Wysokoprzepustowa identyfikacja synergicznych kombinacji leków metodą Overlap²

Ogólnym celem tej metodologii jest zidentyfikowanie synergicznych cząsteczek, które wzmacniają nawzajem swoją aktywność, gdy zostaną połączone za pomocą wysokoprzepustowych badań przesiewowych. Synergistyczne pary leków są obiecującą strategią zwalczania zakażeń lekoopornych, ale są trudne do zidentyfikowania. Metoda ta może identyfikować cząsteczki, które wchodzą w interakcje z istniejącymi lekami przeciwdrobnoustrojowymi stosowanymi w leczeniu chorób zakaźnych.

W dłuższej perspektywie te kombinacje mogą wejść do oceny przedklinicznej i ostatecznie poprawić opiekę nad pacjentem. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją wykonać na dowolnym interesującym nas organizmie i na dowolnej bibliotece małych cząsteczek. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię wielu chorób zakaźnych, ponieważ działa ona z każdym organizmem będącym przedmiotem zainteresowania.

Użyj standardowego arkusza kalkulacyjnego, aby obliczyć średni wynik wzrostu i odchylenie standardowe dla wszystkich mutantów, w obecności określonego stężenia dodanej małej cząsteczki. Następnie oblicz wyniki Z dla każdego stężenia małych cząsteczek. Następnie podkreśl mutanty genów ze znaczącymi wynikami Z.

Najpierw wyhoduj kulturę E.coli w minimalnym podłożu M9, na noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie rozpuść małe cząsteczki w sulfotlenku dimetylu w wysokim stężeniu powyżej 10 miligramów na mililitr. Następnie dodaj 100 mikrolitrów pożywki M9 do każdej studzienki na 96-dołkowej płytce.

Odpipetować dodatkowe 100 mikrolitrów pożywki M9 w kolumnie pierwszej, tak aby objętość w tej kolumnie wynosiła 200 mikrolitrów. Następnie dodaj około 10 mikrolitrów stężonego roztworu drobnocząsteczkowego w kolumnie pierwszej. Po dodaniu małych cząsteczek zacznij rozcieńczać je w poprzek osi X płytki.

Kontynuuj rozcieńczanie, aż pojawi się 100 mikrolitrów w kolumnie 11. Po wymieszaniu kolumny 11 wyrzucić 100 mikrolitrów z tej kolumny. Niech w kolumnie 12 będzie tylko pożywka, aby znormalizować dane.

Następnie zapisz wartość gęstości optycznej przy 600 nanometrach kultury wyhodowanej przez noc wyhodowanej w minimalnym pożywce M9. Następnie dodaj dwa mikrolitry kultury do każdej studzienki. Tak, że na studzienkę przypada 1000 komórek.

Następnie delikatnie potrząśnij talerzem. I zwróć uwagę na odczyt gęstości optycznej przy 600 nanometrach dla punktu czasowego godziny zero. Po zarejestrowaniu odczytu inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jeden dzień.

Ponownie zmierz wartość gęstości optycznej przy 600 nanometrach dla 24-godzinnego punktu czasowego. Aby wykonać test szachownicy, hoduj kulturę E. coli w minimalnym podłożu M9 przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie dodaj 100 mikrolitrów pożywki M9 do każdej studzienki i dodaj dodatkowe 100 mikrolitrów tej samej pożywki w pierwszej kolumnie płytki 96-dołkowej.

Następnie dodaj testowane małe cząsteczki do każdej studzienki w kolumnie pierwszej. I dodać podwójne stężenie do studzienki A1. Następnie utwórz gradient rozcieńczenia wzdłuż osi X, przenosząc 100 mikrolitrów z kolumny pierwszej do kolumny drugiej. Kontynuować proces rozcieńczania, aż do dodania 100 mikrolitrów w kolumnie 11.

Po wymieszaniu kolumny 11 wyrzucić 100 mikrolitrów z tej kolumny i pozostawić kolumnę 12 tylko z podłożem bez żadnych leków. Utwórz kolejny gradient dla drugiego rozcieńczenia leku. Aby to zrobić, dodaj 100 mikrolitrów pożywki zawierającej dwa X, minimalne stężenie hamujące cząsteczki wejściowej w rzędzie A.Następnie przenieś 100 mikrolitrów z rzędu A do B.Kontynuuj proces rozcieńczania, aż do dodania 100 mikrolitrów w rzędzie G. Po wymieszaniu rzędu G wyrzuć 100 mikrolitrów z dołka.

Następnie zaszczepij płytkę dwoma mikrolitrami kultury do każdej studzienki. Tak, że na studzienkę przypada 1000 komórek. Następnie zmierz odczyt gęstości optycznej przy 600 nanometrach dla punktu czasowego godziny zero.

Po zarejestrowaniu odczytu inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. A następnie zmierz wartość gęstości optycznej przy 600 nanometrach dla 24-godzinnego punktu czasowego. Aby przeprowadzić wysokoprzepustowe badania przesiewowe dla leków synergicznych, hoduj zarówno zmutowane komórki typu dzikiego, jak i predykcje synergii w minimalnej pożywce M9.

Następnie dodaj leki z biblioteki do podłoża. Następnie zaszczepij jedną płytkę leków bibliotecznych typem dzikim, a drugą inną płytką zmutowanymi bakteriami przewidującymi synergię. Ta tabliczka przedstawia test szachownicy używany do badania synergicznych kombinacji leków.

Na tej płytce dobrze F9 z najniższym wynikiem FICI wynoszącym 0,07 wskazuje, że para małych cząsteczek jest synergistyczna. Ta tabliczka przedstawia test szachownicy do badania nieoddziałującej kombinacji leków. W tej płytce studzienka C3 z najniższym wynikiem FICI wynoszącym 1,0 wskazuje, że para małych cząsteczek nie oddziałuje ze sobą.

Ta tabliczka reprezentuje test szachownicy używany do badania antagonistycznych kombinacji leków. Na tej płytce dobrze A1 z najniższym wynikiem FICI wynoszącym 8,0 wskazuje, że interakcja między cząsteczkami leku jest antagonistyczna. Następnie Befeldin A, lek małocząsteczkowy zawarty w flukonazolu, jest stosowany do badania wzrostu formin C i U.

Wykres pokazuje, że wzrost zarówno mutanta typu dzikiego, jak i mutanta przewidującego synergię jest nieznacznie i w takim samym stopniu zahamowany. Wskazuje to, że Befeldin A i flukonazol są niesynergistycznymi partnerami lekowymi. Wręcz przeciwnie, wzrost mutanta przewidywania synergii formin C i U jest znacznie zahamowany w obecności refromisynu i flukonazolu.

Wskazując, że leki są synergistycznymi partnerami. Co ciekawe, wzrost dzikiego typu nie jest w ogóle zahamowany. Tutaj obserwuje się największą różnicę wzrostu, między 32 a 49 godzinami po inokulacji.

Po opanowaniu technika ta może skrócić czas identyfikacji synergicznych interakcji leków. Wykonując tę procedurę, należy pamiętać, aby nie łączyć leków w ostatniej kolumnie w ostatnim wierszu testu szachownicy. Po tej procedurze można zastosować inne metody identyfikacji cząsteczek synergicznych w celu zidentyfikowania dodatkowych synergicznych interakcji leków.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać metodologii O2M do identyfikacji przypuszczalnych markerów synergii w celu znalezienia synergicznych interakcji leków z interesującym Cię organizmem. Nie zapominaj, że praca z niektórymi małymi cząsteczkami może być niebezpieczna i należy przestrzegać wszelkich środków ostrożności zawartych w karcie charakterystyki podczas wykonywania tego protokołu.