Specjalnie zaprojektowane formy do kultur tkankowych od mistrzów trawionych laserowo
21 maja 2018
Tutaj prezentujemy szybką, łatwą i tanią metodę wytwarzania niestandardowych form polidimetylosiloksanowych, które mogą być używane do produkcji hydrożelowych tkanek inżynieryjnych o skomplikowanej geometrii. Dodatkowo opisujemy wyniki ocen mechanicznych i histologicznych przeprowadzonych na zmodyfikowanych tkankach serca wytworzonych tą techniką.
Metoda ta może ułatwić badania w dziedzinie inżynierii tkankowej związanej z rozwojem tkanek, dopasowywaniem komórek i analizą mechaniczną polimerów i tkanek inżynieryjnych. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest tania, łatwa w użyciu i szybka. Opracowaliśmy tę technikę w moim laboratorium, ponieważ kontrola geometryczna tkanek inżynieryjnych w skali od milimetra do centymetra nie była wykonywana w terenie i dostrzegliśmy krytyczną potrzebę myślenia translacyjnego o zwiększaniu rozmiaru tkanek inżynieryjnych.
Technika ta pozwala nam wykorzystać korzyści płynące z geometrycznych kolejek w fizjologii komórkowej i zmodyfikowanych tkankach poprzez techniki wytwarzania przy użyciu słupków i różnych kształtów. Metoda ta może zapewnić wgląd w produkcję zmodyfikowanych tkanek o kontrolowanym rozmiarze, kształcie i wyrównaniu. Może być również stosowany do różnych modeli chorobowych, spersonalizowanej medycyny regeneracyjnej oraz do przekładania zmodyfikowanych tkanek do badań przedklinicznych.
Zacznij od otwarcia programu do grafiki wektorowej na komputerze. Aby przygotować żądaną geometrię formy i format wektorowy, otwórz nowe płótno o odpowiednich wymiarach z formatem kolorów RGB. Następnie wybierz narzędzie kształtu z panelu po lewej stronie i utwórz żądaną geometrię, wprowadzając wymiary w górnej części okna, aby precyzyjnie zdefiniować rozmiary kształtów.
Zaprojektuj geometrię formy tak, aby umożliwić co najmniej sześciomilimetrową granicę od krawędzi najbardziej zewnętrznych elementów i linię cięcia, aby umożliwić przycinanie menisku PDMS po odlaniu formy. Umożliwi to gotową formę ułożenia równo z dnem naczynia hodowlanego. Następnie otwórz próbnik kolorów w lewym górnym rogu okna i zdefiniuj nowe próbki kolorów, które są kompatybilne z oprogramowaniem do cięcia laserowego.
Zaznacz każdą ścieżkę i przypisz jej odpowiedni kolor z wyciętej próbki. Po zakończeniu przypisz None jako kolor wypełnienia. W podobny sposób można przypisać kolory próbki do ścieżek trawienia, zaznaczając obiekt, a następnie wybierając ścieżkę trawienia dla koloru wypełnienia i Brak dla koloru ścieżki z próbnika kolorów.
Zapisuj projekty w formatach plików AI or. pdf, w zależności od tego, który z nich jest odpowiedni dla programu do grafiki wektorowej i wycinarki laserowej. Przygotuj wycinarkę laserową do cięcia zgodnie ze specyfikacją producenta i upewnij się, że zapewniona jest odpowiednia wentylacja.
Następnie umieść arkusz akrylu o grubości 1/4 cala na łóżku lasera. Dostosuj wysokość łóżka tak, aby było odpowiednio skalibrowane do akrylu. Następnie otwórz plik projektu na komputerze podłączonym do wycinarki laserowej i otwórz menu Drukuj.
Upewnij się, że wycinarka laserowa jest ustawiona jako drukarka i że w menu rozwijanym Skalowanie wybrano opcję Nie skaluj, aby zapobiec zniekształceniu projektu. Następnie kliknij przycisk Drukuj u dołu okna dialogowego Drukowanie. W narzędziu do drukowania wycinarki laserowej kliknij przycisk ustawień, aby ustawić parametry wytrawiania cięcia dla każdej z cech konstrukcyjnych.
Tutaj ustaw parametry mocy, prędkości i impulsów na cal dla każdego z wcześniej wybranych kolorów. Po wprowadzeniu ustawień kliknij duży zielony przycisk w oprogramowaniu wycinarki laserowej. Spowoduje to, że wycinarka laserowa zacznie wytrawiać i ciąć ujemne formy główne.
Na koniec użyj małej szczotki lub sprężonego powietrza, aby usunąć wszelkie resztki zanieczyszczeń z ujemnych form głównych. To przygotuje powierzchnię do odlewania PDMS. Przygotuj mieszankę odlewniczą PDMS zgodnie ze specyfikacją producenta.
Przygotowany PDMS odgazowuje się w komorze próżniowej podłączonej do standardowego laboratoryjnego laboratorium próżniowego przez jedną godzinę lub do momentu, gdy wszystkie pęcherzyki zostaną wyeliminowane. Podczas odgazowywania PDMS należy przyciąć zewnętrzną krawędź formy za pomocą taśmy winylowej lub maskującej, tak aby taśma wystawała co najmniej trzy milimetry ponad wytrawioną powierzchnię ujemnej formy wzorcowej. Pamiętaj, aby mocno docisnąć taśmę do boku formy, aby zapobiec późniejszym wyciekom.
Następnie wlej około 0,35 mililitra na centymetr kwadratowy PDMS do formy głównej, aby PDMS osiągnął minimalną grubość 1,5 milimetra. Umieść ujemną formę główną pokrytą PDMS w komorze próżniowej i ponownie odgazowuj przez godzinę lub do momentu, gdy wszystkie pęcherzyki zostaną usunięte. Następnie umieść odgazowaną, pokrytą PDMS ujemną formę wzorcową na równej półce w piekarniku o temperaturze 60 stopni Celsjusza na co najmniej sześć godzin, aby utwardzić PDMS.
Po utwardzeniu użyj żyletki, aby rozciąć poszczególne formy, gdy nadal znajdują się na ujemnej formie głównej. Następnie powoli i ostrożnie oderwij każdą formę PDMS od ujemnej formy głównej. Odetnij wszelkie obszary z meniskiem przed odlewaniem, co zapobiegłoby płaskiemu leżeniu pleśni, a także nadmiarowi materiału lub zanieczyszczeń.
Na koniec przeprowadź autoklaw form przy użyciu standardowego cyklu autoklawu, aby wysterylizować je do hodowli tkankowej. Na początek przyklej formy do nieobrobionych plastikowych płytek. Przygotuj roztwory fibrynogenu, trombiny i zneutralizowanego kolagenu i zbierz pożądane komórki zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym.
Połącz fibrynogen, zneutralizowany kolagen i zawiesinę komórkową, aby stworzyć mieszankę odlewniczą. Trzymaj mieszankę odlewniczą na lodzie. Następnie użyj ręcznego generatora wysokiej częstotliwości, aby obrobić powierzchnie formy, które będą narażone na działanie mieszanki odlewniczej, aby złagodzić hydrofobowość PDMS.
Wystaw powierzchnie na obróbkę plazmową na trzy do pięciu sekund około pięciu minut przed odlaniem materiału. Bezpośrednio przed odlewaniem mieszaniny komórek białkowych dodaj trombinę do mieszanki odlewniczej i delikatnie pipetuj w górę iw dół, nie wprowadzając żadnych pęcherzyków. Pracując szybko, odpipetuj mieszankę odlewniczą do form, uważając, aby umieścić mieszankę we wszystkich rogach i szczelinach formy.
Unikaj wyrzucania mieszanki poza pierwszy ogranicznik pipety, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków wewnątrz konstrukcji. Następnie umieść próbki w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 45 minut. Po 45 minutach włóż konstrukty z powrotem do kaptura i przykryj je pożywką komórkową przed powrotem do inkubatora.
Zmieniaj nośnik ogniwa co 48 do 72 godzin, zgodnie z potrzebami dla typu komórki i konstrukcji. Na koniec postępuj zgodnie z dołączonym protokołem tekstowym, aby określić ilościowo zagęszczenie tkanek i właściwości rozciągania konstrukcji, a także przygotować różne techniki barwienia i zmierzyć wyrównanie komórek. Z biegiem czasu i hodowli konstrukty komórkowe ulegają zwarciu w wyniku przebudowy matrycy.
Dzieje się tak zarówno poprzez reorganizację, jak i degradację otaczającej matrycy i jest zwykle związane ze wzrostem sztywności mechanicznej. Ukierunkowane zagęszczenie może również indukować pola stresowe w tkance, którymi można manipulować w konstruktach komórkowych, aby zachęcić do wyrównania komórek. Te dwa obrazy zostały wykonane z konstruktów tkanki serca, które były hodowane w prostokątnych formach o wymiarach trzy milimetry na 17 milimetrów ze słupkami na obu końcach.
Te dwa obrazy to konstrukty tkanki serca, które były hodowane bez ograniczeń. Dwa konstrukty, które były ograniczone, były w stanie zagęścić się tylko w pozostałych dwóch kierunkach i doprowadziły do wyrównania komórkowego wywołanego stresem. Po opanowaniu technika ta może być wykorzystana do projektowania, wytwarzania i wdrażania niestandardowych form tkankowych w mniej niż jeden dzień.
Po utworzeniu tkanki można wykonać inne metody, takie jak testy mechaniczne i histologia, aby lepiej zrozumieć wpływ wyrównania na morfologię komórki i funkcję tkanki. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wytwarzać niestandardowe formy tkankowe PDMS z laserowo wycinanych mistrzów akrylu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szybką i niedrogą metodę wytwarzania niestandardowych form z polidimetylosiloksanu do produkcji inżynieryjnych tkanek opartych na hydrożelach. Technika ta umożliwia kontrolę geometryczną tkanek inżynieryjnych, co ułatwia badania nad rozwojem tkanek oraz analizy mechaniczne.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Inżynieria tkankowa
- Wytwarzanie hydrożeli
- Inżynieria tkanki serca
Wstęp
- Obecne metody nie zapewniają kontroli geometrycznej nad inżynierowanym tkankami.
- Istnieje krytyczna potrzeba opracowania skalowalnych technik inżynierii tkankowej.
- Wskazówki geometryczne mogą wpływać na fizjologię komórkową.
- Niniejsza metoda rozwiązuje problemy związane z wytwarzaniem inżynierowanych tkanek o złożonej geometrii.
Cel badania
- Opracowanie taniej i wydajnej metody wytwarzania tkanek inżynieryjnych.
- Zwiększenie kontroli nad rozmiarem i kształtem tkanek inżynieryjnych.
- Zastosowanie tej techniki w różnych modelach chorób oraz w medycynie regeneracyjnej.
Zastosowane metody
- Wytwarzanie form z polidimetylosiloksanu.
- Oceny mechaniczne inżynieryjnych tkanek serca.
- Oceny histologiczne struktury tkanki.
- Zastosowanie wskazówek geometrycznych w inżynierii tkankowej.
Główne wyniki
- Metoda jest szybka, łatwa w użyciu i kosztowo efektywna.
- Sztucznie wytworzone tkanki wykazywały kontrolowany rozmiar i kształt.
- Właściwości mechaniczne tkanek zostały pomyślnie ocenione.
- Technikę tę można wykorzystać w badaniach przedklinicznych w medycynie regeneracyjnej.
Wnioski
- Opracowana metoda zapewnia znaczące zalety w inżynierii tkankowej.
- Umożliwia ona wytwarzanie tkanek inżynierowanych o pożądanej geometrii.
- Podejście to może zwiększyć zrozumienie rozwoju i funkcji tkanek.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Geometryczna kontrola inżynierowanych tkanek umożliwia precyzyjne modulowanie zachowania komórek i mechaniki tkanek, co eliminuje krytyczną lukę w powtarzalności modeli przedklinicznych. Ta niskokosztowa, szybka metoda wytwarzania wspiera skalowalną produkcję konstruktów tkankowych o zdefiniowanym kształcie w celu minimalizacji ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkryć. Dzięki zapewnieniu powtarzalnych form tkankowych w skali od mikro do centymetrów, technika ta zwiększa pewność prognostyczną w późniejszych analizach funkcjonalnych oraz w procesie podejmowania decyzji translacyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne Etapy Odkrywania i Walidacja Celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie wpływu geometrii tkanki na orientację komórek i przebudowę macierzy w systemach istotnych dla procesów chorobowych.
- Wartość operacyjna: Ułatwia szybką iterację projektów form w celu optymalizacji struktury tkanki dla specyficznych fenotypowo przesiewów.
- Wartość prognostyczna: Wspiera testowanie hipotez dotyczących szlaków mechanotransdukcji poprzez kontrolowanie pól naprężeń w tkankach inżynieryjnych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na wytworzenie tkanek o wysokiej powtarzalności wymiarów, co jest kluczowe dla mechanicznej analizy całych tkanek i odczytów funkcjonalnych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzowane wytwarzanie form z PDMS z wykorzystaniem matryc trawionych laserowo, co zapewnia spójność testów w ramach kampanii przesiewowych.
- Skalowalność: Umożliwia szybką i niskokosztową produkcję niestandardowych form w celu wysokoprzepustowej adaptacji do różnych formatów testów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Wspiera skalowanie inżynieryjnych tkanek od etapu odkryć do badań przedklinicznych dzięki kontrolowanym parametrom rozmiaru i kształtu.
- Znaczenie dla modeli chorób: Możliwość zastosowania w modelach chorób serca i innych schorzeń, w których wskazówki geometryczne wpływają na funkcję tkanki i odpowiedź terapeutyczną.
- Mechanistyczna redukcja ryzyka: Pozwala na izolację zmiennych geometrycznych w celu zmniejszenia ryzyka związanego z głównymi kandydatami poprzez wyjaśnienie zależności między strukturą a funkcją w modelach przedklinicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu badawczego — od inżynierii tkankowej opartej na hipotezach po identyfikację wiodących cząsteczek — dostarczając tkanek o kontrolowanej geometrii, które umożliwiają ilościową ocenę funkcjonalną przed przejściem do etapu badań przedklinicznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie wpływu wskazówek topograficznych i geometrycznych na modulację fenotypów komórkowych w procesach walidacji celów terapeutycznych.
- Screening: Dostarcza zestandaryzowane, precyzyjne wymiarowo konstrukty tkankowe, umożliwiając wiarygodne badanie zmian funkcjonalnych indukowanych przez związki w testach mechanicznych lub analizach orientacji.
- Analityka: Pozwala na generowanie tkanek o określonym rozmiarze i kształcie, co umożliwia dokładną kwantyfikację zagęszczenia, właściwości rozciągających oraz orientacji komórkowej jako kluczowych parametrów odczytu.
- Badania translacyjne: Łączy etap odkryć z pracami przedklinicznymi poprzez wytwarzanie tkanek o skalowalnej geometrii, odpowiednich do badań mechanistycznych w modelach chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Pozycjonuje formy matrycowe trawione laserowo jako platformę wielokrotnego użytku, pozwalającą na szybką adaptację w wielu projektach z zakresu inżynierii tkankowej i różnych typach testów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną, umożliwiając precyzyjną kontrolę geometrii tkanki jako niezależnej zmiennej w badaniach funkcjonalnych.
- Wartość operacyjna: Oferuje niskokosztowy, szybki i łatwy w użyciu proces wytwarzania form przy minimalnych wymaganiach co do doświadczenia, co wspiera zdecentralizowane wdrożenie w zespołach badawczo-rozwojowych.
- Wartość strategiczna: Poprawia procesy podejmowania decyzji o kontynuacji badań (go/no-go) poprzez zwiększenie wiarygodności modeli przedklinicznych dzięki ograniczeniu zmienności biologicznej wynikającej z niekontrolowanego kształtu tkanki.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia ustalanie priorytetów dla kandydatów w oparciu o analizę ryzyka na podstawie powtarzalnych, kontrolowanych geometrycznie odpowiedzi tkankowych w badaniach mechanistycznych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga podstawowego przeszkolenia w obsłudze oprogramowania do grafiki wektorowej oraz wycinarki laserowej w celu projektowania i wykonania formy.
- Zależy od dostępu do wycinarki laserowej oraz sprzętu do odgazowywania próżniowego w celu produkcji wysokiej jakości form z PDMS.
- Wymaga standaryzacji protokołów mieszania, odgazowywania i utwardzania PDMS przez wszystkich użytkowników, aby zapewnić spójność form.
- Obejmuje kwestie adaptacyjne przy przenoszeniu form do różnych formatów naczyń hodowlanych lub typów tkanek innych niż konstrukty sercowe.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak minimalna wielkość elementu (~25 μm) oraz degradacja formy podczas wielokrotnych cykli autoklawowania.
Najczęściej zadawane pytania dot. Biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
1:02
Vector Format Master Mold Formation
2:28
Laser Cut the Acrylic Master Molds
3:47
Preparing the PDMS Mold for Cell or Tissue Culture
5:30
Casting Collagen and Fibrin Hydrogel Tissues
7:25
Results: Mold Enhanced Alignment of Cardiac Tissue Constructs
8:22
Conclusion
