Name: Połączenie optogenetyki ze sztucznymi mikroRNA w celu scharakteryzowania wpływu knockdownu genów na funkcję presynaptyczną w nienaruszonych obwodach neuronalnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Poznaj metodę łączącą sztuczne mikroRNA z optogenetyką do badania funkcji presynaptycznej w nienaruszonych obwodach neuronalnych. Technika umożliwia selektywną stymulację i analizę transmisji synaptycznej w ostrych preparatach mózgu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy F. Benfenati (Istituto Italiano di Tecnologia, IIT) za wsparcie i Carmela Vitale za pomoc w demonstracji. Praca ta została sfinansowana przez IIT i Compagnia San Paolo (grant nr 9734 dla LAC).

<ol><li>Lam, J. K., Chow, M. Y., Zhang, Y., Leung, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA+Versus+miRNA+as+Therapeutics+for+Gene+Silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther-Nucl+Acids%22%5BJournal%5D)">siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing.</a> Mol Ther-Nucl Acids. 4, e252(2015).</li>
<li>Kohl, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemisphere-specific+optogenetic+stimulation+reveals+left-right+asymmetry+of+hippocampal+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity.</a> Nat Neurosci. 14 (11), 1413-1415 (2011).</li>
<li>Maejima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+loss+of+P%2FQ-type+channels+confined+to+rhombic-lip-derived+neurons+alters+synaptic+transmission+at+the+parallel+fiber+to+purkinje+cell+synapse+and+replicates+genomic+Cacna1a+mutation+phenotype+of+ataxia+and+seizures+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Postnatal loss of P/Q-type channels confined to rhombic-lip-derived neurons alters synaptic transmission at the parallel fiber to purkinje cell synapse and replicates genomic Cacna1a mutation phenotype of ataxia and seizures in mice.</a> J Neurosci. 33 (12), 5162-5174 (2013).</li>
<li>Mark, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+postnatal+loss+of+P%2FQ-type+calcium+channels+recapitulates+the+absence+epilepsy%2C+dyskinesia%2C+and+ataxia+phenotypes+of+genomic+Cacna1a+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Delayed postnatal loss of P/Q-type calcium channels recapitulates the absence epilepsy, dyskinesia, and ataxia phenotypes of genomic Cacna1a mutations.</a> J Neurosci. 31 (11), 4311-4326 (2011).</li>
<li>Thalhammer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+Splicing+of+P%2FQ-Type+Ca2%2B+Channels+Shapes+Presynaptic+Plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Alternative Splicing of P/Q-Type Ca2+ Channels Shapes Presynaptic Plasticity.</a> Cell Rep. 20 (2), 333-343 (2017).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-phosphate-mediated+Transfection+of+Eukaryotic+Cells+with+Plasmid+DNAs%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Calcium-phosphate-mediated Transfection of Eukaryotic Cells with Plasmid DNAs.</a> CSH Protoc. 2006 (1), (2006).</li>
<li>Chung, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycistronic+RNA+polymerase+II+expression+vectors+for+RNA+interference+based+on+BIC%2FmiR-155%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Polycistronic RNA polymerase II expression vectors for RNA interference based on BIC/miR-155.</a> Nucleic Acids Res. 34 (7), e53(2006).</li>
<li>McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+titering+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors.</a> J Vis Exp. (57), e3348(2011).</li>
<li>Cingolani, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+regulation+of+synaptic+AMPA+receptor+composition+and+abundance+by+beta3+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent regulation of synaptic AMPA receptor composition and abundance by beta3 integrins.</a> Neuron. 58 (5), 749-762 (2008).</li>
<li>Huang, H., Xu, Y., Cheng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+alternative+splicing+during+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of alternative splicing during epithelial-mesenchymal transition.</a> J Vis Exp. (92), e51845(2014).</li>
<li>Vandesompele, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+normalization+of+real-time+quantitative+RT-PCR+data+by+geometric+averaging+of+multiple+internal+control+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes.</a> Genome Biol. 3 (7), (2002).</li>
<li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nat Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press. (2012).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Rat+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press. (2013).</li>
<li>Gunaydin, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+optogenetic+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ultrafast optogenetic control.</a> Nat Neurosci. 13 (3), 387-392 (2010).</li>
<li>Bourinet, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+of+alpha+1A+subunit+gene+generates+phenotypic+variants+of+P-+and+Q-type+calcium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Splicing of alpha 1A subunit gene generates phenotypic variants of P- and Q-type calcium channels.</a> Nat Neurosci. 2 (5), 407-415 (1999).</li>
<li>Chaudhuri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+as+a+molecular+switch+for+Ca2%2B%2Fcalmodulin-dependent+facilitation+of+P%2FQ-type+Ca2%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing as a molecular switch for Ca2+/calmodulin-dependent facilitation of P/Q-type Ca2+ channels.</a> J Neurosci. 24 (28), 6334-6342 (2004).</li>
<li>Soong, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+splice+variants+in+human+P%2FQ-type+channel+alpha1%282.1%29+subunits%3A+implications+for+current+density+and+Ca2%2B-dependent+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of splice variants in human P/Q-type channel alpha1(2.1) subunits: implications for current density and Ca2+-dependent inactivation.</a> J Neurosci. 22 (23), 10142-10152 (2002).</li>
<li>Berndt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+channelrhodopsins+for+fast+neuronal+stimulation+at+low+light+levels%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">High-efficiency channelrhodopsins for fast neuronal stimulation at low light levels.</a> P Natl Acad Sci USA. 108 (18), 7595-7600 (2011).</li>
<li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li>
<li>Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+engineered+channelrhodopsin+variants+with+improved+properties+and+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics.</a> Biophys J. 96 (5), 1803-1814 (2009).</li>
<li>Zhang, Y. P., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+induction+of+synaptic+plasticity+using+a+light-sensitive+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel.</a> Nat Methods. 4 (2), 139-141 (2007).</li>
<li>Fowler, D. K., Williams, C., Gerritsen, A. T., Washbourne, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+knockdown+from+artificial+microRNAs+in+an+enhanced+miR-155+backbone%3A+a+designer%27s+guide+to+potent+multi-target+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Improved knockdown from artificial microRNAs in an enhanced miR-155 backbone: a designer's guide to potent multi-target RNAi.</a> Nucleic Acids Res. 44 (5), e48(2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Jednoczesna ekspresja sondy optogenetycznej i miR przeciwko genowi presynaptycznemu będącemu przedmiotem zainteresowania oferuje potężne podejście do scharakteryzowania wpływu knockdownu genu na funkcję presynaptyczną w nienaruszonych obwodach neuronalnych. Dla tego eksperymentalnego podejścia ważne jest zidentyfikowanie i scharakteryzowanie miR, które są wysoce wydajne i selektywne w powalaniu genu będącego przedmiotem zainteresowania w systemach natywnych. Jeśli to możliwe, należy użyć dwóch lub więcej niezależnych miR przeciwko temu samemu mRNA będącemu przedmiotem zainteresowania, aby kontrolować ewentualne efekty poza celem. Eksperymenty ratunkowe, w których gen oporny na miR jest ponownie wprowadzany do systemu, mogą być stosowane jako kontrola swoistości.
Użycie tego samego konstruktu do ekspresji sondy optogenetycznej i miR pozwala na optyczną stymulację tylko tych neuronów presynaptycznych, które zostały zmanipulowane. Nie jest to możliwe w przypadku stymulacji elektrycznej, ponieważ nie rozróżniają one neuronów zainfekowanych i niezainfekowanych, dając w ten sposób mieszane i rozcieńczone wyniki. Ponieważ stymulacje optyczne mogą indukować wiele potencjałów czynnościowych15, ważne jest, aby wybierać tylko najszybsze sondy optogenetyczne z rozszerzającej się palety 15,19,20,21. Ponadto konieczne jest upewnienie się, że stymulacja optyczna nie indukuje bezpośredniej depolaryzacji napadów presynaptycznych, aby uniknąć pominięcia niektórych etapów transmisji synaptycznej, które chce się zbadać22.
Opisane przez nas podejście eksperymentalne umożliwia równoległą ocenę fizjologicznego znaczenia wielu genów presynaptycznych będących przedmiotem zainteresowania w ograniczonym okresie czasu (4-6 miesięcy). Należy jednak pamiętać, że nokdauny rzadko sięgają 100%. Co więcej, rAAV muszą być eksprymowane przez co najmniej dwa tygodnie, aby umożliwić maksymalne wyłączenie i pełną ekspresję sondy optogenetycznej, co może stanowić ograniczenie czasowe podczas badania wczesnych procesów rozwojowych. Chociaż jest to bardziej czasochłonne, myszy z warunkowym nokautem ograniczone do neuronów presynaptycznych, zazwyczaj skutkują całkowitym usunięciem genu będącego przedmiotem zainteresowania i dlatego oferują ważne podejście uzupełniające.
Szczególną zaletą technologii miR jest to, że umożliwia ona ekspresję wielu miR z tego samego promotora. Ta właściwość została wykorzystana głównie do zwiększenia wydajności knockdown poprzez wstawienie wielu kopii tego samego miR lub różnych miR przeciwko temu samemu genowi docelowemu. Może być jednak również używany do niszczenia wielu genów poprzez ekspresję miR przeciwko różnym genom docelowym 7,23. Ta właściwość może być wykorzystana do wyciszenia wielu białek presynaptycznych w celu przeanalizowania presynaptycznych szlaków sygnałowych.
Tutaj połączyliśmy optogenetykę ze sztucznymi miR, aby scharakteryzować wpływ knockdownu genów na funkcję presynaptyczną w ostrych wycinkach hipokampa. Podobne podejście można również zastosować do manipulowania i badania obwodów neuronalnych in vivo. Ponadto połączenie sztucznych miR z metodami chemogenetycznymi umożliwiłoby badanie obwodów neuronalnych w dłuższych skalach czasowych.

Ten protokół opisuje nowe podejście do charakteryzowania wpływu knockdownu genu na funkcję presynaptyczną w obrębie nienaruszonych obwodów neuronalnych. Badanie funkcji presynaptycznych w nienaruszonych obwodach neuronalnych jest wyzwaniem, ponieważ wiele butonów presynaptycznych jest zbyt małych i daleko od somy, aby umożliwić połączone interwencje molekularne i elektrofizjologiczne. Chociaż interferencja RNA oferuje potężny i elastyczny sposób na zniszczenie białek synaptycznych1, podejście to było używane oszczędnie do badania funkcji presynaptycznych, ponieważ trudno jest wykryć efekty knockdownu za pomocą tradycyjnych stymulacji elektrycznych, które nie rozróżniają między zmanipulowanymi i naiwnymi butonami presynaptycznymi2. W tym miejscu opisujemy, jak połączyć interferencję RNA za pośrednictwem sztucznego mikroRNA (miR) z niedawno opracowaną technologią optogenetyczną w celu uzyskania selektywnej stymulacji zmanipulowanych boutonów presynaptycznych w ostrych wycinkach mózgu.
Chociaż myszy z warunkowym nokautem w połączeniu z elektrofizjologią mogą być również używane do badania funkcji białek presynaptycznych3,4, nasza strategia nie wymaga rozwoju i utrzymywania genetycznie modyfikowanych linii myszy i może być również łatwo wykorzystana do niszczenia określonych izoform genu. W porównaniu z częściej stosowanymi krótkimi RNA spinki do włosów (shRNA), sztuczne miR, które tutaj stosujemy, oferują kluczowe korzyści w zakresie knockdownu neuronów. W przeciwieństwie do shRNA, mogą one ulegać ekspresji pod kontrolą promotora polimerazy II1. W ten sposób pojedynczy promotor może być używany do sterowania ekspresją zarówno miR, jak i sondy optogenetycznej, wraz z reporterem fluorescencyjnym. W ten sposób rozmiar konstruktu może być utrzymany w granicach opakowania rekombinowanych wirusów związanych z adenowirusami (rAAV, <silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Ponadto zastosowanie pojedynczego konstruktu i pojedynczego promotora zmniejsza zmienność eksperymentalną, ponieważ pozwala na ekspresję miR, sondy optogenetycznej i reportera fluorescencyjnego w ustalonym stosunku.
Ostatnio zastosowaliśmy tę technologię do zbadania roli alternatywnie splicowanych izoform presynaptycznych kanałów wapniowych w hipokampie5. Taka strategia ma ogólne zastosowanie do badania fizjologicznego znaczenia innych białek o ekspresji presynaptycznej w dowolnym interesującym obwodzie mózgu.

<table><tbody><tr><td>Akrylamid</td><td>Sigma</td><td>Akrylamid/Bis-akrylamid, roztwór 30%</td><td>Regulator temperatury toksycznych</td></tr><tr><td>zwierząt z poduszką termiczną</td><td>WPI</td><td>ATC2000</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek BCA</td> Zestaw wektorów ekspresji <td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>BLOCK-iT Pol II miR RNAi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K4936-00</td><td></td></tr><tr><td>Plastry mózgu Komora wstępna</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BSC-PC</td><td></td></tr><tr><td>CCD kamera termowizyjna</td><td>Bio-Rad</td><td>ChemiDoc&trade; </td><td></td>Odczynniki do</tr><tr><td>hodowli komórkowych</td> MP <td>Technologie życia Podłoże</td><td></td><td></td></tr><tr><td>chemiluminescencyjne</td><td>GE Helthcare</td><td>ECL Western Blotting Odczynniki, RPN2106</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>C2432</td><td>Cytozyna</td></tr><tr><td>toksyczna &beta;-D-arabinofuranozyd</td><td>Sigma</td><td>C6645</td><td></td></tr><tr><td>Wiertło</td><td>Foredom</td><td>K.1030</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Maść gentamycyna Apteka</td><td>lokalna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>54459</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipety iniekcyjne</td><td>Narishige</td><td>GD1</td><td></td></tr><tr><td>Sole nieorganiczne i detergenty</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>K2- fosforan kreatyny</td><td>Calbiochem</td><td>237911</td><td></td></tr><tr><td>KGlukonian</td><td>Fluka</td><td>60245</td><td></td></tr><tr><td>Laser</td><td>Laserglow Technologies</td><td>LRS-0473-GFM-00100-03</td><td></td></tr><tr><td>Membrana</td><td>Amersham</td><td>Protran&trade; 0,2 &micro; m NC</td><td></td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt do mikropipet</td><td>Narishige</td><td>IM-H1</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Narishige</td><td>PC-100</td><td></td></tr><tr><td>Na3GTP</td><td>Sigma</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>NaPyrgronian</td><td>Sigma</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Smar do oczu</td><td>Lokalna apteka</td><td>Lacrigel</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitory fosforanowe</td><td>Sigma</td><td>P0044, P5726</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitory proteazy</td><td>Sigma</td><td>cOmplete&trade;, Inhibitor proteazy bez EDTA Koktajl</td><td></td></tr><tr><td>białkowy Żel białkowy urządzenia do elektroforezy i blottingu</td><td>Bio-Rad</td><td>Mini-Protean III Cell</td><td></td></tr><tr><td>Providone Jod</td><td>Apteka lokalna</td><td>Betadine</td><td></td></tr><tr><td>Qiazol Odczynnik do lizy</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>QuantiTect Reverse Zestaw do transkrypcji</td><td>Qiagen</td><td>205311</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Aparat stereotaktyczny</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetrodotoksyna</td><td>Tocris</td><td>1069</td><td>Toksyczna</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td></td></tr></tbody></table>

połączenie optogenetyki ze sztucznymi mikrorna w celu scharakteryzowania wpływu knockdownu genów na funkcję presynaptyczną w nienaruszonych obwodach neuronalnych

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

Celem tego protokołu jest scharakteryzowanie wpływu knockdownu genu na funkcję presynaptyczną w obrębie nienaruszonych obwodów neuronalnych. Opisujemy przebieg pracy nad tym, jak połączyć interferencję RNA za pośrednictwem sztucznego mikroRNA (miR) z optogenetyką, aby osiągnąć selektywną stymulację zmanipulowanych butonów presynaptycznych w ostrych wycinkach mózgu. Podejście eksperymentalne polega na wykorzystaniu pojedynczego konstruktu wirusowego i pojedynczego promotora specyficznego dla neuronu w celu sterowania ekspresją zarówno sondy optogenetycznej, jak i sztucznych miR przeciwko genom presynaptycznym. Po stereotaktycznym wstrzyknięciu do obszaru mózgu będącego przedmiotem zainteresowania, wyrażony konstrukt umożliwia stymulację światłem wyłącznie neuronów o zmniejszonej ekspresji badanego genu (genów). Strategia ta nie wymaga rozwoju i utrzymania genetycznie zmodyfikowanych linii myszy i w zasadzie może być stosowana do innych organizmów i do dowolnego genu neuronalnego z wyboru. Niedawno zastosowaliśmy go do zbadania, w jaki sposób knockdown alternatywnych izoform splicingu presynaptycznych kanałów wapniowych bramkowanych napięciem typu P / Q (VGCC) reguluje krótkoterminową plastyczność synaptyczną w synapsach pobudzających CA3 do CA1 w ostrych wycinkach hipokampa. Podobne podejście można również zastosować do manipulowania i badania obwodów neuronalnych in vivo.

Opisane powyżej procedury stanowią niezawodną metodę oceny wpływu wyciszenia białek synaptycznych w neuronach presynaptycznych na przekaźnictwo synaptyczne. Poniżej, w ramach przykładu, przedstawiono reprezentatywne wyniki obrazujące, w jaki sposób wyciszenie alternatywnych izoform splicingowych presynaptycznych kanałów VGCC Cav2.1 (typu P/Q) reguluje krótkotrwałą plastyczność synaptyczną w pobudzających synapsach między obszarami CA3 a CA1.
Kanały Cav2.1 (typu P/Q) są dominującymi presynaptycznymi VGCC w większości szybkich synaps w ośrodkowym układzie nerwowym. Alternatywny splicing wzajemnie wykluczających się eksonów 37a i 37b podjednostki α1 tworzącej por kanału Cav2.1 (α1A) prowadzi do powstania dwóch głównych wariantów: Cav2.1[EFa] oraz Cav2.1[EFb]16,17,18. Aby określić, czy Cav2.1[EFa] i Cav2.1[EFb] różnicowo regulują transmisję synaptyczną i plastyczność w piramidowych neuronach hipokampa szczura, opracowaliśmy najpierw izoformowo-specyficzne miRs w celu selektywnego wyciszenia ekspresji (knockdown) Cav2.1[EFa] lub Cav2.1[EFb]5. Pomimo niewielkiego rozmiaru (97 bp) i wysokiego podobieństwa (61,86% identyczności na poziomie nukleotydów) między eksonami 37a i 37b, udało nam się zaprojektować trzy sekwencje miR przeciwko szczuremu Cav2.1[EFa] (miR EFa1: TCCTTATAGTGAATGCGGCCG; miR EFa2: ATGTCCTTATAGTGAATGCGG; miR EFa3: TTGCAAGCAACCCTATGAGGA) i dwie przeciwko szczuremu Cav2.1[EFb] (miR EFb1: ATACATGTCCGGGTAAGGCAT; miR EFb2: ATCTGATACATGTCCGGGTAA) z przewidywaną wysoką wydajnością wyciszenia. Jako kontrolę negatywną (miR Control) wykorzystaliśmy plazmid pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg zawierający sekwencję, która nie jest skierowana przeciwko żadnemu znanemu genowi kręgowców. Na podstawie wstępnego przesiewu w komórkach HEK 293 przeciwko kanałom heterologicznym wybrano miR EFa1, miR EFa3 oraz miR EFb2 i sklonowano ich kasety ekspresyjne do 3'UTR wektora pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X, który jest przeznaczony do produkcji rAAVs, a w którym promotor synapsyny steruje ekspresją ultraszybkiej channelrhodopsyny ChETA, czerwonego białka fluorescencyjnego TdTomato oraz wstawionego miR (Rycina 1). Powieliliśmy również kasetę ekspresyjną miR EFb2, aby zwiększyć wydajność wyciszenia przez ten miR.
Następnie przygotowaliśmy rAAV1/2 dla powyższych czterech konstruktów i określiliśmy ich wydajność oraz selektywność wyciszania w pierwotnych kulturach neuronów szczura za pomocą izoformowo-specyficznego qRT-PCR. miR EFa1 oraz miR EFa3 zredukowały poziom mRNA natywnego Cav2.1[EFa] o ~70%, lecz nie wpłynęły na poziom mRNA Cav2.1[EFb], podczas gdy miR EFb zredukował poziom mRNA natywnego Cav2.1[EFb] o ~60%, nie wpływając na mRNA Cav2.1[EFa] (Rycina 2).
Następnie każdy z czterech rAAV1/2 wstrzyknęliśmy stereotaktycznie do obszaru CA3 hipokampa szczurów P18 (Rysunek 3A-C), stosując współrzędne (A-P/M-L/D-V od Bregmy) −2,6/± 2,9/−2,9. Od piętnastu do dwudziestu czterech dni po iniekcji przygotowaliśmy ostre skrawki hipokampa od szczurów, którym wstrzyknięto rAAV1/2, i wykorzystaliśmy fluorescencję TdTomato do potwierdzenia ekspresji i lokalizacji rAAVs (Rysunek 3B). Aby zbadać, czy presynaptyczne wyciszenie (knockdown) Cav2.1[EFa] lub Cav2.1[EFb] wpłynęło na krótkotrwałą plastyczność synaptyczną w synapsach między obszarem CA3 a CA1, stymulowaliśmy selektywnie zainfekowane neurony CA3 krótkimi impulsami światła laserowego o długości fali 473 nm (czas trwania 2 ms; Rysunek 3C) i rejestrowaliśmy powstałe EPSCs, stosując metodę patch-clamp w neuronach piramidowych w części proksymalnej względem drogi przyśrodkowej regionu CA1 (Rysunek 3C). Stwierdziliśmy, że wyciszenie izoform splicingowych Cav2.1 wpłynęło na odpowiedzi na stymulację podwójnym impulsem w przeciwnych kierunkach: wyciszenie Cav2.1[EFa] (miR EFa1 lub miR EFa3) zwiększyło ułatwienie po podwójnym impulsie (PPF), podczas gdy wyciszenie Cav2.1[EFb] (miR EFb2) zniosło ten efekt (Rysunek 3D, E).
<img alt="Schemat plazmidu pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR X do ekspresji genów; zawiera sekwencje miRNA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57223/57223fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat konstruktów do połączonej ekspresji ultraszybkiej sondy optogenetycznej ChETA oraz izoformowo-specyficznych miR przeciwko Cav2.1[EFa] i Cav2.1[EFb]. (A) Mapa konstruktu rAAV pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X, zawierającego promotor synapsyny (Syn), ultraszybką kanałorodopsynę ChETA połączoną z TdTomato oraz, w proksymalnym regionie 3'UTR, miR specyficzny dla izoformy splicingu Cav2.1. Przedstawione enzymy restrykcyjne są enzymami tnącymi w jednym miejscu. (B) Góra, schemat kasety ekspresyjnej. Promotor synapsyny steruje ekspresją zarówno ChETA-TdTomato, jak i izoformowo-specyficznego miR. Dół, odwrotna komplementarność 21-nukleotydowych sekwencji docelowych, które stanowią część kasety miR. Dla miR EFb2 dwie identyczne kasety miR były eksprimowane tandemowo, jedna po drugiej. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57223/57223fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres słupkowy przedstawiający ekspresję mRNA Cav2.1 EF, czerwony/niebieski, warunki miR, istotność statystyczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57223/57223fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Ocena wydajności i selektywności wyciszania izoformowych miR dla Cav2.1[EFa] i Cav2.1[EFb]. Analiza qRT-PCR specyficzna dla izoform przeprowadzona na RNA wyizolowanym z pierwotnych kultur w 17-18 DIV, zainfekowanych w 6 DIV wektorami rAAV wykazującymi ekspresję miR celujących w Cav2.1[EFa] (miR EFa1 i miR EFa3) lub Cav2.1[EFb] (miR EFb2). Dane znormalizowano względem kontroli negatywnej (miR Control). miR EFa1 i miR EFa3 znacząco i selektywnie redukują mRNA Cav2.1[EFa] (odpowiednio n = 8 i 7 kultur), podczas gdy miR EFb znacząco i selektywnie redukuje mRNA Cav2.1[EFb] (n = 4 kultur; ***p&lt;0.001; jednoczynnikowa analiza wariancji ANOVA, a następnie test post-hoc Tukeya-Kramera). Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. Rycina została zaadaptowana z Thalhammer, A. et al.5. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57223/57223fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Układ do stymulacji optogenetycznej; analiza odpowiedzi synaptycznej; ChETA, optyczna, ekspresja miR, elektrofizjologia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57223/57223fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Ocena roli Cav2.1[EFa] i Cav2.1[EFb] w natywnym hipokampie poprzez ukierunkowaną stymulację optogenetyczną neuronów z wyciszonymi genami. (A) Schemat kasety ekspresyjnej konstruktów rAAV użytych do infekcji in vivo. (B) Przekrój hipokampa wykazujący, że fluorescencja TdTomato jest ograniczona do obszaru CA3 i jego projekcji. (C) Konfiguracja eksperymentalna: wiązka lasera była skierowana na somata CA3, a rejestracje metodą patch-clamp przeprowadzono z neuronów piramidowych CA1. (D) Impulsy niebieskiego (473 nm) światła laserowego o długości 2 ms emitowane z częstotliwością 20 Hz wywołują EPSCs, których PPF jest zwiększony przez miRs nakierowane na Cav2.1[EFa] i zniesiony przez miR dla Cav2.1[EFb]. (E) Podsumowanie stosunku podwójnego impulsu dla eksperymentów jak w (D), wykazujące wzrost PPF dla miR EFa1 i miR EFa3 oraz spadek dla miR EFb2 w stosunku do miR Control (n = 9 - 11 rejestracji; *p=0.02; **p=0.01; ***p&lt;0.0004; analiza kowariancji). Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. Rysunek został zaadaptowany z Thalhammer, A. et al.5. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57223/57223fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Ten protokół dostarcza przepływ pracy, jak połączyć sztuczną interferencję RNA za pośrednictwem mikroRNA z optogenetyką, aby stymulować specyficznie presynaptyczne butony ze zmniejszoną ekspresją selektywnych genów w nienaruszonych obwodach neuronalnych.

Połączenie optogenetyki ze sztucznymi mikroRNA w celu scharakteryzowania wpływu knockdownu genów na funkcję presynaptyczną w nienaruszonych obwodach neuronalnych

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Ogólnym celem połączenia interferencji RNA za pośrednictwem sztucznego mikroRNA z optogenetyką jest scharakteryzowanie wpływu knockdownu genu na funkcję presynaptyczną w nienaruszonych obwodach neuronalnych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie fizjologii synaptycznej, takie jak zajęcie się fizjologiczną rolą białek presynaptycznych w nienaruszonych obwodach mózgu. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona selektywne monitorowanie transmisji synaptycznej w neuronach o zmniejszonej ekspresji badanego białka presynaptycznego.Użyliśmy również tej metody do zbadania funkcji presynaptycznej w ostrych wycinkach mózgu. Może być również stosowany do manipulowania i sondowania bezpieczeństwa neuronów in vivo. Procedurę zademonstruje Carmela Vitale, doktorantka z naszego laboratorium.Po zaprojektowaniu mikroRNA i skonstruowaniu wektora rekombinowanego do ekspresji mikroRNA oraz sondy optogenetycznej, należy przygotować pierwotne kultury neuronalne z obszaru mózgu będącego przedmiotem zainteresowania. Aby to zrobić, postępuj zgodnie z ustalonym protokołem kortykokulturacji opracowanym przez L.A. Cingolani and Company z następującymi modyfikacjami. Po pierwsze, użyj płytek sześciodołkowych, umieść pół miliona neuronów na studzienkę i użyj 2,5 mililitra podłoża przyłączającego na studzienkę.Po inkubacji płytki przez cztery godziny zmień na 3,3 mililitra pożywki podtrzymującej na dołek, a jeśli obserwuje się przerost astrocytów, dodaj 0,5 mililitra pożywki podtrzymującej uzupełnionej 7,5 mikromola AraC w trzech do czterech DIV. Przy pięciu do sześciu DIV zainfekuj trzy dołki dla każdego mikroRNA do przetestowania. Użyj najniższej dawki zakaźnej, która zainfekuje co najmniej 99% neuronów.Dodaj wirusa bezpośrednio do neuronów, delikatnie wymieszaj i umieść płytki z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przy 17 do 18 DIV neurony poddają się lizie w celu ekstrakcji RNA. Przechyl płytki i użyj szklanych pipet, aby usunąć całe medium z każdej studzienki.Następnie natychmiast dodaj 700 mikrolitrów odczynnika do lizy do każdej studzienki. Po krótkim wymieszaniu przenieś lizat komórkowy z każdej studzienki do oddzielnych 1,5-mililitrowych probówek. Następnie dodaj 140 mikrolitrów chloroformu do każdego lizatu.Szybko zakręć probówki i energicznie nimi potrząsaj przez 15 sekund, aby zemulgować zawartość. Następnie odwiruj probówki w temperaturze 12 000 razy G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie ostrożnie przenieś górną fazę wodną zawierającą RNA do nowej probówki.Nie pozwól, aby końcówka pipety dotykała fazy organicznej. Do fazy wodnej dodać 1,5 objętości 100% etanolu i powoli pipetować roztwór trzy razy, aby wymieszać. Następnie oczyść RNA za pomocą dostępnego na rynku zestawu i określ ilościowo plony.Spodziewaj się co najmniej 3,5 mikrograma na próbkę. Proporcje czystości w stosunku do białek i związków organicznych powinny wynosić co najmniej 1,9. Następnie użyj zestawu do retrotranskrypcji 250, 500 lub 1 000 nanogramów RNA.Następnie określ ilościowo skuteczność knockdown dla endogennego genu będącego przedmiotem zainteresowania za pomocą ilościowego RTPCR. Dąż do skuteczności knockdown na poziomie co najmniej 60%W tym protokole użyj zwierzęcia, któremu 15 dni wcześniej lub dłużej wstrzyknięto RAAV12 do mózgu, zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem przez A.Cetin and Company. Wyizoluj mózg i wykonaj ostre plastry mózgu za pomocą wibratomu i zagazowanego, lodowatego ACFF.Zbierz wycinki obszaru zainteresowania i zminimalizuj ich ekspozycję na światło, aby uniknąć aktywacji sondy optogenetycznej. Pozwól plastrom dojść do siebie przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w tym samym ACFF. Użyj komory specjalnie zaprojektowanej do przechowywania plasterków mózgu.Następnie przywróć plastry do temperatury pokojowej, gdzie pozostaną zdrowe przez sześć do ośmiu godzin. Aby kontynuować, przenieś plasterek do komory nagrywającej i przelej go z prędkością dwóch mililitrów na minutę ACFF. Następnie krótko sprawdź sygnał wyrażonego reportera fluorescencyjnego, aby upewnić się o lokalizacji i intensywności infekcji.Następnie napełnij elektrodę łatową roztworem wewnątrzkomórkowym. Teraz, w świetle podczerwonym, uzyskaj szczelną konfigurację hurtową na neuronie, który odbiera sygnały synaptyczne z zainfekowanych neuronów. Rezystancję szeregową można pozostawić bez kompensacji, ale powinna być stała i niska.Na przykład, jeśli neurony piramidowe CA3 zostały zainfekowane, załataj neurony piramidowe w proksymalnym i przyśrodkowym odcinku regionu CA1. Kiedy komórki zaczynają wyglądać na skurczone lub spuchnięte, gdy łatanie staje się trudne lub partie są niestabilne, wybrane wycinki nie są już wystarczająco zdrowe, aby można było z nich nagrywać. Następnie użyj farmakologii, aby wyizolować badane prądy synaptyczne.Na przykład, jeśli celem jest zbadanie pobudzającej transmisji synaptycznej, zablokuj hamującą transmisję synaptyczną poprzez dodanie bicukuliny do kąpieli. Następnie wywołaj prądy synaptyczne, takie jak pobudzające prądy postsynaptyczne, za pomocą 473-nanometrowego niebieskiego lasera sprzężonego ze światłowodem umieszczonym na somatach zainfekowanych neuronów. Nie kieruj lasera na aksony neuronów.Na przykład unikaj rzucania światła na zabezpieczenia Shaffera. Bezpośrednia depolaryzacja aksonów nie jest pożądana. Następnie dostosuj długość stymulacji do minimum, aby zmniejszyć możliwość wywołania więcej niż jednego potencjału czynnościowego na impuls świetlny.Następnie dopracuj intensywność lasera, aby wywołać mały, ale wyraźnie wykrywalny prąd synaptyczny. Na przykład, w przypadku pobudzającej transmisji synaptycznej między neuronami piramidowymi CA3 i CA1, dostosuj intensywność lasera, aby wywołać prądy synaptyczne o natężeniu od 20 do 50 pikoamperów. Pod koniec eksperymentu nałóż tetrodotoksynę o stężeniu 0,5 mikromola, aby zablokować kanały sodowe.Wrażliwość prądów wywołanych optycznie na tetrodotoksynę wskazuje, że są one napędzane potencjałem czynnościowym. Kontynuuj zbieranie danych, aż co najmniej osiem neuronów zostanie załatanych dla danego schorzenia od co najmniej trzech różnych zwierząt. Jest to minimalna ilość danych potrzebnych do analizy wyników.Za pomocą opisanej metody zniszczono alternatywne izoformy splicingowe presynaptycznych kanałów wapniowych bramkowanych napięciem typu P/Q. Uważa się, że kanały te regulują krótkotrwałą plastyczność synaptyczną w synapsach pobudzających CA3 do CA1. Stworzono cztery różne konstrukty wyrażające mikroRNA specyficzne dla izoformy; każdy z nich był eksprymowany razem z ultraszybką rodopsyną kanałową wraz z białkiem fluorescencyjnym Td-Tomato.Po pierwsze, potwierdzono, że każdy konstrukt ma wystarczającą skuteczność knockdown i selektywność w pierwotnych hodowlach neuronów szczurów przy użyciu ilościowego RTPCR specyficznego dla izoformy. Następnie każdy konstrukt został wstrzyknięty do hipokampa szczurów P18. Ostatecznie zbadano wpływ konstruktów na krótkoterminową plastyczność synaptyczną w synapsach CA3 do CA1 poprzez stymulację zainfekowanych neuronów piramidowych CA3 krótkimi impulsami światła o długości 473 nanometrów oraz rejestrację powstałych EPSC w konfiguracji hurtowej z neuronów piramidowych regionu CA1.Knockdown różnych izoform splicingu wpłynął na reakcje na sparowaną stymulację impulsową w przeciwnych kierunkach. Knockdown izoformy A wzmocnił ułatwienie parowanego impulsu; podczas gdy knockdown izoformy B go zniósł. Połączenie interferencji RNA w optogenetyce pozwala na badania w dziedzinie fizjologii synaptycznej w celu zbadania, w jaki sposób białka presynaptyczne regulują krótkoterminową plastyczność synaptyczną w nienaruszonych obwodach.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak walidować mikroRNA pod kątem interferencji RNA i jak łączyć je z optogenetyką w celu zbadania transmisji synaptycznej w ostrych wycinkach mózgu.

combining-optogenetics-with-artificial-micrornas-to-characterize

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film demonstruje hamowanie pobudzających prądów synaptycznych za pośrednictwem mikroRNA w wycinkach mózgu myszy w hipokampie. Neurony CA3 zostały zainfekowane rekombinowanym wektorem wirusowym zawierającym konstrukt do ekspresji fluorescencyjnego reportera, aktywowany światłem kanał błonowy i mikroRNA, który obniża ekspresję kanałów wapniowych bramkowanych napięciem. Po umieszczeniu wycinka w komorze rejestracyjnej i załataniu neuronu CA1 za pomocą pipety rejestrującej, impulsy świetlne...

Hamowanie pobudzających prądów postsynaptycznych za pośrednictwem mikroRNA w mysich wycinkach hipokampa

MikroRNA odgrywają znaczącą rolę w strukturze i funkcjonowaniu mózgu. Tutaj opisujemy metodę wymuszania nadmiernej ekspresji miRNA w hipokampie za pomocą stereotaktycznego wstrzykiwania zmodyfikowanego lentiwirusa wykazującego ekspresję miRNA. Podejście to może służyć jako stosunkowo szybki sposób oceny skutków in vivo nadmiernej ekspresji miRNA w określonych regionach mózgu.

Stereotaktyczne wstrzyknięcie lentiwirusów eksprymujących mikroRNA do regionu CA1 hipokampa myszy i ocena wyniku behawioralnego

Niedawny rozwój narzędzi neuronauki, które łączą genetykę i optykę, określany jako "optogenetyka", umożliwia kontrolę nad aktywnością obwodów neuronowych z niespotykanym dotąd poziomem rozdzielczości przestrzennej i czasowej. W tym miejscu przedstawiamy protokół integracji zapisu in vivo z manipulacją optogenetyczną genetycznie zdefiniowanych podzbiorów neuronów przedczołowych korowych i podkostnych neuronów piramidowych.

Metoda wysokiej wierności optogenetycznej kontroli pojedynczych neuronów piramidowych in vivo

Opisujemy metodę charakteryzowania funkcjonalnej topografii i właściwości synaptycznych obwodów przodomózgowia za pomocą podejścia optogenetycznego do fotostymulacji populacji neuronów in vitro.

Fotostymulacja optogenetycznie ukierunkowana obwodów przodomózgowia ze skaningiem laserowym

Optogenetyka stała się potężnym narzędziem do wykorzystania w eksperymentach neuronauki behawioralnej. Protokół ten oferuje przewodnik krok po kroku po projektowaniu i konfiguracji systemów laserowych oraz zapewnia pełny protokół przeprowadzania wielokrotnych i jednoczesnych stymulacji optogenetycznych in vivo zgodnych z większością paradygmatów testów behawioralnych gryzoni.

In vivo (in vivo) Stymulacja optogenetyczna ośrodkowego układu nerwowego gryzoni

Opisano protokół generowania systemu kokulturowego składającego się z neuronów pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), pierwotnych neuronów korowych i astrocytów. Ten system kohodowli umożliwia wykrycie powstawania kontaktów i obwodów synaptycznych między nowymi neuronami pochodzącymi z iPSC a istniejącymi wcześniej neuronami korowymi wykazującymi ekspresję rodopsyny kanałowej-2.

Optogenetyczne podejście do oceny tworzenia połączeń neuronalnych w systemie kokulturowym

Tutaj opisujemy metody optogenetycznej manipulacji poszczególnych typów neuronów podczas monitorowania stanów snu/czuwania u myszy, przedstawiając jako przykład naszą niedawną pracę nad jądrem łożyska prążka końcowego.

Manipulacja optogenetyczna obwodów nerwowych podczas monitorowania stanów snu/czuwania u myszy

Celem tego protokołu jest opisanie podejścia do analizy zachowania dorosłych nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych w odpowiedzi na manipulację chemogenetyczną specyficznego lokalnego obwodu neuronowego.

Regulacja specyficzna dla obwodu testowego dorosłych nerwowych komórek prekursorowych hipokampa

Dzięki optogenetycznej manipulacji określonych populacji neuronów lub obszarów mózgu, zachowanie może być modyfikowane z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną u swobodnie poruszających się zwierząt. Stosując różne narzędzia optogenetyczne w połączeniu z przewlekle wszczepionymi światłowodami, można przeprowadzić różnorodne modulacje neuronalne i testy behawioralne.

Optogenetyczna manipulacja aktywnością neuronalną w celu modulacji zachowania u swobodnie poruszających się myszy

Tutaj prezentujemy protokół opisujący transdukcję wirusa w dyskretnych obszarach mózgu za pomocą konstruktów optogenetycznych, które umożliwiają specyficzną dla synaps charakterystykę elektrofizjologiczną w ostrych wycinkach mózgu gryzoni.

Ex vivo Badanie optogenetyczne transmisji synaptycznej dalekiego zasięgu i plastyczności od przyśrodkowej kory przedczołowej do bocznej kory śródwęchowej

Tutaj opisujemy protokół łączący wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem z implantacją okna czaszkowego w celu jednoczesnego obrazowania dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy.

Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy

Poznaj metodę łączącą sztuczne mikroRNA z optogenetyką do badania funkcji presynaptycznej w nienaruszonych obwodach neuronalnych. Technika umożliwia selektywną stymulację i analizę transmisji synaptycznej w ostrych preparatach mózgu.

Połączenie optogenetyki ze sztucznymi mikroRNA w celu scharakteryzowania wpływu knockdownu genów na funkcję presynaptyczną w nienaruszonych obwodach neuronalnych (Wideo) | JoVE Journal

Połączenie optogenetyki ze sztucznymi mikroRNA w celu scharakteryzowania wpływu knockdownu genów na funkcję presynaptyczną w nienaruszonych obwodach neuronalnych

Przeglądaj więcej filmów