2+ i Na+ i aktywowany przez zaciąganie się, jest głównie odpowiedzialny za wykrywanie początkowego naprężenia mechanicznego podczas tworzenia żylaków aksonów<klasa sup = "xref">4. Zostało to dodatkowo potwierdzone za pomocą podejścia opartego na nokaucie siRNA. Podsumowując, ten nowy system testów, który opracowaliśmy z hodowlą neuronów hipokampa, jest bardzo cenny dla badania właściwości mikromechanicznych neuronów centralnych, zwłaszcza w połączeniu z innymi technikami.
Ten mikromechaniczny system, który stworzyliśmy, jest unikalny i różni się od poprzednio istniejących systemów w kilku głównych aspektach. Po pierwsze, w tym systemie neurony doświadczają naprężeń mechanicznych poza płaszczyzną w postaci kompresji i ścinania. Podczas uderzenia mechanicznego procesy neuronalne pozostają przyczepione do powierzchni szkiełka nakrywkowego i nie poruszają się. Różni się to od innych systemów eksperymentalnych, które głównie obejmowały zginanie i rozciąganie w płaszczyźnie (lub rozciąganie), na przykład ugięcie wiązek aksonów, takich jak ruchome struny5,6 lub rozciąganie aksonów wyhodowanych na kanałach z mikrowzorami i rozciągliwych membranach7,8. Co więcej, chociaż żylaki aksonów mogą być również wywołane w tych testach, takich jak w naszym systemie zaciągania płynem, proces w tych ustawieniach zajmuje znacznie więcej czasu (od 10 minut do kilku godzin6,7,8) i wydaje się nieodwracalny. Wreszcie, nasz system wykorzystujący miejscowe zaciąganie płynem pozwala na badanie przestrzennych cech powstawania żylaków (np. dendryty, kolce dendrytyczne, soma, początkowe segmenty aksonów, zakończenia aksonów), oprócz jego cech czasowych. Korzystając z tego systemu, odkryliśmy kilka nieoczekiwanych i unikalnych cech powstawania żylaków aksonów, w szczególności szybki początek, powolną odwracalność i polaryzację akson-dendryt.
System, który omawiamy w tym artykule, jest kompatybilny z wieloma technikami biologii molekularnej i komórkowej. Na przykład, aby zbadać wpływ stresu mechanicznego na morfologię i funkcję neuronów, można go stosować razem z kokulturą mieliny, obrazowaniem poklatkowym transferu energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET) i fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF), obrazowaniem wapnia i nagrywaniem klamry krosowej. W tym artykule skupimy się na podstawowych elementach systemu. Hodowla neuronów w hipokampie, konfiguracja do wydmuchiwania płynów, obrazowanie poklatkowe w wysokiej rozdzielczości do transportu aksonalnego oraz obrazowanie wapnia są zilustrowane krok po kroku poniżej.

<table><tbody><tr><td>Szkiełka nakrywkowe 12 mm&nbsp;</td><td>Instrumenty Warnera&nbsp;</td><td>64-0702</td><td>do płytki 24-dołkowej&nbsp;</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe 25 mm&nbsp;</td><td>Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>12-545-102&nbsp;</td><td>do płytki 6-dołkowej&nbsp;</td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lizyna</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen z ogona szczura&nbsp;</td><td>Roche&nbsp;</td><td>11 179 179 001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>10X PBS&nbsp;</td><td>Diagnostyka Krajowa&nbsp;</td><td>CL-253</td><td></td></tr><tr><td>Na2SO4</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>S373-500</td><td></td></tr><tr><td>K2SO4</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>P304-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>BP410-500</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza&nbsp;</td><td>Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>Enzym proteazy&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P4032</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>25030081</tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna 100x (P/S)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>MEM Sole Earle'a&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>11090</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplement&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Arabinozylocytozyna (Ara-C)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>147-94-4</td><td></td></tr><tr><td>Nośniki Opti-MEM&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>1854313</td><td>odczynnik do transfekcji&nbsp;</td></tr><tr><td>Pręty borokrzemianowe&nbsp;</td><td>World Precision Instruments Inc.&nbsp;</td><td>PG52151-4</td><td>do pipety do zaciągania&nbsp;</td></tr><tr><td>Rurki gumowe&nbsp;</td><td>Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>14-169-1A</td><td></td></tr><tr><td>10cc plastikowa strzykawka i tłok</td><td>Becton Dickinson&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator&nbsp;</td><td>Instrumenty Sutter&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>S640-3</td><td></td></tr><tr><td>KCl&nbsp;</td><td>Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>C70-500</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych (35 mm x 10 mm)</td><td>Corning&nbsp;</td><td>3294</td><td></td></tr><tr><td>Sondy molekularne</td><td>Fluo-4 AM</td><td>F14201</td><td>do obrazowania wapnia&nbsp;</td></tr><tr><td>Konstrukcja Mito-YFP&nbsp;</td><td>Takara Bio Inc.&nbsp;</td><td></td><td>do transfekcji komórek&nbsp;</td></tr><tr><td>Konstrukcja YFP-N1&nbsp;</td><td>Takara Bio Inc.&nbsp;</td><td></td><td>do transfekcji komórek&nbsp;</td></tr><tr><td>Model P-1000 Ściągacz do mikropipet płomieniowych/brązowych&nbsp;</td><td>Instrumenty Sutter&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mcroskop Eclipse TE2000-U&nbsp;</td><td>Obiektyw Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan Fluor ELWD 20x&nbsp; &nbsp;</td><td>Obiektyw Nikon</td><td>062933</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Obiektyw olejowy Apo TIRF 100x/1.49&nbsp;</td><td>Obiektyw Nikon</td><td>MRD01991</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

system mikrobiomechaniczny do badania powstawania i regeneracji żylaków w aksonach neuronów centralnych

A Microbiomechanical System for Studying Varicosity Formation and Recovery in Central Neuron Axons

Żylaki aksonów to powiększone struktury wzdłuż trzonów aksonów o wysokim stopniu niejednorodności. Są one obecne nie tylko w mózgach z chorobami lub urazami neurodegeneracyjnymi, ale także w normalnym mózgu. W tym miejscu opisujemy nowo opracowany system mikromechaniczny do szybkiego, niezawodnego i odwracalnego wywoływania żylaków aksonów, co pozwala nam zrozumieć mechanizmy rządzące powstawaniem żylaków i niejednorodnym składem białka. System ten stanowi nowatorski sposób oceny wpływu naprężeń ściskających i ścinających na różne subkomórkowe przedziały neuronów, różniący się od innych systemów in vitro, które koncentrują się głównie na efekcie rozciągania. Co ważne, dzięki unikalnym cechom naszego systemu, niedawno dokonaliśmy nowego odkrycia, z którego wynika, że zastosowanie płynu pod ciśnieniem może szybko i odwracalnie wywołać żylaki aksonów poprzez aktywację przejściowego kanału potencjału receptora. Nasz system biomechaniczny może być wygodnie wykorzystywany w połączeniu z perfuzją leków, obrazowaniem żywych komórek, obrazowaniem wapnia i nagrywaniem klamer krosowych. Dlatego metoda ta może być stosowana do badania mechanowrażliwych kanałów jonowych, regulacji transportu aksonalnego, dynamiki cytoszkieletu aksonalnego, sygnalizacji wapniowej i zmian morfologicznych związanych z urazowym uszkodzeniem mózgu.

Przed aplikacją pulsacyjną aksony zazwyczaj wykazują niewielką tendencję do tworzenia żyłek. Po aplikacji pulsacyjnej przy zastosowaniu standardowego ciśnienia (wysokość 190 mmH2O), aksony zaczynają rozwijać liczne, przypominające koraliki żyłki. Tworzenie żyłek jest częściowo odwracalne, co obrazują regiony aksonu powracające do stanu sprzed aplikacji po 10 min okresie regeneracji (Rycina 2A-B). Po dłuższym okresie regeneracji (&g...

Ten protokół opisuje fizjologicznie istotne, ciśnieniowe podejście do szybkiego i odwracalnego wywoływania żylaków w neuronach.

System mikrobiomechaniczny do badania powstawania i regeneracji żylaków w aksonach neuronów centralnych

Axonal varicosities are enlarged structures along the shafts of axons with a high degree of heterogeneity. They are present not only in brains with ...

Ogólnym celem tej konfiguracji płynu pod ciśnieniem jest wytworzenie powtarzalnych i spójnych obrzęków wzdłuż aksonów hodowanych neuronów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie uszkodzeń mózgu, takie jak mechanizmy stojące za subkomórkowymi zmianami morfologicznymi w neuronach po urazie. Główną zaletą tej techniki jest to, że metoda ta powoduje spójne i powtarzalne zmiany morfologiczne, które z czasem wracają do normy.Jest to bardzo ważna technika, którą opracowaliśmy w laboratorium. Dzieje się tak dlatego, że możemy nie tylko wykorzystać system do identyfikacji mechanizmu molekularnego rządzącego zmianą morfologii aksonów wywołaną stresem mechanicznym jako nową formą plastyczności neuronalnej, ale także wykorzystać system jako narzędzie przesiewowe do identyfikacji nowych leków i strategii leczenia łagodnego lub urazowego uszkodzenia mózgu. Aby rozpocząć tę procedurę, umieść jedno lub więcej pudełek z 12-milimetrowymi lub 25-milimetrowymi szkiełkami nakrywkowymi w szklanej zlewce zawierającej 70% kwasu azotowego i inkubuj szkiełka nakrywkowe w temperaturze pokojowej przez noc.Następnego dnia przenieś wszystkie szkiełka nakrywkowe do czterolitrowej zlewki wypełnionej 2,5 litra podwójnie destylowanej wody. Potrząsaj zlewką zawierającą szkiełka nakrywkowe przez godzinę z prędkością 100 obr./min i nie zapomnij użyć gumek do przytrzymania zlewki podczas potrząsania. Następnie przenieść oczyszczone szkiełka nakrywkowe do suchej kolby z metalową pokrywą.Szkiełka nakrywkowe pieczemy w piekarniku w temperaturze 225 stopni Celsjusza przez sześć godzin. Następnie pozwól im ostygnąć do temperatury pokojowej i przechowuj je w wysterylizowanym plastikowym pojemniku do czasu użycia. Teraz umieść jedno szkiełko nakrywkowe w każdym dołku 24-dołkowej płytki.Dodaj 30 mikrolitrów roztworu powłoki szkiełka nakrywkowego na 12-milimetrowe szkiełko nakrywkowe i zamieszaj. Następnie dodaj jeden mililitr sterylnego PBS do każdej studzienki. Płytka może być zużyta natychmiast lub przechowywana w temperaturze czterech stopni Celsjusza w sterylnym PBS przez okres do jednego tygodnia.W dniu sekcji należy usunąć PBS z płytki. Wysuszyć na powietrzu i umieścić płytkę w świetle UV na dwie do czterech godzin. Aby oddzielić neurony hipokampa do hodowli, rozmrozić roztwór enzymu proteazy i wstępnie podgrzać podłoże galwaniczne w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnie spłucz wypreparowany hipokamp za pomocą SLDS. Następnie usuń go i dodaj dwa mililitry roztworu enzymu proteazy i inkubuj próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie umyj eksplantaty hipokampa dwukrotnie pięcioma do 10 mililitrami podłoża galwanicznego i dodaj pięć mililitrów podłoża galwanicznego.Zdysocjuj eksplantaty hipokampa na pojedyncze komórki, generując mały wir za pomocą pipety z jednomililitrową plastikową końcówką. Pipetować w górę i w dół około 40 razy, unikając tworzenia się pęcherzyków tlenu, aż roztwór stanie się mętny i nie pozostaną żadne duże kawałki eksplantatu. Następnie odwiruj komórki pod ciśnieniem 1,125 razy większym niż grawitacja przez trzy minuty.Usunąć supernatant z komórkami zanurzonymi w pożywce i ponownie zawiesić komórki w 145 mililitrach pożywki galwanicznej. Następnie dodaj jeden mililitr zawiesiny komórek na dołek do płytki 24-dołkowej. Inkubować komórki w pożywce galwanicznej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie do czterech godzin.Następnie usuń podłoże galwaniczne i zastąp je świeżym medium konserwacyjnym. Po dwóch dniach zastąp połowę pożywki dwoma mikromolowymi RSC rozpuszczonymi w pożywce podtrzymującej, aby zahamować wzrost fibroblastów, komórek śródbłonka i gleju. Następnie, po wystawieniu komórek na działanie RSC przez dwa dni, zastąp pożywkę świeżą pożywką konserwacyjną.Aby dokonać transfekcji w celu wizualizacji morfologii komórki, rozcieńczyć konstrukt z podstaw w ilości jednego mikrograma na mikrolitr w pożywce Opti-MEM i wirze. Następnie rozcieńczyć odczynnik do transfekcji za pośrednictwem liposomów w pożywce Opti-MEM i wirować. Następnie należy przygotować jedno rozcieńczenie konstrukcyjne i jedno rozcieńczenie transfekcyjne dla każdej studzienki.Następnie należy przygotować mieszaninę jeden do jednego konstruktu i pożywki Opti-MEM oraz odczynnika do transfekcji i pożywki Opti-MEM oraz wiru. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Po 20 minutach usuń połowę pożywki z każdej studzienki i przenieś to podłoże do czystej stożkowej probówki.Trzymaj probówkę w inkubatorze, a następnie dodaj 100 mikrolitrów mieszanki przygotowanej w poprzednim kroku do pozostałego podłoża w studzince. Pozwól komórkom inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 do 30 minut. Podczas inkubacji dodać jedną objętość świeżej pożywki do pożywki w stożkowej probówce i umieścić mieszaninę w tym samym inkubatorze.Po inkubacji usunąć pożywki zawierające roztwór do transfekcji ze studzienek i zastąpić je mieszaniną jeden do jednego starego i świeżego podłoża do konserwacji w stożkowej probówce. W tej procedurze włóż pipetę do górnej części mikromanipulatora, aby utrzymać ją na miejscu. Przykręć metalową, płaską przymocowaną do ramienia mikromanipulatora tak, aby trzymała niewyciągnięty koniec pipety tuż nad miejscem, w którym przymocowana jest gumowa rurka.Ustawić pipetę pod kątem 45 stopni w stosunku do powierzchni neuronu zawierającej szkiełka nakrywkowe. Włącz filtr fluorescencyjny. Otwórz przysłonę i upewnij się, że widać fluorescencyjną plamkę przechodzącą przez obiektyw.Za pomocą mikromanipulatora przesuń pipetę do pozycji, która zrównuje końcówkę z plamką fluorescencyjną i opuść pipetę do pozycji tuż nad wysokością naczynia do hodowli komórkowej. Gdy znajdzie się na swoim miejscu, włącz przechodzące światło i wyłącz kwiatostan. Za pomocą pęsety przenieś jedno szkiełko nakrywkowe z komórkami skierowanymi w stronę pipety z płytki do hodowli komórkowej na naczynie do hodowli komórkowej zawierające 2 mililitry buforu Hanka w temperaturze pokojowej.Używając precyzyjnego pokrętła ostrości i 20-krotnego obiektywu, ustaw ostrość na płaszczyźnie około czterech pełnych obrotów nad komórkami. Następnie za pomocą mikromanipulatora ustaw końcówkę pipety tak, aby była skupiona i znajdowała się pośrodku lewej strony płaszczyzny, patrząc przez okulary. Gdy pipeta znajdzie się na swoim miejscu, ustaw ostrość mikroskopu na płaszczyźnie, która zawiera obszar zainteresowania.W obrazowaniu siedmiu div, transfekowane GFP mysie neurony hipokampa wykazywały akson przed i po zaciągnięciu, a także następujący po nim 10-minutowy okres rekonwalescencji. Oto kimogram przedstawiający obrazowanie poklatkowe tego samego neuronu. Czerwone strzałki wskazują żylaki, które powstały po 150 sekundach zaciągania się 190 mililitrami H2O, zaczynając od 30 sekund.Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak rejestracja całych komórek, obrazowanie poklatkowe FRET i TIRF oraz obrazowanie wapnia, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak wpływ stresu mechanicznego na sygnalizację neuronalną i elektryczną oraz wapń, transport białek i interakcje. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się fotograficznym urazowym uszkodzeniem mózgu do wyjaśnienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw powstawania żylaków aksonów w żywych neuronach.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzać eksperymenty w celu zbadania mechanosensacji neuronów centralnych.

a-microbiomechanical-system-for-studying-varicosity-formation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Żywe bakterie Gram-ujemne i Gram-dodatnie mogą zostać unieruchomione na miki powlekanej żelatyną i obrazowane w cieczy przy użyciu mikroskopii sił atomowych (AFM).

Immobilizacja bakterii do obrazowania za pomocą skaningowej mikroskopii sił atomowych

Ten film demonstruje metodę śledzenia transportu aksonalnego w neuronach ruchowych za pomocą systemu komór mikroprzepływowych. Polega na hodowli tkanek embrionalnych rdzenia kręgowego myszy w studzienkach pokrytych polimerem z pożywką w celu wywołania wzrostu aksonów. Ruch organelli barwionych barwnikiem fluorescencyjnym w obrazowaniu na żywo potwierdza dwukierunkowy transport aksonalny.

Śledzenie transportu aksonalnego organelli w neuronach ruchowych za pomocą urządzenia mikroprzepływowego

Ten film demonstruje indukcję żylaków aksonalnych poprzez zastosowanie bodźca mikromechanicznego na neuronach. System składa się z mikropipety podłączonej do strzykawki zawierającej bufor za pomocą rurki. Za pomocą mikromanipulatora mikropipetę umieszcza się nad neuronami. Następnie stosuje się ciśnienie płynu w celu wywołania żylaków w aksonach.

Wywoływanie żylaków aksonalnych za pomocą bodźca mikromechanicznego na neuronach

Chociaż obwodowy układ nerwowy (PNS) jest zdolny do znacznej naprawy po urazie, niewiele wiadomo o komórkowych i molekularnych mechanizmach rządzących tym zjawiskiem. Korzystając z żywego, transgenicznego danio pręgowanego i powtarzalnego testu przecięcia nerwów, możemy badać dynamiczne zachowania komórek glejowych podczas degeneracji i regeneracji nerwów.

Przekrój nerwu ruchowego i obrazowanie poklatkowe zachowań komórek glejowych u żywych danio pręgowanego

Obrazowanie dwufotonowe, sprzężone z nanodysekcją laserową, są użytecznymi narzędziami do badania procesów zwyrodnieniowych i regeneracyjnych w ośrodkowym układzie nerwowym z rozdzielczością subkomórkową. Protokół ten pokazuje, jak oznaczać, obrazować i preparować pojedyncze włókna pnące w korze móżdżku in vivo.

Laserowa nanochirurgia aksonów móżdżku in vivo

Prezentujemy protokół wykorzystujący mikroskopię poklatkową z wzbudzeniem dwufotonowym do jednoczesnej wizualizacji dynamiki uszkodzeń aksonów i mielin w czasie rzeczywistym. Ten proponowany protokół pozwala na badanie zarówno wewnętrznych, jak i zewnętrznych czynników, które mogą wpływać na los centralnego mielinizowanego aksonu po urazie i przyczyniać się do trwałej niepełnosprawności klinicznej.

Model uszkodzenia rdzenia kręgowego indukowany laserem ex vivo do oceny mechanizmów zwyrodnienia aksonów w czasie rzeczywistym

Tutaj prezentujemy protokół, który opiera się na wycinkach rdzenia kręgowego hodowanych na układach wieloelektrodowych w celu zbadania funkcjonalnej regeneracji połączeń propriordzeniowych in vitro.

Badanie regeneracji funkcjonalnej w organotypowych kokulturach rdzenia kręgowego hodowanych na matrycach wieloelektrodowych

Ten manuskrypt szczegółowo opisuje wytwarzanie mikro-tkankowych sieci neuronowych: trójwymiarowe konstrukcje o rozmiarach mikronów, składające się z długich, wyrównanych dróg aksonalnych, obejmujących zagregowane populacje neuronów, zamknięte w rurkowym hydrożelu. Te żywe rusztowania mogą służyć jako funkcjonalne przekaźniki do rekonstrukcji lub modulacji obwodów nerwowych lub jako biofideliczne stanowiska testowe naśladujące neuroanatomię istoty szarej i białej.

Inspirowane anatomią trójwymiarowe sieci neuronowe oparte na inżynierii mikrotkankowej do rekonstrukcji, modulacji i modelowania układu nerwowego

Transport aksonalny jest kluczowym mechanizmem dla zdrowia neuronów ruchowych. W tym protokole przedstawiamy szczegółową metodę śledzenia transportu aksonalnego przedziałów kwasowych i mitochondriów w aksonach neuronów ruchowych za pomocą komór mikroprzepływowych.

Transport aksonalny organelli w kulturach neuronów ruchowych z wykorzystaniem systemu komór mikroprzepływowych

Protokół ten opisuje system mikroprzepływowy modelujący dynamikę metaboliczną neuronów po uszkodzeniu aksonalnym, umożliwiając obrazowanie, analizę multiomiczną i mechanistyczne badania wewnętrznej przebudowy metabolicznej.

Chip mikroprzepływowy do budowy modeli uszkodzeń aksonalnych i umożliwiający analizę multiomiczną

Poznaj metodę indukowania żylaków w aksonach neuronów hipokampalnych przy użyciu układu z płynem pod ciśnieniem. Technika ta pozwala badać plastyczność neuronalną i mechanizmy urazów mózgu.

System mikrobiomechaniczny do badania powstawania i regeneracji żylaków w aksonach neuronów centralnych

Przeglądaj więcej filmów