Obrazowanie PET zapalenia układu nerwowego przy użyciu [¹¹C] DPA-713 w mysim modelu udaru niedokrwiennego

Ogólnym celem tego eksperymentu jest dokładne ilościowe określenie rozkładu przestrzennego i rozległości zapalenia układu nerwowego w mysim modelu udaru niedokrwiennego za pomocą obrazowania TSPO-PET i MR oraz walidacja tych wyników in vivo za pomocą autoradiografii ex vivo. Jestem naprawdę podekscytowany, że mogę podzielić się z wami tym przewodnikiem krok po kroku, jak używać obrazowania PET do wizualizacji zapalenia nerwów u żywego obiektu. Tutaj używamy mysiego modelu obrysu jako przykładu.

Dlaczego warto skorzystać z tej techniki? Powodów jest kilka. Pierwszym z nich jest to, że zapalenie nerwów, które jest po prostu stanem zapalnym występującym w ośrodkowym układzie nerwowym, uważa się za ściśle związane i naprawdę coś, co leży u podstaw wielu, wielu chorób mózgu, w tym udaru, ale także choroby Alzheimera, stwardnienia rozsianego, choroby Parkinsona, a lista jest długa.

Jest więc niezwykle ważne, abyśmy dysponowali technikami, które naprawdę pozwalają nam badać te zjawiska biologiczne. Po drugie, obrazowanie PET ma wiele zalet w porównaniu z niektórymi bardziej tradycyjnymi technikami. Na przykład, większość z tych tradycyjnych technik opiera się w dużej mierze na wykorzystaniu zarówno ludzkiej, jak i mysiej pośmiertnej tkanki mózgowej i chociaż dostarczyły one wielu ważnych spostrzeżeń, techniki te są z natury statyczne, co oznacza, że mogą naprawdę przekazać nam informacje tylko o jednym momencie w czasie.

Ponieważ wiemy, że zarówno mózg, jak i układ odpornościowy są bardzo dynamiczne, sensowne jest, że chcielibyśmy mieć technikę, która pozwoli nam naprawdę uchwycić te procesy molekularne w żywych, nienaruszonych systemach, a więc w ich naturalnym środowisku w czasie rzeczywistym, i to jest dokładnie to, co robi obrazowanie PET. Tutaj pokażemy Ci, w jaki sposób używamy specyficznego radioznacznika PET, DPA-713, o którym wiadomo, że wiąże się z TSPO lub białkiem translokatora. Pokażemy Ci konkretnie, w jaki sposób dynamicznie wstrzykujemy obraz nie tylko jednej myszy, ale czterem myszom jednocześnie, i dlaczego jest to tak ważne, ponieważ naprawdę pomaga to zwiększyć liczbę myszy, które możesz obrazować w danym dniu za pomocą tej samej partii znacznika, co naprawdę usprawnia twoje eksperymenty.

Chociaż jest to technicznie trudne, naprawdę mam nadzieję, że ten film pomoże Ci poprowadzić Cię tak, abyś mógł to zrobić we własnym laboratorium. Zacznij od ułożenia znieczulonych myszy leżących na łóżku skanera PET/CT, upewniając się, że są wyprostowane i bezpiecznie w stożkach nosowych. Przyklej głowę i ciało każdej myszy do łóżka miękką taśmą chirurgiczną, upewniając się, że oddychanie nie jest ograniczone przez umieszczenie taśmy.

Gdy zwierzęta są już bezpieczne w łóżku, a oddychanie jest stabilne, włącz celownik laserowy i przesuń łóżko skanujące tak, aby zrównało się z mózgiem wszystkich czterech myszy. Przesuń łoże skanera do pozycji akwizycji, tak aby mózgi myszy znajdowały się jak najbliżej środka pola widzenia. Uzyskaj obraz myszy w widoku zwiadowcy, aby zweryfikować ich pozycję i dostosuj pozycję, przeciągając pole pola widzenia na interfejsie, jeśli to konieczne.

Na koniec kliknij przycisk Rozpocznij przepływ pracy w oprogramowaniu skanera, aby rozpocząć tomografię komputerową, upewniając się, że wybrano opcję wyświetlania interaktywnych monitów użytkownika, aby skanowanie PET można było rozpocząć ręcznie przed wstrzyknięciem znacznika. Gdy myszy automatycznie przejdą z tomografii komputerowej do PET, ustaw tylną część skanera do wstrzyknięcia radioznacznika. Umieść ochronną, chłonną wyściółkę na półce i upewnij się, że nożyczki i zapalniczka są pod ręką.

Przetnij zapieczętowaną rurkę cewnika nożyczkami. Sprawdź, czy linie cewnika są wolne od pęcherzyków i upewnij się, że kaniula nadal znajduje się w żyle, wykonując płukanie solą fizjologiczną o pojemności od 10 do 20 mikrolitrów, a następnie załaduj wcześniej zmierzone strzykawki do każdego z czterech cewników, śledząc, jaka dawka została podana każdej myszy. Kliknij OK, gdy skanowanie PET jest gotowe do rozpoczęcia, jednocześnie uruchamiając 10-sekundowy timer.

Niech dwóch badaczy z tyłu skanera ze strzykawkami z dawką w ręku wstrzyknie wszystkim czterem myszom jednocześnie, gdy zegar osiągnie zero. Przepłucz każdy cewnik od 50 do 100 mikrolitrów soli fizjologicznej, aby upewnić się, że pełna dawka dostanie się do żyły ogonowej i ponownie uszczelnij rurkę za pomocą zapalniczki. Następnie należy zmierzyć dawkę strzykawki za pomocą kalibratora dawki, aby uzyskać resztkową wartość radioaktywności.

Zwróć uwagę na wartości i czas ich rejestrowania. Po zakończeniu skanowania przywróć łóżko PET do pierwotnej pozycji za pomocą przycisku Horizontal Home (Poziome położenie początkowe) w panelu sterowania ruchem. Wyjmij myszy ze skanera i ostrożnie wyjmij cewnik.

Delikatnie uciskaj miejsce kaniulacji, aby zapobiec nadmiernemu krwawieniu. Następnie zmierz pozostałą aktywność w cewniku za pomocą kalibratora dawki. Na koniec zrekonstruuj dane, otwierając oprogramowanie zarządzające przetwarzaniem końcowym, które automatycznie zrekonstruuje każde skanowanie przy użyciu danych histogramu wygenerowanych z pierwszego pliku.

W przypadku analizy PET zacznij od otwarcia oprogramowania do analizy obrazu, kliknięcia ikony Otwórz dane, aby załadować obraz CT i wybrania ikony Dołącz dane, aby załadować dynamiczny PET. Przeprowadź wizualną kontrolę jakości danych za pomocą operatora szeregów czasowych w menu rozwijanym. Wybierz opcję odniesienie i globalne, a następnie zastosuj odpowiednie wartości minimalne i maksymalne dla skali kolorów.

Wizualizuj dynamiczne dane PET klatka po klatce, weryfikując wychwyt radioaktywności i sprawdzając, czy w skanowaniu nie ma zakłóceń w ruchu. Następnie utwórz średni obraz PET za pomocą funkcji arytmetycznej. Wybierz opcję Średnia zaznaczona, usuń zaznaczenie opcji Odniesienie i upewnij się, że wybrano opcje Wejście 1, Wejście 2 i Wejście, aby utworzyć średnią ze wszystkich ramek PET.

Przejdź do zakładki Data Manager (Menedżer danych) i przeciągnij uśredniony obraz w górę do pozycji Input 1, aby umożliwić wizualizację sygnału PET za pomocą uśrednionego obrazu PET. Następnie ponownie rozprowadź skalę kolorów, klikając automatyczne obliczenia w narzędziu Min/Max. Następnie zarejestruj CT w przeciętnym pliku PET za pomocą funkcji automatycznego 3D w menu rozwijanym Rejestracja reorientacji.

Wybierz opcję Ref i Input 1, a następnie wybierz opcję Rigid, Fast, Input 1 do Ref registration. Sprawdź wzrokowo pasowanie we wszystkich trzech wymiarach i w razie potrzeby ręcznie dostosuj w zakładce Manual 3D za pomocą funkcji Translation i Rotation. Jeśli rejestracja jest zadowalająca, wybierz Wejście 2 i Wejście i zastosuj do wszystkich ramek PET, klikając znacznik wyboru.

Kliknij prawym przyciskiem myszy pliki CT i PET w DM i zapisz jako surowe. Następnie wybierz Kadrowanie z menu rozwijanego i przeciągnij granice obrazu, aby przyciąć głowę jednej myszy na raz poniżej pnia mózgu. Ręcznie zmień orientację obrazów PET i CT tak, aby czaszka była prosta we wszystkich wymiarach.

Załaduj obraz MR dla tej myszy za pomocą przycisku Dołącz dane w lewym górnym rogu interfejsu. Przesuń rezonans magnetyczny za pomocą ręcznej reorientacji 3D i dopasuj go do czaszki na obrazie CT. Następnie wyłącz wizualizację PET, odznaczając ją na karcie Kontroler wizualny i użyj tylko MR i CT do narysowania obszaru zainteresowania lub ROI.

W narzędziu 3D ROI kliknij przycisk Dodaj ROI, aby utworzyć nowy ROI i nazwać go Infarct. Wybierz narzędzie Splajn, klikając lewym przyciskiem myszy, aby narysować obramowanie ROI i kliknij prawym przyciskiem myszy, aby je zamknąć. Następnie utwórz nowy zwrot z inwestycji i oznacz go jako kontralateralny.

Kliknij prawym przyciskiem myszy ROI zawału i wybierz Eksportuj. Następnie przesuń ROI do pozycji 2, wejście 1, aby umożliwić wizualizację i ręczną zmianę orientacji nowego ROI. Po wybraniu tylko wejścia 1 zaznacz pole ROI i wybierz opcję Tylko wyświetlanie, aby umożliwić wizualizację zwrotu z inwestycji w zawał bez zmiany jego orientacji.

W menu Rejestracja zmiany orientacji zastosuj przewrót w lewo i w prawo za pomocą funkcji Operator i ręcznie przenieś nowy zwrot z inwestycji do tego samego obszaru po stronie przeciwnej. Następnie wybierz operator arytmetyki i zastosuj pomnożenie skalarne liczby dwóch do nowego zwrotu z inwestycji, umożliwiając niezależną kwantyfikację zwrotów z inwestycji. Wróć do narzędzia ROI 3D.

Przejdź do zakładki Expert i Experimental i kliknij przycisk Importuj ROI. Wybierz opcję Wejście 1 w oknie dialogowym, aby załadować nowy wolumin jako kontralateralny zwrot z inwestycji. Na koniec kliknij prawym przyciskiem myszy przeciętny obraz PET, rozładuj go i ponownie włącz PET.

Wygeneruj ilościowe wyniki absorpcji za pomocą ikony Eksportuj wyniki w narzędziu 3D ROI. Uzyskane obrazy PET/CT i krzywe aktywności w czasie wskazują na zwiększony wychwyt radioznacznika w półkulach ipsilateralnych i przeciwległych. Kwantyfikacja dynamicznych obrazów mózgu PET przy użyciu zsumowanych danych z 50 do 60 minut ujawniła znaczny wzrost wychwytu znacznika w półkuli ipsilateralnej w porównaniu z półkulą przeciwległą w dMCAO, ale nie u myszy pozorowanych przy użyciu ręcznie rysowanego podejścia ROI.

Po obejrzeniu tej techniki powinieneś dobrze zrozumieć, jak dokładnie i skutecznie określić ilościowo zapalenie nerwów w mysim modelu udaru niedokrwiennego za pomocą TSPO-PET, przy użyciu zarówno automatycznych, jak i ręcznych metod analizy obrazu. Co ważne, powinieneś być również w stanie potwierdzić te wyniki in vivo za pomocą cyfrowej autoradiografii ex vivo. Ponieważ okres półtrwania węgla 11 jest tak krótki, ważne jest, aby nakreślić jasny plan eksperymentalny i harmonogram przed przystąpieniem do tej procedury, aby zmaksymalizować ilość i jakość danych.

Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak immunohistochemia, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak korelacja między aktywacją glejową a ekspresją TSPO. Należy pamiętać, że stosowanie radioaktywności może być bardzo niebezpieczne. Aby zminimalizować narażenie, podczas wykonywania tej procedury należy używać odzieży ochronnej, osłon ołowianych i zwiększać odległość.