Model in ovo do badania związków insulinomimetycznych
23 kwietnia 2018
W tym badaniu opisujemy system in-ovo jako obiecujące narzędzie do testowania związków insulinomimetycznych w żywym organizmie. Do głównych zalet należy zaliczyć odpowiednie przepustowości i akceptowalne koszty, które umożliwiają identyfikację fitozwiązków o właściwościach insulinomimetycznych.
Ogólnym celem przedstawionego zmodyfikowanego modelu zarodka pisklęcia jest scharakteryzowanie substancji o właściwościach insulinomimetycznych w organizmie żywym. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad diabetykami, takie jak znalezienie ekstraktów ziołowych o właściwościach insulinomimetycznych, które obniżają poziom glukozy we krwi bez skutków ubocznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że skuteczność związków może być testowana w żywym organizmie przy odpowiedniej przepustowości i że nie jest wymagana zgoda komisji bioetycznej.
Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy przygotowania i cięcia są trudne do nauczenia, ponieważ naczynia nie są łatwe do przygotowania lub często są całkowicie przecięte i gubią się. Sprawdź jaja pod kątem zapłodnienia po inkubacji w temperaturze 38 stopni Celsjusza przy średniej wilgotności od 40 do 60 procent przez okres do 11 dni. Aby to zrobić, zanurz frędzle lampy konserwującej w poduszce z atramentem, a następnie zapal spiczastą stronę jajka.
Aby zidentyfikować pęcherz powietrzny, sprawdź, czy nie ma różnic w jasności na górze jajka. Pęcherz powietrzny wydaje się być okrągłym, bardziej przezroczystym obszarem, podczas gdy albumina wydaje się ciemniejsza. Zaznacz położenie pęcherza powietrznego, lekko dociskając lampę do jajka wcześniej nałożonym tuszem.
Wyklucz niezapłodnione jaja, które nie wykazują różnicy w jasności między albuminą a pęcherzem powietrznym. Przygotuj insulinomimetyk lub insulinę, rozcieńczając do pożądanego stężenia w zrównoważonym roztworze soli Hanka. Aby nałożyć wybrany związek, użyj spiczastej pęsety, aby ostrożnie dziobać skorupkę jajka w zaznaczonym obszarze pęcherza powietrznego, aby utworzyć otwór równy średnicy strzykawki z igłą.
Za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności jednego mililitra wstrzyknąć 300 mikrolitrów roztworu buforowego zawierającego substancję będącą przedmiotem zainteresowania. Aby określić działanie substancji obniżające poziom glukozy we krwi, umieść jaja z powrotem w inkubatorze i zmierz poziom glukozy we krwi po 60, 120 i 180 minutach. W odpowiednim momencie ostrożnie wyjmij skorupkę jajka nad pęcherzem powietrznym i wyrównaj błonę skorupki jaja, dodając wystarczającą ilość buforu PBS, aby pokryć całą błonę.
Po wylaniu nadmiaru PBS użyj spiczastej pęsety, aby ostrożnie zdjąć błonę skorupki jajka. Użyj mikronożyczek, aby przeciąć i usunąć błonę kosmówkowo-omocznikową, unikając dużych naczyń w błonie. Zlokalizuj duże naczynie wychodzące z brzucha zarodka.
Wyjmij to naczynie z albuminy za pomocą zamkniętych mikronożyczek i umieść je na plastikowym pasku pH. Przesuń pasek pH pod naczyniem i ostrożnie pociągnij mikronożyczki. Konieczne jest przygotowanie dużego naczynia krwionośnego wychodzącego z jamy brzusznej, ponieważ mniejsze mogą się rozerwać i uniemożliwić pobranie krwi.
Usunąć płyn otaczający naczynie za pomocą pipety, aby uniknąć rozcieńczenia krwi. Następnie użyj bibuły filtracyjnej, aby wysuszyć naczynie i pasek pH. W przypadku pobierania krwi ważne jest, aby nie przecinać całkowicie naczynia, ponieważ zostanie ono utracone.
Następnie za pomocą mikronożyczek ostrożnie przeciąć naczynie krwionośne z jednej strony. Nie przecinaj naczynia więcej niż do połowy, aby uniknąć całkowitego przecięcia naczynia. Zebrać wyciekającą krew na pasek pH za pomocą pipety.
Do określenia poziomu glukozy za pomocą glukometru potrzeba 10 mikrolitrów krwi. Po zastosowaniu wybranego związku przez 24 godziny, należy zrównoważyć błonę skorupki jaja PBS jak poprzednio przez co najmniej 30 sekund. Usuń nadmiar buforu PBS, wylewając go.
Następnie ostrożnie zdejmij membranę skorupki jajka za pomocą spiczastej pęsety. Sprawdź naczynia krwionośne pod kątem zmian chorobowych i potwierdź witalność, obserwując ruch zarodka pisklęcia. Do eksperymentów wykorzystano ekstrakty przygotowane z combretum indicum, czyli pnącza z Rangunu, oraz nieujawniony ekstrakt oznaczony jako ekstrakt 0845.
Jak wskazano na tym rysunku, ekstrakt z pnącza Rangunu nie spowodował znacznego obniżenia stężenia glukozy we krwi. Jednak stężenie glukozy we krwi udało się obniżyć za pomocą ekstraktu 0845, a znaczący efekt zaobserwowano po wydłużeniu czasu inkubacji. W porównaniu z jajami nieleczonymi, traktowanie jaj toksycznym ekstraktem ziołowym w dniu 10 przez 24 godziny doprowadziło do poważnych zmian w naczyniach krwionośnych w błonie kosmówkowej omoczniowej.
Zmiany chorobowe były również widoczne na leczonym zarodku w porównaniu z normalną kontrolą. Po opanowaniu dwa jaja można przeanalizować pod kątem poziomu glukozy i toksyczności w ciągu pięciu minut, jeśli zostaną wykonane prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować naczynia krwionośne i pobrać krew w modelu zarodka kurczaka, aby określić ilościowo działanie związków naturalnych lub syntetycznych na obniżenie poziomu glukozy we krwi.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia zmodyfikowany model zarodka kurczaka jako narzędzie do oceny związków imitujących insulinę. System in-ovo umożliwia testowanie ekstraktów roślinnych, które mogą obniżać poziom glukozy we krwi bez działań niepożądanych, wykazując znaczące korzyści pod względem wydajności i kosztów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Badania nad cukrzycą
- Badania fitochemiczne
- Związki insulinomimetyczne
Wstęp
- Model embrionu kurczaka zapewnia platformę w postaci żywego organizmu do przeprowadzania testów.
- Metoda ta pozwala uniknąć procesów przeglądu etycznego, co przyspiesza badania.
- Odpowiada ona na zapotrzebowanie na alternatywy dla insuliny chemicznej.
Cel badania
- Identyfikacja ekstraktów roślinnych o właściwościach insulinomimetycznych.
- Ocena ich wpływu na obniżenie poziomu glukozy we krwi.
- Ocena potencjalnych działań niepożądanych w organizmie żywym.
Zastosowane metody
- Wykorzystano zmodyfikowany model zarodka kurczaka.
- Związki mimetyki insuliny podano za pomocą wstrzyknięć do pęcherza powietrznego.
- Po podaniu związków zmierzono poziom glukozy we krwi.
- Kluczowe etapy obejmowały świecenie jaj, przygotowanie naczyń oraz techniki pobierania krwi.
Główne wyniki
- Ekstrakt 0845 znacząco obniżył poziom glukozy we krwi w porównaniu z grupami kontrolnymi.
- Nie zaobserwowano istotnego wpływu ekstraktu z Combretum indicum.
- W wyniku ekspozycji na toksyczny ekstrakt wystąpiły zmiany destrukcyjne.
Wnioski
- Badanie wykazuje użyteczność modelu zarodka kurczaka w ocenie związków o działaniu insulinopodobnym.
- Metoda ta zwiększa efektywność badań nad poszukiwaniem bezpiecznych alternatyw dla insuliny.
- Wnioski obejmują lepsze zrozumienie roli związków roślinnych w leczeniu cukrzycy.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ocena związków insulinomimetycznych na etapie odkrywania wymaga predykcyjnych, skalowalnych i etycznie zoptymalizowanych modeli in vivo do wstępnej selekcji kandydatów przed badaniami na ssakach. Zmodyfikowany model zarodka kurczaka umożliwia szybką, ilościową ocenę efektów obniżania poziomu glukozy we krwi oraz toksyczności, wspierając wczesne ograniczanie ryzyka w przypadku kandydatów syntetycznych i roślinnych. Podejście to usprawnia podejmowanie decyzji dotyczących portfolio poprzez dostarczenie praktycznych danych na temat skuteczności i bezpieczeństwa związków w żywym systemie.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia walidację funkcjonalną aktywności insulinomimetycznej w żywym organizmie.
- Pozwala na biologiczną ocenę ryzyka poprzez ujawnienie sygnałów dotyczących zarówno skuteczności, jak i jawnej toksyczności.
- Ułatwia szybką selekcję związków kandydackich przed rozpoczęciem czasochłonnych i kosztownych badań na ssakach.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia system kompatybilny z wysoką przepustowością do ilościowego pomiaru glikemii po podaniu związku.
- Standaryzuje ocenę efektów translokacji Glut4 i wychwytu glukozy indukowanych przez związek.
- Umożliwia odtwarzalne przesiewowe badanie właściwości insulinomimetycznych zarówno w przypadku syntetycznych związków, jak i ekstraktów roślinnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Stanowi pomost pomiędzy badaniami przesiewowymi in vitro a ssaczymi modelami przedklinicznymi w badaniach nad chorobami metabolicznymi.
- Umożliwia wczesne wykrycie toksyczności lub uszkodzeń naczyniowych, co wspiera translacyjną ocenę ryzyka.
- Zapewnia ciągłość oceny bezpieczeństwa i skuteczności kandydatów w różnych systemach modelowych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten model in ovo stanowi ogniwo pośrednie między screeningiem in vitro a przedklinicznymi badaniami na ssakach, zapewniając kontekst żywego organizmu dla oceny funkcjonalnej i bezpieczeństwa związków insulinomimetycznych.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących mechanizmów obniżania poziomu glukozy oraz oddziaływania na cel in vivo.
- Przesiew): Dostarcza ilościowe, powtarzalne odczyty glikemii do analizy porównawczej skuteczności kandydatów.
- Analityka: Wspiera statyczną ocenę redukcji glukozy i punktów końcowych toksyczności w różnych punktach czasowych.
- Badania translacyjne: Ułatwia dostosowanie postępu badań do ryzyka poprzez wczesne wykrywanie toksyczności lub braku skuteczności w kontekście całego organizmu.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Zapewnia wielokrotnego użytku, etycznie zoptymalizowaną platformę do iteracyjnej oceny związków w ramach programów badań nad chorobami metabolicznymi.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w wyborze kandydatów poprzez integrowanie danych dotyczących skuteczności i toksyczności z żywego systemu.
- Wartość operacyjna: Usprawnia wczesne etapy przesiewowe dzięki ustandaryzowanym, skalowalnym protokołom i braku wymogów dotyczących etyki badań na zwierzętach.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie bardziej świadomych decyzji o kontynuowaniu lub przerwaniu badań (go/no-go), redukując biologiczne ryzyko na późniejszych etapach oraz wydatki zasobowe.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój kandydatów na insulinomimetyki o potencjale translacyjnym.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy technicznej w zakresie manipulacji zarodkami, przygotowania naczyń oraz pobierania krwi.
- Wymagany jest dostęp do mikroskopii fluorescencyjnej oraz aparatury do pomiaru glukozy we krwi.
- Wymagana jest międzyzespołowa standaryzacja protokołów przygotowania związków i dawkowania.
- Może być konieczna adaptacja dla różnych klas związków lub punktów końcowych metabolizmu.
- Kluczowa jest staranna technika, aby uniknąć utraty naczyń lub rozcieńczenia próbek, co mogłoby naruszyć integralność danych.
