Name: Chirurgia stereotaktyczna w manipulacji genetycznej w komórkach prążkowia mózgów noworodków myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Poznaj chirurgię stereotaktyczną do mikroiniekcji w prążkowie mózgów noworodków myszy. Ta metoda umożliwia precyzyjną manipulację genetyczną komórek neuronalnych podczas kluczowych etapów rozwoju postnatalnego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Ministerstwo Nauki i Technologii przyznaje granty MOST104-2311-B-010-010-MY3, MOST106-2321-B-010-012, National Health Research Institutes grant NHRI-EX106-10429NI, oraz grant z Programu Centrum Badań nad Obszarami z Ministerstwa Edukacji za pośrednictwem Centrum Badań nad Mózgiem, Narodowy Uniwersytet Yang-Ming na Tajwanie,oraz stypendia podoktorskie MOST106-2811-B-010-031 (S.-Y.C.), MOST105-2811-B-010-036 i MOST106-2811-B-010-030 (H.-Y.K.).

Opisane tutaj protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Narodowego Uniwersytetu Yang-Ming.
1. Przygotowanie uchwytu dla noworodków w aparacie stereotaktycznym
<ol>
	<li>Przygotuj tackę na głowę: odetnij spód probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml (o długości 15 mm) do kształtu pasującego do głowy nowonarodzonych młodych, usuwając 1/5 ścianki probówki.</li>
	<li>Weź pudełko z końcówkami do pipet o odpowiednim rozmiarze, które pasuje do cokołu aparatu stereotaktycznego, i zdejmij górną pokrywę. Przymocuj tackę na głowę przygotowaną w kroku 1.1 i kasetę z wkładem do zatapiania chusteczek na podstawie tacki na końcówki za pomocą kleju topliwego. Wysokość kasety do zatapiania tkanek wynosi 7 mm, która służy do podparcia szyi i ciała szczeniaka w pozycji unieruchomionej przez głowę.</li>
	<li>Umieść cały zestaw w standardowym aparacie stereotaktycznym.</li>
</ol>
2. Przygotowanie igieł do iniekcji 30G ze stali nierdzewnej
<ol>
	<li>Wstępnie wyczyść igły strzykawki 30G, mocząc je w chloroformie przez 3 dni.</li>
	<li>Użyj kleszczyków, aby ostrożnie i powoli wyciągnąć igłę z polipropylenowej piasty w kapturze chemicznym.</li>
	<li>Myj igły absolutnym etanolem przez 20 minut, a następnie płucz 70% etanolem przez 3 × 10 minut na wytrząsarce z prędkością 50 obr./min. Pozostaw igły do wyschnięcia na powietrzu i przechowuj oczyszczone igły w czystym pudełku w temperaturze pokojowej (RT) do czasu użycia.</li>
</ol>
3. Przygotuj adapter do wężyka do mikroiniekcji
<ol>
	<li>Podłączyć strzykawkę o pojemności mikrolitrów do igły iniekcyjnej 30G z rurką polietylenową PE10 (tubka PE10). Przygotować adapter rurki polietylenowej PE20 (rurka PE20) do mostkowania igły iniekcyjnej i strzykawki o pojemności mikrolitrów. Użycie adaptera jest konieczne, ponieważ średnica rurki PE10 jest znacznie mniejsza niż igły strzykawki mikrolitrowej 26G.</li>
	<li>Przygotuj rurkę do strzykawki z mikrolitrami: połącz wstępnie oczyszczoną igłę iniekcyjną 30G z 5 cm rurką PE20 i uszczelnij złącze klejem błyskawicznym. Ten adapter do węży jest wielokrotnego użytku. 
	UWAGA: Jeśli igła strzykawki do mikroiniekcji ma 30 G, przygotowanie (krok 3.1) i użycie (krok 3.3) tego adaptera nie jest konieczne.</li>
	<li>Połączyć adapter rurki (przygotowany w kroku 3.1) ze strzykawką o pojemności mikrolitrów (10 μl).</li>
	<li>Podłącz jeden koniec rurki PE10 (nie dłuższej niż 60 cm) do igły 30G adaptera rurki PE20. Zamontuj nową igłę iniekcyjną 30G na drugim końcu rurki PE10.</li>
</ol>
4. Załaduj rurkę do mikroiniekcji autoklawowaną wodą destylowaną, barwnikiem i wirusami
<ol>
	<li>Zdjąć tłok strzykawki z mikrolitrami. Użyj strzykawki 25G, aby załadować strzykawkę mikrolitrową i połączoną z nią rurkę PE autoklawowaną wodą destylowaną, aby usunąć powietrze z rurki.</li>
	<li>Umieścić tłok z powrotem w strzykawce o pojemności mikrolitrów i naciskać tłok, aż w cylindrze pozostaną 2 μl wody destylowanej. Nie pozwól, aby objętość wody destylowanej spadła poniżej 2 μl.</li>
	<li>Ostrożnie zamontuj strzykawkę o mikrolitrach na pompie strzykawkowej o mikroprzepływie.</li>
	<li>Pipetą odpipetować niewielkie ilości 0,1% szybko zielonego barwnika (przygotowanego w 0,9% soli fizjologicznej i przefiltrowanego filtrem 0,22 μm) i wirusa płynić do kawałka parafilmu.</li>
	<li>Pobrać niewielką ilość powietrza, aby na styku igły iniekcyjnej 30G i rurki PE10 był widoczny pęcherzyk powietrza, a następnie załadować 0,7 μl przefiltrowanego, szybko zielonego środka do probówki, aby przetestować przepływ płynów w rurce do mikroiniekcji.</li>
	<li>Pobrać kolejną niewielką ilość powietrza, aby wytworzyć drugi pęcherzyk powietrza, a następnie załadować płyny wirusowe do rurki do mikroiniekcji.</li>
	<li>Przymocuj i przymocuj igłę do mikroiniekcji 30G do ramienia aparatu stereotaktycznego.</li>
</ol>
5. Znieczulenie nowonarodzonych myszy przez hipotermię
<ol>
	<li>Umieść szczeniaka w lateksowym rękawie rękawicznym i zanurz go w kruszonym lodzie po szyję na 5 minut.</li>
	<li>Uszczypnij stopy szczeniaka kleszczami, aby upewnić się, że jego stopy nie reagują na wycofanie.</li>
	<li>Umieść szczeniaka z lateksowym rękawem na rękawiczki w tacy na głowę i umieść trochę pokruszonego lodu wokół lateksowego rękawa, aby był zimny do znieczulenia hipotermią.</li>
	<li>Nałóż maść weterynaryjną na oczy szczeniaka, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia, jeśli to możliwe.</li>
</ol>
6. Mikroiniekcja
<ol>
	<li>Przygotuj sterylną operację, dokładnie wycierając instrument stereotaktyczny 70% etanolem. Wysterylizuj narzędzie chirurgiczne, zanurzając je w 70% etanolu.</li>
	<li>Wyszoruj głowę szczeniaka 70% etanolem. Zlokalizuj punkt orientacyjny lambda na czaszce i zaznacz lambdę markerem. Skieruj końcówkę igły do lambdy i ustaw współrzędne przednio-tylne (AP) i przyśrodkowo-boczne (ML) na zero.</li>
	<li>Przesunąć ramię iniekcyjne do miejsca docelowego zgodnie ze współrzędnymi X i Y miejsca docelowego. Dla prążkowia dnia pourodzeniowego (P) 2 młode współrzędne to: AP, +2,4 mm przed lambdą; ML, ±1,0 mm bocznie od linii środkowej; grzbietowo-brzuszna (DV), −1,7 mm od czaszki. Zaznacz długopisem pozycję szybkiego zielonego barwnika w tubie PE10.</li>
	<li>Powoli opuść igłę do wstrzykiwań 30G, aby przeniknęła przez skórę i czaszkę, a następnie podnieś końcówkę igły, aż zatrzyma się na powierzchni czaszki. Ustaw współrzędną DV na zero.</li>
	<li>Powoli opuszczać igłę do wstrzykiwań 30G, aż osiągnie współrzędną DV miejsca docelowego. Odczekaj 1 minutę, aby miąższ powrócił do normalnego kształtu. Uruchomić program mikroiniekcji (100 nL/min).</li>
	<li>Upewnij się, że ślad szybkiego zielonego barwnika porusza się w probówce PE, aby upewnić się, że płyn wirusowy został wstrzyknięty do mózgu.</li>
	<li>Odczekać 1 minutę po zakończeniu mikroiniekcji, a następnie powoli i stopniowo podnosić igłę do 1/2 wysokości DV w ciągu 30 sekund. Po 30 s powoli wyjmij igłę z głowy szczeniaka.</li>
	<li>Powtarzaj kroki od 6.2 do 6.7, aż do zakończenia mikroiniekcji we wszystkich docelowych miejscach.</li>
</ol>
7. Rekonwalescencja pooperacyjna szczeniaka
<ol>
	<li>Rozgrzej szczenię przez 20 minut w inkubatorze o temperaturze 33 °C. Sprawdzaj powrót szczeniaka do zdrowia po znieczuleniu hipotermicznym co 5 minut, aż szczenię odzyska wystarczającą przytomność, aby utrzymać leżący mostek.</li>
	<li>Zwróć szczenię z powrotem do tamy po tym, jak szczenię w pełni wyzdrowieje.</li>
</ol>

<ol><li>Athos, J., Storm, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+precision+stereotaxic+surgery+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">High precision stereotaxic surgery in mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. , Suppl ement 14. Appendix 4, Wiley Online Library A.4A.1-A.4A.9 (2001).</li>
<li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nat. Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).</li>
<li>Tye, K. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+investigation+of+neural+circuits+underlying+brain+disease+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models.</a> Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 251-266 (2012).</li>
<li>Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DREADDs+for+neuroscientists%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">DREADDs for neuroscientists.</a> Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).</li>
<li>Knopfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+optical+indicators+for+the+analysis+of+neuronal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits.</a> Nat. Rev. Neurosci. 13 (10), 687-700 (2012).</li>
<li>Tau, G. Z., Peterson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+development+of+brain+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacol%22%5BJournal%5D)">Normal development of brain circuits.</a> Neuropsychopharmacol. 35 (1), 147-168 (2010).</li>
<li>Mitchell, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+neurodevelopmental+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The genetics of neurodevelopmental disease.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 21 (1), 197-203 (2011).</li>
<li>Sahin, M., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes%2C+circuits%2C+and+precision+therapies+for+autism+and+related+neurodevelopmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genes, circuits, and precision therapies for autism and related neurodevelopmental disorders.</a> Science. 350 (6263), (2015).</li>
<li>Schierberl, K. C., Rajadhyaksha, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+microinjection+of+viral+vectors+expressing+Cre+recombinase+to+study+the+role+of+target+genes+in+cocaine+conditioned+place+preference%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic microinjection of viral vectors expressing Cre recombinase to study the role of target genes in cocaine conditioned place preference.</a> J. Vis. Exp. (77), e50600(2013).</li>
<li>Mathon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+the+effectiveness+of+intracerebral+injections+in+adult+and+neonatal+mice%3A+a+neurosurgical+point+of+view%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Bull%22%5BJournal%5D)">Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view.</a> Neurosci. Bull. 31 (6), 685-696 (2015).</li>
<li>Davidson, S., Truong, H., Nakagawa, Y., Giesler, G. J. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microinjection+technique+for+targeting+regions+of+embryonic+and+neonatal+mouse+brain+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">A microinjection technique for targeting regions of embryonic and neonatal mouse brain in vivo.</a> Brain Res. 1307, 43-52 (2010).</li>
<li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxp2+controls+synaptic+wiring+of+corticostriatal+circuits+and+vocal+communication+by+opposing+Mef2c%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Foxp2 controls synaptic wiring of corticostriatal circuits and vocal communication by opposing Mef2c.</a> Nat. Neurosci. 19 (11), 1513-1522 (2016).</li>
<li>Gerfen, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neostriatal+mosaic%3A+multiple+levels+of+compartmental+organization+in+the+basal+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The neostriatal mosaic: multiple levels of compartmental organization in the basal ganglia.</a> Annu. Rev. Neurosci. 15, 285-320 (1992).</li>
<li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+techniques+for+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transfection techniques for neuronal cells.</a> J. Neurosci. 30 (18), 6171-6177 (2010).</li>
<li>Cheetham, C. E., Grier, B. D., Belluscio, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+regional+viral+injection+in+neonatal+mice+enables+structural+and+functional+interrogation+of+defined+neuronal+populations+throughout+targeted+brain+areas%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neural+Circuit%22%5BJournal%5D)">Bulk regional viral injection in neonatal mice enables structural and functional interrogation of defined neuronal populations throughout targeted brain areas.</a> Front. Neural Circuit. 9, 72(2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W niniejszym badaniu demonstrujemy prostą i niezawodną stereotaktyczną metodę wstrzykiwania wirusów AAV do prążkowia mózgów noworodków myszy. Mikrowstrzyknęliśmy wirusy AAV-eGFP-Cre do prążkowia myszy reporterowych Ai14 w P2, a następnie przeanalizowaliśmy ekspresję genu reporterowego w P14. Odkryliśmy, że komórki transdukowane przez AAV GFP w całym prążkowiu na poziomie rostrocaudalnym. Co więcej, prawie wszystkie komórki GFP-dodatnie wykazywały koekspresję genu reporterowego tdTomato w komórkach prążkowia, co sugeruje ...

Nowoczesne badania nad strukturą i funkcją mózgu zazwyczaj wymagają genetycznej manipulacji specyficznymi genami w komórkach neuronalnych. Aby zbadać funkcje różnych genów, rutynowo generowano transgeniczne myszy przenoszące zmutowane allele, w tym allele knockout i knock-in. Stereotaktyczna chirurgia mózgu u dorosłych gryzoni jest standardową metodą miejscowego dostarczania leków, wirusów, znaczników i innych odczynników do określonych obszarów mózgu gryzoni1,2. Zastosowanie stereotaktycznej chirurgii mózgu u myszy transgenicznych pozwala na genetyczne manipulowanie funkcją genu i aktywnością neuronalną w określonych populacjach neuronów mózgu myszy. Manipulacja specyficzna dla typu komórki zapewnia potężne podejście do rozszyfrowywania funkcji neuronalnych w złożonych obwodach neuronowych mózgu3,4,5.
Rozwój neuronalny układu nerwowego rozpoczyna się we wczesnych stadiach embrionalnych, a procesy rozwojowe trwają po urodzeniu aż do okresu młodzieńczego. Pourodzeniowe dojrzewanie układu nerwowego obejmuje precyzyjne okablowanie synaptyczne obwodów nerwowych, co jest niezbędne dla fizjologicznych i poznawczych funkcji mózgu6. Dlatego badanie zdarzeń rozwojowych, które występują w oknach czasowych noworodków, jest ważne nie tylko dla zrozumienia prawidłowego rozwoju neuronów, ale może również dostarczyć wglądu w patogenezę zaburzeń neurorozwojowych i neuropsychiatrycznych7,8. Chociaż metody stereotaktycznej chirurgii mózgu u dorosłych gryzoni są łatwo dostępne2,9, w Internecie dostępnych jest niewiele protokołów stereotaktycznej chirurgii mózgu u noworodków myszy10,11. W rzeczywistości stereotaktyczne mikrowstrzyknięcia odczynników do mózgów nowonarodzonych młodych myszy są trudne, ponieważ głowa nowonarodzonego szczeniaka jest zbyt delikatna, aby można ją było zamocować w standardowym aparacie stereotaktycznym. Niemniej jednak, zastosowanie stereotaktycznej chirurgii mózgu u myszy transgenicznych jest wykonalne dla noworodków myszy12. Tutaj opisujemy prostą metodę z domowym zestawem do wykonywania stereotaktycznej operacji mózgu u nowonarodzonych szczeniąt myszy. Pokazujemy, że ta technika pozwala na warunkowe usunięcie floksowanych genów poprzez mikrowstrzyknięcie rekombinazy Cre DNA z ekspresją AAV do prążkowia myszy z genem reporterowym i myszy transgenicznych z warunkowym floksowaniem. Technika ta ma również zastosowanie do dostarczania odczynników do prążkowia noworodka myszy typu dzikiego.

<table><tbody><tr><td>Igła 30G PrecisionGlide</td><td>Becton Dickinson</td><td>REF 305106</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>JT Baker</td><td>9180-03</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Hamilton MICROLITR</td><td>Hamilton&nbsp;</td><td>Igła 80300</td><td>30G pasująca do rurki PE10; Igła 26G wymaga adaptera PE20</td></tr><tr><td>Rurka polietylenowa PE20</td><td>Rurka polietylenowa Becton Dickinson</td><td>427406</td><td></td></tr><tr><td>PE10</td><td>Becton Dickinson</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa z mikroprzepływem</td><td>Dłuższa pompa precyzyjna Co.</td>Strzykawka <td>TJ-2A (kontroler) i L0107-2A (jednostka napędowa)</td><td></td></tr><tr><td>25G</td><td>Becton Dickinson</td><td>REF 302105</td><td></td></tr><tr><td>Fast green</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-7252</td><td>0.1%</td></tr><tr><td>Standard Stereotaxic Instruments</td><td>RWD Life Science</td><td>68037</td><td>Bez użycia 68030 Adapter myszy/noworodka Szczur</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-FOXP2</td><td>Abcam</td><td>ab16046</td><td>Królik poliklonalny do FOXP2, 1:4,000</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-RFP</td><td>Abcam</td><td>ab65856</td><td>Mysz monoklonalna do RFP, 1:1,000</td></tr><tr><td>Mikroskop BX63</td><td>Olympus</td><td>BX63</td><td></td></tr><tr><td>LSM 880 mikroskop konfokalny</td><td>Zeiss</td><td>LSM 880</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty-królik sprzężony z Alexa fluor594</td><td>Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc.</td><td>111-585-003</td><td></td></tr><tr><td>AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40</td><td>Penn Vector Core</td><td>AV-9-PV1848</td><td>Lot # CS0987, 5.506x1013 (GC/mL)</td></tr><tr><td>AAV9.chicken aktyna-eGFP</td><td>AAV core, Instytut Nauk Biomedycznych, Academia Sinica, Tajwan</td><td>N/A</td><td>1x1014 (GC/ml)</td></tr><tr><td>B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J</td><td>Laboratorium Jacksona&nbsp;</td><td>007914</td><td>Ai14</td></tr><tr><td>B6(Cg)-Foxp2TM1.1Sfis/CfreJ</td><td>Laboratorium Jacksona&nbsp;</td><td>026259</td><td>Foxp2fl/fl</td></tr><tr><td>Dulbecco" s sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Corning&nbsp; cellgro</td><td>21-030-CVR</td><td></td></tr></tbody></table>

chirurgia stereotaktyczna w manipulacji genetycznej w komórkach prążkowia mózgów noworodków myszy

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Wiele genów ulega ekspresji w embrionalnych mózgach, a niektóre z nich są ciągle wyrażane w mózgu po urodzeniu. W przypadku takich trwale wyrażanych genów mogą one funkcjonować w celu regulacji procesu rozwojowego i/lub funkcji fizjologicznych w mózgach noworodków. Aby zbadać neurobiologiczne funkcje określonych genów w mózgu, niezbędna jest dezaktywacja genów w mózgu. Tutaj opisujemy prostą metodę stereotaktyczną do inaktywacji ekspresji genów w prążkowiu myszy transgenicznych w oknach noworodkowych. Wirusy AAV-eGFP-Cre zostały mikrowstrzyknięte do prążkowia myszy z genem reporterowym Ai14 w dniu pourodzeniowym (P) 2 za pomocą stereotaktycznej operacji mózgu. Ekspresję genu reporterowego tdTomato wykryto w prążkowiu P14, co sugeruje udaną rekombinację DNA za pośrednictwem Cre-loxP w komórkach prążkowia transdukowanych przez AAV. Następnie zweryfikowaliśmy tę technikę, mikroiniekując wirusy AAV-eGFP-Cre myszom P2Foxp2 fl / fl. Podwójne znakowanie GFP i Foxp2 wykazało, że komórkom GFP-dodatnim brakowało immunoreaktywności Foxp2 w prążkowiu P9, co sugeruje utratę białka Foxp2 w komórkach prążkowia transdukowanych przez AAV-eGFP-Cre. Podsumowując, wyniki te wskazują na skuteczną delecję genetyczną przez stereotaktycznie mikrowstrzykiwane wirusy AAV-eGFP-Cre w określonych populacjach neuronów w mózgach noworodków myszy transgenicznych. Podsumowując, nasza technika stereotaktyczna zapewnia łatwą i prostą platformę do manipulacji genetycznej w mózgach noworodków myszy. Technika ta może być nie tylko wykorzystywana do usuwania genów w określonych regionach mózgu noworodków, ale może być również stosowana do wstrzykiwania leków farmakologicznych, znaczników neuronalnych, genetycznie zmodyfikowanych białek optogenetycznych i chemogenetycznych, wskaźników aktywności neuronalnej i innych odczynników do prążkowia mózgów noworodków myszy.

W pierwszej serii eksperymentów mikroiniekcyjnie podano 200 nL wirusów AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (AAV-eGFP-Cre, rozcieńczenie 1/10 w soli fizjologicznej Dulbecco), które wykazują ekspresję rekombinazy DNA Cre połączonej z GFP, do prążkowia myszy Ai14 w dniu P2. Myszy Ai14 wykazują ekspresję genu reporterowego tdTomato po Cre-pośrednim usunięciu kasety STOP flankowanej przez sekwencje loxP (floxed) (Rysunek 2F). Mózgi pobrano w dniu P14 w celu przep...

Opisujemy protokół chirurgii stereotaktycznej za pomocą domowego urządzenia do mikrowstrzykiwania odczynników do prążkowia mózgów noworodków myszy. Technika ta pozwala na manipulację genetyczną w komórkach neuronalnych określonych regionów mózgów noworodków myszy.

Chirurgia stereotaktyczna w manipulacji genetycznej w komórkach prążkowia mózgów noworodków myszy

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w rozwoju genetycznym i neurologicznym, na przykład podczas rozwoju poporodowego. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to prosta technika z domowym urządzeniem. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ wykonywanie ukierunkowanych zastrzyków do mózgu wymaga pełnej dbałości o szczegóły.Na początek zrób uchwyt, aby używać nowonarodzonych szczeniąt w aparacie stereotaktycznym. Najpierw przygotuj tacę na głowę. Odetnij około 1/5 dna 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej, aby zrobić otwór na głowę nowonarodzonego szczeniaka.Następnie wybierz puste pudełko z końcówkami do pipet, które pasuje do cokołu aparatu stereotaktycznego. Następnie użyj gorącego kleju, aby przymocować tackę na głowę do podstawy pudełka na końcówki. Następnie przyklej kasetę z tkankami do osadzania w pudełku, w której może podeprzeć tułów szczeniaka, gdy jego głowa jest zamocowana.Teraz przygotuj igły ze stali nierdzewnej o rozmiarze 30 mm do wstrzykiwania. Najpierw należy je wstępnie oczyścić, mocząc je w chloroformie przez trzy dni w szklanej fiolce. Trzy dni później ostrożnie wyjmij igły i umyj je absolutnym etanolem przez 20 minut i mieszaniem 50 obr./min.Następnie umyj je trzy razy w 70% etanolu przez 10 minut na pranie, również z mieszaniem. Po umyciu pozostaw igły do wyschnięcia na powietrzu i przechowuj je w czystym pudełku w temperaturze pokojowej do czasu użycia. Do montażu mikroiniekcji użyj pięciocentymetrowego odcinka rurki polietylenowej PE20, aby połączyć rurkę PE10 ze strzykawką o średnicy 10 mikrolitrów.Zabezpiecz połączenie cyjanoakrylanem. Następnie zamontuj nową igłę iniekcyjną o rozmiarze 30 na drugim końcu rurki PE10. Teraz załaduj strzykawkę do mikroiniekcji o pojemności 10 mikrolitrów.Zdejmij tłok i użyj kolejnej strzykawki o rozmiarze 25, aby ponownie załadować zespół autoklawowaną wodą destylowaną w celu usunięcia powietrza z rurki. Następnie umieścić tłok z powrotem w strzykawce mikrolitrowej i naciskać tłok, aż w cylindrze pozostaną tylko dwa mikrolitry wody destylowanej i nie mniej. Następnie ostrożnie zamontuj strzykawkę z mikrolitrami na pompie strzykawkowej z mikroprzepływem.Następnie odpipetować niewielkie ilości przefiltrowanego 0,1% barwnika Fast Green w eksperymentalnych płynach wirusowych na kawałek parafilmu. Następnie należy zassać niewielką ilość powietrza do strzykawki, aż między igłą do wstrzykiwań a rurką będzie widoczny pęcherzyk powietrza. Następnie załaduj 0,7 mikrolitra przefiltrowanego roztworu Fast Green, aby przetestować przepływ płynów w rurce do mikroiniekcji.Jeśli przepływ jest dobry, należy zassać kolejną niewielką objętość powietrza, aby wytworzyć drugi pęcherzyk powietrza, a następnie załadować roztwór do wstrzykiwań do rurki do mikroiniekcji. Przymocować i zabezpieczyć igłę do mikroiniekcji do aparatu stereotaktycznego i przystąpić do mikroiniekcji nowonarodzonych myszy. Przygotowując się do zabiegu, dokładnie przetrzyj instrument stereotaktyczny 70% etanolem i wysterylizuj narzędzia chirurgiczne 70% etanolem.Następnie znieczulij noworodka za pomocą hipotermii. Umieść szczeniaka w lateksowej rękawiczce i zanurz go w kruszonym lodzie po szyję na pięć minut. Następnie uszczypnij stopy szczeniaka kleszczami, aby upewnić się, że nie ma odruchu pedałowania.Następnie umieść szczeniaka z rękawicą w tacy na głowę i połóż trochę pokruszonego lodu wokół lateksowego rękawa, aby utrzymać znieczulenie hipotermiczne. Następnie wyszoruj głowę szczeniaka 70% etanolem i zlokalizuj punkt orientacyjny lambda. Zaznacz to markerem.Następnie skieruj końcówkę igły do lambdy i ustaw współrzędne przednie/tylne i przyśrodkowe/boczne na zero. Następnie, konsultując się z atlasem mózgu, przesuń ramię iniekcji do miejsca docelowego. Na przykład prążkowie szczeniąt P2 znajduje się 2,4 milimetra przed lambdą, 1,0 milimetra po każdej stronie linii środkowej i 1,7 milimetra brzusznej.Następnie zaznacz za pomocą pisaka położenie barwnika Fast Green na tubce PE10. Następnie powoli zacznij penetrować igłę przez skórę i czaszkę, aż końcówka igły zetknie się z powierzchnią czaszki. Ustaw współrzędną grzbietową/brzuszną na zero.Następnie powoli opuść igłę do miejsca docelowego. Po ustawieniu na miejscu odczekaj minutę, aby miąższ powrócił do normalnego kształtu. Następnie uruchom program mikroiniekcji z prędkością 100 nanolitrów na minutę.Podczas wstrzykiwania należy obserwować, jak barwnik Fast Green porusza się w rurkach PE. Bardzo ważne jest, aby powoli penetrować igłę przez skórę i czaszkę, aż końcówka igły zetknie się z powierzchnią czaszki. Podczas wstrzykiwania konieczne jest obserwowanie, jak barwnik Fast Green porusza się w rurkach PE.Po zakończeniu iniekcji należy odczekać minutę, a następnie powoli podnieść igłę do 1/2 głębokości penetracji DV. Następnie odczekaj kolejne 30 sekund, zanim przystąpisz do powolnego wyciągania igły z głowy szczeniaka. Po zakończeniu iniekcji ważne jest, aby odczekać minutę przed powolnym podniesieniem igły do 1/2 głębokości penetracji DV.Następnie odczekaj kolejne 30 sekund, zanim powoli wyjmiesz igłę z głowy szczeniaka. Po wstrzyknięciu wszystkich docelowych miejsc rozgrzej szczenię przez 20 minut w inkubatorze o temperaturze 33 stopni Celsjusza. Sprawdzaj szczenię co pięć minut, aż odzyska pozycję leżącą mostka.Następnie zwróć młode do matki. 200 nanolitrów wirusa, który wyraża rekombinazę DNA Cre połączoną z GFP, wstrzyknięto do prążkowia P2 myszy Ai14. Myszy te wykazywały ekspresję genu reporterowego tdTomato po delecji kasety zatrzymania z bokami loxP za pośrednictwem Cre.Mózgi pobrano w P14 w celu barwienia immunologicznego GFP i tdTomato. Wiele komórek GFP transdukowanych przez AAV było obecnych w całym prążkowiu, co wskazuje na rozległe zakażenie komórek prążkowia wirusami AAV EGFP Cre. Podobnie rozległą ekspresję tdTomato stwierdzono również w prążkowiu.Po badaniu mikroskopowym w dużym powiększeniu wyraźnie stwierdzono, że wszystkie komórki prążkowia GFP dodatnie wykazują współekspresję genu reporterowego tdTomato. Co więcej, sygnały tdTomato wykryto w przypuszczalnie zakończonych aksonach w gałki bladej, w istocie czarnej pars reticulata, docelowych obszarach neuronów projekcyjnych prążkowia i prążkowia. Łącznie wyniki te sugerują udaną rekombinację DNA za pośrednictwem Cre loxP indukowaną przez ekspresję aktywności Cre za pośrednictwem AAV w neuronach prążkowia noworodków.Po opanowaniu tę technikę można wykonać w ciągu 30 minut w celu obustronnego wstrzyknięcia prążkowia, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że jest to delikatna operacja mózgu u noworodka, która wymaga cierpliwości i ostrożności. Z tej procedury można wykonać inne metody, takie jak optogenetyka i chemogenetyka, w celu analizy dojrzewania podczas rozwoju poporodowego.

stereotaxic-surgery-for-genetic-manipulation-striatal-cells-neonatal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisano celowaną ablację konkretnych obszarów mózgu poprzez infuzję egzocytotoksyny z wykorzystaniem współrzędnych stereotaksycznych. Technikę tę można również zaadaptować do infuzji innych substancji chemicznych do mózgu szczura.

Chirurgia stereotaktyczna w celu wywołania uszkodzeń ekscytotoksycznych w określonych obszarach mózgu dorosłego szczura

Kontrola ekspansji somatycznych komórek macierzystych jest głównym czynnikiem utrudniającym ich badanie oraz zastosowanie w terapii. W niniejszym opracowaniu opisujemy system czasowej kontroli ekspansji neuronalnych komórek macierzystych podczas rozwoju oraz w wieku dorosłym, który może zostać wykorzystany do zwiększenia liczby neuronów generowanych w mózgu myszy.

Ekspansja embrionalnych i dorosłych komórek macierzystych układu nerwowego poprzez elektroporację in utero lub stereotaksycyjne wstrzyknięcie wirusowe

Źródło: Porlan, E., et al. Stabilna i wydajna modyfikacja genetyczna komórek u dorosłej myszy V-SVZ do analizy autonomicznych i nieautonomicznych efektów neuronalnych komórek macierzystych. J. Vis. Exp. (2016)Ten film pokazuje stabilną modyfikację genetyczną nerwowych komórek macierzystych (NSC) w strefie komorowo-podkomorowej (V-SVZ) poprzez stereotaktyczne wstrzyknięcie genu terapeutycznego przenoszącego wirusa w modelu mysim. Wirus wnika do NSC, ulega odwrotnej transkrypcji, integruje się z...

Stereotaktyczne wstrzykiwanie wirusów w celu stabilnej modyfikacji genetycznej w modelu mysim

Ten film opisuje skuteczną technikę wywoływania glejaków (GBM) za pomocą transpozonu DNA wstrzykiwanego do komór noworodków myszy. Komórki strefy podkomorowej, które pobierają plazmid, przekształcają się, namnażają i generują guzy o charakterystyce histopatologicznej ludzkiego GBM.

Indukcja glejaka za pomocą transpozycji za pośrednictwem SB: technika generowania nowego modelu myszy przy użyciu integracji plazmidu SB za pośrednictwem transpozonu z mózgiem noworodka myszy

Źródło: Chen, S., et al., Stereotaktyka chirurgiczna w komórkach prążkowia noworodków w mózgach myszy noworodków. J. Vis. Exp. (2018)Ten film pokazuje stereotaktyczne wstrzyknięcie wektora wirusowego kodującego rekombinazę Cre i białko zielonej fluorescencji lub GFP do prążkowia genetycznie zmodyfikowanego szczeniaka myszy w celu uzyskania manipulacji genami poprzez wycięcie kasety STOP po bokach loxP, aktywując białko czerwonej fluorescencji lub RFP jako reportera.

Stereotaktyczne mikrowstrzyknięcie wektora wirusowego do manipulacji genami u prążkowia szczeniąt myszy

Źródło: Fricano-Kugler, C. J., et al. Projektowanie, pakowanie i dostarczanie wysokomianowych CRISPR Retro i lentiwirusów poprzez iniekcję stereotaktyczną. J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa w celu precyzyjnej edycji genów neuronalnych w mózgu myszy. Protokół zapewnia dokładne dostarczanie wirusa do zakrętu zębatego, umożliwiając znakowanie fluorescencyjne i nokaut genów za pośrednictwem CRISPR w celu badania obwodów neuronalnych, funkcji genów i...

Stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa do celowanej edycji genów neuronalnych w mózgu myszy

Źródło: Gonzalez-Ramos, A., et al., Transplantation of Human Stem Cell-Derived GABAergic Neurons into the Early Postnatal Mouse Hippocampus to Mitigate Disorders. J. Vis. Exp. (2022)Ten film pokazuje stereotaktyczne wstrzyknięcie komórek prekursorowych interneuronów pochodzenia ludzkiego do hipokampa genetycznie zmodyfikowanego szczeniaka myszy ze zmniejszonymi interneuronami hamującymi, mające na celu przywrócenie równowagi pobudzająco-hamującej.

Przeszczep komórek prekursorowych interneuronów pochodzenia ludzkiego do hipokampa szczeniaka myszy

Tutaj opisujemy procedurę opartą na wykorzystaniu cząsteczek lentiwirusowych do długoterminowej modyfikacji genetycznej nerwowych komórek macierzystych i/lub ich sąsiadujących komórek wyściółkowych w dorosłej komorowo-podkomorowej niszy neurogennej, która pozwala na oddzielną analizę autonomicznych i nieautonomicznych, zależnych od niszy efektów na neuronalne komórki macierzyste.

Stabilna i wydajna modyfikacja genetyczna komórek dorosłej myszy V-SVZ do analizy autonomicznych i nieautonomicznych efektów neuronalnych komórek macierzystych

Przedstawiamy technikę lentiwirusową służącą do manipulacji genetycznej i wizualizacji pojedynczego aksonu neuronu sensorycznego węchu oraz jego arboryzacji terminalnej in vivo.

Lentiwirusowa manipulacja genetyczna i wizualizacja neuronów sensorycznych węchu in vivo

Chirurgia stereotaktyczna u gryzoni umożliwia celowane podawanie leków lub stymulację elektryczną i rejestrację sygnałów u czuwających zwierząt podczas wykonywania określonych zachowań. W niniejszej prezentacji wideo zademonstrujemy niedawne udoskonalenia tej ugruntowanej procedury, które skutecznie zwiększyły przeżywalność i zmniejszyły utratę masy ciała po operacji.

Chirurgia stereotaktyczna gryzoni i poprawa dobrostanu zwierząt w neuronauce behawioralnej

Poznaj chirurgię stereotaktyczną do mikroiniekcji w prążkowie mózgów noworodków myszy. Ta metoda umożliwia precyzyjną manipulację genetyczną komórek neuronalnych podczas kluczowych etapów rozwoju postnatalnego.

Chirurgia stereotaktyczna w manipulacji genetycznej w komórkach prążkowia mózgów noworodków myszy

Przeglądaj więcej filmów