Name: Przeszczep arkusza komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej w celu zmniejszenia przecieku po częściowej kolektomii w modelu szczurzym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Poznaj metodę przeszczepu arkuszy ASC na anastomozę okrężniczą u szczurów, aby zmniejszyć przeciek po częściowej kolektomii. Technika ta wspiera gojenie tkanek bez materiałów syntetycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są wdzięczni Prof. Dr. S.E.R. Hoviusowi, Dr. M.A.M. Mureau i wszystkim chirurgom z Oddziału Chirurgii Plastycznej za pobranie podskórnej tkanki tłuszczowej. P. Sukho jest wspierany przez grant z programu The Netherlands Fellowship (NFP-12/435), podczas prowadzenia badania. Y.M. Bastiaansen-Jenniskens jest wspierany przez granty z Dutch Arthritis Foundation (LP11).

Podskórna tkanka tłuszczowa w jamie brzusznej została pobrana od ludzkich dawców za zgodą Komisji Etyki Medycznej (#MEC-2014-092), Erasmus MC University Medical Center, Rotterdam, Holandia. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komisję Etyczną ds. Doświadczeń na Zwierzętach, Erasmus MC University Medical Center, Rotterdam, Holandia (133-14-01).
1. Izolacja i kultura ASC człowieka
<ol>
	<li>Przygotować 3 ml pożywki izolacyjnej na 1 g tkanki tłuszczowej. Wymieszaj zmodyfikowaną pożywkę Eagle's Eagle's o niskim poziomie glukozy (LG-DMEM) z 10 g/l albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 1 g/l kolagenazy typu 1.</li>
	<li>Wypreparuj ludzką podskórną tkankę tłuszczową jamy brzusznej (n = 8, wszystkie kobiety, średni wiek 40 ± 9 lat) na małe kawałki (0,5 cm) za pomocą sterylnego ostrza chirurgicznego w rozmiarze 10, kleszczyków do tkanek Adson-Brown i nożyczek Metzenbauma w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	<li>Przechowuj wypreparowaną tkankę w sterylnej szklanej butelce do przechowywania pożywki. Zważyć całkowitą ilość wypreparowanej tkanki i rozpocząć trawienie od przygotowanego podłoża izolacyjnego (50 g tkanki tłuszczowej ze 150 ml pożywki izolacyjnej na butelkę). W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu, przechowując przez noc butelkę z wypreparowaną tkanką tłuszczową i pożywką izolacyjną w temperaturze 4 °C na mieszalniku rolkowym. Następnie podgrzej butelkę następnego dnia do temperatury pokojowej 25 °C przez 15 minut, zanim przejdziesz do następnego kroku. 
	UWAGA: Podskórna tkanka tłuszczowa jamy brzusznej została pozyskana jako materiał resztkowy od dawców poddanych operacji rekonstrukcji piersi za zgodą Komisji Etyki Medycznej Erasmus MC (#MEC-200) i zgodnie z Kodeksem Postępowania: "Właściwe Wtórne Wykorzystanie Tkanki Ludzkiej" (<http://www.federa.org>). Resztki tkanki tłuszczowej wykorzystano wyłącznie od dawców, którzy nie zrezygnowali z wtórnego wykorzystania.</li>
	<li>Rozbioroną tkankę tłuszczową roztrawić w sterylnej szklanej butelce do przechowywania w shakerze-inkubatorze z prędkością 150 obr./min i temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Podzielony przefermentowany roztwór na probówki o pojemności 50 ml i odwirowywać probówki przez 10 minut przy 390 x g.</li>
	<li>Przygotować pożywkę hodowlaną: LG-DMEM uzupełniony 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 50 μg/ml gentamycyny i 1,5 μg/ml amzokulturyny B.</li>
	<li>Po odwirowaniu usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 20 ml pożywki hodowlanej (LG-DMEM uzupełniony 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 50 μg/ml gentamycyny i 1,5 μg/ml amfonicyny B). Ponownie odwirować komórki przez 5 minut przy 390 x g i usunąć supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy za pomocą 10 ml pożywki hodowlanej (LG-DMEM uzupełniony 10% FBS, 50 μg/ml gentamycyny i 1,5 μg/ml amzotericyny B) i przefiltrować zawiesinę komórkową przez filtr 100 μm.</li>
	<li>Dodać 50 μl 3% roztworu kwasu octowego/błękitu metylenowego (do lizy czerwonych krwinek) do 50 μl zawiesiny komórek, wymieszać roztwór i użyć 10 μl do policzenia komórek. Wykonaj zliczanie komórek za pomocą hemocytometru. Następnie płytkie komórki o gęstości 40 000 komórek/cm2 w pożywce hodowlanej (LG-DMEM uzupełniony 30% FBS, 50 μg/ml gentamycyny i 1,5 μg/ml amhomenicyny B).</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze z 5% CO2 przez 24 godziny.</li>
	<li>Po inkubacji przemyć komórki ciepłym (37 °C) roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS) w celu usunięcia resztek komórek i zastąpić pożywkę 10% pożywką hodowlaną FBS ze świeżo dodanym kwasem askorbinowym-2-fosforanem (25 μg/ml) i ludzkim rekombinowanym czynnikiem wzrostu fibroblastów 2 (FGF2, 1 ng/ml).</li>
	<li>Subkultura ASC przy 90% zbiegu przy użyciu standardowego 0,25% roztworu trypsyny EDTA (3 ml dla kolby T175). Po 3-5 minutach zneutralizować 0,25% roztwór trypsyny EDTA za pomocą 10 ml pożywki hodowlanej (LG-DMEM uzupełnionej 10% FBS, 50 μg/ml gentamycyny i 1,5 μg/ml amzokulturyny B). 
	UWAGA: Analiza cytometrii przepływowej przy użyciu typowych markerów powierzchniowych ASC i testów różnicowania trójliniowego została przeprowadzona wcześniej i wykazała, że ASC wyizolowane przy użyciu tego protokołu wykazywały cechy specyficzne dla ASC21,22.</li>
	<li>Przemyć komórki 10 ml pożywki hodowlanej (LG-DMEM uzupełniony o 10% FBS, 50 μg/ml gentamycyny i 1,5 μg/ml amzokulturyny B) dla kolby T175 i odwirować komórki przez 8 minut przy 250 x g. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki hodowlanej. Policz komórki za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Umieść komórki w kolbach hodowlanych T175 o gęstości 8 000 komórek/cm2.</li>
	<li>Przed dalszym użyciem zamrozić pozostałe ASC w ciekłym azocie z 10% dimetylosulfotlenkiem (DMSO) w pożywce hodowlanej.</li>
</ol>
2. Przygotowanie arkusza ASC
<ol>
	<li>Termoczułe szalki hodowlane (o średnicy 3,5 cm) należy wstępnie pokryć 1 ml FBS, a następnie umieścić szalki w inkubatorze w temperaturze 37 °C na co najmniej 30 minut przed wysiewem komórek.</li>
	<li>Trypsynizować ASC za pomocą standardowego 0,25% roztworu trypsyny EDTA przez 3-5 minut (3 ml dla kolby hodowlanej T175). Jeśli po trypsynizacji pojawią się jakieś grudki komórek, przed zliczeniem przefiltruj je przez filtr 100 μm.</li>
	<li>Zneutralizować roztwór trypsyny za pomocą LG-DMEM uzupełnionego 10% FBS (10 ml dla kolby T175) i odwirować zawiesinę komórek przez 8 minut przy 250 x g. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml LG-DMEM uzupełnionym 10% FBS.</li>
	<li>Po pokryciu termoczułych naczyń hodowlanych FBS, przenieś naczynia z inkubatora na płytę grzewczą w temperaturze 37 °C i usuń FBS z naczynia.</li>
	<li>Nasiona ASC przy 400 000 komórek/cm2 (w sumie 3,52 ×10 6 komórek rozcieńczonych w 2 ml pożywki hodowlanej na szalkę).</li>
	<li>Ostrożnie rozprowadź komórki tak równomiernie, jak to możliwe, delikatnie kołysząc naczynie.</li>
	<li>Arkusze ASC do hodowli przez 48 godzin w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze z 5% CO2, 
	UWAGA: Staraj się zminimalizować otwieranie drzwi inkubatora po wysiewie ASC, aby zapobiec spadkom temperatury, które mogą zakłócać tworzenie arkuszy ASC lub powodować przedwczesne odklejanie się uformowanych arkuszy ASC.</li>
</ol>
3. Częściowa kolektomia i zespolenie jelita grubego
<ol>
	<li>Samce szczurów rasy Wistar (o masie ciała od 250 do 350 g) należy indukować i utrzymywać w inhalacji 1 l/min izofluranu (1,5-5%)/tlen i wstrzyknąć domięśniowo 0,05 mg/kg buprenorfiny.</li>
	<li>Gdy zwierzęta znajdą się w znieczuleniu ogólnym, oceń głębokość znieczulenia za pomocą testów odruchowych. Nałóż na oczy maść do oczu zawierającą witaminę A, aby zapobiec wysuszeniu. Gdy znieczulenie jest uważane za wystarczające do operacji, należy aseptycznie przygotować brzuch, goląc włosy i dwukrotnie spryskując obszar operacyjny 70% etanolem. Ułóż brzuch sterylnymi papierowymi zasłonami. Stosuj technikę aseptyczną i utrzymuj sterylne pole podczas całego zabiegu chirurgicznego.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie brzucha w linii środkowej o długości 5 cm za pomocą sterylnego ostrza chirurgicznego w rozmiarze 10 i przedłuż nacięcie nożyczkami Metzenbaum. Zidentyfikuj i zewnętrznij okrężnicę i odsuń okrężnicę od pozostałej części jamy brzusznej gazami zwilżonymi solą fizjologiczną. Zidentyfikuj prawą, środkową i lewą tętnicę kolkową w krezce, tępo rozetnij wokół każdego naczynia za pomocą komara Halsted i podwiąż każde naczynie za pomocą niewchłanialnego plecionego jedwabiu 4/0.</li>
	<li>Odizoluj odcinek okrężnicy między 1,0 cm abordowo do jelita ślepego a 0,5 cm powyżej tętnicy krezkowej ogonowej. Przeciąć zdrową okrężnicę za pomocą nożyczek Metzenbaum. Po wycięciu odcinka okrężnicy zbliż do siebie proksymalny i dystalny koniec okrężnicy, wprowadzając dwa długie waciki bawełniane przezodbytniczo przez dystalną okrężnicę, a następnie do bliższego końca okrężnicy.</li>
	<li>Za pomocą mikroskopu chirurgicznego stworzyć niedostatecznie zszyte zespolenie end-to-end poprzez jednowarstwowe szycie odwracające za pomocą 5 szwów przerywanych (niewchłanialny monofilament poliamid 8/0). Umieść przerwane szwy przez wszystkie warstwy ściany jelita grubego i ustaw węzły zewnątrzświetlisto.</li>
	<li>Podziel szczury losowo na grupę kontrolną lub grupę arkuszy ASC.</li>
</ol>
4. Przeszczep arkusza ASC
<ol>
	<li>Pozwól szalkom hodowlanym ostygnąć do temperatury pokojowej na 40 minut przed przeszczepem in vivo, aby ułatwić odklejanie arkusza ASC. 
	UWAGA: Po oderwaniu arkusze ASC kurczą się do około 2 cm średnicy. Żywotność arkusza ASC utrzymuje się na wysokim poziomie przez co najmniej 3-6 godzin po odłączeniu20.</li>
	<li>Usuń pożywkę hodowlaną i zastąp ją 1 ml wolnego od surowicy LG-DMEM.</li>
	<li>Delikatnie chwyć krawędzie arkusza ASC za pomocą atraumatycznych kleszczy i połóż stronę naczynia arkusza ASC na linii zespolenia.</li>
	<li>Ostrożnie rozciągnij arkusz ASC około 0,25 cm powyżej i poniżej linii zespolenia za pomocą atraumatycznych kleszczy i owiń prześcieradło wokół okrężnicy. Podnieś okrężnicę do góry, aby owinąć arkusz ASC wokół strony grzbietowej. 
	UWAGA: Arkusze ASC przylegają samoistnie do linii zespolenia, nie ma potrzeby stosowania kleju tkankowego ani żadnego innego biomateriału. Grupa kontrolna nie otrzymuje żadnego dodatkowego leczenia.</li>
	<li>Usuń bawełniane waciki i zmień rękawice i instrumenty. Wymień okrężnicę w jamie brzusznej. Zamknij jamę brzuszną-linea alba jedną warstwą szwów biegowych za pomocą wchłanialnego plecionego kwasu poliglikolowego 5/0. Zszyj tkankę podskórną i skórkę razem w jednej warstwie szwów biegowych za pomocą wchłanialnego plecionego kwasu poliglikolowego 5/0.</li>
</ol>
5. Ocena pooperacyjna i obserwacja
<ol>
	<li>Po operacji należy natychmiast nawodnić zwierzęta za pomocą podskórnego wstrzyknięcia 5 ml ciepłej soli fizjologicznej. Umieść zwierzęta pod lampą grzewczą, aby utrzymać temperaturę ciała i monitorować parametry życiowe, dopóki zwierzęta nie odzyskają wystarczającej świadomości, aby utrzymać pozycję leżącą w mostku. 
	UWAGA: Zwierzęta, które przeszły operację, nie były zwracane do towarzystwa innych zwierząt, dopóki w pełni nie wyzdrowiały. Po wyzdrowieniu zapewnij swobodny dostęp do wody i regularnej karmy dla szczurów. W celu złagodzenia bólu pooperacyjnego należy podawać 0,05 mg/kg buprenorfiny podskórnie co 6-8 godzin przez 3 dni. W żadnym momencie tego badania nie podawano antybiotyków.</li>
	<li>Otrzymuj codzienne oceny kliniczne dotyczące samopoczucia i wagi. W przypadku bardzo niskiego wyniku dobrego samopoczucia lub znacznej utraty wagi, zwierzęta powinny zostać poddane eutanazji przez wykrwawienie poprzez punkcję serca, jeszcze pod narkozą.</li>
	<li>W 3. lub 7. dniu po operacji należy ponownie znieczulić szczury 1 l/min izofluranu (1,5-5%)/inhalację tlenową bez buprenorfiny i wykonać ponowną laparotomię z nacięciem w kształcie litery U. Sprawdź jamę brzuszną pod kątem oznak zapalenia otrzewnej, zwężenia, zrostów włóknistych i obecności ropni. Oceń nasilenie zrostów i ropnia zarówno w jamie brzusznej, jak i w okolicy zespolenia.</li>
	<li>Określić ciśnienie rozrywające zespolenie przez wdmuchiwanie powietrza do zamkniętego odcinka jelita grubego, w tym zespolenia. Zapisz ciśnienie powietrza i miejsce pęknięcia w momencie pierwszego wycieku powietrza jako ciśnienie rozrywające.</li>
	<li>Usunąć okrężnicę z każdego uśmierconego zwierzęcia i przymocować przecięty segment okrężnicy - zawierający zespolenie jelita grubego - za pomocą 4% buforowanego formaldehydu, a następnie zatopić parafinę i pociąć okrężnicę na odcinki o grubości 4 μm.</li>
	<li>Poddaj eutanazji zwierzęta w znieczuleniu bezpośrednio po pobraniu segmentu zespolenia przez wykrwawienie przez nakłucie serca. Potwierdź śmierć zwierzęcia przy braku ruchu oddechowego i biciu serca.</li>
	<li>Wykonaj barwienia histochemiczne, takie jak Hematoxylina i Eozyna oraz czerwień Picro Sirius, oraz barwienia immunohistochemiczne z przeciwciałami przeciwko ludzkim mitochondriom, komórkom śródbłonka szczura (anty-CD34) i komórkom układu odpornościowego (CD3+, CD163+).</li>
	<li>Digitalizacja slajdów w celu analizy komputerowej i porównania grup zwierząt.</li>
</ol>

<ol><li>Kawahara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-incision+laparoscopic+right+colectomy+for+recurrent+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatogastroenterology%22%5BJournal%5D)">Single-incision laparoscopic right colectomy for recurrent Crohn's disease.</a> Hepatogastroenterology. 57 (102-103), 1170-1172 (2010).</li>
<li>Saia, M., Buja, A., Mantoan, D., Agresta, F., Baldo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colon+Cancer+Surgery%3A+A+Retrospective+Study+Based+on+a+Large+Administrative+Database%5BTitle%5D)+AND+%22Surg+Laparo+Endo+Per%22%5BJournal%5D)">Colon Cancer Surgery: A Retrospective Study Based on a Large Administrative Database.</a> Surg Laparo Endo Per. 26 (6), e126-e131 (2016).</li>
<li>Snijders, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meta-analysis+of+the+risk+for+anastomotic+leakage%2C+the+postoperative+mortality+caused+by+leakage+in+relation+to+the+overall+postoperative+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Surg+Oncol%22%5BJournal%5D)">Meta-analysis of the risk for anastomotic leakage, the postoperative mortality caused by leakage in relation to the overall postoperative mortality.</a> Eur J Surg Oncol. 38 (11), 1013-1019 (2012).</li>
<li>Daams, F., Luyer, M., Lange, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorectal+anastomotic+leakage%3A+aspects+of+prevention%2C+detection+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroentero%22%5BJournal%5D)">Colorectal anastomotic leakage: aspects of prevention, detection and treatment.</a> World J Gastroentero. 19 (15), 2293-2297 (2013).</li>
<li>Testini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bovine+pericardium+patch+wrapping+intestinal+anastomosis+improves+healing+process+and+prevents+leakage+in+a+pig+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Bovine pericardium patch wrapping intestinal anastomosis improves healing process and prevents leakage in a pig model.</a> PLoS One. 9 (1), e86627(2014).</li>
<li>Kilroy, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+profile+of+human+adipose-derived+stem+cells%3A+expression+of+angiogenic%2C+hematopoietic%2C+and+pro-inflammatory+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cytokine profile of human adipose-derived stem cells: expression of angiogenic, hematopoietic, and pro-inflammatory factors.</a> J Cell Physiol. 212 (3), 702-709 (2007).</li>
<li>Mussano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+Factor+Profile+Characterization+of+Undifferentiated+and+Osteoinduced+Human+Adipose-Derived+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Growth Factor Profile Characterization of Undifferentiated and Osteoinduced Human Adipose-Derived Stem Cells.</a> Stem Cells Int. , 6202783(2017).</li>
<li>Hassan, W. U., Greiser, U., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+adipose-derived+stem+cells+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regen%22%5BJournal%5D)">Role of adipose-derived stem cells in wound healing.</a> Wound Repair Regen. 22 (3), 313-325 (2014).</li>
<li>Shudo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+mesenchymal+stem+cells+enhances+the+therapeutic+effects+of+skeletal+myoblast+cell-sheet+transplantation+in+a+rat+ischemic+cardiomyopathy+model%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Pt+A%22%5BJournal%5D)">Addition of mesenchymal stem cells enhances the therapeutic effects of skeletal myoblast cell-sheet transplantation in a rat ischemic cardiomyopathy model.</a> Tissue Eng Pt A. 20 (3-4), 728-739 (2014).</li>
<li>Otsuki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+stem+cell+sheets+improved+cardiac+function+in+the+rat+myocardial+infarction%2C+but+did+not+alter+cardiac+contractile+responses+to+beta-adrenergic+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res%22%5BJournal%5D)">Adipose stem cell sheets improved cardiac function in the rat myocardial infarction, but did not alter cardiac contractile responses to beta-adrenergic stimulation.</a> Biomed Res. 36 (1), 11-19 (2015).</li>
<li>Hamdi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicardial+adipose+stem+cell+sheets+results+in+greater+post-infarction+survival+than+intramyocardial+injections%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Epicardial adipose stem cell sheets results in greater post-infarction survival than intramyocardial injections.</a> Cardiovasc Res. 91 (3), 483-491 (2011).</li>
<li>Cerqueira, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adipose+stem+cells+cell+sheet+constructs+impact+epidermal+morphogenesis+in+full-thickness+excisional+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Human adipose stem cells cell sheet constructs impact epidermal morphogenesis in full-thickness excisional wounds.</a> Biomacromolecules. 14 (11), 3997-4008 (2013).</li>
<li>Perrod, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Sheet+Transplantation+for+Esophageal+Stricture+Prevention+after+Endoscopic+Submucosal+Dissection+in+a+Porcine+Model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cell Sheet Transplantation for Esophageal Stricture Prevention after Endoscopic Submucosal Dissection in a Porcine Model.</a> PLoS One. 11 (3), e0148249(2016).</li>
<li>Pascual, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+in+biosutures+do+not+improve+healing+of+experimental+colonic+anastomoses%5BTitle%5D)+AND+%22Brit+J+Surg%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived mesenchymal stem cells in biosutures do not improve healing of experimental colonic anastomoses.</a> Brit J Surg. 95 (9), 1180-1184 (2008).</li>
<li>Yoo, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-tissue-derived+Stem+Cells+Enhance+the+Healing+of+Ischemic+Colonic+Anastomoses%3A+An+Experimental+Study+in+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Korean+Soc+Coloproctol%22%5BJournal%5D)">Adipose-tissue-derived Stem Cells Enhance the Healing of Ischemic Colonic Anastomoses: An Experimental Study in Rats.</a> J Korean Soc Coloproctol. 28 (3), 132-139 (2012).</li>
<li>Okano, T. <a target="_blank" href="http://europepmc.org/abstract/med/17432182">Cell sheet engineering.</a> Rinsho Shinkeigaku. 46 (11), 795-798 (2006).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+cell+sheet+technique+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Rep%22%5BJournal%5D)">Application of the cell sheet technique in tissue engineering.</a> Biomed Rep. 3 (6), 749-757 (2015).</li>
<li>Labbe, B., Marceau-Fortier, G., Fradette, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+sheet+technology+for+tissue+engineering%3A+the+self-assembly+approach+using+adipose-derived+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell sheet technology for tissue engineering: the self-assembly approach using adipose-derived stromal cells.</a> Methods Mol Biol. 702, 429-441 (2011).</li>
<li>Sukho, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+Tissue-Derived+Stem+Cell+Sheet+Application+for+Tissue+Healing+In+Vivo%3A+A+Systematic+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B-Re%22%5BJournal%5D)">Adipose Tissue-Derived Stem Cell Sheet Application for Tissue Healing In Vivo: A Systematic Review.</a> Tissue Eng Part B-Re. , (2017).</li>
<li>Sukho, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+adipose+stem+cell+sheets+on+colon+anastomotic+leakage+in+an+experimental+model%3A+Proof+of+principle%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Effects of adipose stem cell sheets on colon anastomotic leakage in an experimental model: Proof of principle.</a> Biomaterials. 140, 69-78 (2017).</li>
<li>Verseijden, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenic+capacity+of+human+adipose-derived+stromal+cells+during+adipogenic+differentiation%3A+an+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Pt+A%22%5BJournal%5D)">Angiogenic capacity of human adipose-derived stromal cells during adipogenic differentiation: an in vitro study.</a> Tissue Eng Pt A. 15 (2), 445-452 (2009).</li>
<li>Sukho, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Cell+Seeding+Density+and+Inflammatory+Cytokines+on+Adipose+Tissue-Derived+Stem+Cells%3A+an+in+Vitro+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Effect of Cell Seeding Density and Inflammatory Cytokines on Adipose Tissue-Derived Stem Cells: an in Vitro Study.</a> Stem Cell Rev. 13 (2), 267-277 (2017).</li>
<li>Surface, N. U. Cell Harvesting by Temperature Reduction. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/AppNote-Nunc-UpCell-N20230.pdf">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/AppNote-Nunc-UpCell-N20230.pdf</a> (2008).</li>
<li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorectal+anastomotic+leakage+caused+by+insufficient+suturing+after+partial+colectomy%3A+a+new+experimental+model%5BTitle%5D)+AND+%22Surg+Infect+%28Larchmt%29%22%5BJournal%5D)">Colorectal anastomotic leakage caused by insufficient suturing after partial colectomy: a new experimental model.</a> Surg Infect (Larchmt). 15 (6), 733-738 (2014).</li>
<li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+colorectal+anastomotic+leakage+with+tissue+adhesive+in+experimental+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm+Bowel+Dis%22%5BJournal%5D)">Reducing colorectal anastomotic leakage with tissue adhesive in experimental inflammatory bowel disease.</a> Inflamm Bowel Dis. 21 (5), 1038-1046 (2015).</li>
<li>Servier. Smart servier medical art. , http://smart.servier.com (2017).</li>
<li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+anastomotic+leakage+by+reinforcement+of+colorectal+anastomosis+with+cyanoacrylate+glue%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Reducing anastomotic leakage by reinforcement of colorectal anastomosis with cyanoacrylate glue.</a> Eur Surg Res. 50 (3-4), 255-261 (2013).</li>
<li>Aysan, E., Dincel, O., Bektas, H., Alkan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polypropylene+mesh+covered+colonic+anastomosis.+Results+of+a+new+anastomosis+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Surg%22%5BJournal%5D)">Polypropylene mesh covered colonic anastomosis. Results of a new anastomosis technique.</a> Int J Surg. 6 (3), 224-229 (2008).</li>
<li>Suarez-Grau, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrinogen-thrombin+collagen+patch+reinforcement+of+high-risk+colonic+anastomoses+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastrointest+Surg%22%5BJournal%5D)">Fibrinogen-thrombin collagen patch reinforcement of high-risk colonic anastomoses in rats.</a> World J Gastrointest Surg. 8 (9), 627-633 (2016).</li>
<li>Kobayashi, J., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+a+thermoresponsive+cell+culture+dish%3A+a+key+technology+for+cell+sheet+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Technol+Adv+Mat%22%5BJournal%5D)">Fabrication of a thermoresponsive cell culture dish: a key technology for cell sheet tissue engineering.</a> Sci Technol Adv Mat. 11 (1), 014111(2010).</li>
<li>Elloumi-Hannachi, I., Yamato, M., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+sheet+engineering%3A+a+unique+nanotechnology+for+scaffold-free+tissue+reconstruction+with+clinical+applications+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Cell sheet engineering: a unique nanotechnology for scaffold-free tissue reconstruction with clinical applications in regenerative medicine.</a> J Intern Med. 267 (1), 54-70 (2010).</li>
<li>Miyahara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayered+mesenchymal+stem+cells+repair+scarred+myocardium+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction.</a> Nat Med. 12 (4), 459-465 (2006).</li>
<li>Makarevich, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+angiogenesis+in+ischemic+skeletal+muscle+after+transplantation+of+cell+sheets+from+baculovirus-transduced+adipose-derived+stromal+cells+expressing+VEGF165%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Enhanced angiogenesis in ischemic skeletal muscle after transplantation of cell sheets from baculovirus-transduced adipose-derived stromal cells expressing VEGF165.</a> Stem Cell Res Ther. 6, 204(2015).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Nieszczelność zespolenia jest najpoważniejszym zdarzeniem niepożądanym po resekcji jelita grubego z zespoleniem pierwotnym. Nadal brakuje optymalnych technik zapobiegania przerwaniu zespolenia i przeciekaniu. Przeprowadzono lokalne zastosowanie szeregu biomateriałów, uzyskując różne wyniki 25,26,27. Celem terapii komórkowych jest ułatwienie naprawy tkanek poprzez wymianę tkanek lub stymulację miejscowego gojenia poprzez wydziela...

Częściowa kolektomia z pierwotnym zespoleniem to często wykonywana operacja, która może być wykonana w przypadku wielu chorób wpływających na okrężnicę, takich jak rak jelita grubego, choroba Leśniowskiego-Crohna i zapalenie uchyłków1,2. Najbardziej przerażającym powikłaniem po zespoleniu jelita grubego jest nieszczelność zespolenia3. Chociaż zidentyfikowano kilka czynników ryzyka związanych z nieszczelnościami zespolenia, rozwiązania zapobiegające przeciekom pozostają nieznane4,5.
Komórki zrębowe pochodzące z tkanki tłuszczowej (ASC) są związane z właściwościami przeciwzapalnymi i troficznymi6,7, co czyni te komórki obiecującymi kandydatami do terapii regeneracyjnych8. Skuteczność ASC w promowaniu gojenia tkanek wykazano w różnych tkankach, takich jak mięsień sercowy, skóra i przełyk9,10,11,12,13. Istnieje jednak niewiele doniesień na temat stosowania ASC w celu wspomagania gojenia jelit. Miejscowe przeszczepienie ASC do eksperymentalnych zespoleń jelita grubego za pomocą bioszwów pokrytych ASC lub wstrzyknięć surowiczych ASC nie wykazało poprawy w gojeniu14 lub nie zapobiegło przeciekowi zespolenia pomimo korzystniejszego gojenia zespolenia15.
Miejscowe przeszczepienie ASC w zawiesinie lub w połączeniu z biomateriałami może być związane z niewystarczającą retencją komórek lub nieodpowiednim rozmieszczeniem przeszczepionych komórek11. Technologia arkuszy komórkowych16,17 oferuje innowacyjną metodę dostarczania ASC18,19. Dlatego w poprzednim badaniu zaproponowano nowatorskie podejście, w którym ASC zorganizowane w arkusz komórek można zastosować do eksperymentalnego zespolenia jelita grubego20. Badanie to wykazało, że przeszczep arkusza ASC jest skuteczny w zmniejszaniu nieszczelności zespolenia jelita grubego po częściowej kolektomii w modelu szczurzym. W tym artykule opisano przygotowanie arkusza ASC i technikę przeszczepu chirurgicznego.

<table><tbody><tr><td>LG DMEM</td><td>Gibco, Technologie życiowe</td><td>22320022</td><td>izolacja i hodowla ASC</td></tr><tr><td>Kolagenaza typu I</td><td>Gibco, Life technologies</td><td>17100-01</td><td>ASC Izolacja</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td>ASC Izolacja</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Gibco, Life technologies</td><td>10270-106</td><td>FBS, izolacja i hodowla ASC</td></tr><tr><td>3% octu kwas z błękitem metylenowym</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7060</td><td>Izolacja ASC</td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Gibco, Life technologies</td><td>15750-037</td><td>Izolacja i hodowla ASC</td></tr><tr><td>Amfonicyna B</td><td>Gibco, Life technologies</td><td>15290-018</td> Wytrząsarka <td>do izolacji i hodowli ASC</td></tr><tr><td>(Gallenkamp Environmental Shaker Model 10X 400)</td><td>Akribis Scientific</td><td>F240</td><td>Izolacja</td></tr> <tr><td>ASCWirówka</td><td>Hettichlab</td><td>Rotina380</td><td>ASC izolacja i hodowla</td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy sól fizjologiczna</td><td>Gibco, Life technologies</td><td>14190-094</td><td>PBS, izolacja i hodowla ASC</td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy-2-fosforan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td>Izolacja i hodowla ASC</td></tr><tr><td>Ludzki rekombinowany czynnik wzrostu fibroblastów 2</td><td>AbD Serotec</td><td>AF-100-15</td><td>FGF2, izolacja i hodowla ASC</td></tr><tr><td>Trypsyna EDTA</td><td>Gibco, Life technologies</td><td>25200-056</td><td>Kultura ASC</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-5x</td><td>DMSO, ASC</td></tr><tr><td>zamrażanie Termoczułe naczynia hodowlane</td> Przygotowanie arkusza <td>Nunc Thermo scientific</td><td>174904</td><td>ASC</td></tr><tr><td>Niewchłanialny jedwab pleciony 4/0</td><td>B Braun</td><td>21151042</td><td>surgery</td></tr><tr><td>Niewchłanialna żyłka poliamid 8/0</td><td>B Braun</td><td>G1118170</td><td>chirurgii</td></tr><tr><td>Wchłanialny pleciony kwas poliglikolowy 5/0</td><td>B Braun</td><td>C1048207</td><td>chirurgii</td></tr></tbody></table>

przeszczep arkusza komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej w celu zmniejszenia przecieku po częściowej kolektomii w modelu szczurzym

Transplantation of Adipose Tissue-Derived Stem Cell Sheet to Reduce Leakage After Partial Colectomy in A Rat Model

Nieszczelność zespolenia jest katastrofalnym powikłaniem po operacji jelita grubego. Chociaż obecne metody zapobiegania wyciekom mają różny poziom skuteczności klinicznej, do tej pory były to rozwiązania niedoskonałe. Terapia komórkami macierzystymi z wykorzystaniem arkuszy ASC może zapewnić rozwiązanie tego problemu. ASC są uważane za obiecujących kandydatów do wspomagania gojenia tkanek ze względu na ich właściwości troficzne i immunomodulujące. W tym miejscu przedstawiamy metody produkcji arkuszy ASC o dużej gęstości, które są przeszczepiane na zespolenie jelita grubego w modelu szczurzym w celu zmniejszenia przecieku. ASC tworzyły arkusze komórek w termoczułych naczyniach hodowlanych, które można było łatwo odłączyć. W dniu przeszczepienia wykonano częściową kolektomię z 5-szwowym zespoleniem jelita grubego. Zwierzętom natychmiast przeszczepiono 1 arkusz ASC na szczura. Arkusze ASC przylegały samoistnie do zespolenia bez kleju, szwów czy biomateriału. Grupy zwierząt uśmiercano 3 i 7 dni po operacji. W porównaniu ze zwierzętami przeszczepionymi, częstość występowania ropni zespolenia i przecieków była wyższa u zwierząt kontrolnych. W naszym modelu przeszczepienie arkuszy ASC po zespoleniu jelita grubego zakończyło się sukcesem i wiązało się z niższym wskaźnikiem przeciekania.

Schemat blokowy niniejszego badania, przedstawiający zarówno hodowlę arkuszy ASC, jak i procedurę resekcji i anastomozy jelita grubego, został przedstawiony na Rysunku 1. Rysunek 2 przedstawia morfologię mikroskopową arkuszy ASC oraz wygląd makroskopowy arkusza ASC podczas i po oddzieleniu. Rysunek 3 przedstawia poszczególne etapy oddzielania i transplantacji arkuszy ASC. Rysunek...

Przedstawiono przygotowanie i przeszczep arkuszy komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC) na niedostatecznie zszyte zespolenia jelita grubego w modelu szczurzym. To nowatorskie zastosowanie pokazuje, że arkusze ASC mogą zmniejszyć nieszczelność zespolenia jelita grubego.

Przeszczep arkusza komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej w celu zmniejszenia przecieku po częściowej kolektomii w modelu szczurzym

Anastomotic leakage is a disastrous complication after colorectal surgery. Although current methods for leakage prevention have different levels of ...

Ponieważ zakładają one pozytywny wpływ na gojenie się tkanek, arkusze ASC zostały przetestowane w wielu modelach chorobowych, takich jak zawał mięśnia sercowego. Ten eksperyment pokazuje, że arkusze ASC mogą być używane dobrzusznie i stosować do jelita. Główną zaletą arkuszy ASC jest to, że nie są potrzebne żadne materiały syntetyczne.Ponadto przeszczep arkusza ASC jest stosunkowo łatwy do wykonania, wymaga tylko niewielkiej praktyki. To nowatorskie zastosowanie przeszczepu arkusza ASC zostało opracowane w celu zapobiegania przeciekaniu po resekcji jelita grubego i stanowi pierwszy krok, do którego prowadzi nowa strategia terapeutyczna. Wykazano, że arkusze ASC stosowane do zespoleń jelitowych są obiecujące w zapobieganiu wyciekom.Arkusze ASC mogą być również stosowane do innych narządów wewnątrzbrzusznych, takich jak drogi moczowe. Zacznij od wypreparowania ludzkiej podskórnej tkanki tłuszczowej brzucha na 0,5 cm kawałki, za pomocą sterylnego ostrza chirurgicznego w rozmiarze 10, kleszczyków do tkanek Adson-Brown i nożyczek Metzenbauma. Zważ całkowitą ilość wypreparowanej tkanki w sterylnej szklanej butelce.Dodać 30 ml pożywki izolacyjnej na butelkę. I trawić wypreparowaną tkankę

transplantation-adipose-tissue-derived-stem-cell-sheet-to-reduce

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film demonstruje technikę izolowania i hodowli fluorescencyjnie znakowanych komórek macierzystych pochodzących z grzebienia nerwowego (ADSC) z mysiej tkanki tłuszczowej łuku okołoaortalnego. Po wyizolowaniu NCADSC są wykrywane, sortowane za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją, a następnie hodowane na płytce, co sprzyja proliferacji komórek.

Izolowanie komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej myszy okołoortowej

W 2001 roku naukowcy z UCLA opisali izolację populacji dorosłych komórek macierzystych, określanych jako komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej lub ASC. W tym artykule przedstawiono izolację ASC z lipoaspiratów przy użyciu ręcznego, enzymatycznego protokołu trawienia z użyciem kolagenazy.

Ręczna izolacja komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej z ludzkich lipoaspiratów

Komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (ASC) są łatwo izolowane i zbierane z tłuszczu normalnych szczurów. Arkusze ASC mogą być tworzone przy użyciu inżynierii arkuszy komórkowych i mogą być przeszczepiane do tłustych szczurów z cukrzycą Zuckera, wykazujących defekty skóry na całej grubości z odsłoniętą kością, a następnie pokryte dwuwarstwą sztucznej skóry.

Tworzenie i przeszczepianie arkusza komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC) w modelu gojenia się ran cukrzycowych

To badanie opisuje udaną metodę endoskopowego przeszczepu komórek zrębu pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSC) w celu zapobiegania zwężeniu przełyku po rozszerzonej endoskopowej dyssekcji podśluzówkowej (ESD) w modelu trzody chlewnej.

Przeszczep arkusza ADSC w celu zapobiegania zwężeniu po rozszerzonym endoskopowym rozwarstwieniu podśluzówkowym przełyku

Tutaj prezentujemy protokół do opracowania modelu raka in vivo przy użyciu technologii arkuszy komórkowych. Taki model może być bardzo przydatny do oceny terapii przeciwnowotworowych.

Badanie potencjału arkusza mezenchymalnych komórek macierzystych w rozwoju raka wątrobowokomórkowego in vivo

Ten artykuł opisuje metodę przeszczepiania komórek nabłonka sutka szczura dawcy do białej poduszeczki tłuszczowej między łopatkami u zwierząt biorców. Metoda ta może być stosowana do badania wpływu gospodarza i/lub dawcy na rozwój nabłonka sutka i eliminuje potrzebę wstępnego oczyszczania, zwiększając w ten sposób przydatność tej techniki.

Przeszczep komórek nabłonkowych sutka szczura do białej poduszeczki tłuszczowej między łopatkami

Ta metoda przeszczepiania wysp trzustkowych pokrytych tłuszczem jest odpowiednia do wykrywania wszczepionych wysp trzustkowych w jamie wewnątrzotrzewnowej. Co ważne, nie wymaga stosowania środków wiążących biologicznie ani szycia.

Przeszczep wysp trzustkowych pokrytych tłuszczem z wykorzystaniem białej tkanki tłuszczowej najądrza

Ten protokół opisuje metodę tworzenia szczurzego modelu zapalenia torebki. Model worka jelita krętego powstał poprzez wykonanie operacji zespolenia jelita krętego z odbytem (IPAA) z wykorzystaniem technik mikrochirurgicznych. Po operacji szczur był leczony 4% siarczanem dekstranu sodu (DSS) przez 4 dni.

Szczurzy model zapalenia torebki po proktokolektomii i zespoleniu jelita krętego z odbytem przy użyciu siarczanu dekstranu sodu

Przedstawiamy tutaj protokół przeszczepu tkanki tłuszczowej białej i brązowej, który oferuje obiecującą strategię odwrócenia niepłodności, otyłości i hiperglikemii, jednocześnie poprawiając funkcję nerek u myszy z cukrzycą i otyłością BTBR.

Przeszczepy białego i brązowego tłuszczu: podejście do korekty deficytów rozrodczych, metabolicznych i nerkowych u myszy otyłych czarno-brązowych brachyury (BTBR)

Przedstawiamy tutaj standardową metodę efektywnej izolacji komórek macierzystych pochodzących z tłuszczu i adipocytów, charakteryzującą się skróceniem czasu przetwarzania o &gt;90%, wysoką żywotnością komórek oraz szeroką kompatybilnością.

Efektywna izolacja komórek macierzystych i adipocytów pochodzących z tłuszczu z tkanki tłuszczowej wieprzi

Poznaj metodę przeszczepu arkuszy ASC na anastomozę okrężniczą u szczurów, aby zmniejszyć przeciek po częściowej kolektomii. Technika ta wspiera gojenie tkanek bez materiałów syntetycznych.

Przeszczep arkusza komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej w celu zmniejszenia przecieku po częściowej kolektomii w modelu szczurzym (Wideo) | JoVE Journal

Przeszczep arkusza komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej w celu zmniejszenia przecieku po częściowej kolektomii w modelu szczurzym

Przeglądaj więcej filmów