Rekonfigurowalny kanał mikroprzepływowy z dyskretnymi ściankami bocznymi

Ogólnym celem tej procedury jest wytworzenie rekonfigurowalnego urządzenia mikroprzepływowego ze ściankami bocznymi wykonanymi z układu pinów. Główną zaletą tego urządzenia mikroprzepływowego jest jego zdolność do radzenia sobie z trudnymi do przepływu obiektami i sytuacjami, które mogą być nieznane na etapie projektowania kanału. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności z wytrawieniem małych szpilek w kształtach kości psa.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ montaż wielu części mikroprzepływowych i montaż ich na podstawie jest trudny do nauczenia się tylko z pisemnego protokołu. To zdjęcie przedstawia ukończone urządzenie mikroprzepływowe z rekonfigurowalnym kanałem. W tym przypadku rekonfigurowalna część znajduje się wzdłuż górnej części obrazu.

Schemat widoku rozstrzelonego ujawnia niektóre z jego głównych elementów. W szczególności zwróć uwagę na mikrokanał i piny używane do jego rekonfiguracji. W pierwszym kroku wytraw szpilki.

Zacznij od odtłuszczonych kołków ze stali nierdzewnej o grubości 0,3 milimetra i kształcie litery L o różnych długościach. Przygotuj cztery mililitry 10% kwasu azotowego i zanurz w nim szpilki. Następnie umieść pojemnik w piekarniku o temperaturze 65 stopni Celsjusza na 30 minut.

Po wyjęciu szpilek przenieś je kolejno pęsetą do pojemnika z wodą dejonizowaną. Następnie poddaj je sonikacji w wodzie przez pięć minut. Po zakończeniu osusz je ręcznikiem papierowym.

Przygotuj 0,5 mililitra środka antyadhezyjnego do form i zanurz w nim kołki. Po dwóch godzinach umieść szpilki w wodzie dejonizowanej i poddawaj je sonifikacji przez pięć minut. Kontynuacja wymaga naczynia do trawienia.

Naczynie trawiące wykonane jest ze szkła i kleju silikonowego. Rozpocznij proces trawienia od dozowania kleju silikonowego na końcówki szpilek na naczyniu. Umieść kołki tak, aby końcówki na ich prostych końcach były zanurzone w kleju.

To jest danie po tym, jak wszystkie szpilki są na swoim miejscu i gotowe do następnego kroku. Przenieś naczynie do trawienia do nawilżonego fermentora podgrzanego do 38 stopni Celsjusza i odczekaj noc, aby utwardzić klej. Gdy będzie gotowy, umieść naczynie do trawienia z kołkami na płycie grzejnej o temperaturze 65 stopni Celsjusza.

Wlej 0,8 mililitra kwasu trawiącego na odsłonięty obszar szpilek. Po 10 minutach przenieść kwas do zlewki za pomocą mikropipetatora. Następnie dodaj więcej kwasu trawiącego do naczynia, aby powtórzyć etap trawienia.

Po wytrawieniu sprawdź, czy szerokość wytrawionego obszaru wynosi około 0,2 milimetra. Jeśli tak, nanieś pięć mililitrów roztworu wodorowęglanu sodu na naczynie do trawienia, aby zneutralizować pozostały kwas. Następnie użyj pęsety, aby usunąć szpilki, ciągnąc wzdłużnie.

Zacznij od sprefabrykowanej formy. Podobnie jak na tym schemacie, forma jest przeznaczona dla urządzenia ze stałą ścianą boczną i miejscem na kołki. Stwórz formę na szkiełku podstawowym za pomocą litografii.

Umieść przygotowane szkiełko na dnie plastikowego naczynia. Teraz wlej prepolimer PDMS na formę o grubości trzech milimetrów. Umieść naczynie w eksykatorze próżniowym na 10 minut.

Następnie przenieś go do piekarnika w temperaturze 65 stopni Celsjusza na godzinę. Rezultatem jest częściowo utwardzona płyta. Użyj skalpela, aby wyjąć płytę z formy do następnych kroków.

Wstaw płytę do piekarnika w temperaturze 120 stopni Celsjusza na godzinę, aby w pełni się utwardziła. Teraz pracuj z w pełni utwardzoną płytą. Będzie miał nieregularne krawędzie wzdłuż wzoru prowadnic.

Użyj skalpela, aby precyzyjnie i czysto przyciąć nieregularne krawędzie. Zwróć szczególną uwagę na powierzchnię otworów do wkładania pinów, aby stworzyć najlepsze urządzenie. Perforować otwory do wlotu/wylotu komory głównej i w innych miejscach za pomocą stempli biopsyjnych.

Teraz wyprodukuj zespół mikrokanałów. Podgrzej roztwór czyszczący do 60 stopni Celsjusza i uzyskaj szkło nakrywkowe numer cztery. Szkło nakrywkowe ma wymiary 10 milimetrów na 20 milimetrów.

Zanurz szkło nakrywkowe w roztworze na 10 minut. Umieść wypłukane i wysuszone szkło nakrywkowe oraz płytę PDMS na dolnej elektrodzie napylarki. Wytwarzaj plazmę próżniową przez 30 sekund.

Sklej pobrany przedmiot tak, aby krawędzie były wyrównane, a elementy kanału były widoczne przez szkło nakrywkowe. Użyj sterylnego pojemnika, aby przenieść połączone warstwy do okapu laminarnego, aby je wysterylizować. Po zakończeniu włóż kołki do gniazda.

Sąsiednie kołki powinny mieć różne długości. Kołki tworzą drugą ścianę boczną mikrokomory. Kontynuuj pracę w okapie laminarnym.

Do kolejnych kroków przygotuj bazę dla urządzenia. Przygotować wypełniacz szczelin poprzez homogenizację mieszaniny białej wazeliny i proszku politetrafluoroetylenu. Wlać homogenizowaną mieszaninę do strzykawki z dozownikiem i włożyć tłok.

Nacisnąć tłok, aby napełnić końcówkę strzykawki. Następnie założyć igłę i naciskać tłok, aż igła zostanie wypełniona. Przygotuj drugą strzykawkę z klejem silikonowym w podobny sposób i podłącz każdą z nich do dozownika pneumatycznego.

Teraz nałóż klej silikonowy na podstawę. Połóż go wzdłuż jednej z kieszeni. Następnie umieść szklankę nakrywkową numer cztery w kieszeni i mocno ją dociśnij, aby ją związać.

Następnie dozuj klej silikonowy wzdłuż dwóch zewnętrznych szczelin podstawy, rysując segmenty o głębokości około jednego milimetra. Wzdłuż innej szczeliny pośrodku dozuj wypełniacz szczelin w segmencie o głębokości jednego milimetra. Nałóż więcej kleju na krawędź drugiej kieszeni.

Umieść zespół mikrokanalików na kieszeni i mocno go dociśnij. Ponownie umieść wypełniacz szczeliny w szczelinie wzdłuż środka podstawy. Następnie nałóż klej na sąsiednie szczeliny.

Pozostaw urządzenie na jeden dzień w sterylnym kapturze. Po utwardzeniu, w kapturze laminarnym, przesuń każdy kołek do jednego milimetra wzdłuż sąsiednich kołków, aby uwolnić je z bariery elastomerowej. Wykonaj test fluorescencyjny pod kątem wycieków, rozcieńczając zielony barwnik fluorescencyjny w zjonizowanej wodzie.

Następnie otwórz mikrokanał, aby uzyskać stałą szerokość w całym tekście. Za pomocą mikropipety przenieś barwnik do jednego portu końcowego mikrokanału i napełnij go roztworem. W dużym plastikowym naczyniu umieść dwa kawałki chłonnego papieru zwilżonego wodą dejonizowaną i urządzenie w środku.

Inkubuj naczynie w 5% dwutlenku węgla przez co najmniej 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wyświetl pobrane urządzenie za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego i zapisz obrazy. Użyj ich, aby potwierdzić, że nie ma wycieków wokół kołków.

Obrazy te przedstawiają próbkę przeciekającą i nieprzeciekającą. Kolejnym testem jest wysiew komórek. Otwórz mikrokanał, aby utworzyć prosty kanał o szerokości 400 mikronów ze ścianą boczną tak płaską, jak to możliwe na całej długości.

Dodaj zawieszenie komórek do jednego portu końcowego, aby wypełnić kanał. Zlokalizuj szpilki, które definiują ścianę boczną regionu, aby rozpocząć hodowlę komórkową, i zamknij je, aby zamknąć komórki w regionie. Zaczynając w pobliżu regionu, zamknij wszystkie piny, aby usunąć komórki w kanale.

Po zasysaniu zawiesiny z portów końcowych dodać pożywkę. Umieść urządzenie w plastikowym pojemniku z mokrym papierem chłonnym. Inkubuj go przez minimum 24 godziny.

Szukaj, aby komórki miały około 10 komórek w zamkniętym obszarze. Następnie powoli cofnij szpilkę, aby poszerzyć obszar kultury. Obrazy te przedstawiają komórki COS-7 hodowane w rekonfigurowalnym mikrokanale.

W ciągu dziewięciu dni obszar hodowli mikrokanałowej został poszerzony. Zebrane dane pozwalają na wykreślenie liczby komórek i gęstości w funkcjach czasu. Niebieskie punkty i dopasowanie krzywej dotyczą liczby komórek.

Czerwone symbole i pasowania dotyczą gęstości. W przypadku gęstości pionowe strzałki wskazują rozszerzenie obszaru hodowli komórkowej po dwóch, pięciu i sześciu dniach. Zagęszczenia są obliczane dla tych samych obszarów kulturowych.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zbudować szczelną ścianę boczną kanału mikroprzepływowego z małych szpilek. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu jednego tygodnia, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby wykonać każdy z kroków protokołu ostrożnie i dokładnie.

Nie zapominaj, że praca z mocnym kwasem może być niezwykle niebezpieczna i zawsze należy zachować środki ostrożności, takie jak przygotowanie odpowiedniej ilości środka neutralizującego. Po tych procedurach można wprowadzić inne komórki z płynem w celu ustanowienia bardziej złożonych kultur komórkowych.