Izolowanie limfocytów od układu odpornościowego myszy w jelicie cienkim

Ogólnym celem tego protokołu jest wyizolowanie limfocytów z jelitowych miejsc indukcyjnych, w tym plastrów Peyera i węzłów chłonnych krezkowych oraz miejsc efektorowych, w tym blaszki właściwej i nabłonka. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii błony śluzowej, takie jak zrozumienie odpowiedzi immunologicznej na infekcje żołądkowo-jelitowe, nowotwory i choroby zapalne. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia izolację wysoce oczyszczonych i żywotnych limfocytów z różnych przedziałów jelita cienkiego przy minimalnym zanieczyszczeniu międzyprzedziałowym.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ trudno jest zidentyfikować i wyizolować węzły chłonne krezki i łaty Peyera oraz zrównoważyć szybkość i precyzję w celu uzyskania optymalnych plonów. Aby rozpocząć protokół, połóż wcześniej znieczuloną mysz na jej grzbiecie i spryskaj ją 70% etanolem. Użyj nożyczek, aby wykonać nacięcie w linii środkowej i otworzyć skórę i ścianę brzucha, aby odsłonić jamę otrzewnej.

Następnie zlokalizuj jelito ślepe i użyj kleszczy, aby delikatnie pociągnąć jelito ślepe w dół. Użyj kleszczy, aby ostrożnie przesunąć jelito cienkie w prawo, odsłaniając całe węzły chłonne krezkowe lub łańcuch MLN, który jest wyrównany z okrężnicą. Zidentyfikuj dolny węzeł w łańcuchu znajdujący się najbliżej jelita ślepego.

Użyj jednego zestawu kleszczy, aby chwycić tłuszcz krezkowy wokół niego i delikatnie przesuń łańcuch MLN od dołu do góry, nacierając tłuszcz wokół węzła chłonnego innym zestawem kleszczy. Następnie zwilż ręcznik podłożem żniwnym i połóż łańcuch MLN na ręczniku papierowym. Usuń tłuszcz krezkowy, zwijając łańcuch na ręczniku papierowym i ściągając tłuszcz za pomocą dwóch zestawów kleszczy.

Umieść MLN w zimnym podłożu do zbioru w celu późniejszego etapu izolacji. Nożyczkami przetnij jelito cienkie poniżej zwieracza odźwiernika i powyżej jelita ślepego. Powoli wyciągnij jelito od jelita krętego do dwunastnicy za pomocą jednego zestawu kleszczy, jednocześnie usuwając przyczepiony tłuszcz krezkowy za pomocą innego zestawu kleszczy.

Umieść jelito na ręczniku papierowym zwilżonym pożywką do zbioru i zetrzyj pozostały tłuszcz krezki za pomocą dwóch zestawów kleszczy. Utrzymuj jelito nawilżone na wszystkich tych etapach, okresowo stosując pożywkę do zbiorów. Zbierz plastry Peyera, usuwając je z jelita zakrzywionymi nożyczkami.

Zbierz 5-11 plastrów Peyera z jelita cienkiego. Umieść plastry Peyera w zimnym podłożu do zbiorów, aby uzyskać późniejsze etapy izolacji. Użyj płaskiej strony kleszczy i delikatnie przesuń się od dwunastnicy w kierunku jelita krętego, aby usunąć zawartość kału i śluz.

Powtórz ten krok raz, aby usunąć większość śluzu. Użyj cienkich nożyczek z końcem w jednym punkcie, włóż koniec do jelita i rozetnij jelito podłużnie od dwunastnicy do jelita krętego. Bocznie przetnij otwarte jelito na dwie centymetrowe kawałki.

Umieść kawałki jelita w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów z 25 mililitrami zimnego podłoża do zbioru w celu późniejszego etapu izolacji. Wyizoluj limfocyty od MLN, delikatnie dysocjując je przez sitko do komórek o średnicy 70 mikrometrów za pomocą tłoka trzymililitrowej strzykawki. Umyj sitko komórkowe pięcioma mililitrami zimnego podłoża do zbiorów.

Granuluj komórki MLN, odwirowując je pod 400-krotnością grawitacji przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie ponownie zawieś granulki komórkowe w jednym mililitrowym podłożu do zbioru na zimno. Umyj kawałki jelita cienkiego trzykrotnie 25 mililitrami zimnego podłoża do zbiorów, odwracając probówkę 10 razy.

Pozwól, aby kawałki jelita opadły i wylej supernatant. Następnie dodać 20 mililitrów wstępnie podgrzanego roztworu ditioerytrytolu lub DTE do 50-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej kawałki jelita i przenieść zawartość do 50-mililitrowej silikonowanej kolby Erlenmeyera z mieszadłem. Użyj dużego magnesu na zewnątrz kolby, aby przytrzymać mieszadło i przenieś tkankę i roztwór z powrotem do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów.

Następnie wiruj rurkę na maksymalnym ustawieniu przez 10 sekund. Przenieś supernatant do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów przez sitko do komórek o średnicy 70 mikrometrów, uważając, aby zachować kawałki tkanki w oryginalnej probówce. Ułóż komórki w peleryncie.

Ponownie zawiesić granulki komórkowe w 10 mililitrach zimnego podłoża do zbioru i przechowywać na lodzie. Dodać 20 mililitrów wstępnie podgrzanego roztworu DTE do 50-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej kawałki jelita i przenieść z powrotem do 50-mililitrowej silikonowanej kolby Erlenmeyera zawierającej mieszadło. Użyj dużego magnesu na zewnątrz kolby, aby przytrzymać mieszadło i przenieś tkankę i roztwór z powrotem do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów.

Obracaj rurkę na maksymalnym ustawieniu przez 10 sekund. Przenieść supernatant przez sitko o średnicy 70 mikrometrów do probówki zawierającej komórki z supernatantu z pierwszego zabiegu DTE i odwirować komórki. Ponownie zawiesić osad komórkowy w ośmiu mililitrach roztworu o gradinie gęstości 44% lub DG w temperaturze pokojowej.

Przenieś ośmiomililitrowy roztwór 44%DG i zawiesinę komórek do 17-milimetrowej na 100-milimetrową rurkę z okrągłym dnem z polipropylenu o wymiarach 17 milimetrów na 100 milimetrów. Umieść ogniwa w pięciu mililitrach roztworu RT 67%DG. Wirować przy 1 600-krotności grawitacji przez 25 minut przy suchej temperaturze bez użycia hamulca.

Żywe komórki tworzą kożuchową sierść na granicy faz 44% i 67%. Usuń warstwę tłuszczu na wierzchu przez aspirację próżniową. Użyj pipety Pasteura, aby zebrać kożuchową powłokę na granicy faz i przenieś do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów zawierającej 40 mililitrów zimnego podłoża do zbioru.

Komórki peletowe przez wirowanie przy 400-krotności grawitacji przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i ponowne zawieś granulki komórkowe w jednym mililitrowym podłożu do zbioru na zimno. Usuń komórki nabłonkowe z kawałków tkanki jelitowej, dodając 25 mililitrów wstępnie podgrzanego roztworu EDTA do pozostałych fragmentów jelita i przenieś zawartość do 50-mililitrowej silikonowanej kolby Erlenmeyera za pomocą mieszadła i wymieszaj. Trzymać mieszadło i ostrożnie wyrzucić supernatant, pozostawiając kawałki jelita w kolbie.

Powtórz krok usuwania komórek nabłonka jeszcze raz. Następnie dodaj 50 mililitrów pożywki do zbioru o temperaturze pokojowej i krótko wymieszaj zawartość za pomocą magnesu. Następnie pozwól kawałkom jelita osiąść i ostrożnie wyrzuć supernatant.

Dodaj 30 mililitrów podgrzanego roztworu kolagenazy i wymieszaj kawałki jelita. Po wymieszaniu przenieś strawioną tkankę i supernatant do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów przez sitko o średnicy 70 mikrometrów. Delikatnie odciąć pozostałe kawałki tkanki, używając tłoka trzymililitrowej strzykawki, aby przebić się przez filtr.

Umyj filtr 10 mililitrami zimnego podłoża do zbioru i rozpyl ogniwa. Po odwirowaniu ponownie zawieś osad ogniwa w ośmiu mililitrach roztworu 44%DG o temperaturze otoczenia. Przenieś osiem mililitrów zawiesiny komórek roztworu 44% DG do świeżej rurki z okrągłym dnem z polipropylenu o wymiarach 70 milimetrów na 100 milimetrów.

Podkład z pięcioma mililitrami roztworu o temperaturze otoczenia 67% DG, a następnie odwirować gradienty. Usuń warstwę tłuszczu na wierzchu przez aspirację próżniową. Użyj pipety Pasteura, aby zebrać kożuchową powłokę na granicy faz i przenieś do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów zawierającej 40 mililitrów zimnego podłoża do zbioru.

Na koniec ponownie zawieś granulat komórkowy w jednym mililitrze zimnego podłoża do zbioru. Każdy jelitowy przedział immunologiczny charakteryzuje się unikalną kompozycją podzbiorów limfocytów. MLN składa się głównie z limfocytów T alfa beta, podczas gdy limfocyty PP to głównie limfocyty B.

Skład limfocytów LP składa się głównie z limfocytów T alfa beta i limfocytów B. IEL to głównie limfocyty T gamma delta i limfocyty T alfa beta bez limfocytów B. Limfocyty T alfa beta CD8 alfa dodatnie w przedziałach LP i IEL wyrażały homodimer alfa CD8 lub heterodimer alfa beta CD8, podczas gdy komórki T CD8 alfa dodatnie alfa beta w miejscu indukcyjnym wyrażały głównie heterodimer CD8 alfa beta.

Większość limfocytów T gamma delta w przedziale IEL wykazywała ekspresję CD8 alfa, podczas gdy limfocyty T gamma delta znalezione w MLN nie mają CD8 alfa. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o poświęceniu wystarczającej ilości czasu i ostrożności podczas etapów izolacji tkanek, aby ograniczyć zanieczyszczenie między przedziałami jelitowymi. Po tej procedurze izolowane limfocyty można poddać stymulacji ex vivo, cytometrii przepływowej i innym technikom w celu dalszej analizy fenotypowej i funkcjonalnej.