Name: Metoda badania polimorfizmu C924T genu receptora tromboksanu A2 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Poznaj metodę analizy polimorfizmu C924T genu TBXA2R w badaniach nad zakrzepicą i hemostazą. Technika PCR-RFLP umożliwia szybką identyfikację alleli dzikich i mutacyjnych w próbkach ludzkich.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt został częściowo sfinansowany z 60% grantów Ateneo od Ministero dell'Università, Włochy dla S.M. i E.T. Otrzymaliśmy również częściowy wkład w wydatki badawcze ze strony Wydziału Nauk Medycznych, Jamy Ustnej i Biotechnologii Uniwersytetu w Chieti "G. d'Annunzio".

Protokół jest zgodny z wytycznymi Komisji Etyki Badań Medycznych Uniwersytetu w Chieti.
1. Konfiguracja odczynnika
<ol>
	<li>Przygotować bufor Tris-EDTA (TE) (pH 8,0). Dodać 200 μl EDTA 0,5 M i 1 ml Tris-Cl 1 M do zlewki i doprowadzić do 100 ml sterylną wodą. Końcowe stężenie buforu TE: 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA. Przechowywać w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Przygotować 1 l 10-krotnego buforu do elektroforezy roztworu podstawowego (TBE). Rozpuścić 108 g zasady Tris, 55 g kwasu borowego i 40 ml EDTA 0,5 M (pH 8) w zlewce i doprowadzić do objętości 1 l sterylną wodą. Sklep w RT.</li>
	<li>Przygotuj barwnik ładujący żel. Rozpuścić 0,25 g błękitu bromofenolowego, 0,25 g cyjanolu ksylenowego FF, 50 g glicerolu, 1 mM EDTA (pH 8) w 60 ml wody dejonizowanej lub destylowanej i doprowadzić do objętości 100 ml sterylną wodą. Przechowywać w temperaturze 4 °C (przez kilka miesięcy) lub w temperaturze -20 °C (przez lata)</li>
	<li>Przygotuj 200 ml 2% żelu agarozowego. Używaj go świeżego lub alternatywnie przechowuj zestalony w temperaturze pokojowej do kilku tygodni.
	<ol>
		<li>Rozpuścić 4 g agarozy w 200 ml 1x buforu TBE w zlewce o pojemności 600 ml. Mieszaj za pomocą miksera magnetycznego przez około 5 minut, aż agaroza całkowicie się zawiesi</li>.
		<li>Podgrzej 2% roztwór agarozy we wrzącej wodzie lub na gorącym talerzu (przez około 10 minut, aż agaroza całkowicie się rozpuści). Należy pamiętać, że zlewka z żelem agarozowym musi być przykryta folią aluminiową. Alternatywnie podgrzej odkrytą zlewkę w kuchence mikrofalowej w wysokiej temperaturze przez około 3–5 minut.</li>
		<li>Zamieszaj 2% roztwór agarozy za pomocą mieszadła magnetycznego, sprawdzając, czy agaroza jest całkowicie rozpuszczona. 
		UWAGA: Cząstki agarozy pojawiają się jako półprzezroczyste ziarna przed całkowitym rozpuszczeniem. Może być konieczne podgrzewanie cząstek przez kilka minut (około 5–10 minut).</li>
		<li>Jeżeli używana jest przechowywana porcja żelu agarozowego, podgrzewać zlewkę pokrytą folią aluminiową w gorącej łaźni wodnej (o temperaturze około 60 °C) aż do rozpuszczenia agarozy. Usunąć pipetą Pasteura wszelkie "ślady" zestalonej agarozy z powierzchni przed nalewaniem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Oczyszczanie DNA
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem oczyszczania wykonaj następujące czynności:
	<ol>
		<li>Użyć próbek świeżej krwi pełnej ludzkiej lub szybko rozmrozić zamrożone próbki krwi pełnej (przez około 2–3 minuty) w łaźni wodnej (w temperaturze 37 °C), lekko mieszając, a następnie zrównoważyć do RT przed użyciem.</li>
		<li>Wymieszaj świeże lub rozmrożone próbki krwi, kilkakrotnie odwracając probówki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Procedurę oczyszczania należy rozpocząć zgodnie z protokołami dostawcy dla 100 μl objętości elucji.</li>
	<li>Określić ilościowo i obliczyć czystość DNA, mierząc absorbancję przy 260, 280 i 320 nm.
	<ol>
		<li>Użyć sterylnej wody do rozcieńczenia próbek i skalibrowania spektrofotometru.</li>
		<li>Zastosować następujący wzór w celu obliczenia stężenia próbki DNA = 50 μg/ml x (A260 − A320) x współczynnik rozcieńczenia oraz czystości DNA = (A260 − A320)/(A280 − A320), przy dopuszczalnym stosunku między 1,7 a 1,9.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Amplifikacja PCR próbek DNA
<ol>
	<li>Przygotować 25 μl mieszaniny reakcyjnej w probówce do mikroamplifikacji o pojemności 0,2 ml, jak pokazano w tabeli 1.</li>
	<li>Przeprowadzić amplifikację PCR oczyszczonych próbek DNA za pomocą automatycznego termocyklera, postępując zgodnie z programem amplifikacji przedstawionym w tabeli 2.</li>
	<li>Pod koniec amplifikacji PCR należy zatrzymać reakcje PCR, pozostawiając próbki DNA w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
4. RFLP produktów PCR
<ol>
	<li>Przygotować 22,5 μl roztworu mieszanki głównej dla każdej próbki, tak aby wybrany enzym restrykcyjny roztrawił produkty PCR, jak pokazano w tabeli 3.</li>
	<li>Przenieś 2,5 μl produktu PCR do nowej probówki PCR dla każdej próbki, używając pipety i końcówek filtrujących.</li>
	<li>Dodać 22,5 μl roztworu głównej mieszanki mineralizacyjnej do probówek zawierających produkt PCR z każdej próbki, używając pipety i końcówek filtrujących.</li>
	<li>Mieszaninę reakcyjną inkubować (roztwór mieszaniny wzorcowej i produkt PCR) w temperaturze 37 °C przez 4 godziny.</li>
</ol>
5. Analiza próbek PCR-RFLP za pomocą elektroforezy żelowej
<ol>
	<li>Wybarwić żel agarozowy, dodając bromek etydyny (EtBr) w stężeniu 0,5 μg/ml do żelu przez 10 minut. EtBr wiąże się z DNA, które można uwidocznić w świetle ultrafioletowym (UV). 
	Uwaga: Ważne jest, aby używać rękawic i innych urządzeń ochronnych podczas obchodzenia się, przechowywania i usuwania EtBr, ponieważ jest to mutagen o potencjalnym działaniu rakotwórczym.</li>
	<li>Wlej przygotowany żel agarozowy do tacki na żel z założonym grzebieniem studzienki i poczekaj, aż stężeje.</li>
	<li>Umieść zestalony żel agarozowy w pudełku żelowym (jednostka do elektroforezy).</li>
	<li>Napełnij pojemnik z żelem 1x TBE, aż żel zostanie pokryty.</li>
	<li>Za pomocą pipety i końcówek filtrujących załadować 6 μl amplifikowanego DNA do trawienia (w szczególności 5 μl każdej próbki i 1 μl barwnika ładującego żel) do dołków żelu agarozowego. Dodaj marker wielkości DNA w oddzielnym studzience i równolegle z próbkami.</li>
	<li>Uruchom żel na 20–30 minut przy napięciu 100 V.</li>
	<li>Za pomocą transiluminatora UV zwizualizuj rozszczepione fragmenty DNA lub niestrawione produkty PCR, porównując fragmenty ze znacznikiem wielkości DNA i zarejestruj wyniki za pomocą fotografii zgodnie z instrukcjami producenta. 
	Ostrzeżenie: Używaj urządzeń ochronnych (okulary ochronne lub maska na twarz) w pobliżu źródeł światła UV.</li>
</ol>

<ol><li>Shen, R. F., Tai, H. H. <a target="_blank" href="https://www.karger.com/Article/Abstract/25327">Thromboxanes: synthase and receptors.</a> J Biomed Sci. 5 (3), 153-172 (1998).</li>
<li>Nusing, R. M., Hirata, M., Kakizuka, A., Eki, T., Ozawa, K., Narumiya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+chromosomal+mapping+of+the+human+thromboxane+A2+receptor+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization and chromosomal mapping of the human thromboxane A2 receptor gene.</a> J Biol Chem. 268 (33), 25253-25259 (1993).</li>
<li>Cyrus, T., Ding, T., Praticò, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+thromboxane+synthase%2C+prostacyclin+synthase+and+thromboxane+receptor+in+atherosclerotic+lesions%3A+correlation+with+plaque+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Expression of thromboxane synthase, prostacyclin synthase and thromboxane receptor in atherosclerotic lesions: correlation with plaque composition.</a> Atherosclerosis. 208 (2), 376-381 (2010).</li>
<li>Cipollone, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Polymorphism+in+the+Cyclooxygenase+2+Gene+as+an+Inherited+Protective+Factor+Against+Myocardial+Infarction+and+Stroke%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">A Polymorphism in the Cyclooxygenase 2 Gene as an Inherited Protective Factor Against Myocardial Infarction and Stroke.</a> JAMA. 291 (18), 2221-2228 (2004).</li>
<li>Fontana, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+functional+polymorphisms+of+the+thromboxane+A2+receptor+gene+in+healthy+volunteers%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Identification of functional polymorphisms of the thromboxane A2 receptor gene in healthy volunteers.</a> Thromb Haemost. 96 (3), 356-360 (2006).</li>
<li>De Iuliis, V., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1098882317300060">Differential TBXA2 receptor transcript stability is dependent on the C924T polymorphism. Prostaglandins Other Lipid Mediat.</a> pii. (17), (2017).</li>
<li>Saiki, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+amplification+of+beta-globin+genomic+sequences+and+restriction+site+analysis+for+diagnosis+of+sickle+cell+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.</a> Science. 230 (4732), 1350-1354 (1985).</li>
<li>Collins, F. S., Brooks, L. D., Chakravarti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+polymorphism+discovery+resource+for+research+on+human+genetic+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">A DNA polymorphism discovery resource for research on human genetic variation.</a> Genome Res. 8 (12), 1229-1231 (1998).</li>
<li>Lee, J. C. -I., Chang, J. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABO+genotyping+by+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Forensic+Sci%22%5BJournal%5D)">ABO genotyping by polymerase chain reaction.</a> J. Forensic Sci. 37 (5), 1269-1275 (1992).</li>
<li>Masao, O., Hirofumi, F., Jerzy, K. K., Hidetoshi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+nucleotide+polymorphism+detection+by+polymerase+chain+reaction-restriction+fragment+length+polymorphism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Single nucleotide polymorphism detection by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism.</a> Nature Protocols. 2 (11), 2857-2864 (2007).</li>
<li>Iwasaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+genotyping+for+single+nucleotide+polymorphisms+by+a+microarray-based+single+nucleotide+polymorphism+typing+method+involving+hybridization+of+short+allele-specific+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Res%22%5BJournal%5D)">Accuracy of genotyping for single nucleotide polymorphisms by a microarray-based single nucleotide polymorphism typing method involving hybridization of short allele-specific oligonucleotides.</a> DNA Res. 9 (2), 59-62 (2002).</li>
<li>Papp, A. C., Pinsonneault, J. K., Cooke, G., Sadee, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+nucleotide+polymorphism+genotyping+using+allele-specific+PCR+and+fluorescence+melting+curves%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Single nucleotide polymorphism genotyping using allele-specific PCR and fluorescence melting curves.</a> Biotechniques. 34 (5), 1068-1072 (2003).</li>
<li>O'Meara, D., Ahmadian, A., Odeberg, J., Lundeberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNP+typing+by+apyrase-mediated+allele-specific+primer+extension+on+DNA+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">SNP typing by apyrase-mediated allele-specific primer extension on DNA microarrays.</a> Nucleic Acids Res. 30 (15), e75(2002).</li>
<li>Pickering, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+DNA+ligation+and+rolling+circle+amplification+for+the+homogeneous%2C+end-point+detection+of+single+nucleotide+polymorphisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Integration of DNA ligation and rolling circle amplification for the homogeneous, end-point detection of single nucleotide polymorphisms.</a> Nucleic Acids Res. 30 (12), e60(2002).</li>
<li>Chatterjee, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+sequencing+of+bacterial+and+P1+artificial+chromosome-nested+deletions+for+identifying+position-specific+single-nucleotide+polymorphisms%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Direct sequencing of bacterial and P1 artificial chromosome-nested deletions for identifying position-specific single-nucleotide polymorphisms.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96 (23), 13276-13281 (1999).</li>
<li>Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allelic+discrimination+using+fluorogenic+probes+and+the+5%27+nuclease+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Genet.+Anal%22%5BJournal%5D)">Allelic discrimination using fluorogenic probes and the 5' nuclease assay.</a> Genet. Anal. 14 (5-6), 143-149 (1999).</li>
<li>Haff, L. A., Smirnov, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleotide+polymorphism+identification+assays+using+a+thermostable+DNA+polymerase+and+delayed+extraction+MALDI-TOF+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Genome Res. 7 (4), 378-388 (1997).</li>
<li>Gunderson, K. L., Steemers, F. L., Lee, G., Mendoza, L. G., Chee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+scalable+SNP+genotyping+assay+using+microarray+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">A genome-wide scalable SNP genotyping assay using microarray technology.</a> Nat. Genet. 37 (5), 549-554 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W niniejszym badaniu opisaliśmy metodologię, która umożliwia genotypowanie pacjentów w celu zbadania potranskrypcyjnej roli polimorfizmu C924T (rs4523) zlokalizowanego w regionie 3' genu TBXA2R. Po pierwsze, metoda ta polega na ekstrakcji DNA z krwi pełnej. W szczególności ten pierwszy proces polega na oczyszczeniu całkowitego ludzkiego DNA, genomowego i mitochondrialnego, z próbek krwi pełnej, świeżych lub mrożonych, poddanych działaniu EDTA (cytrynianu lub heparyny). W przypadku krótkotrwałego przechowywania próbek krwi pełnej należy przechowywać w temperaturze 2-8 °C przez okres do 10 dni. W przypadku przechowywania przez 10 dni próbki należy przechowywać w temperaturze -70 °C. Zautomatyzowany proces oczyszczania składa się z 4 etapów: lizyzacji, wiązania, mycia i elucji. Po drugie, metoda opiera się na amplifikacji PCR części genu TBXA2R zawierającej mutację C924T. Na koniec przeprowadza się identyfikację dzikiego typu i/lub zmutowanego genotypu za pomocą analizy enzymu restrykcyjnego (RFLP) na żelu agarozowym.
Kluczowe etapy protokołu są następujące: (i) W przypadku użycia części żelu agarozowego przechowywanego w temperaturze pokojowej, zestaloną agarozę można ponownie rozpuścić we wrzącej łaźni wodnej (w temperaturze 60 °C przez około 15-20 minut) lub w kuchence mikrofalowej (3-5 minut) przed nalewaniem. Uwaga: poluzuj nakrętkę podczas ponownego topienia agarozy w butelce. (ii), ponadto, przy ponownym podgrzewaniu agarozy, odparowanie spowoduje wzrost jej stężenia. Z tego powodu przydatna może być kompensacja poprzez dodanie niewielkiej ilości wody. (iii) Fragmenty DNA o długości mniejszej niż 1000 pz różnicowano za pomocą żelu agarozowego i zaleca się bufor TBE w celu uzyskania najlepszej możliwej separacji. (iv) Wolimy używać żelu agarozowego niż żelu poliakrylamidowego, ponieważ przygotowanie tego ostatniego jest trudniejsze, a jego przygotowanie zajmuje znacznie więcej czasu. (v) Wybór czasu trwania elektroforezy żelowej zależy od oczekiwanej wielkości produktów amplifikacji. W oparciu o ten protokół wystarczy wykonać elektroforezę przez 20-30 minut przy napięciu 100 V w 2% żelu agarozowym, ponieważ wielkość fragmentów PCR waha się od 100 do 500 pz. (vi) Obowiązkowe jest uzyskanie od 10 do 50 ng dobrej jakości matrycy DNA wyekstrahowanej z próbek ludzkich. Z tego powodu wolimy stosować automatyczne oczyszczanie DNA niż półautomatyczne lub ręczne. (vii) Przygotować reakcję master-mix do amplifikacji PCR i roztwór master-mix do trawienia produktów PCR, dodając 10% więcej (w celu uwzględnienia utraty cieczy podczas pipetowania) do obliczonej objętości pomnożonej przez liczbę próbek na objętość wymaganą dla jednej próbki DNA.
Najczęstszą pułapką tej metody jest obecność dodatkowych produktów amplifikacji spowodowanych nieprawidłowym programem termocyklera, niewłaściwym preparatem master-mix amplifikacji lub zanieczyszczeniem matrycą DNA. Co więcej, brak produktów PCR może być spowodowany inaktywowaną polimerazą Taq lub nieprawidłowym uruchomieniem termocyklera. Ponadto obecność nieoczekiwanych fragmentów może być spowodowana zanieczyszczeniem produktu metodą PCR lub niepełnym trawieniem przez inaktywowany enzym, zbyt małą objętością enzymu restrykcyjnego lub zbyt krótkim czasem inkubacji.
W ostatnich latach do analizy SNP przy użyciu techniki PCR wykorzystano następujące metodologie: hybrydyzacja oligonukleotydów specyficznych dla krótkich alleli11, PCR swoista dla alleli12, rozszerzenie starterów na mikromacierzach DNA13, test ligacji oligonukleotydów14, bezpośrednie sekwencjonowanie DNA do identyfikacji polimorfizmów pojedynczego nukleotydu specyficznychdla pozycji 15, metoda Taqmana16, spektrometria mas MALDI-TOF (MALDI-TOF) z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą ekstrakcją17 oraz GeneChips18. Metody te nie są idealne, ponieważ nie są proste w użyciu i/lub wymagają drogiego sprzętu. I odwrotnie, metoda PCR-RFLP opisana w tym badaniu jest niedroga, prosta w użyciu, wygodna, ma wysoką skuteczność i pozwala na szybką identyfikację polimorfizmu C924T. Ograniczeniem obecnej metody jest to, że może być ona stosowana tylko w odniesieniu do niewielkiej liczby SNP i kilku próbek w sesji roboczej.
W przyszłych zastosowaniach metoda ta może być wykorzystana do badań predykcyjnych dotyczących tworzenia się blaszek miażdżycowych i progresji miażdżycy poprzez analizę genotypów pacjentów pod kątem polimorfizmu TBXA2R C924T. Co więcej, metoda ta może zidentyfikować osoby bardziej podatne na procesy miażdżycowe, w szczególności pacjentów wysokiego ryzyka leczonych aspiryną. Wreszcie, metoda ta może być zastosowana do badania innych polimorfizmów związanych z medycyną spersonalizowaną dla określonych leków (na przykład leków przeciwzakrzepowych i przeciwdrgawkowych) w celu zrozumienia odpowiedniej dawki leku oraz indywidualnej odpowiedzi farmakologicznej i klinicznej dla każdego pacjenta przed rozpoczęciem terapii i uniknięcia działań niepożądanych.

TBXA2R należy do nadrodziny białkowej G z siedmioma regionami transbłonowymi, które są szeroko wyrażane i zlokalizowane na błonach komórkowych lub w strukturach wewnątrzkomórkowych1,2. Szlak sygnałowy TBXA2R bierze udział w zaawansowanych procesach miażdżycowych3. Zwiększoną ekspresję receptora TBXA2 wykazano podczas progresji miażdżycy, a badania kliniczne i eksperymentalne wykazały jego istotną rolę w niedokrwieniu i zawale mięśnia sercowego4. C924T, polimorfizm pojedynczego nukleotydu (SNP) genu TBXA2R, został rozpoznany jako funkcjonalny polimorfizm u zdrowych ochotników i został powiązany z zaburzeniami klinicznymi5. Co więcej, nasze poprzednie badanie6 wykazało, że polimorfizm C924T genu TBXA2R jest zaangażowany w stabilność transkryptu; w szczególności występuje zwiększona niestabilność transkryptu typu zmutowanego (TT) w stosunku do typu dzikiego (CC). Ponadto kilka bodźców, takich jak difosforan adenozyny (ADP), epinefryna i kolagen w różnych stężeniach, indukowało agregację płytek krwi mniej skuteczną dla typu zmutowanego (TT). Jest to zgodne ze zmniejszonym tworzeniem się skrzeplin i hemostazą. Zatem niestabilność transkryptu TBXA2R i związane z nią zmniejszenie agregacji płytek krwi mogą być związane z ochronną rolą genotypu TBXA2R TT przed zakrzepicą tętnic i jej powikłaniami u pacjentów wysokiego ryzyka leczonych aspiryną6.
Tutaj opisujemy metodologię genotypowania pacjentów w celu zbadania potranskrypcyjnej roli polimorfizmu C924T (rs4523) zlokalizowanego w regionie 3' genu receptora TBXA2. Metoda ta opiera się na następujących etapach: (1) ekstrakcja DNA z krwi pełnej, (2) amplifikacja PCR części genu TBXA2R zawierającej mutację C924T oraz (3) identyfikacja dzikich i/lub zmutowanych genotypów za pomocą polimorfizmu długości fragmentu restrykcyjnego (RFLP) na żelu agarozowym. RFLP to technika, która wykorzystuje zmiany w homologicznych sekwencjach DNA7. Aplikacja ta została wykorzystana do wykrywania polimorfizmów DNA, zwłaszcza SNP, oraz do znajdowania i kojarzenia znaczenia biologicznego w odmianach genetycznych8. Polimorfizm analizowany po raz pierwszy przy użyciu RFLP-PCR u ludzi to ABO blood9. Metoda RFLP-PCR pozwala na analizę mutacji genetycznych w homologicznych sekwencjach DNA poprzez ocenę obecności fragmentów o różnej długości po trawieniu DNA przy użyciu wysoce specyficznych endonukleaz restrykcyjnych10.
W ubiegłych latach następujące metodologie były wykorzystywane do analizy SNP przy użyciu techniki PCR: hybrydyzacja krótkich oligonukleotydów specyficznych dla alleli11, PCR12, rozszerzenie startera na mikromacierze DNA13, test ligacji oligonukleotydów14, Bezpośrednie sekwencjonowanie DNA do identyfikacji specyficznych dla pozycji polimorfizmów pojedynczego nukleotydu15, Taqman method16, spektrometria mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą ekstrakcją (MALDI-TOF) spektrometria masowa17, oraz GeneChips18. Techniki te nie są proste w użyciu i mogą wymagać drogiego sprzętu. I odwrotnie, metoda PCR-RFLP jest niedroga, prosta w użyciu, wygodna, ma wysoką skuteczność i umożliwia szybką identyfikację polimorfizmu C924T. Dodatkowo potwierdziliśmy wyniki poprzez sekwencjonowanie genu TBXA2R przy użyciu metody Sangera15.
To podejście pozwala na predykcyjne badanie powstawania blaszek miażdżycowych i progresji miażdżycy poprzez analizę genotypów pacjentów pod kątem polimorfizmu TBXA2R C924T. Metoda ta może zidentyfikować osoby bardziej podatne na procesy miażdżycowe, w szczególności wśród pacjentów wysokiego ryzyka leczonych aspiryną.

<table><tbody><tr><td>QIAsymphony SP</td><td></td> Spektrofotometr <td>QIAGEN</td> 937055 <td></td></tr><tr><td></td><td>EPPENDORF</td><td>6131-02222</td><td></td></tr><tr><td>Oświetlacz UV</td><td>UVP</td><td>732-110</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do PCR</td><td>EPPENDORF</td><td>H0030121589</td><td></td></tr><tr><td>Termocykler do PCR</td><td>EPPENDORF</td><td>5331-03721</td><td></td></tr><tr><td>Pipety i końcówki filtrujące</td><td>EPPENDORF</td><td>H4910000018/42/69 I 0030067037/10/02</td><td></td></tr><tr><td>Horyzontalna aparatura do elektroforezy miniżelowej</td><td>DIATECH PHORESIS 10</td><td>RI002-10</td><td></td></tr><tr><td>Suchy blok grzewczy</td><td>PODWÓJNY INKUBATOR</td><td>DG210</td><td></td></tr><tr><td>QIAsymphony DNA Midi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>931255</td><td></td></tr><tr><td>10x bufor PCR (zwykle dostarczany przez producenta z polimerazą Taq)</td><td>DIATECH I TAKARA</td><td>T0100 I R0001DM</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza</td><td>Taq TAKARA</td><td>R0001DM</td><td></td></tr><tr><td>mieszanina dNTP</td><td>DIATECH&nbsp; farmakogenetyka</td><td>NM001</td><td>dNTP MIX 10x 100 mikrolitrów, 10 mM</td></tr><tr><td>startery PCR</td><td>DIATECH&nbsp; farmakogenetyka</td><td>\\Enzym</td><td></td></tr> <tr><td>restrykcyjny RsaI</td><td>New England biolabs</td><td>R0167L</td><td></td></tr><tr><td>Enzym restrykcyjny 10x bufor</td><td>New England biolabs</td><td>R0167L</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td>Fragmenty DNA najlepiej rozdzielać w buforze TBE</td></tr><tr><td>Baza Tris</td><td>baza Sigma</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Sigma</td><td>B7901</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Sigma</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>10% (wag./obj.) nadsiarczan amonu</td><td>Sigma</td><td>E3678</td><td>przygotowywany świeży za każdym razem</td></tr><tr><td>EtBr ( 0,5 &mu; g/&mu; L)</td><td>Sigma</td><td>E8751</td><td></td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>Sigma</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>Ksylenol cyjanol FF</td><td>Sigma</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Marker wielkości DNA</td><td>DIATECH&nbsp; farmakogenetyka</td><td>R1002-10</td><td>Plazmid pBluescript II SK (+) restrict MSPI</td></tr><tr><td>Sterylna woda (autoklawowana)</td><td>DIATECH&nbsp; farmakogenetyka</td><td>\\</td><td></td></tr></tbody></table>

metoda badania polimorfizmu c924t genu receptora tromboksanu a2

A Method to Study the C924T Polymorphism of the Thromboxane A2 Receptor Gene

Gen receptora tromboksanu A2 (TBXA2R) należy do nadrodziny białkowej G z siedmioma regionami transbłonowymi. Bierze udział w progresji miażdżycy, niedokrwieniu i zawale mięśnia sercowego. W artykule przedstawiono metodologię genotypowania pacjentów w celu zbadania potranskrypcyjnej roli polimorfizmu C924T (rs4523) zlokalizowanego w regionie 3' genu receptora TBXA2. Metoda ta opiera się na ekstrakcji DNA z krwi pełnej, amplifikacji części genu TBXA2 zawierającej mutację C924T za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) oraz identyfikacji genotypów typu dzikiego i/lub zmutowanych za pomocą analizy trawienia restrykcyjnego, w szczególności polimorfizmu długości fragmentu restrykcyjnego (RFLP) w żelu agarozowym. Ponadto wyniki zostały potwierdzone przez sekwencjonowanie genu TBXA2R. Metoda ta ma kilka potencjalnych zalet, takich jak wysoka skuteczność i szybka identyfikacja polimorfizmu C924T za pomocą PCR i analizy enzymów restrykcyjnych. Takie podejście pozwala na badanie predykcyjne tworzenia się blaszek miażdżycowych i progresji miażdżycy poprzez analizę genotypów pacjentów pod kątem polimorfizmu TBXA2R C924T. Zastosowanie tej metody może potencjalnie zidentyfikować osoby, które są bardziej podatne na procesy miażdżycowe, w szczególności osoby w grupie wysokiego ryzyka leczonej aspiryną.

Celem niniejszej metody jest ocena genotypu receptora tromboksanu A2 w odniesieniu do polimorfizmu C924T. Ludzki gen TBXA2R znajduje się w locus 19p13.3, obejmuje 15 kbp i składa się z trzech egzonów oddzielonych dwoma intronami. Polimorfizm C924T genu TBXA2R (o długości 539 bp) został amplifikowany przy użyciu starterów PCR przedstawionych na Rysunku 1, które zostały zaprojektowane w celu amplifikacji specyficznego regionu DNA, z wykluczeniem ortologicznych lub paralogicznych regionów niespecyficznych. Ponadto przeprowadzono analizę RFLP z wykorzystaniem enzymu restrykcyjnego RsaI (Rysunek 1) na produktach PCR, a wyniki zwizualizowano na żelu agarozowym w celu charakterystyki badanego SNP.
Na podstawie obecności fragmentów o różnej długości po trawieniu DNA możliwe jest rozróżnienie genotypu pacjenta w obrębie polimorfizmu C924T. W rzeczywistości, jak pokazano na Rysunku 2, homozygotyczność allelu dominującego (CC) objawia się dwiema prążkami (395 i 14 bp), ponieważ enzym restrykcyjny precyzyjnie przecina fragment genu TBXA2R w miejscu polimorfizmu C924T. Homozygotyczność allelu rzadkiego (TT) objawia się pojedynczym prążkiem (539 bp), ponieważ cięcie enzymem restrykcyjnym nie zachodzi. Allel heterozygotyczny (CT) wykazuje trzy prążki (539, 395 i 14 bp). Jak pokazano na Rysunku 2, polimorfizm C924T, określony na podstawie trawienia produktu PCR enzymem RsaI, został potwierdzony analizą sekwencji.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Składnik</td>
			<td >Objętość (µL)</td>
			<td >Stężenie końcowe</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bufor PCR 10x Tween-20 (15 M MgCl2)</td>
			<td >0.25</td >
			<td >1.5 MgCl2 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mieszanina dNTP (10 mM)</td >
			<td >1</td >
			<td >20 µM</td >
		</tr>
		<tr >
			<td >Starter (forward) (10 pmol/µM)</td >
			<td >1</td >
			<td >0.4 µM/µL</td >
		</tr>
		<tr >
			<td >Starter (reverse) (10 pmol/µM)</td >
			<td >1</td >
			<td >0.4 µM/µL</td >
		</tr>
		<tr >
			<td >Taq polimeraza (5 U/µL)</td >
			<td >0.2</td >
			<td >1 U/µL</td >
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA próbki (42 ng/µL)</td >
			<td >1</td >
			<td >42 ng/µL</td >
		</tr>
		<tr >
			<td >Woda wolna od DNaz</td >
			<td >20.55</td >
			<td ></td >
		</tr>
		<tr >
			<td >Suma</td >
			<td >25</td >
			<td ></td >
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Konfiguracja amplifikacji PCR. Mieszanina reakcyjna master-mix o objętości 25 µL przygotowana w probówce PCR 0,2 mL w celu amplifikacji pojedynczej próbki DNA.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Standardowa PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wstępny etap aktywacji</td>
			<td>5 min</td>
			<td></td>
			<td>95 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cykl 3-etapowy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denaturacja</td>
			<td>30 s</td>
			<td></td>
			<td>94 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wyżarzanie</td>
			<td>60 s</td>
			<td></td>
			<td>55 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozszerzenie</td>
			<td>60 s</td>
			<td></td>
			<td>72 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liczba cykli</td>
			<td></td>
			<td>30 cykli</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ostateczne przedłużenie</td>
			<td>8 min</td>
			<td></td>
			<td>72 °C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Program amplifikacji PCR. Ustaw automatyczny termocykler w celu przeprowadzenia reakcji PCR i amplifikacji matrycy DNA. Reakcje PCR zatrzymuje się poprzez chłodzenie w temperaturze 4 °C.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Składnik</td>
			<td >Objętość (µL) (n = 1)</td>
			<td >Objętość (µL) (n = 10)*</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bufor enzymatyczny 10x</td>
			<td >2.5</td>
			<td >27.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Enzym restrykcyjny (5 U/µL)</td>
			<td >0.5</td>
			<td >5.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Woda wolna od DNaz</td>
			<td >19.5</td>
			<td >214.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Suma</td>
			<td >2.5</td>
			<td >247.5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Trawienie produktów PCR enzymami restrykcyjnymi. Przygotowuje się roztwór master-mix w taki sposób, aby wybrany enzym restrykcyjny strawił produkty PCR. *: Aby przygotować roztwór master-mix dla 10 próbek, należy dodać 10% więcej, przygotowując ostatecznie 1 próbek.
<img alt="Projektowanie starterów PCR i schemat miejsc cięcia enzymów restrykcyjnych dla amplifikacji DNA, produkt: 539 bp." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57289/57289fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1: Startery PCR i enzym restrykcyjny RsaI. Startery bezpośredni i odwrotny zaprojektowane do amplifikacji fragmentu genu TBXA2R o długości 539 bp, zawierającego polimorfizm C924T. RsaI jest enzymem restrykcyjnym wybranym do rozpoznawania sekwencji GTAC. ˅: miejsce cięcia enzymu RsaI. C(/T): polimorfizm C924T. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57289/57289fig1v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Elektroforeza w żelu wykazująca rozdzielenie prążków DNA; chromatogram sekwencji genetycznej; analiza mutacji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57289/57289fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2: Obraz elektroforetyczny i analiza sekwencji DNA. (AGenotyp C924T jest rozpoznawany na podstawie wzoru RFLP po trawieniu specyficznym enzymem RsaI.B) Analiza sekwencji DNA: Wyniki uzyskane metodą RFLP po trawieniu enzymem restrykcyjnym RsaI zostały potwierdzone za pomocą analizy sekwencji, która wykazała polimorfizm C924T. Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie opracowania De Iuliis i wsp., Prostaglandyny &amp; Pozostałe mediatory lipidowe6. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57289/57289fig2v2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

W niniejszym badaniu opisujemy metodologię analizy genotypu C924T. Protokół składa się z trzech faz: ekstrakcji DNA, amplifikacji w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) oraz analizy polimorfizmu długości fragmentu restrykcyjnego (RFLP) na żelu agarozowym.

Metoda badania polimorfizmu C924T genu receptora tromboksanu A2

The thromboxane A2 receptor (TBXA2R) gene is a member of the G-protein coupled superfamily with seven-transmembrane regions. It is involved in ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie zakrzepicy i hemostazy, identyfikując osoby bardziej podatne na procesy miażdżycowe, w szczególności pacjentów wysokiego ryzyka leczonych aspiryną. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest niedroga, prosta w użyciu, wygodna, ma wysoką wydajność i umożliwia szybką identyfikację polimorfizmów C924T. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w dziedzinę miażdżycy, może być również stosowana do innych systemów, takich jak polimorfizmy obejmujące medycynę spersonalizowaną lub określone leki, w celu zrozumienia indywidualnej odpowiedzi farmakologicznej.Zabieg zademonstruje doktor Sebastiano Ursi, technik z naszego laboratorium. Aby przygotować bufor Tris EDTA o pH 8,0, dodaj 200 mikrolitrów 0,5 molowego EDTA i jeden mililitr jednego molowego chlorku Tris do zlewki, a następnie dostosuj objętość do 100 mililitrów sterylną wodą i przechowuj w temperaturze pokojowej. Następnie przygotuj jeden litr 10-krotnego roztworu podstawowego buforu do elektroforezy, dodając wszystkie odczynniki, a następnie przechowuj bufor w temperaturze pokojowej.Następnie przygotuj barwnik ładujący żel, dodając wszystkie odczynniki, a następnie doprowadź objętość do 100 mililitrów sterylną wodą. Po przygotowaniu przechowuj barwnik w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez kilka miesięcy. Dodaj 450 mililitrów wody do 50 mililitrów buforu 10X TBE, aby przygotować roztwór buforu 1X TBE.Dodaj cztery gramy agarozy w 200 mililitrach buforu 1X TBE razem w 600-mililitrowej zlewce, aby przygotować 200 mililitrów 2% żelu agarozowego. Zestalony żel agarozowy przechowywany w temperaturze pokojowej można ponownie rozpuścić we wrzącej łaźni wodnej o temperaturze 60 stopni przez 15 do 20 minut lub w kuchence mikrofalowej przez 35 minut, dodając niewielką objętość wody w celu skompensowania wzrostu stężenia agarozy. Mieszaj zlewkę w mikserze magnetycznym przez około pięć minut, aż agaroza zostanie zawieszona, a następnie podgrzej agarozę na gorącej płycie przez około 10 minut lub w kuchence mikrofalowej przez trzy minuty, aż całkowicie się rozpuści.Po oczyszczeniu DNA delikatnie wymieszaj świeże próbki DNA za pomocą probówek do pipetowania. Obowiązkowe jest uzyskanie od 10 do 50 nanogramów dobrej jakości matrycy DNA wyekstrahowanej z próbek ludzkich. Z tego powodu wolimy stosować automatyczne oczyszczanie DNA niż półautomatyczne lub ręczne.Aby rozpocząć oczyszczanie, najpierw określ ilościowo i oblicz czystość DNA, mierząc absorbenty przy 260, 280 i 320 nanometrach, a następnie rozcieńcz próbki sterylną wodą. Następnie skalibruj spektrofotometr. Aby utworzyć reakcję PCR, dodaj wszystkie odczynniki, aby przygotować 25 mikrolitrów głównej mieszanki PCR w 0,2 mililitrowej probówce do mikroamplifikacji.Następnie umieść probówki PCR w automatycznym termocyklerze i amplifikuj oczyszczone próbki DNA. Po zakończeniu programu przerwij reakcję, pozostawiając probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Dodaj 10X bufor enzymatyczny pięć jednostek na mikrolitr enzymu restrykcyjnego w wolnej wodzie DNA do objętości 22,5 mikrolitra.Następnie dodaj 2,5 mikrolitra produktu PCR do nowej probówki PCR, a następnie dodaj 22,5 mikrolitra mieszanki trawienia restrykcyjnego do produktu PCR. Inkubować główną mieszankę mineralizacji z ograniczeniami produktu PCR w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery godziny, a następnie dodać 0,5 mikrograma na mililitr bromku etydyny, aby zabarwić żel przez 10 minut. Wlej żel na tackę na żel z założonym grzebieniem, aby żel zastygł.Teraz wlej pudełko żelowe z buforem 1X TBE, aż żel zostanie pokryty. Za pomocą cienkich końcówek załaduj sześć mikrolitrów amplifikowanego, strawionego DNA do dołków utworzonych w żelu, a następnie dodaj również marker DNA w oddzielnym dołku równolegle do próbki. Następnie włącz jednostkę do elektroforezy.W celu zidentyfikowania polimorfizmu genetycznego C924T w genie TBXA2R przeprowadza się analizę RFLP. W żelu wyświetla dwie prążki na 395 i 144 parach zasad dla wersji dzikiego allelu głównego, podczas gdy pojedyncze prążki na 539 parach zasad dla zmutowanej wersji mniejszego allelu wskazują na brak cięcia przez enzym restrykcyjny. Co ciekawe, dla allelu heterozygotycznego występują trzy prążki w 395, 144 i 539 parach zasad.Następnie polimorfizm C924T jest potwierdzany za pomocą analizy sekwencji. Podświetlona sekwencja reprezentuje polimorfizm. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około osiem godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że ta metoda może być stosowana tylko w przypadku niewielkiej liczby wycinków i kilku próbek w sesji roboczej. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak analiza snipa, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak znaczenie innych szlaków obejmujących procesy miażdżycowe. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie biologii molekularnej do zbadania wariacji genetycznych wyróżniających się w tym początkowym rozwoju i postępie.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ocenić genotyp receptora tromboksanu A2 w odniesieniu do polimorfizmu C924T za pomocą analizy elektroforezy żelowej próbek PCR-RFLP. Nie zapominaj, że praca z bromkiem etydyny i źródłami światła UV może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak rękawice, okulary ochronne lub maska na twarz i inne urządzenia ochronne.

a-method-to-study-c924t-polymorphism-thromboxane-a2-receptor

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Ten protokół przedstawia kompletną i szczegółową procedurę zastosowania sekwencjonowania RNA, potężnej technologii sekwencjonowania DNA nowej generacji, do profilowania transkryptomów w ludzkich komórkach śródbłonka mikronaczyniowego płuc z leczeniem trombiną lub bez. Protokół ten można uogólnić na różne komórki lub tkanki dotknięte różnymi odczynnikami lub stanami chorobowymi.

Analiza sekwencyjna RNA transkryptomów w ludzkich komórkach śródbłonka mikronaczyniowego płuc leczonych trombiną i kontrolnych

Ten film demonstruje tandemowe oczyszczanie powinowactwa — technikę oczyszczania kompleksów białkowych z komórek eukariotycznych w celu zbadania interakcji białko-białko. Kompleks zawiera dwa białka znakowane różnymi znacznikami epitopów. Po oczyszczeniu kompleksu za pomocą dwóch żywic o powinowactwie do dwóch różnych znaczników w sposób sekwencyjny, obecność obu białek w elucie potwierdza oddziaływanie między nimi.

Tandemowy test oczyszczania powinowactwa do badania interakcji białko-białko

Tutaj opisujemy innowacyjną metodę określania polimorfizmów długości receptora dopełniacza 1 (CR1) do wykorzystania w wielu zastosowaniach, szczególnie w ocenie podatności na choroby takie jak choroba Alzheimera (AD). Metoda ta może być przydatna do lepszego zrozumienia roli izoform CR1 w patogenezie choroby Alzheimera.

Genotypowanie polimorfizmu długości receptora dopełniacza 1 metodą topnienia w wysokiej rozdzielczości: innowacyjne narzędzie do oceny podatności genów choroby Alzheimera

Przedstawiono łatwy test fluorescencyjny w celu oceny skuteczności par syntetazy amino-acyl-tRNA/tRNA zawierających niekanoniczne aminokwasy (ncAA) do białek ulegających ekspresji w komórkach ssaków. Opisano zastosowanie ncAA do badania receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR), w tym fotosieciowanie miejsc wiązania i bioortogonalne znakowanie GPCR na żywych komórkach.

Optymalizacja genetycznego włączenia sond chemicznych do GPCR w celu mapowania fotosieciowania i chemii bioortogonalnej w żywych komórkach ssaków

Ten protokół opisuje kluczowe kroki i środki ostrożności wymagane do przeprowadzenia reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w pojedynczej komórce po patch-clamp. Technika ta jest prostą i skuteczną metodą analizy profilu ekspresji z góry określonego zestawu genów z pojedynczej komórki, charakteryzującego się zapisami patch-clamp.

Reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją w monokomórkach po patch-clamp

Opisana tutaj jest metoda celowanej, bezznacznikowej delecji genu w Chlamydia trachomatis przy użyciu mutagenezy wymiany alleli w kasecie floksowanej, FLAEM.

Bezmarkerowa delecja genu przez mutagenezę wymiany alleli w kasecie floksowanej w Chlamydia trachomatis

Synergiczne kombinacje leków są trudne i czasochłonne do empirycznego zidentyfikowania. W tym miejscu opisujemy metodę identyfikacji i walidacji synergicznych małych cząsteczek.

Wysokoprzepustowa identyfikacja synergicznych kombinacji leków metodą Overlap2

W miarę jak warianty genetyczne związane z chorobami ludzkimi zaczynają być odkrywane, coraz ważniejsze staje się opracowanie systemów, za pomocą których można szybko ocenić biologiczne znaczenie tych zidentyfikowanych wariantów. Protokół ten opisuje metody oceny funkcji ludzkich genów podczas mejozy żeńskiej I przy użyciu mysich oocytów.

Wykorzystanie oocytów myszy do oceny funkcji ludzkich genów podczas mejozy I

Tutaj opisujemy protokół uzyskiwania danych o sekwencji amplikonów mikrobiomów gleby, ryzosfery i korzeni. Informacje te mogą być wykorzystane do zbadania składu i różnorodności zbiorowisk mikrobiologicznych związanych z roślinami i nadają się do stosowania w odniesieniu do szerokiej gamy gatunków roślin.

Badanie mikrobiomu korzeni: ekstrakcja danych o społeczności bakteryjnej z gleby, ryzosfery i endosfery korzeni

Identyfikacja fizycznych interakcji między genami a elementami regulatorowymi jest trudna, ale została ułatwiona dzięki metodom wychwytywania konformacji chromosomów. Ta modyfikacja protokołu 4C-seq łagodzi stronniczość PCR, minimalizując nadmierną amplifikację matryc PCR i maksymalizując mapowalność odczytów poprzez włączenie etapu trawienia enzymu ograniczającego dodawanie.

Wysokoprzepustowa identyfikacja sekwencji regulatorowych genów przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji wychwytywania konformacji chromosomów kołowych (4C-seq)

Poznaj metodę analizy polimorfizmu C924T genu TBXA2R w badaniach nad zakrzepicą i hemostazą. Technika PCR-RFLP umożliwia szybką identyfikację alleli dzikich i mutacyjnych w próbkach ludzkich.

Metoda badania polimorfizmu C924T genu receptora tromboksanu A2

Przeglądaj więcej filmów