Metoda badania polimorfizmu C924T genu receptora tromboksanu A2

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie zakrzepicy i hemostazy, identyfikując osoby bardziej podatne na procesy miażdżycowe, w szczególności pacjentów wysokiego ryzyka leczonych aspiryną. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest niedroga, prosta w użyciu, wygodna, ma wysoką wydajność i umożliwia szybką identyfikację polimorfizmów C924T. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w dziedzinę miażdżycy, może być również stosowana do innych systemów, takich jak polimorfizmy obejmujące medycynę spersonalizowaną lub określone leki, w celu zrozumienia indywidualnej odpowiedzi farmakologicznej.

Zabieg zademonstruje doktor Sebastiano Ursi, technik z naszego laboratorium. Aby przygotować bufor Tris EDTA o pH 8,0, dodaj 200 mikrolitrów 0,5 molowego EDTA i jeden mililitr jednego molowego chlorku Tris do zlewki, a następnie dostosuj objętość do 100 mililitrów sterylną wodą i przechowuj w temperaturze pokojowej. Następnie przygotuj jeden litr 10-krotnego roztworu podstawowego buforu do elektroforezy, dodając wszystkie odczynniki, a następnie przechowuj bufor w temperaturze pokojowej.

Następnie przygotuj barwnik ładujący żel, dodając wszystkie odczynniki, a następnie doprowadź objętość do 100 mililitrów sterylną wodą. Po przygotowaniu przechowuj barwnik w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez kilka miesięcy. Dodaj 450 mililitrów wody do 50 mililitrów buforu 10X TBE, aby przygotować roztwór buforu 1X TBE.

Dodaj cztery gramy agarozy w 200 mililitrach buforu 1X TBE razem w 600-mililitrowej zlewce, aby przygotować 200 mililitrów 2% żelu agarozowego. Zestalony żel agarozowy przechowywany w temperaturze pokojowej można ponownie rozpuścić we wrzącej łaźni wodnej o temperaturze 60 stopni przez 15 do 20 minut lub w kuchence mikrofalowej przez 35 minut, dodając niewielką objętość wody w celu skompensowania wzrostu stężenia agarozy. Mieszaj zlewkę w mikserze magnetycznym przez około pięć minut, aż agaroza zostanie zawieszona, a następnie podgrzej agarozę na gorącej płycie przez około 10 minut lub w kuchence mikrofalowej przez trzy minuty, aż całkowicie się rozpuści.

Po oczyszczeniu DNA delikatnie wymieszaj świeże próbki DNA za pomocą probówek do pipetowania. Obowiązkowe jest uzyskanie od 10 do 50 nanogramów dobrej jakości matrycy DNA wyekstrahowanej z próbek ludzkich. Z tego powodu wolimy stosować automatyczne oczyszczanie DNA niż półautomatyczne lub ręczne.

Aby rozpocząć oczyszczanie, najpierw określ ilościowo i oblicz czystość DNA, mierząc absorbenty przy 260, 280 i 320 nanometrach, a następnie rozcieńcz próbki sterylną wodą. Następnie skalibruj spektrofotometr. Aby utworzyć reakcję PCR, dodaj wszystkie odczynniki, aby przygotować 25 mikrolitrów głównej mieszanki PCR w 0,2 mililitrowej probówce do mikroamplifikacji.

Następnie umieść probówki PCR w automatycznym termocyklerze i amplifikuj oczyszczone próbki DNA. Po zakończeniu programu przerwij reakcję, pozostawiając probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Dodaj 10X bufor enzymatyczny pięć jednostek na mikrolitr enzymu restrykcyjnego w wolnej wodzie DNA do objętości 22,5 mikrolitra.

Następnie dodaj 2,5 mikrolitra produktu PCR do nowej probówki PCR, a następnie dodaj 22,5 mikrolitra mieszanki trawienia restrykcyjnego do produktu PCR. Inkubować główną mieszankę mineralizacji z ograniczeniami produktu PCR w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery godziny, a następnie dodać 0,5 mikrograma na mililitr bromku etydyny, aby zabarwić żel przez 10 minut. Wlej żel na tackę na żel z założonym grzebieniem, aby żel zastygł.

Teraz wlej pudełko żelowe z buforem 1X TBE, aż żel zostanie pokryty. Za pomocą cienkich końcówek załaduj sześć mikrolitrów amplifikowanego, strawionego DNA do dołków utworzonych w żelu, a następnie dodaj również marker DNA w oddzielnym dołku równolegle do próbki. Następnie włącz jednostkę do elektroforezy.

W celu zidentyfikowania polimorfizmu genetycznego C924T w genie TBXA2R przeprowadza się analizę RFLP. W żelu wyświetla dwie prążki na 395 i 144 parach zasad dla wersji dzikiego allelu głównego, podczas gdy pojedyncze prążki na 539 parach zasad dla zmutowanej wersji mniejszego allelu wskazują na brak cięcia przez enzym restrykcyjny. Co ciekawe, dla allelu heterozygotycznego występują trzy prążki w 395, 144 i 539 parach zasad.

Następnie polimorfizm C924T jest potwierdzany za pomocą analizy sekwencji. Podświetlona sekwencja reprezentuje polimorfizm. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około osiem godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że ta metoda może być stosowana tylko w przypadku niewielkiej liczby wycinków i kilku próbek w sesji roboczej. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak analiza snipa, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak znaczenie innych szlaków obejmujących procesy miażdżycowe. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie biologii molekularnej do zbadania wariacji genetycznych wyróżniających się w tym początkowym rozwoju i postępie.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ocenić genotyp receptora tromboksanu A2 w odniesieniu do polimorfizmu C924T za pomocą analizy elektroforezy żelowej próbek PCR-RFLP. Nie zapominaj, że praca z bromkiem etydyny i źródłami światła UV może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak rękawice, okulary ochronne lub maska na twarz i inne urządzenia ochronne.