Name: Śledzenie ruchów tkanki wsierdzia poprzez fotokonwersję komórek w zarodku danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Poznaj metodę śledzenia komórek wsierdzia podczas formowania zastawek serca u zarodków Danio rerio. Technika fotokonwersji białka Kaede pozwala pokonać trudności związane z szybkim biciem serca w tradycyjnej mikroskopii czasowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Anne-Laure Duchemin, Denise Duchemin, Nathalie Faggianelli i Basile Gurchenkov za pomoc w zaprojektowaniu i wykonaniu formy opisanej w tym protokole. Prace te były wspierane przez FRM (DEQ20140329553), ANR (ANR-15-CE13-0015-01, ANR-12-ISV2-0001-01), EMBO Young Investigator Program, Wspólnotę Europejską, ERC CoG N°682938 Evalve oraz przez grant ANR-10-LABX-0030-INRT, francuski fundusz państwowy zarządzany przez Agence Nationale de la Recherche w ramach programu ramowego Investissements d'Avenir o nazwie ANR-10-IDEX-0002-02.

1. Przygotowanie form i montaż agarozy
<ol>
	<li>Utwórz formę o wymiarach pokazanych w <silna klasa="xfig">Rysunek 1 za pomocą drukarki 3D lub tradycyjnych mechanicznych narzędzi warsztatowych.</li>
	<li>Odpipetować około 1,5 ml stopionej 1% agarozy do plastikowego naczynia montażowego o średnicy 35 mm. Umieść plastikową formę w płynnej agarozie, uważając, aby nie uwięzić powietrza między formą a agarozą. Naczynie nastawiamy w temperaturze 4°C, czekamy aż agaroza stwardnieje (trwa to około 5 minut), a następnie wyjmujemy plastikową foremkę.</li>
	<li>Aby przechowywać naczynie montażowe do późniejszego wykorzystania, przykryj naczynie pokrywką, a następnie szczelnie owiń zarówno naczynie, jak i pokrywkę parafilmem. Naczynie montażowe można następnie przechowywać pokrywą skierowaną w dół do 5 dni w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotuj wcześniej 1 ml podwielokrotności 0,7 % agarozy o niskiej temperaturze topnienia w 1,5 ml probówek Eppendorfa do użycia w dniu montażu. 
	UWAGA: Studzienki agarozowe naczynia montażowego odkształcają się z czasem, gdy woda odparowuje, jeśli parafilm nie jest szczelnie owinięty wokół naczyń.</li>
</ol>
2. Pozyskiwanie zarodków do fotokonwersji
<ol>
	<li>Przekrocz linię Tg(fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede) i wyhoduj około 200 zarodków w pożywce zarodkowej w ciemności w temperaturze 28,5 °C. Więcej informacji na temat krzyżowania linii ryb danio pręgowanego można znaleźć w bazie danych JoVE Science Education Database11.</li>
	<li>Po 5 godzinach, ale przed upływem 24 godzin, należy potraktować zarodki 1-fenylo-2-tiomocznikiem (PTU), aby zapobiec tworzeniu się pigmentu (0,003 % PTU w pożywce dla zarodków).</li>
	<li>Około 1 godzinę przed rozpoczęciem fotokonwersji należy przeprowadzić badania przesiewowe zarodków pod fluorescencyjnym stereoskopem i wybrać 5 zdrowych zarodków, które wydają się wyrażać najjaśniejszą zieloną fluorescencję. Zaleca się stosowanie światła o niskim natężeniu podczas wizualizacji zarodków, aby uniknąć ekspozycji zarodków na światło otoczenia, aby uniknąć fotokonwersji Kaede w komórkach niespecyficznych.</li>
</ol>
3. Osadzanie
<ol>
	<li>Przygotować 10 ml pożywki montażowej: 0,02 % trikainy i 50 ml BDM w pożywce dla zarodków.</li>
	<li>Dodaj 2 ml pożywki montażowej do naczynia montażowego i odczekaj 15-30 minut, aż roztwór dyfunduje do agarozy.</li>
	<li>W międzyczasie rozpuść 1 ml podwielokrotności 0,7% agarozy o niskiej temperaturze topnienia (LMP), umieszczając probówkę w bloku grzewczym o temperaturze 70 °C na około 5 minut.
	<ol>
		<li>Poczekaj, aż agaroza LMP lekko ostygnie, a następnie dodaj 25 μl roztworu trikainy o stężeniu 8 mg/ml i 40 μl roztworu 1M BDM do probówki z agarozą o niskiej temperaturze topnienia. Mieszać pipetując w górę i w dół, a następnie przenieść probówkę do bloku grzewczego o temperaturze 38 °C, aby utrzymać agarozę LMP w stanie ciekłym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Na szalce Petriego z pożywką dla zarodków ostrożnie zdekorionować wstępnie wybrane zarodki pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą kleszczy, uważając, aby nie uszkodzić zarodków.</li>
	<li>Przenieść zarodki do oddzielnego naczynia zawierającego 2 ml podłoża montażowego.
	<ol>
		<li>Po zatrzymaniu serc zarodków (trwa to około 5-10 minut), przenieś zarodki do naczynia montażowego i ułóż zarodki w dołkach za pomocą kleszczy tak, aby leżały pod kątem 25 stopni, ogonami skierowanymi w stronę głębszej części studzienki, żółtkiem skierowanym do góry.</li>
		<li>Gdy zarodki są mniej więcej na swoim miejscu, usuń pożywkę, osadź zarodki w ~200 μl 0,7% agarozy LMP zawierającej trikainę i BDM i ponownie dostosuj pozycje zarodków, przechylając zarodki w lewo lub w prawo, w zależności od potrzeb.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Poczekaj, aż agaroza LMP stężeje (trwa to około 5 minut), a następnie dodaj do naczynia podłoże montażowe. Zarodki są teraz gotowe do fotokonwersji. 
	UWAGA: Trikaina i BDM są używane odpowiednio do znieczulenia zarodków i zatrzymania serca zarodków. Nośnik montażowy można przygotować dzień przed obrazowaniem, ale należy pamiętać o ochronie nośnika przed światłem. 
	UWAGA: Prawidłowe ułożenie zarodków jest ważne, aby umożliwić wyraźną ścieżkę lasera do komórek, które mają zostać fotokonwertowane. Umieść głowę zarodka blisko początku studzienki, aby światło lasera nie musiało podróżować daleko, aby dotrzeć do zarodka i aby zarodki można było łatwo zdemontować po fotokonwersji.</li>
</ol>
4. Konwersja zdjęć
<ol>
	<li>Na pionowym mikroskopie konfokalnym (takim jak Leica SP8) wyposażonym w źródło lasera o długości fali 405 nm, 488 nm i 561 nm, zlokalizuj serce zarodka za pomocą przechodzącego światła białego (jasne pole) i soczewki obiektywu (np. obiektyw Leica HCX IRAPO L, 25 ×, N.A. 0.95). Sprawdź czerwoną fluorescencję Kaede za pomocą lasera 561 nm (tj. lasera DPSS 561, o intensywności ~5 %, detektor ustawiony na 589-728 nm). Następnie należy uwidocznić wsierdzie za pomocą lasera o długości fali 488 nm (tj. wieloliniowy laser argonowy o mocy 30 mW o intensywności ~5 %, detektor ustawiony na 502-556 nm).</li>
	<li>Wejdź w tryb "FRAP" w oprogramowaniu do akwizycji mikroskopu. Wybierz ~1 % mocy lasera zarówno dla laserów 488 nm, jak i 561 nm.</li>
	<li>Skoncentruj się na płaszczyźnie zainteresowania, wybierz obszar zainteresowania (ROI), a następnie fotokonwertuj komórki za pomocą lasera diodowego 405 nm o mocy lasera 25%, skanując ROI trzykrotnie. Jeśli niewystarczająca ilość Kaede zostanie fotokonwersja w ROI, ponownie zeskanuj laser 405 nm nad obszarem trzy razy. Powtórz ten krok dla wszystkich zwrotów z inwestycji.</li>
	<li>Wróć do trybu "TCS SP8" w oprogramowaniu i uzyskaj stos z, używając sekwencyjnie laserów 561 nm i 488 nm. Upewnij się, że wybrałeś opcję "dwukierunkową", aby zwiększyć szybkość obrazowania. 
	UWAGA: Czas potrzebny na fotokonwersję i obrazowanie każdego zarodka jest różny. Wiadomo, że bicie serca jest ważne dla prawidłowego rozwoju zastawek serca, więc unikaj zatrzymywania serca na dłużej niż 30 minut, nawet jeśli oznacza to, że nie masz czasu na fotokonwersję wszystkich 5 zarodków. 
	UWAGA: Podczas procesu fotokonwersji należy stosować detektory PMT, natomiast po fotokonwersji zaleca się stosowanie detektorów hybrydowych ustawionych w tryb 'zliczania'. Dzieje się tak, ponieważ detektory hybrydowe są bardziej czułe i są w stanie generować obrazy lepszej jakości, ale łatwo ulegają uszkodzeniu w wyniku prześwietlenia.</li>
</ol>
5. Zdejmowanie fotokonwertowanych embrionów
<ol>
	<li>Po fotokonwersji użyj szklanej pipety, aby lekko docisnąć tuż nad główką zarodka, aby rozbić agarozę LMP, a następnie delikatnie zassaj zarodek.
	<ol>
		<li>Wysunąć zarodek ze szklanej pipety na szalkę Petriego o średnicy 35 mm zawierającą pożywkę zarodkową z PTU (w celu zmycia pożywki zawierającej BDM).</li>
		<li>Przenieść zarodek do studzienki na 6-dołkowej płytce zawierającej pożywkę dla zarodków z PTU. Na tym etapie należy zwrócić uwagę na to, który zarodek wchodzi do której studni, ponieważ jest to niezbędne do skorelowania pozycji komórek fotokonwertowanych na późniejszych etapach rozwoju.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Teraz, gdy zarodki zostały usunięte z pożywki zawierającej BDM, ich serca powinny zacząć ponownie bić w ciągu około 5 minut. Przywróć zarodki do ciemności w temperaturze 28,5 °C, aby umożliwić zarodkom dalszy normalny rozwój.</li>
</ol>
6. Obrazowanie fotokonwertowanych komórek w późniejszych stadiach embrionalnych
<ol>
	<li>Na pożądanym etapie zatrzymaj pracę serca i ponownie osadź zarodki, tak jak w kroku 3 tego protokołu, z istotną różnicą, że zarodki muszą być leczone BDM w oddzielnych, oznaczonych naczyniach, aby śledzić zarodki.</li>
	<li>W przypadku zarodków do 62 hpf należy uzyskać stosy Z wsierdzia przy użyciu 561 nm i 488 nm dla sygnałów fluorescencyjnych odpowiednio czerwonych i zielonych. W przypadku zarodków w stadiach starszych niż 62 hpf należy użyć lasera wielofotonowego ustawionego na 940 nm, aby zobrazować zielony Kaede zamiast lasera 488 nm.</li>
</ol>
7. Analiza obrazu dla zarodków poniżej 48 hpf
Uwaga: Ruchy tkanek AVC mogą być trudne do analizy ze względu na jego złożoną trójwymiarową strukturę. Aby określić ilościowo długość regionu fotokonwertowanego w AVC między dwoma regionami niefotokonwertowanymi lub długość regionu niefotokonwertowanego w AVC między dwoma regionami fotokonwertowanymi, pożądane może być odwzorowanie struktury trójwymiarowej na mapie dwuwymiarowej. Obrazy fotokonwertowanych zarodków uzyskane przed 48 hpf można analizować przy użyciu następującej metody.
<ol>
	<li>Zaimportuj pozyskane obrazy do Matlaba lub innego podobnego oprogramowania.</li>
	<li>Ręcznie wyznacz ROI, tj. wsierdzie, i nałóż maskę, aby usunąć sygnał poza ten obszar.</li>
	<li>Zastosuj próg intensywności na obrazie, aby zidentyfikować punkty na wsierdziu i wykreślić je w trzech wymiarach. Wyizoluj punkty odpowiadające najwęższej i najprostszej części AVC, usuwając ręcznie punkty, które nie są interesujące na przedsionku i komorze za pomocą polecenia wymazywania w oprogramowaniu.</li>
	<li>Użyj walca, aby dopasować punkty reprezentujące uzyskany w ten sposób AVC.</li>
	<li>Zdefiniuj układ odniesienia, aby porównać kilka próbek. Na przykład przyjmij środek masy punktów AVC jako początek układu odniesienia, a oś zamontowanego cylindra jako oś z.
	<ol>
		<li>Upewnij się, że dodatnie pozycje Z odpowiadają zawsze tej samej stronie serca (komorowej lub przedsionkowej).</li>
		<li>Rzutuj punkty AVC na płaszczyznę x-y i użyj elipsy, aby je dopasować.</li>
		<li>Obrócić punkty wsierdzia wokół osi z tak, aby główna oś elipsy i oś y układu odniesienia były równoległe, a dodatnie wartości y odpowiadały wewnętrznej stronie AVC w odniesieniu do zarodka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby podzielić AVC na segmenty, należy przeciąć trójwymiarowy zestaw danych kilkoma płaszczyznami uzyskanymi przez obrócenie półpłaszczyzny {y=0, x>0} w kierunku z.
	<ol>
		<li>Rzutuj intensywność sąsiednich pikseli na te płaszczyzny i zdefiniuj śródbłonek w spójny sposób. Na przykład ręcznie narysuj linię od przedsionka do komorowej strony AVC w połowie grubości śródbłonka.</li>
		<li>Interpoluj punkty linii reprezentujących śródbłonek za pomocą trójwymiarowego splajnu, korzystając z przybornika splajnu, aby reprezentować AVC za pomocą powierzchni. 
		UWAGA: Liczba płaszczyzn cięcia decyduje zarówno o dokładności segmentacji, jak i o czasochłonności tego kroku. Zwykle do osiągnięcia dobrych wyników wystarczy 8 samolotów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ położenie azymutalne każdego punktu na powierzchni AVC za pomocą współrzędnych cylindrycznych.
	<ol>
		<li>W każdym położeniu azymutalnym zdefiniuj krzywą parametryczną wzdłuż powierzchni AVC, obliczając długość łuku na powierzchni między kolejnymi punktami.</li>
		<li>Dla każdej krzywej parametrycznej zdefiniuj punkt na krzywej znajdujący się najbliżej środka AVC z zerem. Punkty AVC są zatem w pełni opisane przez ich położenie azymutalne i ich położenie na krzywej parametrycznej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozłóż AVC na dwuwymiarowy obraz, używając parametrycznego położenia punktów.</li>
	<li>Znajdź krawędzie obszaru do ilościowego określenia jako krawędzie obrazu binarnego wyznaczające stosunek intensywności kanałów fotokonwertowanych i niefotokonwertowanych. W razie potrzeby ręcznie skoryguj wynik.</li>
	<li>Oblicz długość łuku między krawędziami, aby obliczyć długość tkanki w funkcji położenia azymutalnego.</li>
</ol>

<ol><li>Chow, R. W., Vermot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rise+of+photoresponsive+protein+technologies+applications+in+vivo%3A+a+spotlight+on+zebrafish+developmental+and+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">The rise of photoresponsive protein technologies applications in vivo: a spotlight on zebrafish developmental and cell biology.</a> F1000Res. 6, (2017).</li>
<li>Sehnert, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+troponin+T+is+essential+in+sarcomere+assembly+and+cardiac+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Cardiac troponin T is essential in sarcomere assembly and cardiac contractility.</a> Nat Genet. 31, 106-110 (2002).</li>
<li>Peal, D. S., Lynch, S. N., Milan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+and+development+of+the+atrioventricular+canal+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Patterning and development of the atrioventricular canal in zebrafish.</a> J Cardiovasc Transl Res. 4, 720-726 (2011).</li>
<li>Boselli, F., Freund, J. B., Vermot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+flow+mechanics+in+cardiovascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Blood flow mechanics in cardiovascular development.</a> Cell Mol Life Sci. 72 (13), 2545-2559 (2015).</li>
<li>Steed, E., Boselli, F., Vermot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamics+driven+cardiac+valve+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Hemodynamics driven cardiac valve morphogenesis.</a> Biochim Biophys Acta. , (2015).</li>
<li>Boselli, F., Vermot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+and+modeling+for+shear+stress+quantification+in+the+embryonic+zebrafish+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Live imaging and modeling for shear stress quantification in the embryonic zebrafish heart.</a> Methods. , (2015).</li>
<li>Steed, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((klf2a+couples+mechanotransduction+and+zebrafish+valve+morphogenesis+through+fibronectin+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">klf2a couples mechanotransduction and zebrafish valve morphogenesis through fibronectin synthesis.</a> Nat Commun. 7, 11646(2016).</li>
<li>Herwig, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+cellular+mechanisms+of+blood+vessel+fusion+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinct cellular mechanisms of blood vessel fusion in the zebrafish embryo.</a> Curr Biol. 21 (22), 1942-1948 (2011).</li>
<li>Boselli, F., Steed, E., Freund, J., Vermot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+shear+stress+patterns+predict+the+orientation+of+convergent+tissue+movements+in+the+embryonic+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Anisotropic shear stress patterns predict the orientation of convergent tissue movements in the embryonic heart.</a> Development. , (2017).</li>
<li>Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Tracking+Using+Photoconvertible+Proteins+During+Zebrafish+Development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development.</a> J. Vis. Exp. (67), (2012).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="NULL">Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Breeding and Embryo Handling</a>. , JoVE. Cambridge, MA. (2017).</li>
<li>Watanabe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+effect+of+2%2C3-butanedione+monoxime+%28BDM%29+on+Na%28%2B%29%2FCa%282%2B%29+exchange+current+in+guinea-pig+cardiac+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes.</a> Br J Pharmacol. 132 (6), 1317-1325 (2001).</li>
<li>Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blebbistatin+effectively+uncouples+the+excitation-contraction+process+in+zebrafish+embryonic+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart.</a> Cell Physiol Biochem. 25 (4-5), 419-424 (2010).</li>
<li>Pestel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+3D+visualization+of+cellular+rearrangements+during+cardiac+valve+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Real-time 3D visualization of cellular rearrangements during cardiac valve formation.</a> Development. 143 (12), 2217-2227 (2016).</li>
<li>Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Long-Term+Imaging+of+Embryos+with+Genetically+Encoded+alpha-Bungarotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin.</a> PLoS One. 10 (8), e0134005(2015).</li>
<li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).</li>
<li>Marchant, J. S., Stutzmann, G. E., Leissring, M. A., LaFerla, F. M., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton-evoked+color+change+of+DsRed+as+an+optical+highlighter+for+cellular+and+subcellular+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multiphoton-evoked color change of DsRed as an optical highlighter for cellular and subcellular labeling.</a> Nat Biotechnol. 19 (7), 645-649 (2001).</li>
<li>Dempsey, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+single-cell+labeling+by+confined+primed+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo single-cell labeling by confined primed conversion.</a> Nat Methods. 12 (7), 645-648 (2015).</li>
<li>Mohr, M. A., Pantazis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+neuron+morphology+in+vivo+with+confined+primed+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Single neuron morphology in vivo with confined primed conversion.</a> Methods Cell Biol. 133, 125-138 (2016).</li>
<li>Mohr, M. A., Argast, P., Pantazis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+cellular+structures+in+vivo+using+confined+primed+conversion+of+photoconvertible+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Labeling cellular structures in vivo using confined primed conversion of photoconvertible fluorescent proteins.</a> Nat Protoc. 11 (12), 2419-2431 (2016).</li>
<li>Mohr, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+Engineering+of+Photoconvertible+Fluorescent+Proteins+for+Dual-Color+Fluorescence+Nanoscopy+Enabled+by+a+Triplet-State+Mechanism+of+Primed+Conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Rational Engineering of Photoconvertible Fluorescent Proteins for Dual-Color Fluorescence Nanoscopy Enabled by a Triplet-State Mechanism of Primed Conversion.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 56 (38), 11628-11633 (2017).</li>
<li>Dempsey, W. P., Fraser, S. E., Pantazis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PhOTO+zebrafish%3A+a+transgenic+resource+for+in+vivo+lineage+tracing+during+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">PhOTO zebrafish: a transgenic resource for in vivo lineage tracing during development and regeneration.</a> PLoS One. 7 (3), e32888(2012).</li>
<li>Dempsey, W. P., Qin, H., Pantazis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cell+tracking+using+PhOTO+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo cell tracking using PhOTO zebrafish.</a> Methods Mol Biol. 1148, 217-228 (2014).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Czas fotokonwersji: Chociaż Kaede pozostaje jasno wyrażona w EdC nawet przy 96 hpf, należy zauważyć, że wraz ze wzrostem zarodka światło laserowe rozprasza się bardziej, zanim dotrze do AVC, co utrudnia ograniczoną fotokonwersję Kaede. W stadiach embrionalnych późniejszych niż 55 hpf balonowanie komory i przedsionka oznacza również, że fioletowa wiązka lasera używana do fotokonwersji nie może dotrzeć do komórek AVC bez uprzedniego przejścia przez przedsionek lub komorę. Oznacza to, że powyżej 55 hpf, aby fotokon...

Danio pręgowany jest obecnie jednym z najważniejszych modeli kręgowców do badania procesów komórkowych i rozwojowych in vivo. Wynika to w dużej mierze z optycznej przezroczystości danio pręgowanego i jego podatności na genetykę, co czyni go potężnym modelem do stosowania technik optycznych obejmujących genetycznie kodowane technologie białek reagujących na światło1. Specyficznie dla badań nad rozwojem serca, danio pręgowany otrzymuje wystarczającą ilość tlenu poprzez dyfuzję, tak że nawet mutanty bez bicia serca mogą przetrwać przez pierwszy tydzień rozwoju, co pozwala na analizy wpływu genów rozwojowych i zaburzonego przepływu krwi na morfogenezę serca, co nie jest możliwe u większości kręgowców2.
Rurka serca danio pręgowanego powstaje po 24 godzinach od zapłodnienia (hpf). Wkrótce po jego utworzeniu rurka sercowa zaczyna aktywnie bić. Przy 36 hpf wyraźne zwężenie oddziela przedsionek od komory. Ten obszar zwężenia nazywany jest kanałem przedsionkowo-komorowym (AVC), a komórki w tym regionie zmieniają morfologię z płaskonabłonkowej na morfologię prostopadłościenną3. Morfogeneza zastawki przedsionkowo-komorowej danio pręgowanego rozpoczyna się około 48 godzin po zapłodnieniu. Po 5 dniach od zapłodnienia dwie płatki zastawki rozciągają się do AVC i zapobiegają cofaniu się krwi z komory do przedsionka podczas cyklu pracy serca4. Śledzenie komórek podczas tworzenia AVC i zastawki jest trudne, ponieważ szybkie bicie serca utrudnia śledzenie komórek za pomocą tradycyjnej mikroskopii poklatkowej5,6. Ten protokół, zaadaptowany z Steed et al., 20167, opisuje metodę, która wykorzystuje Tg(fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede)8 linii transgenicznej danio pręgowanego, w której fotokonwertowalne białko Kaede ulega ekspresji w komórkach śródbłonka, w tym w wsierdziu. Lek 2,3-butanodione-2-monoksymu (BDM) jest stosowany w celu tymczasowego zatrzymania bicia serca, umożliwiając dokładną fotokonwersję EdC między 36 a 55 hpf oraz obrazowanie w wysokiej rozdzielczości fotokonwertowanych EdC w określonych punktach czasowych rozwoju. Wcześniej wykazano, że EdC fotokonwertowane przy użyciu tej metody mogą pozostać rozpoznawalne od swoich nieprzekonwertowanych sąsiadów przez pięć dni lub dłużej po czasie fotokonwersji7. Protokół ten szczegółowo opisuje również metodę stosowaną do analizy obrazu fotokonwertowanych EdC w zarodkach młodszych niż 48 hpf, która została z powodzeniem wykorzystana do śledzenia ruchów tkanek podczas rozwoju AVC (Boselli et al., w druku)9. Mamy nadzieję, że czytelnicy uznają ten protokół za przydatny do badania AVC i rozwoju zastawek w normalnych zarodkach oraz w mutantach, morfantach lub zarodkach leczonych lekami. Aby zapoznać się z bardziej ogólnym protokołem odnoszącym się do śledzenia komórek za pomocą fotokonwertowalnych białek podczas rozwoju danio pręgowanego, zapoznaj się z artykułem Lombardo et al., 201210.

<table><tbody><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Niezbędny sprzęt do hodowli ryb i zbierania ikry (szczegóły w Księdze Danio pręgowanego22).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pionowy mikroskop konfokalny (wyposażony w lasery pracujące przy 488 nm, 561 nm i 405 nm, przestrajalny laser wielofotonowy i obiektyw Leica HCX IRAPO L, 25 &times;, N.A. 0.95)</td><td>Leica</td><td>Leica SP8</td><td></td></tr><tr><td>Blok grzewczy</td><td>ThermoScientific</td><td>88870001</td><td></td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm naczynie do hodowli tkankowych</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>szalka</td><td></td><td></td><td></td>Petriego</tr><tr><td>Kleszcze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta</td><td></td><td></td><td></td>szklana</tr><tr><td>Pleśń</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><mocne>Odczynniki</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8 mg/ml Roztwór podstawowy trikainy&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M roztwór podstawowy</td><td></td><td></td><td></td>BDM</tr><tr><td>UltraPure o niskiej temperaturze topnienia</td><td>Invitrogen</td><td>16520-050</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>PTU (1-fenylo-2-tiomocznik)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka zarodkowa: 30x roztwór</td><td></td><td></td><td></td> podstawowy</tr><tr><td>Oprogramowanie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab wyposażony w Zestaw narzędzi do analizy obrazu, dopasowania krzywych, bioformatów</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8 mg/ml roztwór podstawowy trikainy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 mg trikainy w proszku (kwas metanosulfonowy 3-aminobenzoesanu etylu)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>25 ml Danieau</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dostosować do pH 7, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 & stopni; C&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><mocny>1 M roztwór podstawowy BDM</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 g BDM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>112135</td><td></td></tr><tr><td>10 ml ddH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aliquot i przechowywać w temperaturze -20 °; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pożywka zarodkowa: 30x roztwór podstawowy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50,7 g NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>0,78 g KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>1,47 g Siarczan magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; 7487-88-9</td><td></td></tr><tr><td>2,1 g Tetrahydrat azotynu wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13477-34-4</td><td></td></tr><tr><td>19,52 g KWAS HEPES (4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Dostosować do pH 7,2 i przechowywać w temperaturze</td><td></td><td></td><td></td> pokojowej</tr><tr><td>Mold</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Żywica PlasCLEAR</td><td>Asiga</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plus 39&nbsp; Drukarka 3D Freeform Pico</td><td>Asiga</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Śledzenie ruchów tkanki wsierdzia poprzez fotokonwersję komórek w zarodku danio pręgowanego

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

Podczas embriogenezy, komórki przechodzą dynamiczne zmiany w zachowaniu komórek, a rozszyfrowanie logiki komórkowej stojącej za tymi zmianami jest podstawowym celem w dziedzinie biologii rozwojowej. Odkrycie i opracowanie białek fotokonwertowalnych znacznie pomogło nam w zrozumieniu tych dynamicznych zmian, dostarczając metody optycznego wyróżniania komórek i tkanek. Jednak podczas gdy fotokonwersja, mikroskopia poklatkowa i późniejsza analiza obrazu okazały się bardzo skuteczne w odkrywaniu dynamiki komórkowej w narządach takich jak mózg czy oko, podejście to na ogół nie jest stosowane w rozwijającym się sercu ze względu na wyzwania związane z szybkim ruchem serca podczas cyklu sercowego. Protokół ten składa się z dwóch części. W pierwszej części opisano metodę fotokonwersji, a następnie śledzenia komórek wsierdzia (EdC) podczas rozwoju kanału przedsionkowo-komorowego (AVC) danio pręgowanego i zastawki przedsionkowo-komorowej serca. Metoda polega na czasowym zatrzymaniu pracy serca za pomocą leku, aby mogła zajść dokładna fotokonwersja. Serca mogą wznowić bicie po odstawieniu leku, a rozwój embrionalny trwa normalnie, dopóki serce nie zostanie ponownie zatrzymane w celu obrazowania w wysokiej rozdzielczości fotokonwertowanych EdC w późniejszym punkcie czasowym rozwoju. Druga część protokołu opisuje metodę analizy obrazu w celu ilościowego określenia długości fotokonwertowanego lub niefotokonwertowanego regionu w AVC u młodych zarodków poprzez mapowanie sygnału fluorescencyjnego ze struktury trójwymiarowej na dwuwymiarową mapę. Razem, dwie części protokołu pozwalają na zbadanie pochodzenia i zachowania komórek, które tworzą AVC danio pręgowanego i przedsionkowo-komorową zastawkę serca, i mogą być potencjalnie stosowane do badania mutantów, morfantów lub zarodków, które zostały potraktowane odczynnikami zakłócającymi rozwój AVC i / lub zastawki.

Przykład zarodka poddanego fotokonwersji w 48 hpf i ponownie obrazowanego w 80 hpf przedstawiono na Rysunku 2 oraz w Filmach 1 i 2. Naświetlanie białka Kaede światłem o długości fali 405 nm nieodwracalnie przekształca je z formy fluorescencyjnie zielonej w formę fluorescencyjnie czerwoną, co umożliwia śledzenie zachowania komórek znakowanych formą zieloną lub czerwoną w stosunku do ich sąsiadów o innym kolorze podczas formow...

Ten protokół opisuje metodę fotokonwersji białka fluorescencyjnego Kaede w komórkach wsierdzia żywego zarodka danio pręgowanego, która umożliwia śledzenie komórek wsierdzia podczas rozwoju kanału przedsionkowo-komorowego i zastawki przedsionkowo-komorowej serca.

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Ogólnym celem tej procedury jest monitorowanie komórek wsierdzia podczas tworzenia kanału przedsionkowo-komorowego i zastawki serca. Metoda ta może pomóc w rozwiązaniu kluczowych pytań w dziedzinie rozwoju serca, takich jak zrozumienie, jak zachowują się komórki wsierdzia w różnych typach mutantów. Śledzenie komórek podczas tworzenia AVC i zastawki jest trudne ze względu na szybkie bicie serca.Utrudnia to śledzenie komórek za pomocą tradycyjnej mikroskopii poklatkowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że omija niektóre z tych trudności. Procedurę zademonstruje Renee, doktor habilitowany w moim laboratorium.Po utworzeniu formy zgodnie z protokołem tekstowym należy odpipetować około 1,5 mililitra stopionej 1% agarozy do 35-milimetrowego plastikowego naczynia montażowego. Następnie umieść plastikową formę w ciekłej agarozie, uważając, aby nie uwięzić powietrza między formą a agarozą. Postaw naczynie na cztery stopnie Celsjusza, aż agaroza stwardnieje.Następnie wyjmij plastikową foremkę z agarozy. Następnie dodaj dwa mililitry wcześniej przygotowanego podłoża montażowego do naczynia montażowego i odczekaj od 15 do 30 minut, aż roztwór dyfunduje do agarozy. W międzyczasie rozpuść jed

following-endocardial-tissue-movements-via-cell-photoconversion

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisano szybką metodę immunobarwienia embrionalnego serca danio pręgowanego. W porównaniu z metodą immunobarwienia całych preparatów, metoda ta znacznie zwiększa penetrację przeciwciał, co pozwala na uzyskanie obrazów o wysokiej rozdzielczości, ujawniających struktury komórkowe i podkomórkowe w sercu przy znacznie krótszym czasie przetwarzania.

Immunobarwienie wypreparowanego serca embrionalnego ryby danio

W niniejszym materiale przedstawiamy metodę fotoaktywnego przełączania fotokonwertowalnych białek fluorescencyjnych (PCFPs) w żywym embrionie danio-pręgowanego oraz dalsze śledzenie fotokonwertowanego białka w określonych punktach czasowych podczas rozwoju. Metodologia ta umożliwia monitorowanie zdarzeń biologii komórkowej leżących u podstaw różnych procesów rozwojowych w żywym organizmie kręgowca.

Śledzenie komórek za pomocą białek fotokonwertowalnych podczas rozwoju ryby danio-ostrogonia

Opisany tutaj jest protokół półautomatycznego obrazowania specyficznej tkankowo fluorescencji w zarodkach danio pręgowanego.

Półautomatyczne obrazowanie specyficznej tkankowo fluorescencji w zarodkach danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół, który pokazuje, jak fotokonwersja komórek jest osiągana poprzez ekspozycję na promieniowanie UV na określone obszary wyrażające białko fluorescencyjne, Eos, u żywych zwierząt.

Fotokonwersja jednokomórkowa u żyjących nienaruszonych danio pręgowanych

Tutaj pokazujemy proces tworzenia linii reportera napięcia elektrycznego komórkowego do wizualizacji rozwoju embrionalnego, ruchu i komórek nowotworowych ryb in vivo.

Wizualizacja komórkowej aktywności elektrycznej we wczesnych zarodkach i nowotworach danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół wizualizacji rozwijających się serc u danio pręgowanego w 4-Dimensions (4-D). Obrazowanie 4D, za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z arkuszami świetlnymi (LSFM), wykonuje trójwymiarowe (3-D) obrazy w czasie, aby zrekonstruować rozwijające się serca. Pokazujemy jakościowo i ilościowo, że naprężenie ścinające aktywuje sygnalizację wsierdzia Notch podczas rozwoju komory, co sprzyja trabekulacji serca.

Mikroskopia fluorescencyjna arkuszy świetlnych w celu uchwycenia 4-wymiarowych obrazów wpływu modulacji naprężeń ścinających na rozwijające się serce danio pręgowanego

Opisujemy zoptymalizowane narzędzia do badania serca danio pręgowanego in vivo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą arkusza świetlnego. W szczególności sugerujemy jasne transgeniczne linie serca i prezentujemy nowe techniki delikatnego osadzania i unieruchamiania, które pozwalają uniknąć wad rozwojowych i wad serca. Przewidziano również możliwy potok pozyskiwania i analizy danych dostosowany do obrazowania serca.

Mikroskopia świetlna szybkiej dynamiki serca w zarodkach danio pręgowanego

Ten protokół wykorzystuje obrazowanie za pomocą arkusza świetlnego do badania funkcji skurczu serca u larw danio pręgowanego i uzyskania wglądu w mechanikę serca poprzez śledzenie komórek i interaktywną analizę.

Obrazowanie 4D Light-sheet skurczu serca danio pręgowanego

Protokół ten opisuje tanią metodę mikroskopii świetlnej do oceny morfologii i funkcji serca w embrionach danio pręgowanych, umożliwiającą powtarzalną ocenę rozwojowej kardiotoksyczności bez potrzeby stosowania zaawansowanych systemów obrazowania.

Funkcjonalne obrazowanie serca w zarodkach danio dano za pomocą standardowej mikroskopii i analizy wideo: zastosowania w badaniach środowiskowych i biomedycznych

Poziomy białka w komórkach i tkankach są często ściśle regulowane przez równowagę produkcji białka i jego usuwania. Korzystając z rozpadu fluorescencji po fotokonwersji (FDAP), kinetykę klirensu białek można eksperymentalnie zmierzyć in vivo.

Pomiar stabilności białek w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą rozpadu fluorescencji po fotokonwersji (FDAP)

Poznaj metodę śledzenia komórek wsierdzia podczas formowania zastawek serca u zarodków Danio rerio. Technika fotokonwersji białka Kaede pozwala pokonać trudności związane z szybkim biciem serca w tradycyjnej mikroskopii czasowej.

Śledzenie ruchów tkanki wsierdzia poprzez fotokonwersję komórek w zarodku danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów