Przeszczep arkusza komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej w celu zmniejszenia przecieku po częściowej kolektomii w modelu szczurzym

Ponieważ zakładają one pozytywny wpływ na gojenie się tkanek, arkusze ASC zostały przetestowane w wielu modelach chorobowych, takich jak zawał mięśnia sercowego. Ten eksperyment pokazuje, że arkusze ASC mogą być używane dobrzusznie i stosować do jelita. Główną zaletą arkuszy ASC jest to, że nie są potrzebne żadne materiały syntetyczne.

Ponadto przeszczep arkusza ASC jest stosunkowo łatwy do wykonania, wymaga tylko niewielkiej praktyki. To nowatorskie zastosowanie przeszczepu arkusza ASC zostało opracowane w celu zapobiegania przeciekaniu po resekcji jelita grubego i stanowi pierwszy krok, do którego prowadzi nowa strategia terapeutyczna. Wykazano, że arkusze ASC stosowane do zespoleń jelitowych są obiecujące w zapobieganiu wyciekom.

Arkusze ASC mogą być również stosowane do innych narządów wewnątrzbrzusznych, takich jak drogi moczowe. Zacznij od wypreparowania ludzkiej podskórnej tkanki tłuszczowej brzucha na 0,5 cm kawałki, za pomocą sterylnego ostrza chirurgicznego w rozmiarze 10, kleszczyków do tkanek Adson-Brown i nożyczek Metzenbauma. Zważ całkowitą ilość wypreparowanej tkanki w sterylnej szklanej butelce.

Dodać 30 ml pożywki izolacyjnej na butelkę. I trawić wypreparowaną tkankę tłuszczową w inkubatorze z wytrząsarką przy 150 obr./min i 37 stopniach Celsjusza przez godzinę. Po godzinie podzielić strawiony roztwór tkankowy na probówki o pojemności 50 ml i odwirować probówki przez 10 minut w temperaturze 390 G. Po odwirowaniu usunąć supernatant.

Dodać pożywkę, aby ponownie zawiesić osady komórkowe, i dodać więcej pożywki hodowlanej, do 45 ml. Odwirować połączone komórki przez pięć minut w temperaturze 390 G i usunąć supernatant. Zawiesić osad komórkowy w 10 ml pożywki hodowlanej.

I przefiltruj zawiesinę komórkową przez filtr o średnicy 100 mikronów. Dodać 50 l 3% roztworu błękitu metylenowego kwasu kwaśnego do 50 l zawiesiny komórkowej do czerwonych krwinek. Po wymieszaniu roztworu odpipetować 10 l na hemocytometr i policzyć komórki.

Płytki komórek o gęstości 40000 komórek na cm kwadratowy w kolbie T175 zawierającej pożywkę hodowlaną. I inkubować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej atmosferze z 5% CO2 przez 24 godziny. Następnego dnia umyj komórki ciepłym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem, aby usunąć resztki komórek.

Następnie zastąp pożywkę 10% pożywką hodowlaną FBS oraz świeżo dodanym kwasem askorbinowym-2-fosforanem i ludzkim rekombinowanym czynnikiem wzrostu fibroblastów dwa. Inkubuj, aż komórki osiągną 90% zbieżności. Subkultura komórek macierzystych tkanki tłuszczowej przy 90% zbiegu, przy użyciu standardowego 0,25% roztworu trypsyny-EDTA.

Po trzech do pięciu minutach zneutralizować 0,25% roztwór trypsyny-EDTA za pomocą 10 ml pożywki hodowlanej. Przenieść do probówki wirówkowej i odwirowywać komórki przez osiem minut w temperaturze 250 G. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki hodowlanej. Po zliczeniu komórek za pomocą hemocytometru, umieść komórki w kolbach hodowlanych T175 o gęstości 8000 komórek na cm kwadratowy.

Zamrozić pozostałe ASC w ciekłym azocie z 10% dimetylosulfotlenkiem w pożywce hodowlanej przed dalszym użyciem. Termoczułe szalki hodowlane o średnicy 3,5 cm pokryć 1 ml płodowej surowicy bydlęcej. Następnie umieść naczynia w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza, na co najmniej 30 minut przed siewem.

Aby wspomóc przyleganie ASC do naczynia termoczułego i zmniejszyć ryzyko przedwczesnego oderwania arkusza ASC w hodowli, naczynie termoczułe powinno być wstępnie pokryte płodową surowicą bydlęcą przed wysiewem komórek. Trypsynizuj ASC jak poprzednio, jeśli po trypsynizacji pojawią się jakieś grudki komórek, przed zliczeniem przefiltruj komórki przez filtr 100 mikronów. Wyjmij naczynia z inkubatora i przenieś na płytę grzewczą o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Usuń FBS z naczynia. Po ponownym zawieszeniu osadu komórkowego w LG DMEM, z 10% FBS, i zliczeniu komórek, rozcieńczyć 3,52 razy 10 do 6. ASC w 2 ml pożywki hodowlanej na naczynie, aby wysiać 400000 komórek na cm kwadratowy w każdym naczyniu o długości 3,5 cm. Ostrożnie rozprowadź komórki tak równomiernie, jak to możliwe, delikatnie kołysząc naczyniem.

Następnie hoduj arkusze ASC przez 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej atmosferze z 5% CO2. W dniu przeszczepu należy pozostawić szalki hodowlane do ostygnięcia do temperatury pokojowej na 40 minut przed przeszczepem in vivo, aby ułatwić oderwanie arkusza ASC. Po schłodzeniu usuń pożywkę hodowlaną i zastąp ją 1 ml LG DMEM bez surowicy.

Aby przeszczepić arkusz komórek, delikatnie chwyć krawędź arkusza ASC za pomocą atraumatycznych kleszczy i umieść stronę naczynia arkusza ASC na linii zespolenia. Delikatne obchodzenie się z arkuszem i prawidłowe ułożenie arkusza są niezbędne, aby zapewnić pomyślny przeszczep arkusza w stanie nienaruszonym. Ostrożnie rozciągnij arkusz ASC do około 0,25 cm powyżej i poniżej linii zespolenia.

Owiń arkusz wokół okrężnicy, podnosząc okrężnicę, aby owinąć arkusz ASC wokół strony grzbietowej. Zwierzęta kontrolne, które nie otrzymały przeszczepionych arkuszy ASC, wykazują wyciek kału w pobliżu linii zespolenia, wskazywany białą strzałką w trzecim dniu po operacji. Zwierzęta z przeszczepionymi arkuszami ASC, oznaczone czarną strzałką, wykazały zmniejszony wyciek kału i tworzenie się ropni w trzecim dniu po operacji.

Ten sam wynik zaobserwowano siedem dni po zabiegu. Obraz ten przedstawia reprezentatywny przekrój miejsca zespolenia jelita grubego u przeszczepionego zwierzęcia barwionego H i E. Strukturę arkusza można zidentyfikować w miejscu zespolenia, do siedmiu dni po operacji. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu kilku minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Arkusz ASC będzie spontanicznie przylegał do powierzchni zerowej komórki okrężnicy, nie ma potrzeby używania kleju ani szwu, aby dopasować arkusz ASC. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować i przeszczepić arkusze ASC na zespolenie jelita grubego u szczurów, aby zapobiec wyciekowi po częściowej kolektomii.