Izolacja i charakterystyka mezenchymalnych komórek zrębowych serca z próbek bioptycznych endomięśnia sercowego pacjentów z kardiomiopatią arytmogenną
28 lutego 2018
W tym artykule przedstawiono metodę izolowania mezenchymalnych komórek zrębu serca z próbek bioptycznych endomiokardiów pacjentów z kardiomiopatią arytmogenną. Opisano ich charakterystykę oraz protokół zwiększający ich różnicowanie adipogenne.
Ogólnym celem tego protokołu jest wyizolowanie mezenchymalnych komórek zrębowych serca od pacjentów z kardiomiopatią arytmogenną, zbadanie ich zdolności do różnicowania adipogennego i fenotypu markerów powierzchniowych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie kardiomiopatii arytmogennej, takie jak udział komórek zrębu serca w substytucji adipo i podkreślić mechanizmy molekularne. Główną zaletą tej techniki jest to, że izolację komórek stomijnych można przeprowadzić za pomocą kilku prostych pasaży z bardzo małych próbek serca.
Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w badanie kardiomiopatii arytmogennej. Może być również stosowany w innych systemach, takich jak badanie chorób sercowo-naczyniowych, w przypadku których wskazana jest biopsja endomięśnia sercowego. Po raz pierwszy przyjrzeliśmy się pomysłowi na tę metodę, gdy zrozumieliśmy, że możemy zmniejszyć procedurę izolacji komórek stomijnych, aby zastosować ją do biopsji serca i elektrofizjologii, którą może nam zapewnić.
W tym protokole należy pobrać biopsję endomiokardialną z prawej komory pacjenta z ACM za pomocą zintegrowanego mapowania elektroanatomicznego i fluoroskopii serca. Weź około pięciu gramów tkanki i wyślij ją do laboratorium w pożywce TMES. W laboratorium należy skonfigurować szafę bezpieczeństwa biologicznego zgodnie z potrzebami, aby przeprowadzić procedurę aż do trawienia ensomatycznego
.Następnie przenieś biopsję na płytkę i umyj ją dwukrotnie PBS. W tym momencie biopsja może zostać udokumentowana fotograficznie pod mikroskopem. Następnie przenieś biopsję do dwumililitrowej probówki zawierającej jeden mililitr roztworu kolagenazy.
W tym celu pokrój próbkę na małe fragmenty o szerokości od 0,5 do jednego milimetra. Następnie inkubować tkankę przez 90 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza z ciągłym mieszaniem obrotowym. Następnie odwirować przefermentowany roztwór, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze PBS.
Następnie ponownie odwirować probówkę, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze TMES. Teraz nałóż zawiesinę na 60-milimetrową płytkę i napełnij płytkę do trzech mililitrów za pomocą TMES, ale nie dalej. Następnie hoduj i rozkaż komórki zgodnie z protokołem tekstowym.
Przed rozpoczęciem przygotuj odczynnik do dysocjacji komórek, bufor myjący i wymagane przeciwciała gotowe do użycia. Gdy szacowana liczba komórek w kulturze osiągnie trzy miliony, umyj 100-milimetrową płytkę dwukrotnie 10 mililitrami sterylnego PBS. Następnie dodaj pięć mililitrów odczynnika do dysocjacji komórek do komórek i inkubuj płytkę przez siedem do 10 minut w temperaturze pokojowej, aby odłączyć komórki.
Po odłączeniu komórek dodaj 15 mililitrów PBS do komórek i przenieś zawiesinę do 50-mililitrowej probówki. Teraz odwiruj komórki i ponownie zawieś osad w jednym mililitrze buforu myjącego. Następnie policz komórki i przenieś trzy miliony do nowej probówki w końcowej objętości 1,5 mililitra buforu myjącego.
Następnie podziel zawiesinę na 12 rurek faksowych. Do każdej probówki dodać przeciwciała używane do charakteryzowania CMSC w zalecanych stężeniach. Pamiętaj, aby dołączyć kontrolki izotypu.
Po przygotowaniu inkubować probówki przez 15 minut w temperaturze pokojowej, osłonięte przed światłem. Później dodaj jeden mililitr buforu do płukania do każdej probówki, aby zatrzymać reakcje. Następnie odwirować komórki, usunąć supernatant i ponownie zawiesić granulki w 250 mikrolitrach buforu myjącego.
Teraz przystąp do scharakteryzowania komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Po różnicowaniu komórek adipogennych należy użyć barwienia ORO w celu zbadania akumulacji lipidów. Przed rozpoczęciem upewnij się, że masz działające rozwiązanie OR.
Przed barwieniem komórek usuń pożywkę i umyj komórki dwukrotnie dwoma mililitrami PBS. Następnie przykryj komórki 4% paraformaldehydem i pozwól im utrwalić się przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie wyrzuć paraformaldehyd i umyj komórki dwukrotnie dwoma mililitrami PBS.
Po drugim przemyciu dodać tyle roztworu roboczego OR, aby pokryć komórki. Następnie inkubuj płytkę przez godzinę w temperaturze pokojowej. Ta inkubacja musi być przeprowadzona w środowisku, w którym automatyczne rozwiązanie nie będzie działać, więc nie zaleca się zapełniania pomieszczeń.
Po inkubacji odessać roztwór ORO i kilkakrotnie przemyć komórki dwoma mililitrami PBS, aż plama nie będzie widoczna w płukaniu PBS i do momentu, gdy podczas oglądania pod mikroskopem nie zostanie wykryte niespecyficzne barwienie. Teraz, używając mikroskopu z odwróconym kontrastem fazowym kultury tkankowej, uchwyć 20 obrazów każdej studzienki w 20-krotnym powiększeniu. Szczegóły znajdują się w protokole tekstowym.
CMSC wyizolowano z biopsji endomięśnia sercowego zgodnie z opisem. Aby potwierdzić ich mezenchymalną linię, komórki inkubowano z odpowiednimi przeciwciałami sprzężonymi z florofourami i analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. CMSC były dodatnie dla specyficznych mezenchymalnych antygenów powierzchniowych CD29, CD44 i CD105.
Wiadomo, że frakcja komórek CD90 dodatnich jest zmienna. Nie wyrażono markerów dziedzictwa śródbłonka, dziedzictwa monocytów lub makrofagów, dziedzictwa onomatopetycznego oraz głównego kompleksu zgodności tkankowej. Następnie CMSC hodowano w pożywce T.ADIPO w celu różnicowania adipogennego i barwiono ORO w poszukiwaniu wewnątrzkomórkowych kropelek lipidów.
CMSC od pacjentów z kardiomiopatią arytmogenną gromadziły więcej kropelek lipidów niż komórki z grupy kontrolnej. Różnice te mierzono w warunkach różnicowania po 72 godzinach i po siedmiu dniach. Po opanowaniu rozdzielczości komórek można wykonać w ciągu trzech godzin, barwienie można wykonać w ciągu dwóch godzin, a analizę faksu można zakończyć w ciągu trzech godzin.
Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak testy narkotykowe, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, czy możemy użyć komórek stomijnych od tych samych pacjentów, które reagują na różne bodźce. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się kardiomiopatią arytmogenną do zbadania udziału ludzkich komórek zrębu serca w patogenezie choroby.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia metodę izolacji mezenchymalnych komórek macierzystych serca (CMSCs) z biopsji endomiokardialnych pobranych od pacjentów z kardiomiopatią arytmogenną. Szczegółowo opisano charakterystykę tych komórek oraz protokół mający na celu zwiększenie ich różnicowania w kierunku adipogenicznym.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia serca
- Badania nad komórkami macierzystymi
- Różnicowanie adipogenne
Wstęp
- Kardiomiopatia arytmogenna to choroba serca charakteryzująca się zastępowaniem mięśnia sercowego tkanką włóknistą lub tłuszczową.
- Zrozumienie roli stromalnych komórek serca w tym stanie może dostarczyć wiedzy na temat mechanizmów choroby.
- Izolacja CMSCs z małych próbek serca jest kluczowa dla badania ich właściwości.
- Metodę tę można również dostosować do innych chorób sercowo-naczyniowych wymagających biopsji endomiokardialnej.
Cel badania
- Izolacja CMSCs od pacjentów z kardiomiopatią arytmogenną.
- Ocena ich potencjału do różnicowania adipogennego.
- Charakterystyka markerów powierzchniowych tych komórek.
Zastosowane metody
- Pobranie biopsji treściwszyjowej z prawej komory serca.
- Trawienie próbek tkanek z użyciem kolagenazy.
- Cytometria przepływowa w celu charakterystyki markerów powierzchniowych.
- Barwienie Oil Red O w celu oceny akumulacji lipidów po różnicowaniu.
Główne wyniki
- CMSCs zostały pomyślnie wyizolowane i scharakteryzowane.
- Komórki wykazywały obecność markerów linii mezenchymalnej.
- CMSCs pobrane od pacjentów gromadziły więcej kropli lipidowych w porównaniu do zdrowych kontroli.
- Metodologia umożliwia szybkie przetwarzanie i analizę komórek.
Wnioski
- Niniejszy protokół przedstawia niezawodną metodę izolacji CMSCs z biopsji serca.
- Uzyskane informacje mogą poszerzyć wiedzę na temat kardiomiopatii arytmogennej.
- Potencjalne zastosowania obejmują inne obszary badań nad układem sercowo-naczyniowym.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Izolacja mezenchymalnych komórek macierzystych serca od pacjentów z kardiomiopatią arytmogenną umożliwia mechanistyczne ograniczenie ryzyka związanego z udziałem zrębu w odkładaniu adipocytów, co stanowi cechę charakterystyczną patologii tej choroby. Ten pierwotny model komórkowy wspiera walidację celów terapeutycznych poprzez powiązanie fenotypów komórkowych z mechanizmami choroby, zwiększając pewność prognostyczną we wczesnych fazach odkrywania leków. Opisana metoda zapewnia skalowalny i powtarzalny system do badania udziału zrębu w progresji chorób układu sercowo-naczyniowego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na weryfikację hipotez terapeutycznych dotyczących udziału komórek zrębu w akumulacji adipocytów i włóknieniu.
- Wartość naukowa: Umożliwia funkcjonalną walidację linii mezenchymalnej poprzez charakterystykę markerów powierzchniowych (CD29, CD44, CD105).
- Wartość naukowa: Wspiera przesiew fenotypowy zdolności do różnicowania adipogennego jako odczytu istotnego w kontekście choroby.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość operacyjna: Pozwala na generowanie ustandaryzowanych, powiększalnych populacji komórek pierwotnych z minimalnej ilości materiału biopsyjnego w celu przygotowania do analizy.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ilościowe wyniki różnicowania adypogennego poprzez barwienie Oil Red O i kwantyfikację kropel lipidowych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia powtarzalne immunofenotypowanie oparte na cytometrii przepływowej w celu spójnej charakterystyki komórek w różnych eksperymentach.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość translacyjna: Wykorzystanie komórek pochodzących od pacjentów do modelowania specyficznej dla choroby skłonności do adipogenezy obserwowanej w sercach z kardiomiopatią arytmogenną.
- Wartość translacyjna: Połączenie fazy odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez testowanie reakcji zrębu w warunkach różnicowania.
- Wartość translacyjna: Wsparcie decyzji dotyczących postępu badań z uwzględnieniem ryzyka poprzez ilościowe określenie akumulacji lipidów związanej z chorobą w stosunku do kontroli.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków – od testowania hipotez dotyczących celu molekularnego po identyfikację związku wiodącego – dostarczając biologicznie relewantnych modeli komórkowych do badań nad mechanizmami działania.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących udziału komórek zrębu w odkładaniu adipocytów i przebudowie mięśnia sercowego.
- Przesiewanie: Dostarcza zestandaryzowanych, ilościowych testów różnicowania adipogennego, odpowiednich do przesiewania związków i badań nad modulacją szlaków sygnałowych.
- Analityka: Generuje wieloparametryczne odczyty, w tym ekspresję markerów powierzchniowych (cytometria przepływowa) i akumulację lipidów (Oil Red O), do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Wykorzystuje komórki pochodzące od pacjentów do modelowania fenotypów adipogennych istotnych dla danej choroby, wspierając ciągłość badań przedklinicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do izolowania i charakteryzowania komórek zrębu serca w różnych wskazaniach sercowo-naczyniowych wymagających biopsji endomiokardialnej.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną poprzez zdefiniowanie fenotypu komórek zrębu oraz ich potencjału różnicowania w kontekście choroby.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzacji protokołów trawienia, ekspansji i charakterystyki z niewielkich próbek tkanek.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez dostarczenie ilościowych, istotnych dla choroby odczytów komórkowych do priorytetyzacji celów.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia postęp skorygowany o ryzyko poprzez powiązanie fenotypów komórkowych z cechami patologicznymi obserwowanymi w tkankach pacjentów.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie hodowli komórek pierwotnych, cytometrii przepływowej oraz technik barwienia histologicznego.
- Zależne od dostępu do próbek biopsji endomiokardialnej oraz infrastruktury do trawienia z wykorzystaniem kolagenazy.
- Wymaga ustandaryzowanych procedur immunofenotypowania i różnicowania adipogennego we wszystkich laboratoriach.
- Wymaga adaptacji pożywek do różnicowania oraz protokołów barwienia w celu zapewnienia spójnej kwantyfikacji kropel lipidowych.
- Ograniczone rozmiarem i żywotnością próbek biopsyjnych, co wymaga zoptymalizowanego przetwarzania w celu maksymalizacji uzysku komórek.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
1:12
Cardiac Biopsy Collection and Processing
3:06
Characterizing Cardiac Mesenchymal Stromal Cells (C-MSC) by Flow Cytometry
5:22
Oil Red O (ORO) Staining C-MSC after Adipogenic Differentiation
7:02
Results: Flow Cytometry Analysis and ORO Staining
8:27
Conclusion
