Połączenie optogenetyki ze sztucznymi mikroRNA w celu scharakteryzowania wpływu knockdownu genów na funkcję presynaptyczną w nienaruszonych obwodach neuronalnych

Ogólnym celem połączenia interferencji RNA za pośrednictwem sztucznego mikroRNA z optogenetyką jest scharakteryzowanie wpływu knockdownu genu na funkcję presynaptyczną w nienaruszonych obwodach neuronalnych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie fizjologii synaptycznej, takie jak zajęcie się fizjologiczną rolą białek presynaptycznych w nienaruszonych obwodach mózgu. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona selektywne monitorowanie transmisji synaptycznej w neuronach o zmniejszonej ekspresji badanego białka presynaptycznego.

Użyliśmy również tej metody do zbadania funkcji presynaptycznej w ostrych wycinkach mózgu. Może być również stosowany do manipulowania i sondowania bezpieczeństwa neuronów in vivo. Procedurę zademonstruje Carmela Vitale, doktorantka z naszego laboratorium.

Po zaprojektowaniu mikroRNA i skonstruowaniu wektora rekombinowanego do ekspresji mikroRNA oraz sondy optogenetycznej, należy przygotować pierwotne kultury neuronalne z obszaru mózgu będącego przedmiotem zainteresowania. Aby to zrobić, postępuj zgodnie z ustalonym protokołem kortykokulturacji opracowanym przez L.A. Cingolani and Company z następującymi modyfikacjami. Po pierwsze, użyj płytek sześciodołkowych, umieść pół miliona neuronów na studzienkę i użyj 2,5 mililitra podłoża przyłączającego na studzienkę.

Po inkubacji płytki przez cztery godziny zmień na 3,3 mililitra pożywki podtrzymującej na dołek, a jeśli obserwuje się przerost astrocytów, dodaj 0,5 mililitra pożywki podtrzymującej uzupełnionej 7,5 mikromola AraC w trzech do czterech DIV. Przy pięciu do sześciu DIV zainfekuj trzy dołki dla każdego mikroRNA do przetestowania. Użyj najniższej dawki zakaźnej, która zainfekuje co najmniej 99% neuronów.

Dodaj wirusa bezpośrednio do neuronów, delikatnie wymieszaj i umieść płytki z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przy 17 do 18 DIV neurony poddają się lizie w celu ekstrakcji RNA. Przechyl płytki i użyj szklanych pipet, aby usunąć całe medium z każdej studzienki.

Następnie natychmiast dodaj 700 mikrolitrów odczynnika do lizy do każdej studzienki. Po krótkim wymieszaniu przenieś lizat komórkowy z każdej studzienki do oddzielnych 1,5-mililitrowych probówek. Następnie dodaj 140 mikrolitrów chloroformu do każdego lizatu.

Szybko zakręć probówki i energicznie nimi potrząsaj przez 15 sekund, aby zemulgować zawartość. Następnie odwiruj probówki w temperaturze 12 000 razy G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie ostrożnie przenieś górną fazę wodną zawierającą RNA do nowej probówki.

Nie pozwól, aby końcówka pipety dotykała fazy organicznej. Do fazy wodnej dodać 1,5 objętości 100% etanolu i powoli pipetować roztwór trzy razy, aby wymieszać. Następnie oczyść RNA za pomocą dostępnego na rynku zestawu i określ ilościowo plony.

Spodziewaj się co najmniej 3,5 mikrograma na próbkę. Proporcje czystości w stosunku do białek i związków organicznych powinny wynosić co najmniej 1,9. Następnie użyj zestawu do retrotranskrypcji 250, 500 lub 1 000 nanogramów RNA.

Następnie określ ilościowo skuteczność knockdown dla endogennego genu będącego przedmiotem zainteresowania za pomocą ilościowego RTPCR. Dąż do skuteczności knockdown na poziomie co najmniej 60%W tym protokole użyj zwierzęcia, któremu 15 dni wcześniej lub dłużej wstrzyknięto RAAV12 do mózgu, zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem przez A.Cetin and Company. Wyizoluj mózg i wykonaj ostre plastry mózgu za pomocą wibratomu i zagazowanego, lodowatego ACFF.

Zbierz wycinki obszaru zainteresowania i zminimalizuj ich ekspozycję na światło, aby uniknąć aktywacji sondy optogenetycznej. Pozwól plastrom dojść do siebie przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w tym samym ACFF. Użyj komory specjalnie zaprojektowanej do przechowywania plasterków mózgu.

Następnie przywróć plastry do temperatury pokojowej, gdzie pozostaną zdrowe przez sześć do ośmiu godzin. Aby kontynuować, przenieś plasterek do komory nagrywającej i przelej go z prędkością dwóch mililitrów na minutę ACFF. Następnie krótko sprawdź sygnał wyrażonego reportera fluorescencyjnego, aby upewnić się o lokalizacji i intensywności infekcji.

Następnie napełnij elektrodę łatową roztworem wewnątrzkomórkowym. Teraz, w świetle podczerwonym, uzyskaj szczelną konfigurację hurtową na neuronie, który odbiera sygnały synaptyczne z zainfekowanych neuronów. Rezystancję szeregową można pozostawić bez kompensacji, ale powinna być stała i niska.

Na przykład, jeśli neurony piramidowe CA3 zostały zainfekowane, załataj neurony piramidowe w proksymalnym i przyśrodkowym odcinku regionu CA1. Kiedy komórki zaczynają wyglądać na skurczone lub spuchnięte, gdy łatanie staje się trudne lub partie są niestabilne, wybrane wycinki nie są już wystarczająco zdrowe, aby można było z nich nagrywać. Następnie użyj farmakologii, aby wyizolować badane prądy synaptyczne.

Na przykład, jeśli celem jest zbadanie pobudzającej transmisji synaptycznej, zablokuj hamującą transmisję synaptyczną poprzez dodanie bicukuliny do kąpieli. Następnie wywołaj prądy synaptyczne, takie jak pobudzające prądy postsynaptyczne, za pomocą 473-nanometrowego niebieskiego lasera sprzężonego ze światłowodem umieszczonym na somatach zainfekowanych neuronów. Nie kieruj lasera na aksony neuronów.

Na przykład unikaj rzucania światła na zabezpieczenia Shaffera. Bezpośrednia depolaryzacja aksonów nie jest pożądana. Następnie dostosuj długość stymulacji do minimum, aby zmniejszyć możliwość wywołania więcej niż jednego potencjału czynnościowego na impuls świetlny.

Następnie dopracuj intensywność lasera, aby wywołać mały, ale wyraźnie wykrywalny prąd synaptyczny. Na przykład, w przypadku pobudzającej transmisji synaptycznej między neuronami piramidowymi CA3 i CA1, dostosuj intensywność lasera, aby wywołać prądy synaptyczne o natężeniu od 20 do 50 pikoamperów. Pod koniec eksperymentu nałóż tetrodotoksynę o stężeniu 0,5 mikromola, aby zablokować kanały sodowe.

Wrażliwość prądów wywołanych optycznie na tetrodotoksynę wskazuje, że są one napędzane potencjałem czynnościowym. Kontynuuj zbieranie danych, aż co najmniej osiem neuronów zostanie załatanych dla danego schorzenia od co najmniej trzech różnych zwierząt. Jest to minimalna ilość danych potrzebnych do analizy wyników.

Za pomocą opisanej metody zniszczono alternatywne izoformy splicingowe presynaptycznych kanałów wapniowych bramkowanych napięciem typu P/Q. Uważa się, że kanały te regulują krótkotrwałą plastyczność synaptyczną w synapsach pobudzających CA3 do CA1. Stworzono cztery różne konstrukty wyrażające mikroRNA specyficzne dla izoformy; każdy z nich był eksprymowany razem z ultraszybką rodopsyną kanałową wraz z białkiem fluorescencyjnym Td-Tomato.

Po pierwsze, potwierdzono, że każdy konstrukt ma wystarczającą skuteczność knockdown i selektywność w pierwotnych hodowlach neuronów szczurów przy użyciu ilościowego RTPCR specyficznego dla izoformy. Następnie każdy konstrukt został wstrzyknięty do hipokampa szczurów P18. Ostatecznie zbadano wpływ konstruktów na krótkoterminową plastyczność synaptyczną w synapsach CA3 do CA1 poprzez stymulację zainfekowanych neuronów piramidowych CA3 krótkimi impulsami światła o długości 473 nanometrów oraz rejestrację powstałych EPSC w konfiguracji hurtowej z neuronów piramidowych regionu CA1.

Knockdown różnych izoform splicingu wpłynął na reakcje na sparowaną stymulację impulsową w przeciwnych kierunkach. Knockdown izoformy A wzmocnił ułatwienie parowanego impulsu; podczas gdy knockdown izoformy B go zniósł. Połączenie interferencji RNA w optogenetyce pozwala na badania w dziedzinie fizjologii synaptycznej w celu zbadania, w jaki sposób białka presynaptyczne regulują krótkoterminową plastyczność synaptyczną w nienaruszonych obwodach.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak walidować mikroRNA pod kątem interferencji RNA i jak łączyć je z optogenetyką w celu zbadania transmisji synaptycznej w ostrych wycinkach mózgu.