Name: Izolacja i hodowla in vitro mysich i ludzkich makrofagów pęcherzykowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Poznaj metody izolacji i hodowli makrofagów pęcherzykowych z płuc myszy i ludzi. Technika ta umożliwia uzyskanie wysoce oczyszczonej populacji komórek do badań w dziedzinie immunologii płucnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Clare Prendergast za pomoc w redagowaniu manuskryptu. DKN jest wspierany przez grant badawczy (#2095) z Flinn Foundation, a TM jest wspierany przez granty z National Institutes of Health (R01HL056643 i R01HL092514). DKN opracował metody, zaprojektował badanie i napisał manuskrypt; OM pomagał w badaniach na zwierzętach i pobieraniu próbek klinicznych; SB wspomagany analizą cytometryczną przepływową i sortowaniem komórek; TM nadzorował badania i recenzował manuskrypt.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) oraz Institutional Review Board (IRB) w St Joseph's Hospital and Medical Center.
1. Izolacja AMs z mysiego płynu do płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL)
<ol>
	<li>Znieczulij ośmiotygodniową mysz C57BL/6 koktajlem ketaminy (87,5 mg/kg masy ciała) i ksylazyny (12,5 mg/kg masy ciała) poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe. Kontynuuj, gdy mysz osiągnie znieczulenie chirurgiczne z utratą odruchów i rozluźnieniem mięśni.</li>
	<li>Umieść mysz na powierzchni preparacyjnej stroną brzuszną skierowaną do góry. Nałóż maść okulistyczną weterynaryjną na oczy, aby zapobiec odwodnieniu i przetrzyj całą powierzchnię brzuszną myszy sterylnymi wacikami nasączonymi alkoholem nasączonym 70% izopropanolem w celu dezynfekcji.</li>
	<li>Zamontuj mysz tak, aby wszystkie cztery nogi były unieruchomione.</li>
	<li>Delikatnie otwórz jamę brzuszną za pomocą narzędzi do mikropreparacji. Należy zachować ostrożność, aby otworzyć jak największą powierzchnię, nie uszkadzając żadnych narządów trzewnych ani nie tworząc zwisającej tkanki.</li>
	<li>Delikatnie otwórz klatkę piersiową, powoli nacinając klatkę piersiową przez śródpiersie. Idealnie byłoby, gdyby klatkę piersiową można było wyciąć z boku na bok. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić opłucnej płuc podczas otwierania klatki piersiowej.</li>
	<li>Zlokalizuj żyłę główną dolną i wykonaj nacięcie, aby wykrwawić mysz. Użyj chłonnych wacików, aby wchłonąć krew.</li>
	<li>Wstrzyknąć 10 ml lodowatej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do prawej komory (za pomocą strzykawki 10 ml i igły 25G) w celu przepłukania krążących krwinek. Absorbuj przepływ krwi za pomocą chłonnych wacików. Po całkowitym perfuzji płuca będą wyglądały na zbledłe, a następnie będą gotowe do płukania.</li>
	<li>Delikatnie rozetnij skórę i mięśnie szyi, aby odsłonić drogi oddechowe. Ostrożnie wytnij sąsiednie mięśnie, chrząstki i tkankę tłuszczową, nie uszkadzając tchawicy.</li>
	<li>Wykonaj małe nacięcie (<2 mm) na tchawicy za krtanią. To nacięcie powinno wystarczyć do wprowadzenia cewnika, gdy tchawica jest nadal przymocowana do krtani. Wprowadzić 1-calowy cewnik 22G bez igły do tchawicy w kierunku płuc. Zabezpiecz cewnik jedwabnym plecionym szwem (4-0; niewchłanialny) z kwadratowym węzłem. 
	UWAGA: Cewnik należy przyciąć w zależności od rozmiaru myszy. Bardzo krótkie lub długie cewniki mają tendencję do przeciekania i/lub rozrywania dróg oddechowych podczas płukania. Długość cewnika powinna być taka, aby po całkowitym włożeniu końcówka pozostawała dobrze w tchawicy i nie sięgała do oskrzeli pierwotnych.</li>
	<li>Podłącz strzykawkę o pojemności 1 ml wypełnioną lodowatym buforem BAL (Ca2+ i Mg2+ wolny PBS + 1 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy, EDTA) do cewnika i powoli wkraplaj bufor do płuc. To napompuje płuca. Trzymaj strzykawkę podłączoną do cewnika przez pięć sekund, a następnie odessaj płyn z płukania, delikatnie pociągając za tłok. Spowoduje to opróżnienie płuc. Zbierz płyn do stożkowej probówki o pojemności 15 ml umieszczonej na lodzie.</li>
	<li>Powtórz krok 1.10 jeszcze dziewięć razy i zgromadź płyn z płukania. Nie należy przekraczać 1 ml buforu na płukanie, ponieważ może to spowodować przekroczenie pojemności płuc i doprowadzić do ich pęknięcia.</li>
	<li>Eutanazja myszy z powodu przedawkowania CO2 zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez IACUC.</li>
	<li>Odwirować 10 ml płynu BAL o stężeniu 250 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Osad komórkowy zawiera komórki BAL. 
	ostrożność: Osad może być bardzo mały, dlatego należy zachować ostrożność podczas zasysania supernatantu.</li>
	<li>Zawiesić komórki BAL w 100 μl buforu przepływowego/sortującego (PBS + 2% inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca (FBS) + 1 mM EDTA + 25 mM kwas N-2-hydroksyetylopiperazyno-N'-2-etanosulfonowy (HEPES)).</li>
	<li>Zablokuj niespecyficzne przeciwciało wiążące się z receptorem Fc, dodając mysi blok Fc (klon 2,4G2, 10 μg/ml) i inkubując przez 20 minut na lodzie.</li>
	<li>Wykonaj barwienie przeciwciałami wraz z fluorescencją minus jeden (FMO) i kontrolami pojedynczego barwienia11,25. Oceń komórki BAL za pomocą analizatora komórek (patrz Tabela materiałów), a następnie analiza cytometrii przepływowej pojedynczych komórek za pomocą odpowiedniego oprogramowania analitycznego (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Wyizolować AM za pomocą aktywowanego fluorescencją sortera komórek (patrz tabela materiałów) bezpośrednio do 1 ml mysiej pożywki hodowlanej AM, gdy AM są przeznaczone do hodowli in vitro lub transferu komórek in vivo. Alternatywnie, posortuj AM do 1 ml buforu do lizy (patrz tabela materiałów) uzupełnionego 10 μl/ml β-merkaptoetanolu do ekstrakcji RNA.</li>
</ol>
2. Izolacja AM z płuca myszy, zawiesina jednokomórkowa
<ol>
	<li>Znieczulij ośmiotygodniową mysz C57BL/6 koktajlem ketaminy (87,5 mg/kg masy ciała) i ksylazyny (12,5 mg/kg masy ciała) poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe. Kontynuuj, gdy mysz osiągnie znieczulenie chirurgiczne z utratą odruchów i rozluźnieniem mięśni.</li>
	<li>Umieść mysz na powierzchni preparacyjnej stroną brzuszną skierowaną do góry. Nałóż maść okulistyczną weterynaryjną na oczy, aby zapobiec odwodnieniu i przetrzyj całą powierzchnię brzuszną myszy sterylnymi wacikami nasączonymi alkoholem nasączonymi 70% izopropanolem w celu dezynfekcji.</li>
	<li>Zamontuj mysz tak, aby wszystkie cztery nogi były unieruchomione.</li>
	<li>Delikatnie otwórz jamę brzuszną za pomocą narzędzi do mikropreparacji. Należy zachować ostrożność, aby otworzyć jak największą powierzchnię, nie uszkadzając żadnych narządów trzewnych ani nie tworząc zwisającej tkanki.</li>
	<li>Delikatnie otwórz klatkę piersiową, powoli nacinając klatkę piersiową przez śródpiersie. Idealnie byłoby, gdyby klatkę piersiową można było wyciąć z boku na bok. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić opłucnej płuc podczas otwierania klatki piersiowej.</li>
	<li>Zlokalizuj żyłę główną dolną i wykonaj nacięcie, aby wykrwawić mysz. Użyj chłonnych wacików, aby wchłonąć krew.</li>
	<li>Wstrzyknąć 10 ml lodowatego PBS do prawej komory (za pomocą strzykawki 10 ml i igły 25G) w celu przepłukania krążących krwinek. Po całkowitym perfuzji płuca będą wyglądały na zblanszowane i będą gotowe do zbioru.</li>
	<li>Wypreparuj płuca, przecinając tchawicę, naczynia krwionośne i więzadła do stożkowej rurki o pojemności 15 ml z 5 ml zimnego zmodyfikowanego podłoża Dulbecco Eagle's (DMEM). Utrzymuj go na lodzie do następnego kroku.</li>
	<li>Eutanazja myszy z powodu przedawkowania CO2 zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez IACUC.</li>
	<li>Przenieść perfundowane płuca do sterylnego i wolnego od pirogenów naczynia hodowlanego o średnicy 60 mm z 3 ml DMEM. Za pomocą kleszczy preparacyjnych usuń drogi oddechowe i inny twardy materiał tkankowy inny niż płucny, jeśli jest obecny. Tkankę płucną zmielić skalpelem do wielkości <1 mm.</li>
	<li>Dodać 300 μg/ml Liberazy TL i 5 U/ml DNazy I, wymieszać pipetując i inkubować w temperaturze 37°C w inkubatorze przez 25 minut. Delikatnie wymieszać raz, pipetując po 10 minutach.</li>
	<li>Przepuść zdysocjowane płuca przez sitko o wielkości 100 μm zainstalowane na stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Użyj tylnej części tłoka ze strzykawki o pojemności 1 ml, aby rozgnieść grudki komórek na filtrze. Umyj filtr 20 ml buforem płuczącym (PBS + 2% inaktywowany termicznie FBS + 2 mM EDTA).</li>
	<li>Wirować przy 500 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odrzucić sklarowany osad i ponownie zawiesić osad komórek w 20 ml buforu do przemywania wody.</li>
	<li>Powtórz kroki 2.12 i 2.13 dwukrotnie, za każdym razem zmieniając filtr i rurkę. Wstępne namoczenie filtra w buforze płuczącym przez ponad pięć minut zwiększa wydajność AM. Przygotować zawiesinę jednokomórkową, dodając 100 μl buforu przepływowego/sortującego do osadu komórkowego.</li>
	<li>Zablokuj niespecyficzne przeciwciało wiążące się z receptorem Fc, dodając mysi blok Fc (klon 2,4G2, 10 μg/ml) i inkubując przez 20 minut na lodzie.</li>
	<li>Wykonaj barwienie przeciwciał wraz z FMO i kontrolami pojedynczego barwienia11,25. Oceń komórki płuc za pomocą analizatora komórkowego (patrz tabela materiałów), a następnie przeprowadź analizę cytometrii przepływowej pojedynczych komórek za pomocą oprogramowania analitycznego.</li>
	<li>Sortować AM za pomocą sortera komórek (patrz Tabela materiałów) bezpośrednio do 1 ml mysiej pożywki hodowlanej AM, gdy AM są przeznaczone do hodowli in vitro lub transferu komórek in vivo. Alternatywnie, posortuj AM do 1 ml buforu do lizy uzupełnionego 10 μl/ml β-merkaptoetanolu w celu ekstrakcji RNA.</li>
</ol>
3. Izolacja AM od ludzkiego płynu BAL
<ol>
	<li>Zorganizować transfer ludzkiego płynu BAL z kliniki do laboratorium w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odwirować płyn BAL (10 - 50 ml) przy 250 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Osad komórkowy zawiera komórki BAL11.</li>
	<li>Przepłukać osad 20 ml buforem do przemywania (PBS + 2% inaktywowany termicznie FBS + 2 mM EDTA) i odwirować przy 250 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Ponowne zawieszenie komórek BAL znajduje się w 100 μl buforu przepływowego/sortującego (PBS + 2% Heat inactivated FBS + 1 mM EDTA + 25 mM HEPES).</li>
	<li>Zablokuj nieswoiste przeciwciało wiążące się z receptorem Fc, dodając ludzki blok Fc (klon Fc1.3070, 25 μg/ml) i inkubując przez 20 minut na lodzie.</li>
	<li>Wykonaj barwienie przeciwciałami wraz z FMO i kontrolą pojedynczego barwienia11,24. Oceń komórki BAL za pomocą analizatora komórek (patrz tabela materiałów), a następnie przeprowadź analizę cytometrii przepływowej pojedynczej komórki za pomocą oprogramowania analitycznego.</li>
	<li>Sortować AM za pomocą sortera komórkowego (patrz tabela materiałów) bezpośrednio do 1 ml ludzkiej pożywki hodowlanej AM lub 1 ml buforu do lizy uzupełnionego 10 μl/ml β-merkaptoetanolu.</li>
</ol>
4. Hodowla in vitro AM
<ol>
	<li>Po posortowaniu komórek zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 250 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Zawiesić ludzkie AM w 1 ml ludzkiej pożywki hodowlanej AM [pożywka Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 uzupełniona 10% FBS, 20% supernatantem hodowli L-929 (jako źródło czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF), 100 U/ml stężenie końcowe), 1 mM pirogronianu sodu, 10 mM kwasu N-2-hydroksyetylopiperazyno-N'-2-etanosulfonowego (HEPES) i 1x penicylina/streptomycyna (opcjonalnie)]. Podobnie, ponownie zawieś mysie AM w 1 ml mysiej pożywki hodowlanej AM [DMEM uzupełniony 10% FBS, 20% supernatantem hodowli L-929 (jako źródło M-CSF, 100 U/ml stężenia końcowego), 1 mM pirogronianu sodu, 10 mM HEPES i 1x penicylina/streptomycyna (opcjonalnie)].</li>
	<li>Zliczyć komórki żywotne z wyłączeniem błękitu trypanowego za pomocą licznika komórek i dostosować stężenie komórek żywotnych na poziomie 1 x 106/ml. 
	UWAGA: Idealnie, z płynu BAL pobranego od 8-10 tygodniowego samca myszy C57BL/6 można wyizolować do 5 x 105 AMs. Wydajność AM z trawienia płuc myszy jest zmienna i może być nieco mniejsza niż w przypadku płynu BAL myszy. Wydajność AM z ludzkiego płynu BAL zależy od objętości płynu BAL, całkowitej objętości soli fizjologicznej użytej w płukaniu i stanu klinicznego pacjenta.</li>
	<li>W zależności od plonu i konieczności doświadczalnej wysiewaj komórki w szkiełkach komorowych, szalkach hodowlanych lub kolbach hodowlanych. Najlepiej wysiać AMs w proporcjach 1 x 105/ml z 10 ml pożywki w kolbie do hodowli tkankowych T25.</li>
	<li>Inkubować komórki w inkubatorze nawilżanym o temperaturze 37 °C z 5% atmosferąCO2. 
	UWAGA: AM będą rosły jako komórki przylegające i rosną bardzo wolno (czas podwojenia >7 dni).</li>
	<li>Po 24 godzinach od wysiewu AM powinny przylegać i nie zostaną oderwane przez delikatną zmianę pożywki hodowlanej. Usunąć pożywkę przez aspirację z jednego końca i uzupełnić świeżą pożywką podgrzaną do temperatury 37 °C. 
	UWAGA: Komórki mogą być teraz wykorzystywane do oceny fizjologii AM lub wpływu bodźców. Preparaty AM hodowane na szkiełkach komórkowych mogą być wygodnie barwione odpowiednimi przeciwciałami i idealnie nadają się do wizualizacji mikroskopowej. W celu oceny cytometrii przepływowej AM zbiera się przez inkubację z nieenzymatycznym roztworem dysocjującym komórki.</li>
	<li>Odessać pożywkę hodowlaną i dodać roztwór dysocjujący w ilości wystarczającej do pokrycia powierzchni hodowli (około 2 ml na kolbę T25) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5-10 minut. Nie będzie konieczne skrobanie i nie zaleca się mechanicznego skrobania komórek. Delikatnie postukaj w boki, dodaj 1-2 ml buforu przepływowego/sortującego i delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby odłączyć większość przylegających komórek.</li>
	<li>W przypadku badań RNA należy poddać komórki lizie bezpośrednio na szalce hodowlanej, dodając bufor do lizy.</li>
</ol>

<ol><li>Westphalen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sessile+alveolar+macrophages+communicate+with+alveolar+epithelium+to+modulate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sessile alveolar macrophages communicate with alveolar epithelium to modulate immunity.</a> Nature. 506 (7489), 503-506 (2014).</li>
<li>Guilliams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+develop+from+fetal+monocytes+that+differentiate+into+long-lived+cells+in+the+first+week+of+life+via+GM-CSF%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF.</a> J Exp Med. 210 (10), 1977-1992 (2013).</li>
<li>Cardani, A., Boulton, A., Kim, T. S., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+prevent+lethal+influenza+pneumonia+by+inhibiting+infection+of+type-1+alveolar+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages prevent lethal influenza pneumonia by inhibiting infection of type-1 alveolar epithelial cells.</a> PLoS Pathog. 13 (1), e1006140(2017).</li>
<li>Ghoneim, H. E., Thomas, P. G., McCullers, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+alveolar+macrophages+during+influenza+infection+facilitates+bacterial+superinfections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Depletion of alveolar macrophages during influenza infection facilitates bacterial superinfections.</a> J Immunol. 191 (3), 1250-1259 (2013).</li>
<li>MacLean, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequestration+of+inhaled+particulate+antigens+by+lung+phagocytes.+A+mechanism+for+the+effective+inhibition+of+pulmonary+cell-mediated+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Sequestration of inhaled particulate antigens by lung phagocytes. A mechanism for the effective inhibition of pulmonary cell-mediated immunity.</a> Am J Pathol. 148 (2), 657-666 (1996).</li>
<li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+alveolar+macrophages+by+clodronate-liposomes+aggravates+ischemia-reperfusion+injury+of+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22J+Heart+Lung+Transplant%22%5BJournal%5D)">Depletion of alveolar macrophages by clodronate-liposomes aggravates ischemia-reperfusion injury of the lung.</a> J Heart Lung Transplant. 24 (1), 38-45 (2005).</li>
<li>Schneider, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+are+essential+for+protection+from+respiratory+failure+and+associated+morbidity+following+influenza+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages are essential for protection from respiratory failure and associated morbidity following influenza virus infection.</a> PLoS Pathog. 10 (4), e1004053(2014).</li>
<li>Pribul, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+are+a+major+determinant+of+early+responses+to+viral+lung+infection+but+do+not+influence+subsequent+disease+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages are a major determinant of early responses to viral lung infection but do not influence subsequent disease development.</a> J Virol. 82 (9), 4441-4448 (2008).</li>
<li>Macdonald, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+alveolar+macrophages+for+sustained+mucosal+T-cell+recall+confers+long-term+protection+to+mice+against+lethal+influenza+challenge+without+clinical+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Harnessing alveolar macrophages for sustained mucosal T-cell recall confers long-term protection to mice against lethal influenza challenge without clinical disease.</a> Mucosal Immunol. 7 (1), 89-100 (2014).</li>
<li>Benoit, A., Huang, Y., Proctor, J., Rowden, G., Anderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+alveolar+macrophage+depletion+on+liposomal+vaccine+protection+against+respiratory+syncytial+virus+%28RSV%29%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Effects of alveolar macrophage depletion on liposomal vaccine protection against respiratory syncytial virus (RSV).</a> Clin Exp Immunol. 145 (1), 147-154 (2006).</li>
<li>Nayak, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+persistence+of+donor+alveolar+macrophages+in+human+lung+transplant+recipients+that+influences+donor+specific+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Long-term persistence of donor alveolar macrophages in human lung transplant recipients that influences donor specific immune responses.</a> Am J Transplant. 16 (8), 2300-2311 (2016).</li>
<li>Sekine, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+passenger+leukocytes+in+allograft+rejection%3A+effect+of+depletion+of+donor+alveolar+macrophages+on+the+local+production+of+TNF-alpha%2C+T+helper+1%2FT+helper+2+cytokines%2C+IgG+subclasses%2C+and+pathology+in+a+rat+model+of+lung+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Role of passenger leukocytes in allograft rejection: effect of depletion of donor alveolar macrophages on the local production of TNF-alpha, T helper 1/T helper 2 cytokines, IgG subclasses, and pathology in a rat model of lung transplantation.</a> J Immunol. 159 (8), 4084-4093 (1997).</li>
<li>Borie, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+alveolar+proteinosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+Rev%22%5BJournal%5D)">Pulmonary alveolar proteinosis.</a> Eur Respir Rev. 20 (120), 98-107 (2011).</li>
<li>Greenhill, S. R., Kotton, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+alveolar+proteinosis%3A+a+bench-to-bedside+story+of+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Pulmonary alveolar proteinosis: a bench-to-bedside story of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor dysfunction.</a> Chest. 136 (2), 571-577 (2009).</li>
<li>Happle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+transplantation+of+macrophage+progenitors+as+effective+and+long-lasting+therapy+for+hereditary+pulmonary+alveolar+proteinosis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis.</a> Sci Transl Med. 6 (250), 250ra113(2014).</li>
<li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+macrophage+transplantation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pulmonary macrophage transplantation therapy.</a> Nature. 514 (7523), 450-454 (2014).</li>
<li>Hashimoto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+macrophages+self-maintain+locally+throughout+adult+life+with+minimal+contribution+from+circulating+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident macrophages self-maintain locally throughout adult life with minimal contribution from circulating monocytes.</a> Immunity. 38 (4), 792-804 (2013).</li>
<li>Murphy, J., Summer, R., Wilson, A. A., Kotton, D. N., Fine, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prolonged+life-span+of+alveolar+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The prolonged life-span of alveolar macrophages.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (4), 380-385 (2008).</li>
<li>Maus, U. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resident+alveolar+macrophages+are+replaced+by+recruited+monocytes+in+response+to+endotoxin-induced+lung+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Resident alveolar macrophages are replaced by recruited monocytes in response to endotoxin-induced lung inflammation.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 35 (2), 227-235 (2006).</li>
<li>Perdiguero, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+macrophages+originate+from+yolk-sac-derived+erythro-myeloid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors.</a> Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).</li>
<li>Bitterman, P. B., Saltzman, L. E., Adelberg, S., Ferrans, V. J., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophage+replication.+One+mechanism+for+the+expansion+of+the+mononuclear+phagocyte+population+in+the+chronically+inflamed+lung%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophage replication. One mechanism for the expansion of the mononuclear phagocyte population in the chronically inflamed lung.</a> J Clin Invest. 74 (2), 460-469 (1984).</li>
<li>Misharin, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte-derived+alveolar+macrophages+drive+lung+fibrosis+and+persist+in+the+lung+over+the+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span.</a> J Exp Med. , (2017).</li>
<li>Zheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+pulmonary+intravascular+nonclassical+monocytes+recruit+recipient+neutrophils+and+mediate+primary+lung+allograft+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Donor pulmonary intravascular nonclassical monocytes recruit recipient neutrophils and mediate primary lung allograft dysfunction.</a> Sci Transl Med. 9 (394), (2017).</li>
<li>Nayak, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zbtb7a+induction+in+alveolar+macrophages+is+implicated+in+anti-HLA-mediated+lung+allograft+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Zbtb7a induction in alveolar macrophages is implicated in anti-HLA-mediated lung allograft rejection.</a> Sci Transl Med. 9 (398), (2017).</li>
<li>Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+macrophages+and+dendritic+cell+subsets+in+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 49 (4), 503-510 (2013).</li>
<li>Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+function+of+lung-resident+macrophages+and+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells.</a> Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).</li>
<li>Eguiluz-Gracia, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+persistence+of+human+donor+alveolar+macrophages+in+lung+transplant+recipients%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Long-term persistence of human donor alveolar macrophages in lung transplant recipients.</a> Thorax. 71 (11), 1006-1011 (2016).</li>
<li>Yu, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+myeloid+cells+in+human+blood%2C+bronchoalveolar+lavage%2C+and+lung+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

AM to długowieczne makrofagi rezydujące w płucach, które zasiedlają płuca począwszy od urodzenia i utrzymują się przez całe życie26. Ich rola w fizjologii płuc7 i patologii12 oraz ich potencjał do przewidywania autoimmunizacji płuc24 zostały rozpoznane. Ponieważ AM są długotrwałe obecne w płucach11,27 i ponieważ biorą udział w aktywacji i progresji odpowiedzi immunolog...

Mikrośrodowisko płuc to wyjątkowo złożony ekosystem z rozbudowanym kanałem powietrznym i układem naczyniowym. Wdychane powietrze przemieszcza się przez tchawicę oraz przez liczne odgałęzienia oskrzeli i oskrzelików, zanim dotrze do pęcherzyków płucnych, gdzie zachodzi wymiana gazowa krew-powietrze. Ze względu na bezpośrednią interakcję z atmosferą, powierzchnia dróg oddechowych wymaga ochrony przed potencjalnie szkodliwym działaniem unoszących się w powietrzu cząstek i zanieczyszczeń. Płuca chronią szereg barier fizycznych, chemicznych i immunologicznych. Warto zauważyć, że rozmieszczenie fagocytów na powierzchni dróg oddechowych służy ważnemu systemowi obrony pierwszej linii. Makrofagi pęcherzykowe (AM) są jednym z rodzajów fagocytów rezydujących w płucach i stanowią zdecydowaną większość puli makrofagów płucnych. Jak sama nazwa wskazuje, AM są przede wszystkim zlokalizowane w świetle pęcherzyków płucnych i występują jako komórki siedzące, które stale pobierają próbki atmosfery otoczenia i komunikują się z nabłonkiem pęcherzyków płucnych1. W płucach w stanie stacjonarnym ponad 95% fagocytów w przestrzeni pęcherzykowej to AMs2, których skład może ulec zmianie z powodu stanu zapalnego, infekcji lub przewlekłego narażenia na zanieczyszczenia.
AMs uczestniczą w szerokim zakresie funkcji, które mogą być lokalne dla płuc i/lub mieć znaczenie ogólnoustrojowe. Na przykład AM są niezbędne do rozwoju i optymalnego funkcjonowania płuc; nadzór immunologiczny; i usuwanie resztek komórkowych, atakujących patogenów i wdychanych cząstek3,4,5,6,7. Wiadomo, że ukierunkowane wyczerpywanie AMs upośledza usuwanie wirusów i bakterii układu oddechowego4,8. Oprócz roli fagocytów i pierwszego rzutu obrońców homeostazy płuc, AM są znane z tego, że działają jako komórki prezentujące antygen w wywoływaniu odporności limfocytów T9, zwiększając skuteczność szczepionki donosowej10 i wpływając na autoimmunizację z ograniczeniami płuc po przeszczepie płuc11,12. Niedobór funkcji AM został powiązany z proteinozą pęcherzyków płucnych (PAP), stanem wynikającym z mutacji genetycznej, nowotworu złośliwego lub infekcji, która upośledza klirens płucnych środków powierzchniowo czynnych13,14. Transplantacja AM jest obecnie badana jako podejście terapeutyczne w leczeniu PAP 15,16.
AMs są znane z tego, że powstają podczas embriogenezy i utrzymują się w płucach przez całe życie, nie będąc zastępowane przez krążące leukocyty2,17. Chociaż rotacja AM jest niewykrywalna w homeostatycznych płucach, różne poziomy rotacji AM odnotowano w niektórych stanach klinicznych, w tym zakażenie wirusem grypy4, napromienianie mieloablacyjne18, narażenie na endotoksynę19 i starość20. Uważa się, że AM samoodnawiają się poprzez proliferację niskiego stopnia17,21, ale niektóre ostatnie badania twierdzą, że monocyty mogą dać początek populacji wewnątrznaczyniowych makrofagów płucnych22,23 w warunkach eksperymentalnych, ale funkcjonalność tych nowo przekształconych makrofagów płucnych nie została jeszcze zdefiniowana w chorobach płuc. Co więcej, zrozumienie progu bodźca w kontekście aktywacji AM jest potencjalnie interesującym obszarem, ponieważ płuca próbują zachować równowagę między sygnałami zapalnymi a maszynerią immunoregulacyjną.
Fizjologiczne lub patologiczne zmiany, które prowadzą do utraty regulacji immunologicznej, są ważne do oceny w różnych warunkach klinicznych (np. infekcje dróg oddechowych, zapalna choroba płuc i zwłóknienie płuc). Niemniej jednak AM są coraz częściej uznawane za wskaźniki, a nawet determinanty zdrowia płuc11,24. Obecnie nie ma dostępnych ujednoliconych protokołów zbierania, charakteryzowania i/lub utrzymywania AM od ludzi i przedklinicznych modeli mysich. Brak konsensusu w sprawie prekursorów i fenotypów AM oraz brak szczegółowej metodologii był główną przeszkodą w rozszyfrowaniu roli AM w zdrowiu i chorobie płuc. Poniższy protokół oferuje ostateczną strategię identyfikacji, izolacji i hodowli in vitro, która znacznie pogłębi zrozumienie zachowania AM i ułatwi badania diagnostyczne i terapeutyczne ukierunkowane na AM.

<table><tbody><tr><td>Nieenzymatyczny roztwór dysocjujący komórki</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C5789</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Vet Maść</td><td>Dechra</td><td>620300</td><td></td></tr><tr><td>Cewnik 22G&nbsp;</td><td>Terumo Medical Products</td><td>SR-OX2225CA</td><td></td></tr><tr><td>4-0 Niewchłanialny jedwabny szew pleciony&nbsp;</td><td>Kent Scientific</td><td>SUT-15-2</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco" s sól fizjologiczna buforowana fosforanami&nbsp;</td><td>Blok myszy Corning</td><td>21-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>FC&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy (zestaw PureLink RNA)</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>12183018A</td><td></td></tr><tr><td>b-merkaptoetanol&nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>M6250&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sorter komórek FACSAria II&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>644832</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina&nbsp; (Ketathesia)</td><td>Henry Schein</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna&nbsp; (AnaSed)</td><td>Akorn</td><td>139-236</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TL&nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>DNaza I</td><td>Milipore-Sigma</td><td>AMPD1-1KT</td><td></td></tr><tr><td>100&mu; Filtr siatkowy M&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki blok Fc</td><td>BD Biosciences</td><td>564220</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Corning</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>Hrabina II Automatyczny licznik komórek</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>AMQAX1000</tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>15250061</tr><tr><td>HEPES</td><td>Corning</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca Atlanta</td><td>Biologicals</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>Linia komórkowa L-929</td><td>Kolekcja kultur typu amerykańskiego</td><td>ATCC,&nbsp; CCL-1</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna&nbsp;</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Corning</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>T25 Kolba do hodowli tkankowych</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>156367</tr><tr><td>Naczynie hodowlane 60 mm&nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>CLS3261</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Probówka stożkowa&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Rurka stożkowa&nbsp;</td><td>Analizator</td><td></td> komórek Corning 352098 <td></td></tr><tr><td>LSRFortessa</td><td>BD Biosciences</td><td>657669</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo</td><td>v10.4</td><td>Oprogramowanie analityczne</td></tr><tr><td>Anti-CD45 (mysz)</td><td>Biolegend</td><td>147709</td><td>Clone I3/2.3, FITC sprzężony</td></tr><tr><td>z anty-CD11b (mysz)</td><td>Biolegend</td><td>101228</td><td>Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 sprzężony</td></tr><tr><td>anty-CD11c (mysz)</td><td>BD Biosciences</td><td>565452</td><td>Klon N418, BV 421 sprzężony</td></tr><tr><td>Anti-I-Ab (mysz)</td><td>Biolegend</td><td>116420</td><td>Klon AF6-120.1, PE/Cy7 sprzężony</td></tr><tr><td>anty-Siglec-F (mysz)</td><td>BD Biosciences</td><td>562757</td><td>Klon E50-2440, PE-CF594 sprzężony</td></tr><tr><td>Anti-Siglec-H (mysz)</td><td>Biolegend</td><td>129605</td><td>Klon 551, PE sprzężony</td></tr><tr><td>Anti-F4/80 (mysz)</td><td>Biolegend</td><td>123118</td><td>Klon BM8, sprzężony APC/Cy7</td></tr><tr><td>Anty-Ly-6C (mysz)</td><td>Biolegend</td><td>128035</td><td>Klon HK1.4, BV605 sprzężony</td></tr><tr><td>Anty-CD64 (mysz)</td><td>Biolegend</td><td>139311</td><td>Klon X54-5/7.1, BV711 sprzężony</td></tr><tr><td>Anti-CD24 (mysz)</td><td>BD Biosciences</td><td>563115</td><td>Klon M1/69, BV510 sprzężony</td></tr><tr><td>Anty-CD103 (Mysz)</td><td>BD Biosciences</td><td>745305</td><td>Klon OX-62, BV650 sprzężony</td></tr><tr><td>Anty-CD317 (Mysz)</td><td>Biolegend</td><td>127015</td><td>Klon 927, sprzężony APC</td></tr><tr><td>Anty-CXCR1 (Mysz)</td><td>Biolegend</td><td>149029</td><td>Klon SA011F11, BV785 sprzężony</td></tr><tr><td>Anty-CD45 (Człowiek)</td><td>Biolegend</td><td>304017</td><td>Klon HI30, AF488 sprzężony</td></tr><tr><td>Anty-CD11b (Człowiek)</td><td>Biolegend</td><td>101216</td><td>Klon M1/70, PE/Cy7 sprzężony</td></tr><tr><td>Anty-HLA-DR (Człowiek)</td><td>Biolegend</td><td>307618</td><td>Klon L243, sprzężony APC/Cy7</td></tr><tr><td>Anty-CD169 (Human)</td><td>Biolegend</td><td>346008</td><td>Klon 7-239, APC sprzężony</td></tr><tr><td>Anty-CD206 (Human)</td><td>Biolegend</td><td>321106</td><td>Klon 15-2, sprzężony z PE</td></tr><tr><td>Anty-CD163 (Human)</td><td>Biolegend</td><td>333612</td><td>Klon GHI/61, BV421 sprzężony</td></tr></tbody></table>

izolacja i hodowla in vitro mysich i ludzkich makrofagów pęcherzykowych

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Makrofagi pęcherzykowe to nieuleczalnie zróżnicowane, rezydujące w płucach makrofagi pochodzenia prenatalnego. Makrofagi pęcherzykowe są wyjątkowe ze względu na swoje długie życie i ważną rolę w rozwoju i funkcjonowaniu płuc, a także zlokalizowane w płucach reakcje na infekcje i stany zapalne. Do tej pory nie istnieje ujednolicona metoda identyfikacji, izolacji i obchodzenia się z makrofagami pęcherzykowymi od ludzi i myszy. Taka metoda jest potrzebna do badań nad tymi ważnymi wrodzonymi komórkami odpornościowymi w różnych warunkach eksperymentalnych. Opisana tutaj metoda, która może być łatwo przyjęta przez każde laboratorium, jest uproszczonym podejściem do pobierania makrofagów pęcherzykowych z płynu popłuczyn oskrzelowo-pęcherzykowych lub z tkanki płucnej i utrzymywania ich in vitro. Ponieważ makrofagi pęcherzykowe występują głównie jako komórki przylegające do pęcherzyków płucnych, metoda ta koncentruje się na ich usunięciu przed pobraniem i identyfikacją. Płuco jest silnie unaczynionym narządem, a różne typy komórek pochodzenia szpikowego i limfoidalnego zamieszkują, oddziałują i są pod wpływem mikrośrodowiska płuc. Korzystając z opisanego tutaj zestawu markerów powierzchniowych, naukowcy mogą łatwo i jednoznacznie odróżnić makrofagi pęcherzykowe od innych leukocytów i oczyścić je do dalszych zastosowań. Opracowana w tym celu metoda hodowli wspiera zarówno ludzkie, jak i mysie makrofagi pęcherzykowe do wzrostu in vitro i jest zgodna z badaniami komórkowymi i molekularnymi.

Podejście z wykorzystaniem cytometrii przepływowej w celu identyfikacji makrofagów pęcherzykowych (AM) myszy przedstawiono na Rysunku 1. Obejmuje ono analizę minimalnego zestawu markerów powierzchniowych niezbędnych do odróżnienia AM od innych fagocytów rezydujących w płucach lub naciekających płuca. Niezbędna jest analiza różnicowa, aby jednoznacznie zidentyfikować AM wśród makrofagów śródmiąższowych, komórek dendrytycznych, neutrofili, monocytów oraz płucny...

Ta komunikacja opisuje metodologie izolacji i hodowli makrofagów pęcherzykowych od ludzi oraz modeli mysich do celów eksperymentalnych.

Izolacja i hodowla in vitro mysich i ludzkich makrofagów pęcherzykowych

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie makrofagów pęcherzykowych ludzi i myszy z płuc i płynu z popłuczyn oskrzelowo-pęcherzykowych oraz opracowanie metody ich hodowli in vitro. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kilka kluczowych pytań w dziedzinie immunologii płuc, takich jak rola makrofagów pęcherzykowych w infekcjach dróg oddechowych, stanach zapalnych i autoimmunizacji. Główną zaletą tej techniki jest możliwość odróżnienia makrofagów pęcherzykowych od innych leukocytów płucnych i uzyskania populacji wysoce oczyszczonych makrofagów pęcherzykowych do celów eksperymentalnych.Umieść znieczuloną mysz na powierzchni preparacyjnej stroną brzuszną skierowaną do góry. Nałóż maść okulistyczną weterynarza na oczy, aby zapobiec odwodnieniu. Przetrzyj całą powierzchnię brzuszną myszy sterylnymi wacikami nasączonymi alkoholem, nasyconymi 70% izopropanolem, w celu dezynfekcji.Zamontuj mysz tak, aby wszystkie cztery nogi były podniesione. Delikatnie otwórz jamę brzuszną za pomocą narzędzi do mikropreparacji. Należy zachować ostrożność, aby otworzyć jak największą powierzchnię, nie uszkadzając żadnych narządów trzewnych ani nie tworząc zwisającej tkanki.Delikatnie otwórz klatkę piersiową, powoli nacinając klatkę piersiową przez śródpiersie. Idealnie byłoby, gdyby klatkę piersiową można było wyciąć z boku na bok. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić opłucnej płuc podczas otwierania klatki piersiowej.Zlokalizuj żyłę główną dolną i wykonaj nacięcie, aby wykrwawić mysz. Użyj chłonnych wacików, aby wchłonąć krew. Wstrzyknij 10 mililitrów lodowatej soli fizjologicznej buforowanej fosforanem do prawej komory, aby przepłukać krążące krwinki.Absorbuj przepływ krwi za pomocą chłonnych wacików. Po całkowitym perfuzji płuca będą wyglądały na zbledłe, a następnie będą gotowe do płukania. Delikatnie rozetnij skórę i mięśnie szyi, aby odsłonić drogi oddechowe.Ostrożnie wyciąć sąsiednie mięśnie, chrząstki i tkankę tłuszczową, nie uszkadzając tchawicy. Następnie wykonaj małe nacięcie na tchawicy, za krtanią. To nacięcie powinno wystarczyć do wprowadzenia cewnika, gdy tchawica jest nadal przymocowana do krtani.Najważniejszym krokiem w zbieraniu płynu BAL jest bezpieczne przymocowanie cewnika do tchawicy, co zminimalizuje wycieki podczas płukania. Wprowadzić jednocalowy cewnik o rozmiarze 22 bez igły do tchawicy w kierunku płuc. Zabezpiecz cewnik jedwabnym plecionym szwem i kwadratowym węzłem.Posiadanie mocnych rąk i wykonanie tego kroku powoli i delikatnie zapobiega pęknięciu tchawicy i płuc. Podłącz jednomililitrową strzykawkę wypełnioną lodowatym buforem BAL do cewnika i powoli wkraplaj bufor do płuc. To napompuje płuca.Trzymaj strzykawkę przymocowaną do cewnika przez pięć sekund, a następnie odessaj płyn z płukania, delikatnie pociągając za tłok. Spowoduje to opróżnienie płuc. Zbierz płyn do 15-mililitrowej stożkowej probówki umieszczonej na lodzie.Powtórz inflację i deflację jeszcze dziewięć razy, a następnie zgromadź płyn do płukania. Nie należy przekraczać jednego mililitra buforu na płukanie, ponieważ może to przekroczyć pojemność płuc i doprowadzić do ich pęknięcia. Odwirować 10 mililitrów płynu BAL o temperaturze 250 razy g i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut.Osad komórkowy zawiera komórki BAL. Ponownie zawiesić komórki BAL w 100 mikrolitrach bufora do sortowania przepływowego. Przystąp do barwienia i sortowania komórek zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Przygotuj znieczuloną mysz do sekcji, wykonaj nacięcia i odpowietrz mysz jak poprzednio. Wstrzyknij 10 mililitrów lodowatego PBS do prawej komory, aby wypłukać krążące krwinki. Po całkowitym perfuzji płuca będą wyglądały na zblanszowane i będą gotowe do zbioru.Wypreparuj płuca, przecinając tchawicę, naczynia krwionośne i więzadła w stożkowej rurce o pojemności 15 mililitrów, z pięcioma mililitrami zimnego DMEM. Utrzymuj go na lodzie do następnego kroku. Przenieś perfundowane płuca do sterylnego i wolnego od pirogenów 60-milimetrowego naczynia hodowlanego z trzema mililitrami DMEM.Za pomocą kleszczy preparacyjnych usuń drogi oddechowe i inny twardy materiał tkanki innej niż płucna, jeśli jest obecny. Zmiel tkankę płucną skalpelem do rozmiaru mniejszego niż jeden milimetr. Dodaj 300 mikrogramów na mililitr Liberase TL i pięć jednostek na mililitr DNAzy jeden.Wymieszać pipetując i inkubować w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 25 minut. Po 10 minutach delikatnie wymieszać jeden raz, pipetując. Przepuść zdysocjowane płuca przez sitko o wielkości 100 mikronów zainstalowane na stożkowej rurce o pojemności 50 mililitrów.Użyj tylnej części tłoka z jednomililitrowej strzykawki, aby zetrzeć grudki komórek na filtrze. Umyj filtr 20 mililitrami buforu do mycia. Wirować w temperaturze 500 razy g i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut.Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 20 mililitrach buforu do przemywania płucz. Powtórz kroki odcedzania i wirowania dwukrotnie, za każdym razem zmieniając filtr i rurkę. Na koniec przygotuj zawiesinę jednokomórkową, dodając 100 mikrolitrów buforu do sortowania przepływu do osadu komórkowego.Wykonaj barwienie przeciwciał i sortowanie komórek, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po posortowaniu komórek zbierz komórki, odwirowując je w temperaturze 250 razy g i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Ponownie zawiesić AM myszy w jednym mililitrze pożywki hodowlanej AM myszy.W zależności od plonu i konieczności eksperymentalnej, wysiewaj komórki w szkiełkach komorowych, szalkach hodowlanych lub kolbach hodowlanych. Najlepiej wysiać AM w ilości 100 000 na mililitr z 10 mililitrami pożywki w kolbie do hodowli tkankowych T 25. Inkubuj komórki w inkubatorze nawilżanym o temperaturze 37 stopni Celsjusza z atmosferą 5% dwutlenku węgla.Po 24 godzinach od wysiewu AM powinny przylegać i nie zostaną oderwane przez delikatną zmianę pożywki hodowlanej. Usuń pożywkę przez aspirację z jednego końca i uzupełnij świeżą pożywką podgrzaną do 37 stopni Celsjusza. Na koniec obserwować kolbę pod mikroskopem odwróconym.Przedstawiono ocenę makrofagów pęcherzykowych metodą cytometrii przepływowej w płynie z płukania oskrzeli myszy za pomocą pęcherzyków płucnych. Makrofagi pęcherzykowe są pozytywnie zidentyfikowane jako komórki CD45-dodatnie, CD11c dodatnie i Siglec-F-dodatnie. Pokazany tutaj jest reprezentatywny wynik makrofagów pęcherzykowych myszy hodowanych in vitro przez 24 godziny.Komórki przyległy do siebie i delikatna zmiana podłoża hodowlanego nie spowoduje ich oderwania. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu około dwóch godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak odróżnić makrofagi pęcherzykowe myszy i człowieka od innych komórek płuc.Również jako procedury uzyskiwania pięknej populacji makrofagów pęcherzykowych do dalszych eksperymentów. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że nie wszystkie makrofagi lub fagocyty rezydujące w płucach są makrofagami pęcherzykowymi. Makrofagi pęcherzykowe to rodzaj wyspecjalizowanych komórek obecnych w płucach od urodzenia.W celu wyizolowania makrofagów pęcherzykowych należy skupić się na realnych metodach ekstrakcji z mikrośrodowiska pęcherzyków płucnych. Opracowana tutaj metoda hodowli in vitro wspomaga wzrost makrofagów pęcherzykowych w warunkach laboratoryjnych, które można wykorzystać w testach molekularnych i komórkowych. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak adoptywny transfer komórek, prezentacja antygenu i ocena odpowiedzi na bodźce zapalne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące biologii makrofagów pęcherzykowych.

isolation-vitro-culture-murine-human-alveolar

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W niniejszym opracowaniu opisujemy protokoły izolacji makrofagów pęcherzykowych myszy, które są rezydującymi w płucach komórkami odporności wrodzonej, oraz badania ich aktywacji w odpowiedzi na kokulturę z nanocząsteczkami polianhydrydowymi.

Pozyskiwanie makrofagów pęcherzykowych myszy oraz ocena aktywacji komórkowej indukowanej przez nanocząsteczki polianhydrydu

Prezentujemy prosty i skuteczny protokół do generowania ludzkich makrofagów. Płaszcze kożuchowe są przetwarzane przez wirowanie gradientowe o podwójnej gęstości, a izolowane monocyty są następnie różnicowane do makrofagów w workach do hodowli komórkowych pokrytych teflonem. Maksymalizuje to wydajność makrofagów i ułatwia pobieranie komórek do kolejnych eksperymentów.

Izolacja ludzkich monocytów przez wirowanie z podwójnym gradientem i ich różnicowanie do makrofagów w workach do hodowli komórkowych pokrytych teflonem

Metoda oceny zdolności izolowanych makrofagów pęcherzykowych myszy do kontrolowania wzrostu fagocytozowanych zarodników Aspergillus za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Ocena aktywności przeciwgrzybiczej izolowanych makrofagów pęcherzykowych za pomocą mikroskopii konfokalnej

Opisujemy tutaj prosty protokół izolacji mysich makrofagów otrzewnowych. Po tej procedurze następuje ekstrakcja RNA w celu przeprowadzenia analizy ekspresji genów po stymulacji receptorów Toll-podobnych.

Izolacja mysich makrofagów otrzewnowej w celu przeprowadzenia analizy ekspresji genów po stymulacji receptorów toll-podobnych

Komórki szpiku kostnego hodowane za pomocą czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów granulocytów (GM-CSF) generują heterogeniczną hodowlę zawierającą makrofagi i komórki dendrytyczne (DC). Metoda ta kładzie nacisk na wykorzystanie wiązania MHCII i hialuronianu (HA) w celu odróżnienia makrofagów od DC w kulturze GM-CSF. Makrofagi w tej kulturze mają wiele podobieństw do makrofagów pęcherzykowych.

Generowanie i identyfikacja makrofagów i komórek dendrytycznych pochodzących z GM-CSF

Przedstawiono protokół dla hodowli komórkowej makrofagów makrofagów stymulujących tworzenie kolonii (M-CSF) zróżnicowanych ludzkich makrocytów pochodzących z monocytów. Protokół wykorzystuje krioprezerwację monocytów w połączeniu z ich masowym różnicowaniem do makrofagów. Następnie zebrane makrofagi można następnie wysiać w studzienkach hodowlanych o wymaganej gęstości komórek do przeprowadzenia eksperymentów.

Posiew czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów Zróżnicowane ludzkie makrofagi pochodzące z monocytów

Tutaj przedstawiamy powszechne metody analizy funkcji fagocytarnej mysich makrofagów pęcherzykowych i klirensu bakteryjnego z płuc. Metody te badają fagocytozę in vitro kulek izotiocyjanianu fluoresceiny oraz fagocytozę in vivo białka zielonej fluorescencji Pseudomonas aeruginosa.  Opisujemy również metodę usuwania P. aeruginosa u myszy.

Fagocytoza makrofagów pęcherzykowych i klirens bakteryjny u myszy

Opisujemy metodę przetwarzania płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i dopasowanej krwi obwodowej od osób przewlekle zakażonych wirusem HIV na terapii antyretrowirusowej w celu oceny rezerwuarów HIV w płucach. Metody te prowadzą do pozyskania wysoce czystych limfocytów T CD4 i makrofagów pęcherzykowych, które można następnie wykorzystać do immunofenotypowania i kwantyfikacji HIV DNA/RNA za pomocą ultraczułej reakcji łańcuchowej polimerazy.

Przetwarzanie płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i dopasowanej krwi do makrofagów pęcherzykowych i immunofenotypowania limfocytów T CD4+ oraz oceny rezerwuaru HIV

Prezentowany tutaj jest zoptymalizowany protokół izolacji, hodowli, transfekcji i różnicowania ludzkich pierwotnych monocytów od osób zakażonych wirusem HIV i zdrowych osób kontrolnych.

Izolacja, transfekcja i hodowla pierwotnych ludzkich monocytów

Prezentowany tutaj jest protokół pierwotnej izolacji monocytów ludzkiej krwi, jak również ich różnicowania na makrofagi i komórki dendrytyczne oraz łączenia z komórkami nabłonkowymi w wielokomórkowy model ludzkiego płuca. Porównano reakcje biologiczne kokultur złożonych z komórek odpornościowych zróżnicowanych ze świeżo wyizolowanych lub rozmrożonych monocytów, po ekspozycji na bodźce prozapalne.

Wielokomórkowy model wyrostka zębodołowego człowieka złożony z komórek nabłonka i pierwotnych komórek odpornościowych do oceny zagrożeń

Obecny protokół opisuje izolację i hodowlę makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego od myszy.

Izolacja i hodowla makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego od myszy

Poznaj metody izolacji i hodowli makrofagów pęcherzykowych z płuc myszy i ludzi. Technika ta umożliwia uzyskanie wysoce oczyszczonej populacji komórek do badań w dziedzinie immunologii płucnej.

Izolacja i hodowla in vitro mysich i ludzkich makrofagów pęcherzykowych

Przeglądaj więcej filmów