Name: Specjalnie zaprojektowane formy do kultur tkankowych od mistrzów trawionych laserowo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Poznaj metodę szybkiego i taniego wytwarzania niestandardowych form PDMS do inżynierii tkankowej. Technika umożliwia precyzyjną kontrolę geometrii tkanki, co wspiera badania nad rozwojem tkanek i analizą mechaniczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za finansowanie z NIH R00 HL115123 i Brown University School of Engineering. Są również wdzięczni Brown Design Workshop i Chrisowi Bullowi za szkolenie i wsparcie przy wycinarce laserowej.

<ol><li>Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+for+micro-+and+nanoscale+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Soft lithography for micro- and nanoscale patterning.</a> Nat. Protoc. 5, 491(2010).</li>
<li>Rogers, J. A., Nuzzo, R. G. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369702105007029">Recent progress in soft lithography.</a> Mater. Today. 8, 50-56 (2005).</li>
<li>Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+Lithography+in+Biology+and+Biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Soft Lithography in Biology and Biochemistry.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).</li>
<li>Isiksacan, Z., Guler, M. T., Aydogdu, B., Bilican, I., Elbuken, C. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/0960-1317/26/3/035008">Rapid fabrication of microfluidic PDMS devices from reusable PDMS molds using laser ablation.</a> J. Micromechanics Microengineering. 26, 035008(2016).</li>
<li>Lee, K. Y., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11710233">Hydrogels for Tissue Engineering.</a> Chem. Rev. 101, 1869-1880 (2001).</li>
<li>Kloxin, A., Kloxin, C., Bowman, C., Anseth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+cellularly+responsive+hydrogels+and+their+experimental+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater.+Deerfield+Beach+Fla%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of cellularly responsive hydrogels and their experimental determination.</a> Adv. Mater. Deerfield Beach Fla. 22, 3484-3494 (2010).</li>
<li>Aubin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+3D+cell+alignment+and+elongation+in+microengineered+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels.</a> Biomaterials. 31, 6941-6951 (2010).</li>
<li>Jaiswal, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vacancy-Driven+Gelation+Using+Defect-Rich+Nanoassemblies+of+2D+Transition+Metal+Dichalcogenides+and+Polymeric+Binder+for+Biomedical+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Vacancy-Driven Gelation Using Defect-Rich Nanoassemblies of 2D Transition Metal Dichalcogenides and Polymeric Binder for Biomedical Applications.</a> Adv. Mater. 29, (2017).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt%2F%CE%B2-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nat. Protoc. 8, 162-175 (2013).</li>
<li>Boxshall, K., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/sia.2274/abstract">Simple surface treatments to modify protein adsorption and cell attachment properties within a poly(dimethylsiloxane) micro-bioreactor.</a> Surf. Interface Anal. 38, 198-201 (2006).</li>
<li>Pins, G. D., Christiansen, D. L., Patel, R., Silver, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+collagen+fibers.+Influence+of+fibrillar+alignment+and+decorin+on+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of collagen fibers. Influence of fibrillar alignment and decorin on mechanical properties.</a> Biophys. J. 73, 2164-2172 (1997).</li>
<li>Pipan, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+antifibrinolytic+agents+on+the+life+span+of+fibrin+sealant%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of antifibrinolytic agents on the life span of fibrin sealant.</a> J. Surg. Res. 53, 402-407 (1992).</li>
<li>Roberts, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+Cells+in+Dense+Collagen+Promote+Cardiomyocyte+and+Microvascular+Patterning+in+Engineered+Human+Heart+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Stromal Cells in Dense Collagen Promote Cardiomyocyte and Microvascular Patterning in Engineered Human Heart Tissue.</a> Tissue Eng. Part A. 22, 633-644 (2016).</li>
<li>Ye, K. Y., Sullivan, K. E., Black, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+Cardiomyocytes+in+a+Fibrin+Hydrogel+for+Cardiac+Tissue+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering.</a> JoVE. , (2011).</li>
<li>Zimmermann, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Engineering+of+a+Differentiated+Cardiac+Muscle+Construct%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue Engineering of a Differentiated Cardiac Muscle Construct.</a> Circ. Res. 90, 223-230 (2002).</li>
<li>McCain, M. L., Agarwal, A., Nesmith, H. W., Nesmith, A. P., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromolded+Gelatin+Hydrogels+for+Extended+Culture+of+Engineered+Cardiac+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Micromolded Gelatin Hydrogels for Extended Culture of Engineered Cardiac Tissues.</a> Biomaterials. 35, 5462-5471 (2014).</li>
<li>Hu, J. J., Chen, G. W., Liu, Y. C., Hsu, S. S. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11340-013-9826-2">Influence of Specimen Geometry on the Estimation of the Planar Biaxial Mechanical Properties of Cruciform Specimens.</a> Exp. Mech. 54, 615-631 (2014).</li>
<li>Munarin, F., Kaiser, N. J., Kim, T. Y., Choi, B. R., Coulombe, K. L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-Etched+Designs+for+Molding+Hydrogel-Based+Engineered+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Laser-Etched Designs for Molding Hydrogel-Based Engineered Tissues.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 23, 311-321 (2017).</li>
<li>Zhang, H., Chiao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-fouling+Coatings+of+Poly%28dimethylsiloxane%29+Devices+for+Biological+and+Biomedical+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Biol.+Eng%22%5BJournal%5D)">Anti-fouling Coatings of Poly(dimethylsiloxane) Devices for Biological and Biomedical Applications.</a> J. Med. Biol. Eng. 35, 143-155 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Niestandardowe geometrie form PDMS, które są kompatybilne z kulturą tkankową, mają ogromne zastosowanie w dostrajaniu ważnych właściwości tkanek inżynieryjnych, takich jak wyrównanie komórek, szybkość dyfuzji i efektywna sztywność. Dodatkowo formy te są bardzo przydatne do przygotowania tkanek do zastosowań analitycznych, w których ważna jest geometria, takich jak badania mechaniczne16,17. Przygotowanie tych urządzeń z wycinanych laserowo ujemnych form wzorcowych...

W ciągu ostatnich dwóch dekad miękka litografia była szeroko stosowana jako technika produkcyjna wspierająca badania naukowe, szczególnie w dziedzinie mikrofluidyki, badań materiałowych i inżynierii tkankowej1,2,3. Formowanie replik, w którym obiekt o pożądanym kształcie jest tworzony z ujemnej formy wzorcowej, oferuje wygodną i tanią metodę wytwarzania dodatnich replik PDMS, które można wykorzystać do odlewania hydrożeli w kształcie. Jednak wymagane ujemne formy wzorcowe są zwykle produkowane przy użyciu technik mikrowytwarzania, które są drogie, czasochłonne, mają ograniczony rozmiar i wymagają przestrzeni w pomieszczeniu czystym oraz wyrafinowanego sprzętu. Chociaż druk 3D stanowi potencjalną alternatywę, jego użyteczność jest nieco ograniczona ze względu na ograniczenia rozdzielczości tańszych drukarek oraz interakcje chemiczne między powszechnymi polimerami drukarek 3D a PDMS, które mogą hamować utwardzanie.
Systemy wycinarek laserowych zdolne zarówno do cięcia, jak i trawienia materiałów takich jak plastik, drewno, szkło i metal, stały się ostatnio drastycznie tańsze, a tym samym bardziej dostępne do produkcji narzędzi badawczych. Komercyjne wycinarki laserowe są w stanie wytwarzać obiekty w skali centymetrowej z minimalnymi cechami mniejszymi niż 25 μm, a ponadto wymagają minimalnego szkolenia, wiedzy i czasu na użytkowanie. Podczas gdy ablacja laserowa PDMS była wcześniej stosowana w produkcji urządzeń mikroprzepływowych, o ile nam wiadomo, żaden manuskrypt nie opisał procesu, w którym formy w skali milimetrowej i centymetrowej mogą być wytwarzane z laserowo wycinanych ujemnych form wzorcowych4.
Użyliśmy tej techniki głównie do manipulowania kształtem tkanek inżynieryjnych w celu poprawy dyfuzji składników odżywczych, wyrównania komórkowego i właściwości mechanicznych5,6,7. Jednak wszechstronność tej techniki pozwala na jej wykorzystanie w każdej dziedzinie, w której interesujące są formowane hydrożele, takich jak dostarczanie leków i badania materiałoznawcze8. Dzięki dostępowi do wycinarki laserowej, repliki form PDMS mogą być wykonane dla prawie każdej geometrii bez wysięgów (co uniemożliwiłoby usunięcie bez wieloczęściowej formy, co wykracza poza zakres tego manuskryptu) i które mieszczą się w wymiarach łoża laserowego.

<table><tbody><tr><td><silny>Pozycja</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibrynogen bydlęcy</td><td>Sigma</td><td>F8630-5G</td><td>Buduje</td></tr><tr><td>Trombinę bydlęcą</td><td>Sigma</td><td>T6634-250UN</td><td>Buduje</td></tr><tr><td>bydlęcą aprotyninę</td><td>Sigma</td><td>10820-25MG</td><td>Buduje</td></tr><tr><td>kolagen z ogona szczura, 4 mg / ml</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5153-100MG</td><td>Konstrukcje</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher</td><td>BP358-10</td><td>Konstrukcje</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-250</td><td>Konstrukcje</td></tr><tr><td>Cienkie kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td>Konstrukcje</td></tr><tr><td>Sylgard 184 elastomer silikonowy</td><td>Corning</td><td>4019862</td><td>PDMS Formy</td></tr><tr><td>Taśma laboratoryjna</td><td>Fisher</td><td>15-901-5R</td><td>PDMS Formy</td></tr><tr><td>Akryl, 1/4" gruby</td><td>McMaster-Carr</td><td>8560K356</td><td>PDMS Formy</td></tr><tr><td>Bufor HEPES, 1 M Sigma</td><td></td><td>H3537-100ML</td><td>Konstrukcje</td></tr><tr><td>RPMI 1640 średnie, proszek</td><td>Fisher</td><td>31800-089</td><td>Konstrukcje</td></tr><tr><td>Dwuwodny chlorek wapnia</td><td>Fisher</td><td>AC423520250</td><td>Konstrukty</td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek magnezu</td><td>Fisher</td><td>M33 500</td><td>Konstrukty</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma</td><td>P9541-500G</td><td>Konstrukcje</td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy siedmiowodny</td><td>Sigma</td><td>S9390-500G</td><td>Wytwarza</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma</td><td>G5767-25G</td><td>Buduje</td></tr><tr><td>OCT</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td>Histologia</td></tr><tr><td>Mrożone formy blokowe</td><td>VWR</td><td>25608-916</td><td>Histologia</td></tr><tr><td>Hematoksylina</td><td>Fisher</td><td>3530 1</td><td>Histologia</td></tr><tr><td>Eozyna Y</td><td>Fisher</td><td>AC152880250</td><td>Histologia</td></tr><tr><td>Szybki zielony FCF</td><td>Fisher</td><td>AC410530250</td><td>Histologia</td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Illustrator</td><td>Adobe Systems</td><td></td><td>Grafika wektorowa</td></tr><tr><td>Inkscape</td><td>(Open Source)</td><td></td><td>Grafika</td></tr> <tr>wektorowa<td>UCP (Universal Control Panel)</td><td>Uniwersalne systemy</td><td></td> laserowe <td>Interfejs wycinarki laserowej</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLS6.75 Wycinarka laserowa</td><td>Uniwersalne systemy</td><td></td> laserowe <td>Wycinarka laserowa</td></tr><tr><td>Analizator mikromechaniczny</td><td>Aurora Scientific</td><td>1530A z ogniwem obciążnikowym 5 mN</td><td>Analiza mechaniczna</td></tr></tbody></table>

specjalnie zaprojektowane formy do kultur tkankowych od mistrzów trawionych laserowo

Custom Engineered Tissue Culture Molds from Laser-etched Masters

Wraz z rozwojem inżynierii tkankowej, wzrosło zainteresowanie szerokim zakresem parametrów tkanki, w tym kształtem tkanki. Manipulowanie kształtem tkanki w skali od mikrometra do centymetra może kierować wyrównaniem komórek, zmieniać efektywne właściwości mechaniczne i rozwiązywać ograniczenia związane z dyfuzją składników odżywczych. Ponadto naczynie, w którym przygotowywana jest tkanka, może nakładać na tkankę mechaniczne ograniczenia, co skutkuje powstawaniem pól stresowych, które mogą dodatkowo wpływać zarówno na strukturę komórki, jak i macierzy. Kształtowane tkanki o wysoce powtarzalnych wymiarach mają również zastosowanie w testach in vitro, w których wymiary próbki mają kluczowe znaczenie, takich jak analiza mechaniczna całej tkanki.
Ten manuskrypt opisuje alternatywną metodę produkcji wykorzystującą negatywne formy wzorcowe przygotowane z laserowo trawionego akrylu: te formy dobrze radzą sobie z polidimetylosiloksanem (PDMS), pozwalają na projekty o wymiarach w skali centymetrowej i rozmiarach elementów mniejszych niż 25 μm, i mogą być szybko zaprojektowane i wyprodukowane przy niskich kosztach i przy minimalnym doświadczeniu specjalistycznym. Minimalne wymagania czasowe i kosztowe pozwalają na szybkie iterowanie form trawionych laserowo, aż do określenia optymalnego projektu, i łatwe dostosowanie do wszelkich interesujących testów, w tym tych spoza dziedziny inżynierii tkankowej.

Optyka wycinarki laserowej sprawi, że obszary trawione będą miały nieco mniejsze wymiary wraz ze wzrostem głębokości trawienia, co skutkuje powstaniem ścian formy z bardzo delikatnym skosem, ze względu na zwężanie się wiązki lasera. Ułatwi to usuwanie odlewów z PDMS, jednak należy to starannie rozważyć w przypadku wymaganych bardzo głęboko trawionych negatywowych form wzorcowych (&gt;6 mm) (Rysunek 1).
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page=...

Tutaj prezentujemy szybką, łatwą i tanią metodę wytwarzania niestandardowych form polidimetylosiloksanowych, które mogą być używane do produkcji hydrożelowych tkanek inżynieryjnych o skomplikowanej geometrii. Dodatkowo opisujemy wyniki ocen mechanicznych i histologicznych przeprowadzonych na zmodyfikowanych tkankach serca wytworzonych tą techniką.

Specjalnie zaprojektowane formy do kultur tkankowych od mistrzów trawionych laserowo

As the field of tissue engineering has continued to mature, there has been increased interest in a wide range of tissue parameters, including tissue ...

Metoda ta może ułatwić badania w dziedzinie inżynierii tkankowej związanej z rozwojem tkanek, dopasowywaniem komórek i analizą mechaniczną polimerów i tkanek inżynieryjnych. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest tania, łatwa w użyciu i szybka. Opracowaliśmy tę technikę w moim laboratorium, ponieważ kontrola geometryczna tkanek inżynieryjnych w skali od milimetra do centymetra nie była wykonywana w terenie i dostrzegliśmy krytyczną potrzebę myślenia translacyjnego o zwiększaniu rozmiaru tkanek inżynieryjnych.Technika ta pozwala nam wykorzystać korzyści płynące z geometrycznych kolejek w fizjologii komórkowej i zmodyfikowanych tkankach poprzez techniki wytwarzania przy użyciu słupków i różnych kształtów. Metoda ta może zapewnić wgląd w produkcję zmodyfikowanych tkanek o kontrolowanym rozmiarze, kształcie i wyrównaniu. Może być również stosowany do różnych modeli chorobowych, spersonalizowanej medycyny regeneracyjnej oraz do przekładania zmodyfikowanych tkanek do badań przedklinicznych.Zacznij od otwarcia programu do grafiki wektorowej na komputerze. Aby przygotować żądaną geometrię formy i format wektorowy, otwórz nowe płótno o odpowiednich wymiarach z formatem kolorów RGB. Następnie wybierz narzędzie kształtu z panelu po lewej stronie i utwórz żądaną geometrię, wprowadzając wymiary w górnej części okna, aby precyzyjnie zdefiniować rozmiary kształtów.Zaprojektuj geometrię formy tak, aby umożliwić co najmniej sześciomilimetrową granicę od krawędzi najbardziej zewnętrznych elementów i linię cięcia, aby umożliwić przycinanie menisku PDMS po odlaniu formy. Umożliwi to gotową formę ułożenia równo z dnem naczynia hodowlanego. Następnie otwórz próbnik kolorów w lewym górnym rogu okna i zdefiniuj nowe próbki kolorów, które są kompatybilne z oprogramowaniem do cięcia laserowego.Zaznacz każdą ścieżkę i przypisz jej odpowiedni kolor z wyciętej próbki. Po zakończeniu przypisz None jako kolor wypełnienia. W podobny sposób można przypisać kolory próbki do ścieżek trawienia, zaznaczając obiekt, a następnie wybierając ścieżkę trawienia dla koloru wypełnienia i Brak dla koloru ścieżki z próbnika kolorów.Zapisuj projekty w formatach plików AI or. pdf, w zależności od tego, który z nich jest odpowiedni dla programu do grafiki wektorowej i wycinarki laserowej. Przygotuj wycinarkę laserową do cięcia zgodnie ze specyfikacją producenta i upewnij się, że zapewniona jest odpowiednia wentylacja.Następnie umieść arkusz akrylu o grubości 1/4 cala na łóżku lasera. Dostosuj wysokość łóżka tak, aby było odpowiednio skalibrowane do akrylu. Następnie otwórz plik projektu na komputerze podłączonym do wycinarki laserowej i otwórz menu Drukuj.Upewnij się, że wycinarka laserowa jest ustawiona jako drukarka i że w menu rozwijanym Skalowanie wybrano opcję Nie skaluj, aby zapobiec zniekształceniu projektu. Następnie kliknij przycisk Drukuj u dołu okna dialogowego Drukowanie. W narzędziu do drukowania wycinarki laserowej kliknij przycisk ustawień, aby ustawić parametry wytrawiania cięcia dla każdej z cech konstrukcyjnych.Tutaj ustaw parametry mocy, prędkości i impulsów na cal dla każdego z wcześniej wybranych kolorów. Po wprowadzeniu ustawień kliknij duży zielony przycisk w oprogramowaniu wycinarki laserowej. Spowoduje to, że wycinarka laserowa zacznie wytrawiać i ciąć ujemne formy główne.Na koniec użyj małej szczotki lub sprężonego powietrza, aby usunąć wszelkie resztki zanieczyszczeń z ujemnych form głównych. To przygotuje powierzchnię do odlewania PDMS. Przygotuj mieszankę odlewniczą PDMS zgodnie ze specyfikacją producenta.Przygotowany PDMS odgazowuje się w komorze próżniowej podłączonej do standardowego laboratoryjnego laboratorium próżniowego przez jedną godzinę lub do momentu, gdy wszystkie pęcherzyki zostaną wyeliminowane. Podczas odgazowywania PDMS należy przyciąć zewnętrzną krawędź formy za pomocą taśmy winylowej lub maskującej, tak aby taśma wystawała co najmniej trzy milimetry ponad wytrawioną powierzchnię ujemnej formy wzorcowej. Pamiętaj, aby mocno docisnąć taśmę do boku formy, aby zapobiec późniejszym wyciekom.Następnie wlej około 0,35 mililitra na centymetr kwadratowy PDMS do formy głównej, aby PDMS osiągnął minimalną grubość 1,5 milimetra. Umieść ujemną formę główną pokrytą PDMS w komorze próżniowej i ponownie odgazowuj przez godzinę lub do momentu, gdy wszystkie pęcherzyki zostaną usunięte. Następnie umieść odgazowaną, pokrytą PDMS ujemną formę wzorcową na równej półce w piekarniku o temperaturze 60 stopni Celsjusza na co najmniej sześć godzin, aby utwardzić PDMS.Po utwardzeniu użyj żyletki, aby rozciąć poszczególne formy, gdy nadal znajdują się na ujemnej formie głównej. Następnie powoli i ostrożnie oderwij każdą formę PDMS od ujemnej formy głównej. Odetnij wszelkie obszary z meniskiem przed odlewaniem, co zapobiegłoby płaskiemu leżeniu pleśni, a także nadmiarowi materiału lub zanieczyszczeń.Na koniec przeprowadź autoklaw form przy użyciu standardowego cyklu autoklawu, aby wysterylizować je do hodowli tkankowej. Na początek przyklej formy do nieobrobionych plastikowych płytek. Przygotuj roztwory fibrynogenu, trombiny i zneutralizowanego kolagenu i zbierz pożądane komórki zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym.Połącz fibrynogen, zneutralizowany kolagen i zawiesinę komórkową, aby stworzyć mieszankę odlewniczą. Trzymaj mieszankę odlewniczą na lodzie. Następnie użyj ręcznego generatora wysokiej częstotliwości, aby obrobić powierzchnie formy, które będą narażone na działanie mieszanki odlewniczej, aby złagodzić hydrofobowość PDMS.Wystaw powierzchnie na obróbkę plazmową na trzy do pięciu sekund około pięciu minut przed odlaniem materiału. Bezpośrednio przed odlewaniem mieszaniny komórek białkowych dodaj trombinę do mieszanki odlewniczej i delikatnie pipetuj w górę iw dół, nie wprowadzając żadnych pęcherzyków. Pracując szybko, odpipetuj mieszankę odlewniczą do form, uważając, aby umieścić mieszankę we wszystkich rogach i szczelinach formy.Unikaj wyrzucania mieszanki poza pierwszy ogranicznik pipety, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków wewnątrz konstrukcji. Następnie umieść próbki w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 45 minut. Po 45 minutach włóż konstrukty z powrotem do kaptura i przykryj je pożywką komórkową przed powrotem do inkubatora.Zmieniaj nośnik ogniwa co 48 do 72 godzin, zgodnie z potrzebami dla typu komórki i konstrukcji. Na koniec postępuj zgodnie z dołączonym protokołem tekstowym, aby określić ilościowo zagęszczenie tkanek i właściwości rozciągania konstrukcji, a także przygotować różne techniki barwienia i zmierzyć wyrównanie komórek. Z biegiem czasu i hodowli konstrukty komórkowe ulegają zwarciu w wyniku przebudowy matrycy.Dzieje się tak zarówno poprzez reorganizację, jak i degradację otaczającej matrycy i jest zwykle związane ze wzrostem sztywności mechanicznej. Ukierunkowane zagęszczenie może również indukować pola stresowe w tkance, którymi można manipulować w konstruktach komórkowych, aby zachęcić do wyrównania komórek. Te dwa obrazy zostały wykonane z konstruktów tkanki serca, które były hodowane w prostokątnych formach o wymiarach trzy milimetry na 17 milimetrów ze słupkami na obu końcach.Te dwa obrazy to konstrukty tkanki serca, które były hodowane bez ograniczeń. Dwa konstrukty, które były ograniczone, były w stanie zagęścić się tylko w pozostałych dwóch kierunkach i doprowadziły do wyrównania komórkowego wywołanego stresem. Po opanowaniu technika ta może być wykorzystana do projektowania, wytwarzania i wdrażania niestandardowych form tkankowych w mniej niż jeden dzień.Po utworzeniu tkanki można wykonać inne metody, takie jak testy mechaniczne i histologia, aby lepiej zrozumieć wpływ wyrównania na morfologię komórki i funkcję tkanki. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wytwarzać niestandardowe formy tkankowe PDMS z laserowo wycinanych mistrzów akrylu.

custom-engineered-tissue-culture-molds-from-laser-etched-masters

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opracowaliśmy nowatorską wielokomorową platformę mikrosystemową do kokultury neuronów, przeznaczoną do badań nad oddziaływaniami aksonów i gleju w OUN in vitro. Platforma ta umożliwia prowadzenie do sześciu niezależnych eksperymentów równolegle i została wykonana przy użyciu nowo opracowanej hybrydowej metody fabrykacji makro/mikro.

Wielokomorowa mikrofluidyczna platforma do kokultury neuronów i gleju ośrodkowego układu nerwowego

W niniejszym protokole prezentujemy proces wytwarzania macierzy mikroaktuatorów z pionowo przesuniętymi słupkami, na której opiera się ta technologia, oraz sposób, w jaki technologia bazowa ta może zostać zmodyfikowana w celu prowadzenia wysokoprzepustowych dynamicznych mechanicznie hodweli komórkowych w dwu- i trójwymiarowych paradygmatach hodowli.

Mikrofabrykowane platformy do mechanicznie dynamicznej hodowli komórek

Opisano przedzielone urządzenie mikrofluidyczne do badania migracji komórek macierzystych nowotworu. Ta nowatorska platforma tworzy żywotne mikrośrodowisko komórkowe i umożliwia mikroskopową wizualizację lokomocji żywych komórek. Wysoce ruchliwe komórki nowotworowe są izolowane w celu zbadania molekularnych mechanizmów agresywnej infiltracji, co w przyszłości może prowadzić do opracowania bardziej skutecznych terapii.

Ocena migracji komórek macierzystych nowotworu z wykorzystaniem kompartymentowych urządzeń mikroprzepływowych i obrazowania żywych komórek

Niniejszy artykuł przedstawia wszechstronną metodę tworzenia pierścieni tkankowych pochodzenia komórkowego poprzez samoorganizację komórkową. Komórki mięśni gładkich zasiane w pierścieniowatych studzienkach agarozowych agregują i kurczą się, tworząc wytrzymałe tkanki trójwymiarowe (3D) w ciągu 7 dni. Pierścienie tkankowe o skali milimetrowej nadają się do testów mechanicznych i służą jako podstawowe elementy do montażu tkanek.

Kierowana samoorganizacja komórkowa w celu wytwarzania pierścieni tkankowych pochodzenia komórkowego do analiz biomechanicznych i inżynierii tkankowej

Tutaj opisujemy unikalną strategię tworzenia biokompatybilnych, warstwowych matryc z ciągłymi interfejsami między różnymi warstwami dla inżynierii tkankowej. Takie rusztowanie może zapewnić idealne, konfigurowalne środowisko do modulowania zachowania komórek za pomocą różnych sygnałów biologicznych, chemicznych lub...

Polimeryzacja wielowarstwowa z gradientem gęstości (DGMP): nowatorska technika tworzenia wielokompartyjnych, konfigurowalnych rusztowań dla inżynierii tkankowej

Ten manuskrypt opisuje technikę opartą na miękkiej litografii, polegającą na inżynierii jednolitych układów trójwymiarowych (3D) tkanek nabłonkowych o określonej geometrii otoczonych macierzą zewnątrzkomórkową. Metoda ta jest dostosowana do szerokiej gamy typów komórek i kontekstów eksperymentalnych oraz pozwala na wysokoprzepustowe badania przesiewowe identycznych kontrprób.

Inżynieria trójwymiarowych tkanek nabłonkowych osadzonych w macierzy zewnątrzkomórkowej

Ten protokół opisuje platformę do produkcji samodzielnie składających się pierścieni tkankowych w różnych rozmiarach przy użyciu dostosowanej formy z tworzywa sztucznego wydrukowanej w 3D. Negatywy PDMS są utwardzane w formie wydrukowanej w 3D; następnie agaroza jest odlewana w utwardzonych negatywach PDMS. Komórki są wysiewane do powstałych studzienek agarozowych, gdzie agregują się w pierścienie tkankowe.

Wytwarzanie niestandardowych studzienek agarozowych do wysiewu komórek i samomontażu pierścieni tkankowych przy użyciu form drukowanych w 3D

Prezentowany tutaj jest protokół generowania zmodyfikowanych tkanek łącznych do równoległej hodowli 48 tkanek na wielodołkowej płytce z podwójnymi biegunami, odpowiedni do badań mechanistycznych, modelowania chorób i badań przesiewowych. Protokół jest zgodny z fibroblastami z różnych narządów i gatunków, a jego przykładem są tutaj pierwotne fibroblasty serca ludzkiego.

Tkanka łączna pochodząca z fibroblastów pochodząca od człowieka do zastosowań przesiewowych

Ten artykuł przedstawia protokół produkcji nowego typu substratu hodowlanego z setkami mikropojemników namm2, w których organoidy mogą być hodowane i obserwowane za pomocą mikroskopii o wysokiej rozdzielczości. Szczegółowo opisano również protokoły wysiewu komórek i barwienia immunologicznego.

Wysokoprzepustowa platforma do hodowli i obrazowania 3D organoidów

Opisujemy metody hodowli pęcherzyków jajników w nowej, wolnej od rusztowania agarozowej pleśni, które uzupełniają gametogenezę in vitro .

Produkcja i stosowanie konfigurowalnych form agarozowych do hodowli pęcherzyków jajników myszy wolnych od rusztowania

Poznaj metodę szybkiego i taniego wytwarzania niestandardowych form PDMS do inżynierii tkankowej. Technika umożliwia precyzyjną kontrolę geometrii tkanki, co wspiera badania nad rozwojem tkanek i analizą mechaniczną.

Specjalnie zaprojektowane formy do kultur tkankowych od mistrzów trawionych laserowo

Przeglądaj więcej filmów