Chirurgia stereotaktyczna w manipulacji genetycznej w komórkach prążkowia mózgów noworodków myszy

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w rozwoju genetycznym i neurologicznym, na przykład podczas rozwoju poporodowego. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to prosta technika z domowym urządzeniem. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ wykonywanie ukierunkowanych zastrzyków do mózgu wymaga pełnej dbałości o szczegóły.

Na początek zrób uchwyt, aby używać nowonarodzonych szczeniąt w aparacie stereotaktycznym. Najpierw przygotuj tacę na głowę. Odetnij około 1/5 dna 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej, aby zrobić otwór na głowę nowonarodzonego szczeniaka.

Następnie wybierz puste pudełko z końcówkami do pipet, które pasuje do cokołu aparatu stereotaktycznego. Następnie użyj gorącego kleju, aby przymocować tackę na głowę do podstawy pudełka na końcówki. Następnie przyklej kasetę z tkankami do osadzania w pudełku, w której może podeprzeć tułów szczeniaka, gdy jego głowa jest zamocowana.

Teraz przygotuj igły ze stali nierdzewnej o rozmiarze 30 mm do wstrzykiwania. Najpierw należy je wstępnie oczyścić, mocząc je w chloroformie przez trzy dni w szklanej fiolce. Trzy dni później ostrożnie wyjmij igły i umyj je absolutnym etanolem przez 20 minut i mieszaniem 50 obr./min.

Następnie umyj je trzy razy w 70% etanolu przez 10 minut na pranie, również z mieszaniem. Po umyciu pozostaw igły do wyschnięcia na powietrzu i przechowuj je w czystym pudełku w temperaturze pokojowej do czasu użycia. Do montażu mikroiniekcji użyj pięciocentymetrowego odcinka rurki polietylenowej PE20, aby połączyć rurkę PE10 ze strzykawką o średnicy 10 mikrolitrów.

Zabezpiecz połączenie cyjanoakrylanem. Następnie zamontuj nową igłę iniekcyjną o rozmiarze 30 na drugim końcu rurki PE10. Teraz załaduj strzykawkę do mikroiniekcji o pojemności 10 mikrolitrów.

Zdejmij tłok i użyj kolejnej strzykawki o rozmiarze 25, aby ponownie załadować zespół autoklawowaną wodą destylowaną w celu usunięcia powietrza z rurki. Następnie umieścić tłok z powrotem w strzykawce mikrolitrowej i naciskać tłok, aż w cylindrze pozostaną tylko dwa mikrolitry wody destylowanej i nie mniej. Następnie ostrożnie zamontuj strzykawkę z mikrolitrami na pompie strzykawkowej z mikroprzepływem.

Następnie odpipetować niewielkie ilości przefiltrowanego 0,1% barwnika Fast Green w eksperymentalnych płynach wirusowych na kawałek parafilmu. Następnie należy zassać niewielką ilość powietrza do strzykawki, aż między igłą do wstrzykiwań a rurką będzie widoczny pęcherzyk powietrza. Następnie załaduj 0,7 mikrolitra przefiltrowanego roztworu Fast Green, aby przetestować przepływ płynów w rurce do mikroiniekcji.

Jeśli przepływ jest dobry, należy zassać kolejną niewielką objętość powietrza, aby wytworzyć drugi pęcherzyk powietrza, a następnie załadować roztwór do wstrzykiwań do rurki do mikroiniekcji. Przymocować i zabezpieczyć igłę do mikroiniekcji do aparatu stereotaktycznego i przystąpić do mikroiniekcji nowonarodzonych myszy. Przygotowując się do zabiegu, dokładnie przetrzyj instrument stereotaktyczny 70% etanolem i wysterylizuj narzędzia chirurgiczne 70% etanolem.

Następnie znieczulij noworodka za pomocą hipotermii. Umieść szczeniaka w lateksowej rękawiczce i zanurz go w kruszonym lodzie po szyję na pięć minut. Następnie uszczypnij stopy szczeniaka kleszczami, aby upewnić się, że nie ma odruchu pedałowania.

Następnie umieść szczeniaka z rękawicą w tacy na głowę i połóż trochę pokruszonego lodu wokół lateksowego rękawa, aby utrzymać znieczulenie hipotermiczne. Następnie wyszoruj głowę szczeniaka 70% etanolem i zlokalizuj punkt orientacyjny lambda. Zaznacz to markerem.

Następnie skieruj końcówkę igły do lambdy i ustaw współrzędne przednie/tylne i przyśrodkowe/boczne na zero. Następnie, konsultując się z atlasem mózgu, przesuń ramię iniekcji do miejsca docelowego. Na przykład prążkowie szczeniąt P2 znajduje się 2,4 milimetra przed lambdą, 1,0 milimetra po każdej stronie linii środkowej i 1,7 milimetra brzusznej.

Następnie zaznacz za pomocą pisaka położenie barwnika Fast Green na tubce PE10. Następnie powoli zacznij penetrować igłę przez skórę i czaszkę, aż końcówka igły zetknie się z powierzchnią czaszki. Ustaw współrzędną grzbietową/brzuszną na zero.

Następnie powoli opuść igłę do miejsca docelowego. Po ustawieniu na miejscu odczekaj minutę, aby miąższ powrócił do normalnego kształtu. Następnie uruchom program mikroiniekcji z prędkością 100 nanolitrów na minutę.

Podczas wstrzykiwania należy obserwować, jak barwnik Fast Green porusza się w rurkach PE. Bardzo ważne jest, aby powoli penetrować igłę przez skórę i czaszkę, aż końcówka igły zetknie się z powierzchnią czaszki. Podczas wstrzykiwania konieczne jest obserwowanie, jak barwnik Fast Green porusza się w rurkach PE.

Po zakończeniu iniekcji należy odczekać minutę, a następnie powoli podnieść igłę do 1/2 głębokości penetracji DV. Następnie odczekaj kolejne 30 sekund, zanim przystąpisz do powolnego wyciągania igły z głowy szczeniaka. Po zakończeniu iniekcji ważne jest, aby odczekać minutę przed powolnym podniesieniem igły do 1/2 głębokości penetracji DV.

Następnie odczekaj kolejne 30 sekund, zanim powoli wyjmiesz igłę z głowy szczeniaka. Po wstrzyknięciu wszystkich docelowych miejsc rozgrzej szczenię przez 20 minut w inkubatorze o temperaturze 33 stopni Celsjusza. Sprawdzaj szczenię co pięć minut, aż odzyska pozycję leżącą mostka.

Następnie zwróć młode do matki. 200 nanolitrów wirusa, który wyraża rekombinazę DNA Cre połączoną z GFP, wstrzyknięto do prążkowia P2 myszy Ai14. Myszy te wykazywały ekspresję genu reporterowego tdTomato po delecji kasety zatrzymania z bokami loxP za pośrednictwem Cre.

Mózgi pobrano w P14 w celu barwienia immunologicznego GFP i tdTomato. Wiele komórek GFP transdukowanych przez AAV było obecnych w całym prążkowiu, co wskazuje na rozległe zakażenie komórek prążkowia wirusami AAV EGFP Cre. Podobnie rozległą ekspresję tdTomato stwierdzono również w prążkowiu.

Po badaniu mikroskopowym w dużym powiększeniu wyraźnie stwierdzono, że wszystkie komórki prążkowia GFP dodatnie wykazują współekspresję genu reporterowego tdTomato. Co więcej, sygnały tdTomato wykryto w przypuszczalnie zakończonych aksonach w gałki bladej, w istocie czarnej pars reticulata, docelowych obszarach neuronów projekcyjnych prążkowia i prążkowia. Łącznie wyniki te sugerują udaną rekombinację DNA za pośrednictwem Cre loxP indukowaną przez ekspresję aktywności Cre za pośrednictwem AAV w neuronach prążkowia noworodków.

Po opanowaniu tę technikę można wykonać w ciągu 30 minut w celu obustronnego wstrzyknięcia prążkowia, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że jest to delikatna operacja mózgu u noworodka, która wymaga cierpliwości i ostrożności. Z tej procedury można wykonać inne metody, takie jak optogenetyka i chemogenetyka, w celu analizy dojrzewania podczas rozwoju poporodowego.