Name: Model in ovo do badania związków insulinomimetycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Poznaj zmodyfikowany model zarodka kurzego do badania związków insulinomimetycznych w żywym organizmie. Ta metoda pozwala szybko oceniać ekstrakty roślinne obniżające poziom glukozy we krwi bez konieczności zgody komisji etycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Austriacką Agencję Promocji Badań (FFG; numer projektu 850681), inicjatywę Podstawowego Finansowania Uniwersytetu Nauk Stosowanych Górnej Austrii (projekt GlucoSTAR) oraz Centrum Innowacji Technologicznych w Medycynie (TIMed Center), które otrzymuje podstawowe fundusze od prowincji Górna Austria.

Zgodnie z dyrektywą 2010/63/UE, eksperymenty na niewyklutych zarodkach ptaków w pierwszych dwóch trzecich rozwoju embrionalnego nie wymagają zgody komisji etyki.
1. Przechowywanie i hodowla jaj
<ol>
	<li>Zaopatrz się w zapłodnione jaja kurze (Tabela materiałów) od lokalnego hodowcy. 
	UWAGA: Jaja mogą być przechowywane w temperaturze 14 °C w wilgotnej atmosferze przez okres do 10 dni po zniesieniu przed użyciem do celów doświadczalnych.</li>
	<li>Jaja należy inkubować w temperaturze 38 °C przy średniej wilgotności 40 - 60% przez 10 lub 11 dni w inkubatorze, który stale obraca jaja.</li>
</ol>
2. Wybór jaj
<ol>
	<li>Sprawdź jaja pod kątem zapłodnienia po inkubacji do 11 dni. Do tego kroku użyj lampy świecowej. Zanurz frędzle lampy świecowej w poduszce z atramentem i zapal spiczastą stronę jajka.</li>
	<li>Aby zidentyfikować pęcherz powietrzny, sprawdź, czy nie ma różnic w jasności na górze jajka. 
	UWAGA: Pęcherz powietrzny wydaje się być okrągłym, bardziej przezroczystym obszarem, podczas gdy białko jest ciemniejsze, gdy jajo jest świecone.</li>
	<li>Po wykryciu pęcherza powietrznego należy zaznaczyć miejsce, lekko dociskając lampę do jajka nałożonym wcześniej tuszem.</li>
	<li>Na tym etapie należy wykluczyć niezapłodnione jaja, które nie wykazują różnicy w jasności między białkiem a pęcherzem powietrznym.</li>
</ol>
3. Wstrzykiwanie substancji
<ol>
	<li>Przygotuj substancję, która Cię interesuje (np. ekstrakt ziołowy lub insulinę), rozcieńczając substancję w pożądanym stężeniu w buforze zrównoważonego roztworu soli (HBSS) Hanka. Na przykład 3,3 U/ml dostępnego na rynku analogu insuliny w HBSS.</li>
	<li>W celu nałożenia wybranego związku ostrożnie dziob skorupkę jajka spiczastą pęsetą w zaznaczonym obszarze pęcherza powietrznego. Nie należy tworzyć otworu większego niż średnica igły strzykawki. Wstrzyknąć roztwór buforowy (300 μl) zawierający substancję będącą przedmiotem zainteresowania w miejscu dziobania za pomocą strzykawki. 
	UWAGA: Używaj sterylnych jednorazowych strzykawek o pojemności 1 ml, końcówek do pipet i naczyń. Do eksperymentów noś rękawice i fartuch laboratoryjny.</li>
	<li>Aby określić działanie substancji obniżające poziom glukozy we krwi, umieść jaja z powrotem w inkubatorze odpowiednio na 60, 120 i 180 minut. Aby określić podstawowy poziom glukozy we krwi, należy uwzględnić co najmniej 10-15 nietraktowanych jaj kontrolnych.</li>
</ol>
4. Testy toksyczności
<ol>
	<li>Po zastosowaniu wybranego związku przez 24 godziny należy zrównoważyć błonę skorupki jaja buforem soli fizjologicznej buforem buforowym fosforanu (PBS) (w ilości wystarczającej do pokrycia całej błony skorupki jaja) przez co najmniej 30 s.</li>
	<li>Usuń nadmiar buforu PBS, wylewając go.</li>
	<li>Ostrożnie zdejmij membranę skorupki jajka spiczastą pęsetą.</li>
	<li>Sprawdź naczynia krwionośne pod kątem zmian chorobowych i potwierdź żywotność (np. ruch) zarodka pisklęcia. 
	UWAGA: Zobacz Rysunek 1 dla porównania żywotnych i nieżywotnych zarodków po zastosowaniu toksycznego ekstraktu ziołowego.</li>
</ol>
5. Pomiar wartości stężenia glukozy we krwi
<ol>
	<li>W odpowiednim momencie ostrożnie wyjmij skorupkę jajka nad pęcherz powietrzny i zrównoważ błonę skorupki jajka buforem PBS (wystarczającym do pokrycia całej błony skorupki jaja).</li>
	<li>Usuń nadmiar buforu PBS, wylewając go.</li>
	<li>Ostrożnie zdejmij membranę skorupki jajka spiczastą pęsetą.</li>
	<li>Przeciąć i usunąć błonę kosmówkowo-omoczniową za pomocą mikronożyczek, aby umożliwić dobry dostęp do odpowiednich naczyń krwionośnych. Przyciąć membranę co najmniej 2 - 3 cm. Nie należy przecinać żadnych dużych naczyń w samej błonie, aby uniknąć niepożądanej utraty krwi przez zarodek.</li>
	<li>Zlokalizuj duże naczynie wychodzące z brzucha zarodka. Wyjmij to naczynie z białka za pomocą zamkniętych mikronożyczek i umieść je na plastikowym pasku pH. Przesuń pasek pH pod naczynie, które jest przytrzymywane mikronożyczkami, i ostrożnie odciągnij mikronożyczki.</li>
	<li>Usunąć pipetą 1-2 ml płynu znajdującego się pod błoną kosmówkowo-omocznikową, aby uniknąć rozcieńczenia krwi w następnym kroku. Osuszyć naczynie i pasek pH bibułą filtracyjną przed przecięciem naczynia.</li>
	<li>Ostrożnie przeciąć naczynie krwionośne mikronożyczkami z jednej strony. Nie przecinaj całkowicie naczynia. 
	UWAGA: Naczynie ma grubość około 1 mm. Nie przecinaj więcej niż połowy naczynia, aby uniknąć całkowitego przecięcia naczynia, ponieważ może ono zsunąć się z paska i nie jest możliwe pobranie krwi.</li>
	<li>Zbierz wyciekającą krew na pasku pH za pomocą pipety. Do określenia poziomu glukozy za pomocą glukometru potrzeba dziesięciu mikrolitrów krwi.</li>
</ol>
6. Ocena statystyczna
<ol>
	<li>Obliczyć średnią wartość dla co najmniej 10 pojedynczych jaj na punkt czasowy i znormalizować te wartości do jednego z jaj kontrolnych (jaja niepoddane działaniu buforu lub jaja poddane działaniu buforu).</li>
	<li>Następnie określ procent spadku. Ponadto należy stosować insulinę jako kontrolę pozytywną. 
	UWAGA: Powtórz każdy eksperyment co najmniej trzy razy.</li>
</ol>

<ol><li>Defronzo, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Banting+Lecture.+From+the+triumvirate+to+the+ominous+octet%3A+a+new+paradigm+for+the+treatment+of+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Banting Lecture. From the triumvirate to the ominous octet: a new paradigm for the treatment of type 2 diabetes mellitus.</a> Diabetes. 58 (4), 773-795 (2009).</li>
<li>American_Diabetes_Association. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+classification+of+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and classification of diabetes mellitus.</a> Diabetes Care. 37, S81-S90 (2014).</li>
<li>Han Cho, N., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHan+Cho%2C+N+%22IDF+Diabetes+Atlas%22">IDF Diabetes Atlas</a>. Cavan, D. 7, International Diabetes Federation. (2015).</li>
<li>Bailey, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individualized+glycaemic+targets+and+pharmacotherapy+in+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+%26+vascular+disease+research%22%5BJournal%5D)">Individualized glycaemic targets and pharmacotherapy in type 2 diabetes.</a> Diabetes & vascular disease research. 10 (5), 397-409 (2013).</li>
<li>Maruthur, N. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27088241">Diabetes Medications as Monotherapy or Metformin-Based Combination Therapy for Type 2 Diabetes: A Systematic Review and Meta-analysis.</a> Annals of internal medicine. 164 (11), 740-751 (2016).</li>
<li>Aleman-Gonzalez-Duhart, D., Tamay-Cach, F., Alvarez-Almazan, S., Mendieta-Wejebe, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Advances+in+the+Biochemical+and+Physiological+Aspects+of+the+Treatment+of+Type+2+Diabetes+Mellitus+with+Thiazolidinediones%5BTitle%5D)+AND+%22PPAR+research%22%5BJournal%5D)">Current Advances in the Biochemical and Physiological Aspects of the Treatment of Type 2 Diabetes Mellitus with Thiazolidinediones.</a> PPAR research. , 7614270(2016).</li>
<li>Cohen, F. J., Neslusan, C. A., Conklin, J. E., Song, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+antihyperglycemic+prescribing+trends+for+US+privately+insured+patients+with+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+care%22%5BJournal%5D)">Recent antihyperglycemic prescribing trends for US privately insured patients with type 2 diabetes.</a> Diabetes care. 26 (6), 1847-1851 (2003).</li>
<li>Desai, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+medication+initiation+in+newly+diagnosed+diabetes+mellitus%3A+quality+and+cost+implications%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Patterns of medication initiation in newly diagnosed diabetes mellitus: quality and cost implications.</a> The American journal of medicine. 125 (3), e301-e307 (2012).</li>
<li>Martel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-obesogenic+and+antidiabetic+effects+of+plants+and+mushrooms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Anti-obesogenic and antidiabetic effects of plants and mushrooms.</a> Nature reviews. Endocrinology. , (2016).</li>
<li>Lanzerstorfer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+insulin+mimetic+drugs+by+quantitative+total+internal+reflection+fluorescence+%28TIRF%29+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22British+journal+of+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Identification of novel insulin mimetic drugs by quantitative total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy.</a> British journal of pharmacology. 171 (23), 5237-5251 (2014).</li>
<li>Onur, S., Stöckmann, H., Zenthoefer, M., Piker, L., Döring, F. <a target="_blank" href="http://www.ccsenet.org/journal/index.php/jfr/article/view/27642">The Plant Extract Collection Kiel in Schleswig-Holstein (PECKISH) Is an Open Access Screening Library.</a> Journal of Food Research. 2 (4), (2013).</li>
<li>Haselgrubler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gluc-HET%2C+a+complementary+chick+embryo+model+for+the+characterization+of+antidiabetic+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Gluc-HET, a complementary chick embryo model for the characterization of antidiabetic compounds.</a> PloS one. 12 (8), e0182788(2017).</li>
<li>Stadlbauer, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomolecular+Characterization+of+Putative+Antidiabetic+Herbal+Extracts%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Biomolecular Characterization of Putative Antidiabetic Herbal Extracts.</a> PloS one. 11 (1), e0148109(2016).</li>
<li>Greywe, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applicability+and+robustness+of+the+hen%27s+egg+test+for+analysis+of+micronucleus+induction+%28HET-MN%29%3A+results+from+an+inter-laboratory+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+research%22%5BJournal%5D)">Applicability and robustness of the hen's egg test for analysis of micronucleus induction (HET-MN): results from an inter-laboratory trial.</a> Mutation research. 747 (1), 118-134 (2012).</li>
<li>Manakova, E., Hubickova, L., Kostalova, J., Zemanova, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryotoxicity+of+mirtazapine%3A+a+study+using+Chick+Embryotoxicity+Screening+Test%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+endocrinology+letters%22%5BJournal%5D)">Embryotoxicity of mirtazapine: a study using Chick Embryotoxicity Screening Test.</a> Neuro endocrinology letters. 31, Suppl 2. 8-10 (2010).</li>
<li>Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+embryo+chorioallantoic+membrane+as+a+useful+tool+to+study+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22International+review+of+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Chick embryo chorioallantoic membrane as a useful tool to study angiogenesis.</a> International review of cell and molecular biology. 270, 181-224 (2008).</li>
<li>Yoshiyama, Y., Sugiyama, T., Kanke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+diabetes+model+in+chick+embryos+treated+with+streptozotocin%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+%26+pharmaceutical+bulletin%22%5BJournal%5D)">Experimental diabetes model in chick embryos treated with streptozotocin.</a> Biological & pharmaceutical bulletin. 28 (10), 1986-1988 (2005).</li>
<li>Wolf, T., Niehaus-Rolf, C., Luepke, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+new+methodological+aspects+of+the+hen%27s+egg+test+for+micronucleus+induction+%28HET-MN%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+research%22%5BJournal%5D)">Some new methodological aspects of the hen's egg test for micronucleus induction (HET-MN).</a> Mutation research. 514 (1-2), 59-76 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Test HET-CAM jest szeroko stosowanym alternatywnym systemem testowym dla testów na zwierzętachw przemyśle 12. Opisany tutaj system in-ovo stanowi zmodyfikowaną wersję testu HET-CAM. Podczas gdy w swojej pierwotnej formie eksperymenty HET-CAM są przeprowadzane w celu zbadania drażniących właściwości związków i formulacji lub analizy angiogenezy 14,15,16, dostosowaliśmy podejście do badania związków o przypuszczalnych cechach insulinomimetycznych12. Zgodnie z dyrektywą 2010/63/UE doświadczenia na niewyklutych zarodkach ptaków w ciągu pierwszych dwóch trzecich rozwoju zarodka nie wymagają zgody komisji etycznej, ponieważ nie są one uznawane za doświadczenia na zwierzętach. Ostatnie badania dowiodły przydatności systemu in-ovo do scharakteryzowania skuteczności wybranych ekstraktów ziołowych, które zostały zidentyfikowane w pierwotnym badaniu przesiewowym opartym na translokacji GLUT410, w celu obniżenia poziomu glukozy we krwi przy braku insuliny12,13. Punkty krytyczne dla dobrego działania systemu in-ovo obejmują: Po pierwsze, niezawodna hodowca dostarczająca zapłodnione jaja. Klasyczny brązowy kurczak Lohmann to dobry wybór rasy. Po drugie, należy przeprowadzić badania toksyczności w celu wykluczenia toksycznego działania badanego związku. Ponadto ważne jest przygotowanie odpowiedniego naczynia krwionośnego do pobrania krwi. Ważne jest, aby unikać przecinania dużych naczyń w samej błonie kosmówkowo-omoczniowej, ponieważ może to prowadzić do niepożądanej utraty krwi. Ponadto, zanim naczynie zostanie przecięte na pasku pH, należy je osuszyć za pomocą bibuły filtracyjnej, aby zapobiec rozcieńczeniu pobranej krwi. Wreszcie, wydaje się, że istotna wydaje się wystarczająca liczba eksperymentów. Zalecamy użycie co najmniej 10 jaj na każdy punkt czasowy i trzykrotne powtórzenie danego eksperymentu.
Oczywiście takie podejście in-ovo ma pewne ograniczenia. Ponieważ potrzeba do 30 minut, zanim substancje zostaną wchłonięte przez błonę skorupki jaja i wejdą w bliski kontakt z błoną kosmówkowo-omocznikową, nie jest możliwe ilościowe określenie szybkiej reakcji zarodka na zastosowany związek. Ponadto niektóre związki mogą być toksyczne w zastosowanym stężeniu, co często prowadzi do uszkodzeń naczyń krwionośnych w błonie kosmówkowej. W związku z tym badanie cytotoksyczności oparte na długotrwałej inkubacji związków przez około 24 godziny wydaje się uzasadnione. Wreszcie, stwierdziliśmy, że system buforowy stosowany do aplikacji związków ma znaczący wpływ na wydajność testu. 12 Obecnie stosuje się bufor HBSS, ponieważ ma on najmniejszy wpływ na stężenie glukozy we krwi zarodka.
Dla przyszłych zastosowań mogą zostać przetestowane dodatkowe systemy buforowe jako alternatywa dla HBSS. Co więcej, wpływ ekstraktów ziołowych na dodatkowe parametry krwi, takie jak cholesterol, trójglicerydy czy lipoproteiny, może być atrakcyjnym pytaniem.
Nasz nowy system in-ovo jest obiecującym i ważnym narzędziem do testowania substancji o cechach insulinomimetycznych w żywym organizmie bez konieczności przeprowadzania eksperymentów na zwierzętach. W związku z tym wypełnia lukę między podejściami in vitro i in vivo . W porównaniu z istniejącymi systemami modelowymi in ovo17 nie ma potrzeby wywoływania cukrzycy za pomocą leczenia streptozotocyną (STZ), ponieważ używamy zarodków w 10 lub 11 dniu inkubacji. Na tym etapie produkcja insuliny jeszcze się nie rozpoczęła, ale zarodki są już wrażliwe na insulinę. Ponadto zgoda komisji bioetycznej może być wymagana, jeśli wykorzystuje się zarodki w wieku od 14 do 17 dni17 dni. Ponadto, w porównaniu z alternatywnymi strategiami18, opisane tutaj stosowanie związków jest mniej szkodliwe i pracochłonne, co zwiększa szybkość wykorzystania eksperymentalnego.
Podsumowując, to podejście in-ovo jest atrakcyjnym systemem, jeśli konieczne jest przetestowanie na żywym organizmie działania substancji insulinomimetycznej obniżającego stężenie krwi.

Cukrzyca jest chorobą metaboliczną charakteryzującą się hiperglikemią i jest spowodowana defektami w wydzielaniu insuliny lub działaniu insuliny1. Dziewięćdziesiąt procent wszystkich przypadków cukrzycy to cukrzyca typu 2 (T2DM), w której osoby wykazują insulinooporność, a głównie niedobór insuliny2. Wiadomo, że kilka czynników zwiększa globalną częstość występowania cukrzycy typu 2, w tym zmiany w stylu życia, szczególnie te związane z przeżywieniem, starzeniem się i brakiem aktywności fizycznej. Według Międzynarodowej Federacji Diabetologicznej (IDF) około 400 milionów ludzi na całym świecie ma cukrzycę. Oczekuje się, że liczba ta osiągnie 600 milionów w ciągu najbliższych 20 lat3.
Powikłania cukrzycowe spowodowane hiperglikemią i insulinoopornością, takie jak nadciśnienie, dyslipidemia, nietolerancja glukozy, choroba niedokrwienna serca i choroba naczyń mózgowych, prowadzą do znacznego obniżenia oczekiwanej długości życia i jakości4. Osoby dotknięte chorobą wymagają farmakoterapii obniżającej stężenie glukozy; Jednak stosowanie leków, takich jak metformina5 często wiąże się z dramatycznymi skutkami ubocznymi6,7,8. Dlatego konieczne są dalsze metody leczenia przeciwcukrzycowego, które są bezpieczne, powszechnie dostępne i niedrogie.
Różnym związkom ziołowym, ekstraktom, roślinom i nutraceutykom przypisuje się właściwości insulinomimetyczne poprzez modulowanie różnych funkcji komórkowych. Ważną cechą jest stymulacja translokacji transportera glukozy 4 (GLUT4) do błony komórkowej z wewnątrzkomórkowych przedziałów magazynowych, co skutkuje zwiększonym wychwytem glukozy w tkance mięśniowej i tłuszczowej przy braku insuliny, co jest znane jako właściwości insulinomimetyczne9. Wcześniej wdrożyliśmy podejście oparte na mikroskopii fluorescencyjnej w celu ilościowego określenia procesu translokacji GLUT410. Analiza licznych ekstraktów roślinnych z biblioteki ekstraktów11 przy użyciu tego testu zaowocowała identyfikacją obiecujących kandydatów. Wymagane są jednak dalsze badania na organizmach żywych. Podejście opisane szczegółowo w tym artykule, zmodyfikowany model zarodka kurcząt, okazało się obiecującym modelem do identyfikacji substancji o właściwościach insulinomimetycznych. Stanowi atrakcyjne narzędzie wypełniające dużą lukę między badaniami in vitro i in vivo i oferuje szereg zalet w porównaniu z istniejącymi systemami, takich jak akceptowalne koszty, proste procedury obsługi i odpowiednie wskaźniki przepustowości. Ponadto nie jest wymagana zgoda komisji bioetycznej.

<table><tbody><tr><td>Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Biochrom</td><td>L1825</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s zrównoważony roztwór soli (HBSS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30268.02</td><td></td></tr><tr><td>NovoRapid</td><td>Novo Nordisk</td><td>8-0905-82-304-6</td><td></td></tr><tr><td>Jaja kurze (Lohmann klasyczny brązowy kurczak)</td><td>Lokalny hodowca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accu-check performa</td><td>Roche</td><td>6454011</td><td></td></tr><tr><td>Accu-check Inform II Teststreifen</td><td>Roche&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5942861 Inkubator&nbsp; HEKA- Turbo 288</td><td>HEKA Brutger&auml; Te</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Omnican F 1 ml</td><td>Braun</td><td>09161502S&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakty Biblioteka</td><td></td><td></td><td>ekstraktów z Pekinu</td></tr><tr><td>Lampa Tempo Nr 119</td><td>ORBAN</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

model in ovo do badania związków insulinomimetycznych

An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

Podwyższony poziom glukozy we krwi w cukrzycy typu 2 (T2DM), złożonej i wieloczynnikowej chorobie metabolicznej, jest spowodowany insulinoopornością i niewydolnością komórek β. Stosowano różne strategie, w tym wstrzykiwanie insuliny lub stosowanie leków uwrażliwiających na insulinę, w celu leczenia cukrzycy typu 2 lub przynajmniej zmniejszenia objawów. Ponadto coraz większą uwagę cieszy się stosowanie związków ziołowych. W związku z tym konieczne jest znalezienie skutecznych systemów testowych do identyfikacji i charakterystyki związków insulinomimetycznych. Opracowaliśmy tutaj zmodyfikowany model zarodka pisklęcia, który umożliwia testowanie związków syntetycznych i ekstraktów ziołowych o właściwościach insulinomimetycznych. Korzystając z pierwotnego badania przesiewowego opartego na mikroskopii fluorescencyjnej, które określa ilościowo translokację transportera glukozy 4 (Glut4) do błony plazmatycznej, byliśmy w stanie zidentyfikować związki, głównie ekstrakty ziołowe, które prowadzą do wzrostu wewnątrzkomórkowych stężeń glukozy w adipocytach. Skuteczność tych substancji wymaga jednak dalszej weryfikacji w żywym organizmie. W związku z tym zastosowaliśmy podejście in-ovo, aby zidentyfikować ich właściwości obniżające poziom glukozy we krwi. Zgoda komisji etycznej nie jest konieczna, ponieważ wykorzystanie zarodków kurcząt w ciągu pierwszych dwóch trzecich rozwoju embrionalnego nie jest uważane za doświadczenie na zwierzętach. Tutaj szczegółowo opisano zastosowanie tego modelu.

Opis podejścia Gluc-HET:
Po inkubacji z badanymi substancjami zapłodnione jaja są otwierane i przygotowywane do pobrania krwi poprzez usunięcie skorupki (Rysunek 2). Dalsza procedura obejmuje równoważenie i usunięcie błony skorupkowej w celu uzyskania dostępu do błony chorioalantoicznej. Błona ta jest następnie ostrożnie rozcinana, aby uzyskać dostęp do odpowiedniego naczynia krwionośnego do pobrania krwi. Preferowane jest umieszczenie dużego naczynia wychodzącego z brzucha zarodka na plastikowym pasku pH. Aby uniknąć rozcieńczenia krwi podczas pobierania, naczynie i pasek pH są osuszane papierem filtracyjnym. Następnie naczynie krwionośne zostaje przecięte, a krew wyciekająca na pasek pH jest zbierana do analizy za pomocą pipety.
Wpływ wybranych ekstraktów roślinnych na poziom glukozy we krwi:
Dzięki niedawno opracowanemu badaniu przesiewowemu opartemu na ilościowym pomiarze translokacji GLUT4 jesteśmy w stanie zidentyfikować substancje o charakterystyce insulinopodobnej10. Przesiewowe badanie setek rozpuszczalnych w wodzie ekstraktów roślinnych doprowadziło do zidentyfikowania kilku trafień. Ekstrakty te przetestowano w naszym modelu in-ovo. W eksperymentach zastosowano ekstrakty przygotowane z Combretum indicum (pnącze rangunskie) oraz jeden nieujawniony ekstrakt (oznaczony jako ekstrakt 0845). Rozpuściliśmy ekstrakty w buforze HBSS w stężeniu 300 mg/L, które okazało się odpowiednie w poprzednich badaniach12,13. Substancje podano zarodom inkubowanym przez 11 dni. Jak pokazano na Rysunku 3, ekstrakt z pnącza rangunskiego nie spowodował istotnej redukcji glukozy we krwi in-ovo. Natomiast w przypadku ekstraktu 0845 udało się obniżyć stężenie glukozy we krwi, przy czym po 60 min odnotowano niewielki spadek, co jest porównywalne z efektem zaobserwowanym przy użyciu komercyjnie dostępnego analogu insuliny. Istotny efekt zaobserwowano po wydłużeniu czasu inkubacji jajy.
<img alt="Etapy rozwoju zarodka, zarodek kręgowca, inkubacja jaja, badanie biologiczne, cztery widoki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57237/57237fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1: Wpływ związków toksycznych na żywotność zarodków. Jaja inkubowano przez 1 dni. (A i C) lub poddane działaniu toksycznego ekstraktu ziołowego w 10. dniu przez kolejne 24 h (B i D). Zastosowanie ekstraktu doprowadziło do ciężkich uszkodzeń naczyń krwionośnych w błonie chorioallantoicznej (D) oraz zarodek (B).
<img alt="Seria doświadczeń dotyczących osmozy w jajku; usunięcie skorup, zastosowanie roztworu, pomiar glukozy; kroki doświadczalne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57237/57237fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Opis in-ovo model Od lewej do prawej: otwarcie i usunięcie skorupki jaja (1-2); równoważenie i usuwanie błony skorupowej z odsłoniętą błoną chorioallantoiczną (3); przygotowane naczynie na pasku pomiarowym pH (4); pobieranie krwi i pomiar stężenia glukozy przy użyciu glukometru (5)Opracowano na podstawie pracy Haselgrueblera i wsp.., 201712. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57237/57237fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres słupkowy przedstawiający spadek poziomu glukozy we krwi w czasie pod wpływem insuliny, *C. indicum* oraz ekstraktu 0845." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57237/57237fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Wpływ ekstraktów ziołowych na poziom glukozy we krwi w porównaniu z jajami nieleczonymi lub leczonymi insuliną. Jaja inkubowano przez 1 dni i traktowano wskazanymi substancjami (dostępny komercyjnie analog insuliny: 3,3 J/ml; ekstrakty: 30 mg/l) rozpuszczonymi w buforze HBSS (300 µL objętości) przez maksymalnie 3 h. Poziomy glukozy we krwi oznaczono przy użyciu glukometru. Wyniki przedstawiono bez uwzględnienia wpływu buforu. Słupki błędów opierają się na standardowym błędzie średniej. *P &lt;0,05 oraz ****P &lt;0,001, istotny spadek w stosunku do jaj traktowanych HBSS o tym samym czasie inkubacji. Adaptacja na podstawie Haselgruebler i wsp.., 201712. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57237/57237fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

W tym badaniu opisujemy system in-ovo jako obiecujące narzędzie do testowania związków insulinomimetycznych w żywym organizmie. Do głównych zalet należy zaliczyć odpowiednie przepustowości i akceptowalne koszty, które umożliwiają identyfikację fitozwiązków o właściwościach insulinomimetycznych.

Model in ovo do badania związków insulinomimetycznych

Elevated blood glucose levels in type 2 diabetes mellitus (T2DM), a complex and multifactorial metabolic disease, are caused by insulin resistance and ...

Ogólnym celem przedstawionego zmodyfikowanego modelu zarodka pisklęcia jest scharakteryzowanie substancji o właściwościach insulinomimetycznych w organizmie żywym. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad diabetykami, takie jak znalezienie ekstraktów ziołowych o właściwościach insulinomimetycznych, które obniżają poziom glukozy we krwi bez skutków ubocznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że skuteczność związków może być testowana w żywym organizmie przy odpowiedniej przepustowości i że nie jest wymagana zgoda komisji bioetycznej.Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy przygotowania i cięcia są trudne do nauczenia, ponieważ naczynia nie są łatwe do przygotowania lub często są całkowicie przecięte i gubią się. Sprawdź jaja pod kątem zapłodnienia po inkubacji w temperaturze 38 stopni Celsjusza przy średniej wilgotności od 40 do 60 procent przez okres do 11 dni. Aby to zrobić, zanurz frędzle lampy konserwującej w poduszce z atramentem, a następnie zapal spiczastą stronę jajka.Aby zidentyfikować pęcherz powietrzny, sprawdź, czy nie ma różnic w jasności na górze jajka. Pęcherz powietrzny wydaje się być okrągłym, bardziej przezroczystym obszarem, podczas gdy albumina wydaje się ciemniejsza. Zaznacz położenie pęcherza powietrznego, lekko dociskając lampę do jajka wcześniej nałożonym tuszem.Wyklucz niezapłodnione jaja, które nie wykazują różnicy w jasności między albuminą a pęcherzem powietrznym. Przygotuj insulinomimetyk lub insulinę, rozcieńczając do pożądanego stężenia w zrównoważonym roztworze soli Hanka. Aby nałożyć wybrany związek, użyj spiczastej pęsety, aby ostrożnie dziobać skorupkę jajka w zaznaczonym obszarze pęcherza powietrznego, aby utworzyć otwór równy średnicy strzykawki z igłą.Za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności jednego mililitra wstrzyknąć 300 mikrolitrów roztworu buforowego zawierającego substancję będącą przedmiotem zainteresowania. Aby określić działanie substancji obniżające poziom glukozy we krwi, umieść jaja z powrotem w inkubatorze i zmierz poziom glukozy we krwi po 60, 120 i 180 minutach. W odpowiednim momencie ostrożnie wyjmij skorupkę jajka nad pęcherzem powietrznym i wyrównaj błonę skorupki jaja, dodając wystarczającą ilość buforu PBS, aby pokryć całą błonę.Po wylaniu nadmiaru PBS użyj spiczastej pęsety, aby ostrożnie zdjąć błonę skorupki jajka. Użyj mikronożyczek, aby przeciąć i usunąć błonę kosmówkowo-omocznikową, unikając dużych naczyń w błonie. Zlokalizuj duże naczynie wychodzące z brzucha zarodka.Wyjmij to naczynie z albuminy za pomocą zamkniętych mikronożyczek i umieść je na plastikowym pasku pH. Przesuń pasek pH pod naczyniem i ostrożnie pociągnij mikronożyczki. Konieczne jest przygotowanie dużego naczynia krwionośnego wychodzącego z jamy brzusznej, ponieważ mniejsze mogą się rozerwać i uniemożliwić pobranie krwi.Usunąć płyn otaczający naczynie za pomocą pipety, aby uniknąć rozcieńczenia krwi. Następnie użyj bibuły filtracyjnej, aby wysuszyć naczynie i pasek pH. W przypadku pobierania krwi ważne jest, aby nie przecinać całkowicie naczynia, ponieważ zostanie ono utracone.Następnie za pomocą mikronożyczek ostrożnie przeciąć naczynie krwionośne z jednej strony. Nie przecinaj naczynia więcej niż do połowy, aby uniknąć całkowitego przecięcia naczynia. Zebrać wyciekającą krew na pasek pH za pomocą pipety.Do określenia poziomu glukozy za pomocą glukometru potrzeba 10 mikrolitrów krwi. Po zastosowaniu wybranego związku przez 24 godziny, należy zrównoważyć błonę skorupki jaja PBS jak poprzednio przez co najmniej 30 sekund. Usuń nadmiar buforu PBS, wylewając go.Następnie ostrożnie zdejmij membranę skorupki jajka za pomocą spiczastej pęsety. Sprawdź naczynia krwionośne pod kątem zmian chorobowych i potwierdź witalność, obserwując ruch zarodka pisklęcia. Do eksperymentów wykorzystano ekstrakty przygotowane z combretum indicum, czyli pnącza z Rangunu, oraz nieujawniony ekstrakt oznaczony jako ekstrakt 0845.Jak wskazano na tym rysunku, ekstrakt z pnącza Rangunu nie spowodował znacznego obniżenia stężenia glukozy we krwi. Jednak stężenie glukozy we krwi udało się obniżyć za pomocą ekstraktu 0845, a znaczący efekt zaobserwowano po wydłużeniu czasu inkubacji. W porównaniu z jajami nieleczonymi, traktowanie jaj toksycznym ekstraktem ziołowym w dniu 10 przez 24 godziny doprowadziło do poważnych zmian w naczyniach krwionośnych w błonie kosmówkowej omoczniowej.Zmiany chorobowe były również widoczne na leczonym zarodku w porównaniu z normalną kontrolą. Po opanowaniu dwa jaja można przeanalizować pod kątem poziomu glukozy i toksyczności w ciągu pięciu minut, jeśli zostaną wykonane prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować naczynia krwionośne i pobrać krew w modelu zarodka kurczaka, aby określić ilościowo działanie związków naturalnych lub syntetycznych na obniżenie poziomu glukozy we krwi.

an-in-ovo-model-for-testing-insulin-mimetic-compounds

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Zasobniki konserwowanych szlaków sygnalizacji insulinowej występujące u muszki owocówki Drosophila melanogaster sprawiają, że organizm ten jest potencjalnym narzędziem do modelowania zaburzeń metabolicznych, w tym cukrzycy typu II. W związku z tym kluczowe jest opracowanie testów fizjologicznych pozwalających na skuteczne pomiary ogólnoustrojowego działania insuliny w zakresie obwodowej utylizacji glukozy u dorosłych much.

Wstrzykiwanie insuliny i pobieranie hemolimfy w celu pomiaru wrażliwości na insulinę u dorosłych Drosophila melanogaster

Opisano trójwymiarowy test kolonogenny, który pozwala progenitorom o fenotypie trzustkowym na różnicowanie się w kolonie wykazujące ekspresję insuliny. Metoda ta wykorzystuje półstałe podłoża zawierające metylocelulozę, Matrigel oraz czynniki wzrostu, w których pojedyncze komórki progenitorowe proliferują i różnicują się in vitro, co umożliwia ilościowe określenie liczby funkcjonalnych progenitorów w populacji.

Ilościowe oznaczenie progenitorów tworzących kolonie wykazujących ekspresję insuliny

Niniejszy protokół umożliwia identyfikację czynników modulujących funkcjonalną masę komórek beta w celu znalezienia potencjalnych celów terapeutycznych w leczeniu cukrzycy. Protokół składa się z usprawnionej metody oceny replikacji wysepek oraz funkcji komórek beta w izolowanych wysepkach szczura po manipulacji ekspresją genów za pomocą adenowirusów.

Ocena replikacji i funkcji komórek beta w izolowanych wysepkach gryzoni poddanych transdukcji adenowirusowej

Prezentujemy tutaj protokół izolacji wysp trzustkowych z mysiego modelu cukrzycy typu 2, Leprdb oraz szczegóły testu żywych komórek do pomiaru wydzielania insuliny z nienaruszonych wysp trzustkowych, który wykorzystuje mikroskopię 2-fotonową.

Mysi model cukrzycy typu 2 Leprdb: izolacja wysp trzustkowych i obrazowanie 2-fotonowe żywych komórek nienaruszonych wysp trzustkowych

Kluczowe wyzwania dla dziedziny badań nad cukrzycą to zrozumienie mechanizmów molekularnych regulujących replikację komórek β wysp trzustkowych oraz opracowanie metod stymulowania regeneracji komórek β. W niniejszym artykule przedstawiono metodę badań przesiewowych o wysokiej zawartości w celu identyfikacji i oceny aktywności małych cząsteczek wspomagającej replikację komórek β.

Platforma odkrywania replikacji β komórek wysp trzustkowych o wysokiej zawartości in vitro

Tutaj prezentujemy metodologię generowania i podawania mikrosfer z poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) (PLGA) do nienaruszonych mysich wysp trzustkowych w hodowli, a następnie analizy immunofluorescencyjnej proliferacji komórek β. Metoda ta jest odpowiednia do określania skuteczności kandydujących mitogenów β-komórkowych.

Trwałe podawanie mitogenów z komórek β do nienaruszonych wysepek myszy ex vivo przy użyciu biodegradowalnych mikrosfer poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego)

Tutaj prezentujemy jednorodny FRET (HTRF) jako skuteczną metodę szybkiego wykrywania insuliny wydzielanej przez komórki.

Jednorodny, rozdzielczy w czasie test rezonansowy oparty na transferze energii Förstera do wykrywania wydzielania insuliny

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzić szybkie, tanie testy lucyferazy przy średniej przepustowości przy użyciu lucyferazy Gaussia połączonej z insuliną jako wskaźnika wydzielania insuliny z komórek beta. Test można wykonać za pomocą większości czytników płytek luminescencyjnych i pipet wielokanałowych.

Pomiar względnego wydzielania insuliny za pomocą współwydzielanego surogatu lucyferazy

Ten protokół opisuje metodę synchronicznego pozyskiwania i korejestracji wewnątrzkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych oraz wydzielania insuliny i glukagonu przez pierwotne ludzkie pseudowyspy za pomocą adenowirusowego dostarczania cyklicznego biosensora monofosforanu adenozyny (cAMP), detektora różnic cAMP in situ (cADDis) oraz systemu mikroperyfuzji.

Ludzki system pseudowysp do synchronicznej oceny dynamiki biosensorów fluorescencyjnych i profili wydzielania hormonów

Opracowaliśmy test hybrydyzacji Duplex in situ do mapowania izoform receptora insuliny IR-A i IR-B w mysim splocie naczyniówkowym, pokonując ograniczenia tradycyjnych metod. To podejście o wysokiej rozdzielczości ujawnia ekspresję specyficzną dla izoformy, oferując nowe informacje na temat sygnalizacji insuliny w mózgu i potencjalnych terapii ukierunkowanych na izoformy w zaburzeniach neurologicznych.

Precyzyjna wizualizacja receptorów insuliny A i B w mózgu myszy za pomocą testu hybrydyzacji RNA in situ

Poznaj zmodyfikowany model zarodka kurzego do badania związków insulinomimetycznych w żywym organizmie. Ta metoda pozwala szybko oceniać ekstrakty roślinne obniżające poziom glukozy we krwi bez konieczności zgody komisji etycznej.

Model in ovo do badania związków insulinomimetycznych

Przeglądaj więcej filmów