Izolacja komórek tucznych pochodzących z otrzewnej i ich charakterystyka funkcjonalna za pomocą Ca²+-obrazowania i testów degranulacji

Metody te mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie sygnalizacji wewnątrzkomórkowej na komórkach pobudliwych, takie jak to, które kanały jonowe są krytyczne dla aktywacji komórek odpornościowych i uwalniania mediatorów. Głównymi zaletami tych technik jest ich względna prostota oraz możliwość jednoczesnej analizy dużej liczby komórek. Obrazowanie wapnia Fura-2 w komórkach tucznych zademonstruje Kathrin Ohlenschlager, doktorantka z mojego laboratorium.

Aby rozpocząć tę procedurę, spryskaj uśpioną mysz 70% etanolem i przymocuj ją do bloku piankowego grzbietem do dołu za pomocą szpilek. Za pomocą nożyczek o krawędziach usuń skórę z brzucha myszy i unikaj uszkodzenia jamy otrzewnej. Następnie wstrzyknij siedem mililitrów lodowatego podłoża RPMI do jamy otrzewnej, ostrożnie wprowadzając igłę o rozmiarze 27 w otrzewnej.

Nie należy perforować żadnych narządów i użyć miejsca w okolicy tłuszczu najądrza, aby zmniejszyć ryzyko perforacji narządu. Po wstrzyknięciu należy potrząsać myszą przez minutę, aby odłączyć komórki otrzewnej od podłoża RMPI. Nie potrząsaj myszą zbyt mocno, aby uniknąć uszkodzenia narządów wewnętrznych i zanieczyszczenia jamy otrzewnej krwią.

Następnie należy ponownie użyć strzykawki, wyposażając ją w nową kaniulę o rozmiarze 20. Przesuń narządy wewnętrzne na jedną stronę, przechylając blok piankowy i delikatnie stukając nim o ławkę, aby ułatwić aspirację podłoża z drugiej strony. Następnie włóż igłę o rozmiarze 20 rozmiarów, aby delikatnie i powoli zassać płyn z jamy brzusznej, aby uniknąć zatkania przez narządy wewnętrzne.

Zbierz jak najwięcej płynu. Następnie wyjąć igłę ze strzykawki i przenieść zawiesinę pobranych komórek do probówki zbiorczej na lodzie. Wyrzuć probówkę z próbką, jeśli widoczne jest zanieczyszczenie krwi.

Odwirować probówkę z czystą zawiesiną komórkową o masie 300 g przez pięć minut. Pod sterylnym kapturem odessać supernatant. Ponownie zawiesić osady próbki w zimnym podłożu PMC i przenieść zawiesinę komórek do kolby do hodowli komórek o powierzchni 25 centymetrów kwadratowych.

Następnie dodaj czynniki wzrostu IL-3 i SCF do końcowych stężeń odpowiednio 10 nanogramów na mililitr i 30 nanogramów na mililitr. Inkubuj komórki przez około 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza do następnego zabiegu. W dniach od 12 do 15, jeśli planowane są jakiekolwiek eksperymenty ze stymulacją plazmalemalnych receptorów IgE, należy wstępnie potraktować komórki przez noc 300 nanogramami na mililitr IgE anty-DNP w standardowej pożywce hodowlanej.

Aby przygotować obrazowanie Fura-2, rozcieńczyć roztwór podstawowy Fura-2, AM w HBSS wapnia do końcowego stężenia pięciu mikromoli w celu przygotowania buforu ładującego. Następnie wymieszaj 500 mikrolitrów buforu ładującego z 500 mikrolitrami zawiesiny komórek PMC. Odpipetować mieszaninę do komory obrazowania i inkubować komórki przez 20 do 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.

Skonfiguruj grawitacyjny system aplikacji z różnymi roztworami zgodnie z protokołem stymulacji. Następnie zamontuj system aplikacji na stoliku mikroskopu odwróconego. Przygotuj 40-krotny obiektyw immersyjny z olejkiem o dużej aperturze, umieszczając na nim małą kroplę olejku immersyjnego.

Umieść komorę obrazowania z załadowanymi komórkami w systemie aplikacyjnym i zabezpiecz ją, aby zapobiec przemieszczaniu się podczas nagrywania. Następnie włącz przepuszczane światło i skup się na komórkach. Następnie uruchom program akwizycji obrazowania w trybie akwizycji fizjologicznej.

Otwórz okno ustawień i dostosuj ostrość oraz optymalny czas akwizycji. Zobrazuj obraz referencyjny i oznacz komórki jako ROI. Zaznacz ostatni zwrot akcji w obszarze, w którym nie ma żadnych komórek, i zdefiniuj go jako tło.

Następnie zakończ konfigurację i rozpocznij pomiar z pięciosekundową szybkością akwizycji. Następnie dodaj roztwory o odpowiednim numerze cyklu zgodnie z projektem eksperymentu. Aby zmierzyć wywołane antygenem zwiększenie wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia, należy zastosować roztwór strzykawki numer dwa po 20 cyklu i zatrzymać rejestrację po 150 cyklu.

Aby zmierzyć wywołane związkiem 48/80 zwiększenie stężenia wapnia w wewnątrzkomórkowych warunkach, należy zastosować roztwór strzykawki po 20 cyklu i zatrzymać rejestrację po 150 cyklu. Aby zmierzyć podwyższenie wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia wywołane przez SOCE, należy zastosować roztwór strzykawki numer cztery po 10 cyklu, zastosować roztwór strzykawki numer pięć po cyklu 70, zastosować roztwór strzykawki numer cztery po cyklu 120, zastosować roztwór strzykawki po cyklu 150 i zatrzymać nagrywanie po cyklu 220. W programie akwizycyjnym naciśnij kolejno przyciski Start Cutter, Zaznacz wszystko, Konwertuj wszystko, Pomiary fizjologiczne, OK, a następnie ponownie OK.

Zapisz pliki jako tabele i stosy obrazów do analizy w trybie offline. Aby zmierzyć uwalnianie beta-heksozaminidazy, przenieś 100 mikrolitrów zawiesiny komórek na studzienkę do 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V. Dodaj 25 mikrolitrów roztworu stymulującego lub kontrolnego do każdej studzienki.

Następnie inkubuj komórki przez 45 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie zatrzymaj reakcję, umieszczając 96-dołkową płytkę na lodzie na pięć minut. Następnie odwirować płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez cztery minuty w temperaturze 120 g.

Przenieść 120 mikrolitrów supernatantu na płaskodenną 96-dołkową płytkę i umieścić ją na lodzie. Ostrożnie unikaj dotykania osadów komórkowych, ale całkowicie zasysaj supernatant. Następnie dodaj 125 mikrolitrów buforu do lizy do granulek komórek.

Inkubować osady komórkowe przez pięć minut w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić je po inkubacji przez wielokrotne pipetowanie. Odpipetować 25 mikrolitrów czteromilimolowego roztworu pNAG w wymaganych studzienkach nowej płaskodennej 96-dołkowej płytki. Do przygotowanego roztworu pNAG dodać 25 mikrolitrów każdego supernatantu i 25 mikrolitrów każdego lizatu komórkowego osobno.

Inkubować partie reakcyjne przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji odpipetować 150 mikrolitrów roztworu zatrzymującego do każdego dołka, aby zatrzymać reakcję. Następnie przeanalizuj absorbancję światła próbki płytki za pomocą czytnika mikropłytek o długości 405 nanometrów z odniesieniem 630 nanometrów w celu automatycznego odejmowania tła.

W programie akwizycji zaznacz pole Odniesienie, a następnie w menu elementu programu absorbancji wybierz 630 nanometrów do automatycznego odejmowania tła. Test uwalniania beta-heksozaminidazy przeprowadzono w celu zbadania zdolności izolowanych PMC, które ulegają degranulacji po usieciowaniu plazmalemmalnych receptorów IgE o wysokim powinowactwie lub stymulacji receptorów Mrg PRB2. Komórki dodano do 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V i stymulowano zgodnie z tym schematem przez 45 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po odwirowaniu i usunięciu supernatantu, granulki poddano lizie. Zawartość beta-heksozaminidazy w poszczególnych supernatantach i lizatach osadów analizowano następnie w ich reakcjach z pNAG podczas godzinnej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Ilość produktów reakcji wykryto kolorymetrycznie i obliczono procent uwolnionej beta-heksozaminidazy.

Spontaniczne uwalnianie było bardzo niskie, podczas gdy odpowiedzi na silne bodźce degranulacyjne, takie jak 10 mikromolowa jonomycyna i związek 48/80 w dawce 50 mikrogramów na mililitr, wynosiły odpowiednio ponad 40% i 60%. Reakcje degranulacyjne na stymulację DNP były zależne od dawki w zakresie stężeń od 10 do 300 miligramów na mililitr. Łącznie dane te wyraźnie wskazują na dobry stan funkcjonalny izolowanych PMC.

Stosując tę technikę, w ciągu dwóch tygodni uzyskasz wysoce czystą populację mysich dojrzałych komórek tucznych tkanki łącznej pochodzących z otrzewnej. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o zachowaniu sterylnych warunków podczas izolacji komórek i hodowli, aby uniknąć zanieczyszczenia bakteryjnego. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak elektrofizjologiczne pomiary prądu jonów krosowych, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące szlaków wnikania wapnia w komórkach tucznych.

Po opracowaniu, technika wewnątrzkomórkowego obrazowania wapnia Fura-2 utorowała drogę naukowcom zajmującym się fizjologią komórek masowych do zbadania zależności degranulacji komórek tucznych od wapnia. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzać eksperymenty obrazowania wapnia Fura-2 i test degranulacji beta-heksozaminidazy z komórkami tucznymi. Nie zapominaj, że praca z promieniowaniem UV może być niebezpieczna dla oczu i skóry, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy unikać niepotrzebnej ekspozycji.