Hodowla komórek ssaków w trójwymiarowych rusztowaniach peptydowych

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania, takie jak zachowanie komórek w mikrośrodowisku 3D, interakcja komórka-komórka i komórka-macierz, jak się namnażają, migrują, różnicują i tworzą funkcjonalne tkanki. Ta technika jest korzystna, ponieważ tworzy mikrośrodowisko komórkowe bliższe warunkom fizjologicznym. Procedurę zademonstruje Nausika Betriu, doktorantka z mojego laboratorium.

Implikacje metody rozciągają się w kierunku terapii uszkodzonych tkanek, ponieważ może być ona stosowana do uzyskiwania ekwiwalentów tkankowych dla medycyny naprawczej lub regeneracyjnej. Metoda może być również stosowana do innych układów, takich jak modele nowotworowe, cukrzyca lub choroby neurodegeneracyjne. Na początek przygotuj 500 mikrolitrów 0,5% roztworu peptydu RAD16-I w 20% wagowo sacharozy w probówce do mikrowirówki.

Sonikować roztwór w łaźni ultradźwiękowej z maksymalną mocą przez 20 minut. Następnie rozcieńczyć 300 mikrolitrów przygotowanego wcześniej roztworu peptydu z 200 mikrolitrami 10% sacharozy, aby uzyskać 500 mikrolitrów 0,3% roztworu peptydu RAD16-I. Następnie umieść probówkę mikrowirówki zawierającą roztwór peptydu w łaźni ultradźwiękowej o temperaturze pokojowej na 20 minut.

Następnie odwirować wcześniej przygotowaną zawiesinę komórkową. Następnie, za pomocą pipety Pasteura podłączonej do przewodu próżniowego, usuń supernatant. Dodaj dwa mililitry 10% sacharozy do osadu komórkowego.

Następnie użyj ręcznego licznika komórek, aby policzyć komórki. Po ponownym wymieszaniu komórek należy odwirować zawiesinę komórek w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Usunąć supernatant i zawiesić osad komórkowy w niezbędnej objętości 10% sacharozy, aby uzyskać pożądane stężenie czterech milionów komórek na mililitr.

Następnie należy poddać sonikacji wcześniej przygotowanego roztworu peptydu w łaźni ultradźwiękowej z maksymalną mocą przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Umieścić wkładkę do hodowli tkankowej w każdym dołku na płytce sześciodołkowej. Następnie wymieszaj 120 mikrolitrów roztworu RAD16-I z równą objętością zawiesiny komórek w probówce mikrowirówkowej.

Mieszać powoli, unikając tworzenia się pęcherzyków, pipetując w górę i w dół. Ważnym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę, jest mieszanie komórek z roztworem peptydu. Bardzo ważne jest, aby podczas mieszania zachować delikatność, powoli, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków, poprzez pipetowanie w górę iw dół.

Następnie za pomocą mikropipety załaduj 80 mikrolitrów mieszaniny RAD16-I i zawiesiny komórek do każdej wkładki. Załadowanie 80 mikrolitrów mieszaniny RAD16-I i zawiesiny komórek do każdej wkładki powinno być wykonane szybko. Dodaj 500 mikrolitrów pożywki na dno każdej studzienki, aby zwilżyć membranę wkładu.

Pozostaw peptyd do żelowania przez 20 minut w komorze laminarnej. Dodanie 500 mikrolitrów pożywki na dno każdej studzienki w celu zwilżenia membrany wkładki będzie sprzyjać tworzeniu się żelu i równoważeniu kultur 3D z pożywką. Po 20 minutach bardzo powoli dodaj 40 mikrolitrów pożywki do wkładu i pozwól mu zsunąć się po wewnętrznej ściance do żelu.

Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut. Po zakończeniu inkubacji dodać 60 mikrolitrów pożywki do wewnętrznej ścianki wkładki i pozwolić jej spłynąć po ściance. Następnie odessać pożywkę bogatą w sacharozę ze studzienki i dodać 500 mikrolitrów świeżej pożywki.

Następnie dodaj 60 mikrolitrów pożywki do wkładu. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie odessaj pożywkę ze studzienki.

Dodaj 2,5 mililitra świeżej pożywki do studzienki i 200 mikrolitrów pożywki do wkładki. Inkubować płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby wykonać test żywotności komórek, przygotuj roztwór dwóch mikromolowych kalceiny AM i dwóch mikromolowych homodimerów etydyny-1 w PBS w 15-mililitrowej probówce.

Wiruj przez 10 sekund i przykryj rurkę folią aluminiową. Następnie za pomocą mikropipety przepłucz próbki 3D-SAPS trzykrotnie dwoma mililitrami PBS. Dodać roztwór homodimeru kalceiny/etydyny do próbek.

Następnie przykryj próbki folią aluminiową i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 40 minut. Po zakończeniu inkubacji przepłukać konstrukty pięciokrotnie dwoma mililitrami PBS. Na koniec zwizualizuj próbki pod mikroskopem fluorescencyjnym przy użyciu 20-krotnego powiększenia.

W tym protokole opisano prostą i szybką metodę hodowli komórek w 3D za pomocą SAPS. Test żywotności komórek po utworzeniu konstruktu 3D przedstawia niewiele martwych komórek, co ilustrują komórki zabarwione na czerwono po pięciu dniach enkapsulacji. Po czterech tygodniach hodowli prawie nie obserwuje się martwych komórek.

Markery molekularne chondrogenezy i hipertrofii są analizowane za pomocą western blot. Pasmo kolagenu typu pierwszego obserwuje się zarówno w systemach 2D, jak i 3D. Jednak dolne pasmo reprezentujące przetworzone, dojrzałe białko kolagenowe obserwuje się tylko w systemie 3D, co wskazuje, że różnicowanie w 3D przebiega w bardziej fizjologiczny sposób.

Dodatkowo kolagen typu drugiego jest wykrywany tylko w konstrukcjach 3D. Kolagen typu 10 jest wykrywany zarówno w konstruktach 2D, jak i 3D, co wskazuje na pewien stopień hipertrofii po czterech tygodniach hodowli. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak trójwymiarowa enkapsulacja komórek kolagenu typu pierwszego, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak zachowanie komórek w naturalnym degradowalnym rusztowaniu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak uzyskać trójwymiarową hodowlę pożądanego typu komórek. Nie zapominaj, że praca z ludzkimi komórkami rakowymi może być niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak korzystanie z urządzeń klasy bezpieczeństwa biologicznego drugiej i wiedza zawodowa na temat pracy w sterylnych warunkach.