Name: Replikacja uporządkowanej, nieredundantnej biblioteki mutantów insercji transpozonów Pseudomonas aeruginosa szczepu PA14 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 35 s
Description: Poznaj protokół replikacji biblioteki mutantów transpozonowych Pseudomonas aeruginosa PA14NR z zachowaniem integralności próbek. Metoda obejmuje kontrolę jakości i minimalizację ryzyka zakażenia podczas pracy z bakteriami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Lisie Philpotts z MGH Treadwell Virtual Library za jej wskazówki w przeszukiwaniu bazy danych. Prace te były wspierane przez Fundację Mukowiscydozy (YONKER16G0 i HURLEY16G0) oraz NIH NIAID (BPH i ADE: R01 A1095338).

Autorzy nie informują o finansowych konfliktach interesów. Eliana Drenkard i Frederick Ausubel brali udział w tworzeniu biblioteki mutantów transpozonów PA14. Bryan Hurley i Lael Yonker obecnie przechowują i dystrybuują bibliotekę mutantów jako część Oddziału Pediatrii w Massachusetts General Hospital.

Plik P. aeruginosa powiedział: Zestaw PA14NR jest cennym zasobem dla społeczności naukowej. Zgodnie ze zbiorem danych z marca 2017 r. z bazy danych Essential Science Indicators firmy Clarivate Analytics, Liberati et al. (2006)37, który opisuje budowę zestawu PA14NR, znajduje się w czołówce 1% publikacji mikrobiologicznych. Google Scholar informuje o ponad 600 cytatach oryginalnego rękopisu Liberati et al. (2006) z sierpnia 2017 r. Biblioteka odegrała ważną rolę ...

Pseudomonas aeruginosa to fenotypowo i genotypowo zróżnicowana i zdolna do adaptacji bakteria Gram-ujemna, obecna w glebie, wodzie i większości środowisk ludzkich, a także mikroflory skóry. W porównaniu z wieloma gatunkami bakterii, P. aeruginosa ma stosunkowo duży genom 5,5-7 Mbp przy wysokiej zawartości G+C (65-67%). Co więcej, znaczna część jego genów jest zaangażowana w zdolności adaptacyjne metaboliczne i jest częścią sieci regulacyjnych, co pozwala na dużą elastyczność w odpowiedzi na stres środowiskowy1. P. aeruginosa wykazuje ekspresję wielu czynników wirulencji, wykazuje skłonność do tworzenia biofilmów, posiada zdolność koordynowania odpowiedzi poprzez wiele ścieżek quorum sensing i wykazuje znaczącą zdolność do rozwijania oporności i tolerancji na antybiotyki2,3,4,5,6,7,8. Cechy te stanowią poważne wyzwanie w leczeniu zakażeń wywołanych przez P. aeruginosa.
Przewlekłe infekcje P. aeruginosa mogą występować w wielu stanach chorobowych. Mukowiscydoza (CF), choroba genetyczna spowodowana mutacją genu CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator), powoduje zainfekowane wydzieliny w drogach oddechowych, postępujące rozstrzenie oskrzeli i ostatecznie śmierć z powodu niewydolności oddechowej9. W wieku dorosłym większość pacjentów z mukowiscydozą jest przewlekle zakażona P. aeruginosa, który odgrywa kluczową rolę w zachorowalności i śmiertelności związanej z tą chorobą10. Dodatkowo, pacjenci z ciężkimi oparzeniami 11, tracheostomia12, wymiany stawów13, lub cewniki na stałe14 są narażeni na zakażenie P. aeruginosa związane ze zdolnością bakterii do tworzenia biofilmów i ucieczki przed reakcjami zapalnymi gospodarza15. Co więcej, kolonizacja zachodzi bez konkurencji po wybraniu populacji opornej lub tolerancyjnej na wiele antybiotyków poprzez sekwencyjne leczenie przeciwdrobnoustrojowe o szerokim spektrum działania12,16,17,18. Lepsze zrozumienie patogenezy P. aeruginosa będzie miało znaczące implikacje dla wielu stanów chorobowych.
Kilka klinicznych izolatów P. aeruginosa, w tym szczepy PAO1, PA103, PA14 i PAK, zostało intensywnie przebadanych w celu zbadania różnych cech patogenezy P. aeruginosa. Szczep PA14 to izolat kliniczny, który należy do jednej z najczęstszych grup klonów na świecie19,20 i nie został intensywnie przebadany w laboratorium. PA14 jest wysoce zjadliwy w modelach infekcji kręgowców, z godnym uwagi profilem endotoksyn21, pili structure22, wyspy chorobotwórcze23, system wydzielania typu III (TTSS), cytotoksyczność w stosunku do komórek ssaków24 oraz profile w zakresie oporności i trwałości antybiotyków25. Co więcej, PA14 jest również wysoce zjadliwy w wielu systemach modelowych gospodarz-patogen, w tym w modelach infiltracji liści roślin26,27,Caenorhabditis elegans infection models28,29, modele owadów30,31, a także modele zapalenia płuc u myszy32,33 oraz modele oparzeń skóry<klasa SUP="xref">34.
Biblioteki mutantów całego genomu to zbiory izogenicznych mutantów w nieistotnych genach, które stanowią bardzo potężne narzędzia do zrozumienia biologii organizmu, umożliwiając analizę funkcji genów w skali genomowej. Dwie biblioteki mutantów transpozonów o niemal nasyceniu, zbudowane w P. aeruginosa, są obecnie dostępne do dystrybucji. Miejsca wstawiania transpozonów zostały określone dla obu bibliotek. Te tak zwane biblioteki nieredundantne ułatwiają badania całego genomu szczepów bakteryjnych, znacznie skracając czas i koszty związane z badaniami przesiewowymi niescharakteryzowanych losowych mutantów transpozonów. Biblioteka mutantów transpozonów P. aeruginosa PAO1, skonstruowana w izolacie MPAO1 szczepu PAO1 przy użyciu transpozonów ISphoA/hah i ISlacZ/hah35, jest kuratorowana przez laboratorium Manoil na Uniwersytecie Waszyngtońskim. Biblioteka składa się ze zweryfikowanej pod kątem sekwencji kolekcji 9 437 mutantów transpozonów, która zapewnia szeroki zakres genomu i zawiera dwie mutanty dla większości genów36. Informacje na temat biblioteki mutantów transpozonów P. aeruginosa PAO1 są dostępne na publicznej, dostępnej w Internecie stronie internetowej laboratorium Manoil pod adresem http://www.gs.washington.edu/labs/manoil/libraryindex.htm. Biblioteka mutantów nieredundantnych transpozonów szczepu PA14 szczepu PA14 (zestaw PA14NR) skonstruowana w szczepie PA14 przy użyciu transpozonów MAR2xT7 i TnphoA37 jest obecnie dystrybuowana przez Oddział Pediatrii w Massachusetts General Hospital. Zestaw PA14NR składa się z kolekcji ponad 5 800 mutantów z pojedynczymi insercjami transpozonów w nieistotnych genach37. Szczegóły dotyczące budowy zestawu PA14NR są opisane na ogólnodostępnej, dostępnej w Internecie stronie internetowej http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi?section=NR_LIB, która zawiera również różne narzędzia wyszukiwania online ułatwiające korzystanie z zestawu PA14NR.
Oryginalny zestaw PA14NR składał się z 5 459 mutantów, wybranych z obszernej biblioteki około 34 000 losowych mutantów insercji transpozonów, które odpowiadają 4 596 przewidywanym genom PA14 reprezentującym 77% wszystkich przewidywanych genów PA1437. Od czasu budowy biblioteki w 2006 roku dodawano nowe mutanty, a obecnie zestaw PA14NR zawiera ponad 5800 mutantów38, które reprezentują około 4600 genów PA14. Większość mutantów transpozonów PA14 została wygenerowana w wildtype background37. Szczegółowe informacje na temat każdego członka biblioteki mutantów, w tym tło genetyczne, są dostępne poprzez przeszukiwanie internetowej bazy danych lub poprzez pobranie arkusza kalkulacyjnego Nonredundant Library, obie funkcje są dostępne na stronie internetowej PA14 (http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi). Większość mutantów została stworzona przy użyciu transpozonu MAR2xT7 (MrT7), z małym zestawem stworzonym za pomocą transpozonu TnPhoA (phoA) class<sup="xref">37. Każdy transpozon posiada kasetę oporności na antybiotyki, która pozwala na selekcję mutantów za pomocą gentamycyny (MrT7) lub kanamycyny (phoA). Zestaw mutantów PA14NR jest przechowywany w sześćdziesięciu trzech 96-dołkowych płytkach i zawiera dwie dodatkowe 96-dołkowe płytki kontrolne, które składają się z dzikich dołków inokulowanych i nieinokulowanych PA14 interkalowanych w ustalony wzór. Format 96-dołkowej płytki w połączeniu z narzędziami wyszukiwania online znacznie ułatwia niestandardowe opracowywanie testów przesiewowych, które pozwalają użytkownikom łatwo zidentyfikować geny związane ze zmutowanymi fenotypami. Wyszukiwarki internetowe ułatwiają również wyszukiwanie i selekcję dodatkowych istotnych mutantów wymaganych do dalszych badań.
Biblioteki mutantów transpozonów PA14 i PAO1 są bardzo ważnymi globalnymi zasobami dla społeczności naukowej i uzupełniają się nawzajem w walidacji funkcji nieznanych genów i szlaków tego bakteryjnego patogenu. Przypadkowo, od czasu skonstruowania bibliotek mutacji transpozonów PAO1 i PA14, analiza sekwencjonowania pełnego genomu DNA wielu izolatów P. aeruginosa wykazała, że PAO1 i PA14 należą do różnych głównych podkladów filogenezy P. aeruginosa7,39,40,41. Ponieważ kliniczne izolaty P. aeruginosa są rozmieszczone w całej filogenezie, fakt, że PAO1 i PA14 należą do różnych podgrup P. aeruginosa, zwiększa wartość dwóch bibliotek mutacji transpozonów dla badań porównawczych.
Publikacje opisujące budowę i badania przesiewowe bibliotek mutantów bakteryjnych, w tym biblioteki P. aeruginosa35,37,42, są łatwo dostępne w literaturze. Jednakże, zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, nie są dostępne żadne opublikowane protokoły opisujące szczegółowe procedury i techniki stosowane do replikacji, konserwacji i walidacji bibliotek mutantów bakteryjnych.
Metodologia opisana w tej publikacji opisuje zestaw trzech protokołów, które ułatwiają korzystanie i utrzymanie zestawu PA14NR. Pierwszy protokół opisuje replikację biblioteki zgodnie z zaleceniami dla odbiorców zestawu PA14NR. Drugi protokół zawiera wytyczne dotyczące smugowania, hodowli i przechowywania poszczególnych mutantów zidentyfikowanych za pomocą zestawu PA14NR. Trzeci protokół opisuje techniki kontroli jakości, w tym amplifikację PCR fragmentów mutantów transpozonów, a następnie sekwencjonowanie w celu potwierdzenia tożsamości mutanta. Ten zestaw protokołów może być również dostosowany do replikacji i utrzymania innych bibliotek lub kolekcji mutantów bakteryjnych. Zdecydowanie zaleca się replikację bibliotek lub kolekcji zmutowanych bakterii w celu zachowania integralności "kopii wzorcowej" (otrzymanej oryginalnej kopii). Replikacja kilku kopii zestawu PA14NR do rutynowego użytku laboratoryjnego minimalizuje prawdopodobieństwo zanieczyszczenia kopii głównej przez odwiert.

<table><tbody><tr><td>Materiały do replikacji bibliotecznej</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylna 96-dołkowa hodowla tkankowa, przypadek 50</td><td>Corning Life Sciences</td><td>353072</td><td>za pośrednictwem Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Sterile 96 Well Clear V-Bottom 2000&mu; L Deep Well Plates, skrzynka 25</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3960</td><td>przez Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Nunc OmniTray (prostokątne płytki), skrzynka 60</td><td>Thermo Scientific Rochester</td><td>242811</td><td>przez Fisher</td></tr><tr><td>Scientific Rectangular Ice Pan, Midi (4L)</td> <td>Corning Life Sciences</td><td>432104</td><td>przez Fisher</td></tr><tr><td>Scientific Secure-Gard Cone Mask, skrzynka 300</td><td>Cardinal Health</td><td>AT7509</td><td>przez Fisher Scientific</td></tr><tr><td>AluminaSeal, opakowanie 100 sztuk</td><td>Diversified Biotech</td><td>ALUM-100</td><td>za pośrednictwem</td></tr><tr><td>membrany Fisher Scientific Breathe-Easy, opakowanie 100</td><td>sztuk Diversified Biotech</td><td>BEM-1</td><td>via Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Sterylne, pakowane pojedynczo, 50 ml koryto roztworu/zbiornik odczynnika, opakowanie 100</td><td>Sorenson</td><td>S50100</td><td>przez Westnet Incorporated</td></tr><tr><td>Wałek płytkowy</td><td>VWR</td><td>60941-118</td><td>via VWR</td></tr><tr><td>Cryo Laser Labels - CRYOLAZRTAG 2,64" x 0,277", opakowanie 16 arkuszy</td><td>GA International</td><td>RCL-11T1-WH</td><td>przez Labtag.com (szablon do druku dostępny również od Labtag.com)</td></tr><tr><td>96-dołkowy replikator</td><td>V & P Naukowy, Inc.</td><td>Custom 407C, średnica sworznia 3,18 mm, długość 57 mm</td><td>przez V & P Naukowy, Inc.</td></tr><tr><td>Multitron Pro, inkubator z wytrząsaniem 3 mm</td><td>Infors HT</td><td>l10003P</td><td>przez Infors HT</td></tr><tr><td>Picus 12 kanałów 50-1200&mu; l Pipeta elektroniczna</td><td>Sartorius</td><td>735491PR</td><td>przez</td></tr><tr><td>końcówki filtrujące Sartorius 50-1200&mu; L, opakowanie 960</td><td>Biohit</td><td>14-559-512</td><td>przez Fisher Scientific; Używaj elektronicznych końcówek kompatybilnych z wieloma kanałami</td></tr><tr><td>Suchy lód</td><td>Dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>emMateriały do indywidualnego przechowywania mutantów</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek premium Fisherbrand: 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-130</td><td>przez Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Pipety (P1000, P200, P20, P2)</td><td>Gilson</td><td>F167370</td><td>za pośrednictwem Gilson</td></tr><tr><td>Materiały do kontroli jakości Probówki do mikrowirówek premium PCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand: 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-130</td><td>przez Fisher</td></tr><tr><td>Scientific NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td>przez</td></tr><tr><td>ThermoFisher PCR Thermo Cycler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki do PCR Omnistrips z wypukłymi pokrywkami</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB0404</td><td>przez Fisher</td></tr><tr><td>Scientific ART Barierowe końcówki do pipet o niskiej retencji (10 uL, 100 uL, 1000 uL)</td><td>Molecular BioProducts, Inc.</td><td>Z676543 (10 μl), Z676713 (100 μl), Z676802 (1000 μl)</td>za pomocą pipet <td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>(P1000, P200, P20, P2)</td><td>Probówki</td> wirówkowe <td></td><td>Gilson F167370 przez Gilson</td></tr><tr><td>Fisherbrand Premium: 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-130</td><td>przez Fisher</td></tr><tr><td>Scientific MasterZestaw do oczyszczania DNA Pure</td><td>Epicentre</td><td>MCD85201</td><td>za pośrednictwem Epicentre Technologies Corp</td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder, gotowy do użycia</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM1333</td><td>przez ThermoFisher</td></tr><tr><td>RediLoad Loading Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>750026</td><td>przez ThermoFisher</td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemicals do przechowywania w bibliotece i indywidualnych mutantów</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycerol MB Grade, 1L</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td>przez Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>LB Rosół</td><td></td><td></td><td>na 1L dH2O: 10g tryptonu, 5g ekstraktu drożdżowego, 5g NaCl, 1ml 1N NaOH (Aktualne protokoły w biologii molekularnej.&nbsp; Wiley, 1994).</td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7293</td><td>przez ekstrakt drożdżowy Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y1625</td><td>przez Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>przez Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8045</td><td>przez Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>LB&nbsp; agar</td><td></td><td></td><td>Zobacz przygotowanie powyżej, dodaj 15g Bacto Agar</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5306</td><td>przez Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Siarczan gentamycyny, 10g</td><td>BioReagent</td><td>1405-41-0</td> przez siarczan kanamycyny <td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td></td><td>Gibco</td><td>11815024</td><td>przez ThermoFisher</td></tr><tr><td>Etanol, 190 proof</td><td>Decon</td><td>04-355-221</td><td>przez Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Chemicals do kontroli jakości PCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Startery</td><td>Preferowany przez użytkownika dostawca</td><td></td><td>Zobacz startery wymienione w Tabeli 3</td></tr><tr><td>Corning cellgro Biologia molekularna Klasa Woda</td><td>Corning</td><td>46000CV</td><td>przez Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Taq Bufor polimerazy</td><td>Invitrogen</td><td>10342020</td><td>przez ThermoFisher</td></tr><tr><td>Taq DNA Polimeraza, rekombinowana</td><td>Invitrogen</td><td>10342020</td><td>przez ThermoFisher</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Invitrogen</td><td>10297018</td><td>przez ThermoFisher</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td>przez Sigma-Aldrich</td></tr></tbody></table>

replikacja uporządkowanej, nieredundantnej biblioteki mutantów insercji transpozonów pseudomonas aeruginosa szczepu pa14

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa to fenotypowo i genotypowo zróżnicowana i zdolna do adaptacji bakteria Gram-ujemna, wszechobecna w środowisku ludzkim. P. aeruginosa jest zdolny do tworzenia biofilmów, rozwijania oporności na antybiotyki, wytwarzania czynników wirulencji i szybkiej ewolucji w przebiegu przewlekłej infekcji. Tak więc P. aeruginosa może powodować zarówno ostre, jak i przewlekłe, trudne do leczenia infekcje, powodując znaczną zachorowalność w niektórych populacjach pacjentów. Szczep PA14 P. aeruginosa jest ludzkim izolatem klinicznym o konserwatywnej strukturze genomu, który infekuje różnych gospodarzy ssaków i bezkręgowców, co czyni PA14 atrakcyjnym szczepem do badania tego patogenu. W 2006 roku stworzono nieredundantną bibliotekę mutantów do insercji transpozonów, zawierającą 5459 mutantów odpowiadających 4596 przewidywanym genom PA14. Od tego czasu dystrybucja biblioteki PA14 pozwoliła społeczności badawczej lepiej zrozumieć funkcję poszczególnych genów i złożonych szlaków P. aeruginosa. Utrzymanie integralności biblioteki poprzez proces replikacji wymaga odpowiedniej obsługi i precyzyjnych technik. W tym celu w niniejszym manuskrypcie przedstawiono protokoły, które szczegółowo opisują etapy związane z replikacją biblioteki, kontrolą jakości biblioteki i prawidłowym przechowywaniem poszczególnych mutantów.

Dwanaście nowych kopii zestawu PA14NR zostało powielonych zgodnie z Protokołem I, a następnie przeprowadzono ocenę kontroli jakości wygenerowanych nowych kopii zgodnie z Protokołem III.
Płyty mutantów zestawu PA14NR wraz z płytami kontrolnymi, składającymi się z dołków zaszczepionych szczepem dzikim PA14 oraz dołków niezaszczepionych, rozmieszczonych naprzemiennie według ustalonego wzoru (Rysunek 4A...

Zakażenie Pseudomonas aeruginosa powoduje znaczną zachorowalność u wrażliwych gospodarzy. Nieredundantna biblioteka mutantów insercji transpozonów szczepu PA14 P. aeruginosa, oznaczona jako PA14NR Set, ułatwia analizę funkcjonalności genów w wielu procesach. Przedstawiono tutaj protokół do generowania wysokiej jakości kopii biblioteki mutantów PA14NR Set.

Replikacja uporządkowanej, nieredundantnej biblioteki mutantów insercji transpozonów Pseudomonas aeruginosa szczepu PA14

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Ogólnym celem tego protokołu jest wygenerowanie wysokiej jakości kopii uporządkowanej, nieredundantnej biblioteki mutantów transpozonów szczepu Pseudomonas aeruginosa PA14, określanej jako zestaw PA14NR. Protokół ten zachowuje integralność zestawu PA14NR podczas replikacji, generując wysokiej jakości kopie tej biblioteki. Główną zaletą tego protokołu jest to, że zapewnia szczegółowy opis wszystkich kroków związanych z replikacją biblioteki, kontrolą jakości i prawidłowym przechowywaniem poszczególnych mutantów.Chociaż protokół ten został zaprojektowany do replikacji zestawu P14NR, można go dostosować do replikacji innych bibliotek bakteryjnych. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności z powodu ryzyka zanieczyszczenia podczas procesu replikacji. Dlatego ten protokół zawiera szczegółowe instrukcje krok po kroku, aby zmniejszyć to ryzyko.Nasze laboratorium dystrybuuje zestaw PA14NR do światowej społeczności naukowej. Zaleca się, aby biblioteki były replikowane przez użytkownika końcowego. Aby udzielić wskazówek, oferujemy protokół szczegółowo opisujący, jak generować wysokiej jakości kopie biblioteki.Wizualna demonstracja tego protokołu ma kluczowe znaczenie, zwłaszcza kroki mające na celu zapobieganie zanieczyszczeniu krzyżowemu. Do samoobrony, a także ochrony kultur bakteryjnych, należy zawsze nosić fartuch laboratoryjny, rękawice i maskę podczas pracy z nieredundantną biblioteką mutantów do insercji transpozonów szczepu PA14 P aeruginosa, oznaczoną jako zestaw PA14NR. Przygotuj płytki agarowe LB, wlewając około 60 mililitrów stopionego agaru LB do prostokątnych płytek.Wysuszyć płytki w sterylnym kapturze przez około godzinę przed użyciem. Stwórz sterylne pole za pomocą palnika Bunsena na blacie wytartym etanolem. I ustaw pojemniki z odpowiednimi roztworami do sterylizacji sworzni replikatora.Wyjmij płytkę główną PA14NR z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i umieść ją na suchym lodzie w 4-litrowej misce do lodu. Wziąć 96-dołkową płytkę wzorcową, która ma zostać odtworzona z suchego lodu, i umieścić ją na ławce, aby umożliwić krótkie rozmrożenie. Wyrównaj płytkę wzorcową i płytkę agarową ze współrzędną A1 obu płytek w lewym górnym rogu.Zaznacz położenie współrzędnej A1 na prostokątnej płytce agarowej. Aby wysterylizować kołki replikatora, zanurz je w 250 mililitrach 0,3 do 0,5% podchlorynu sodu na 30 sekund. Lekko postukaj w replikator, aby usunąć nadmiar płynu i zanurz szpilki w 250 mililitrach sterylnej ultraczystej wody na 10 sekund, a następnie 250 mililitrów 70% etanolu na 30 sekund i 250 mililitrów 95% etanolu na dwie minuty.Płomieniem wysterylizuj kołki replikatora, trzymając replikator prostopadle do płomienia palnika Bunsena, powoli zbliżając się do płomienia, aż etanol się zapali, a następnie natychmiast wycofując go z płomienia. Płomień zgaśnie, gdy wypali się cały etanol. Schłodzić szpilki, przypinając je do nieużywanej prostokątnej płytki zawierającej sterylny agar LB przez 30 sekund.Podczas gdy kołki replikatora stygną, krótko rozgrzej ręką aluminiową uszczelkę z płyty głównej zestawu PA14NR, a następnie ostrożnie ją zdejmij, upewniając się, że uszczelka nie retuszuje płytki. Użyj pęsety, aby odkleić wszelkie resztki aluminiowej uszczelki. Włóż kołki replikatora do płytki głównej, delikatnie popychając i kołysząc replikator we wszystkich czterech kierunkach, aby upewnić się, że kołki stykają się z zamrożonymi kulturami bakteryjnymi w każdym z 96 dołków.Zwróć szczególną uwagę na studzienki znajdujące się na zewnętrznej krawędzi płytki, dociskając kołki replikatora do zamrożonych kultur w dołkach znajdujących się na krawędzi płytki. Delikatnie umieścić kołki replikatora na powierzchni płytek agarowych. Poruszaj replikatorem lekkimi ruchami okrężnymi, aby utworzyć wiele trawników o wielkości około czterech do pięciu milimetrów dla każdego zmutowanego szczepu.Uszczelnij płytkę główną zestawu PA14NR za pomocą nowej sterylnej aluminiowej uszczelki. Użyj wałka do płyty, aby upewnić się, że każda studzienka i krawędzie płyty są całkowicie uszczelnione. Umieść 96-dołkową płytkę wzorcową z powrotem w suchym lodzie.Po obsłudze zestawu PA14NR przetrzyj wszystkie powierzchnie robocze 70% etanolem. Przenieś zduplikowaną płytkę agarową do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza i inkubuj przez noc. Przed rozpoczęciem tej procedury upewnij się, że okap z przepływem laminarnym jest wolny od zbędnych urządzeń i włącz dmuchawę okapu na co najmniej 10 minut.Wytrzyj powierzchnie okapu i wszelkie przedmioty umieszczone w okapie za pomocą 70% etanolu. Używając 12-kanałowej pipety elektronicznej o pojemności od 50 do 1200 mikrolitrów, napełnij każdą studzienkę bloku studzienki o głębokości 12 mililitrów 525 mikrolitrami płynnego bulionu LB zawierającego odpowiednie antybiotyki. Następnie uszczelnij głęboki blok studzienki przed wyjęciem go z okapu z przepływem laminarnym.Następnie przenieś wypełniony pożywką blok studni głębinowej na stół wytarty etanolem. Stwórz sterylne pole z palnikiem Bunsena na blacie stołu i ustaw pojemniki z odpowiednimi roztworami do sterylizacji kołków replikatora. Zanurz kołki replikatora w każdym roztworze, jak pokazano wcześniej.Wysterylizuj płomieniem kołki replikatora. Następnie ostudź szpilki, wkładając je do nieużywanej prostokątnej płytki zawierającej agar LB przez 30 sekund. Delikatnie umieścić kołki replikatora na płytce agarowej zawierającej wyhodowane zmutowane szczepy i sprawdzić, czy szpilki stykają się ze wszystkimi 96 mutantami na płytce agarowej.Następnie zanurz szpilki w głębokich studzienkach zawierających płynny bulion LB na pięć do 10 sekund. Unikaj dotykania boków studzienek szpilkami. Uszczelnij blok studni głębinowej sterylną, oddychającą membraną uszczelniającą.Użyj wałka do płyty, aby upewnić się, że każda pojedyncza studzienka jest odpowiednio uszczelniona. Po obsłudze zestawu PA14NR przetrzyj wszystkie powierzchnie robocze 70% etanolem. Hoduj zaszczepione płynne kultury w wytrząsarce o wysokiej prędkości w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 950 obr./min przez 15 do 16 godzin.Zacznij od oczyszczenia okapu z przepływem laminarnym i włączenia dmuchawy okapu na co najmniej 10 minut. Wytrzyj wszystkie powierzchnie okapu i wszelkie przedmioty umieszczone w okapie 70% etanolem. Wyjmij 96-dołkowe płytki z plastikowej folii.Odklej etykietę płytki dla każdej płytki i umieść ją wzdłuż krawędzi płytki znajdującej się najbliżej dołków od A1 do H1 płytki docelowej. Lekko unieś pokrywę tabliczki docelowej i umieść etykietę na dolnej krawędzi, aby wyświetlić etykietę, gdy tabliczka jest przykryta pokrywką. Wyjmij blok studni głębinowej z wytrząsarki wysokoobrotowej i przenieś blok do sterylnego okapu z przepływem laminarnym.Ostrożnie zdejmij oddychającą membranę uszczelniającą i zastąp ją aluminiową uszczelką. Zakręć blok studni głębinowej z bardzo niską prędkością, aby zebrać kondensację. Ponieważ przenoszenie kultur na płytki docelowe stwarza największe ryzyko potencjalnego zanieczyszczenia między studzienkami, bardzo ważne jest dokładne przestrzeganie wszystkich procedur w celu utrzymania sterylności.Włóż blok studni głębinowej do sterylnego okapu. Używając 12-kanałowej pipety elektronicznej o pojemności od 50 do 1200 mikrolitrów i sterylnych końcówek z filtrem, dodaj 525 mikrolitrów płynnej mieszanki bulionu glicerolu LB do każdej studzienki. Wymieszać, delikatnie pipetując 300 mikrolitrów w górę i w dół trzy razy za pomocą pipety elektronicznej.Dotknij końcówek z boku studzienek przed wstrzyknięciem końcówek, aby zapobiec kapaniu. Załaduj pipetę nowymi sterylnymi końcówkami z filtrem i napełnij następny rząd studzienek płynną mieszanką bulionową glicerolu LB. Po napełnieniu wszystkich studzienek płynną mieszanką bulionową glicerolu LB, użyj 12-kanałowej pipety elektronicznej i przefiltrowanych końcówek, aby wyciągnąć 900 mikrolitrów mieszanki kultur mutantów glicerolu z każdego rzędu bloku studni głębinowej i dozować 150 mikrolitrów do studzienek w odpowiednim rzędzie na płytkach docelowych, aby wygenerować sześć kopii płytki bibliotecznej.Użyj sterylnej aluminiowej uszczelki, aby przykryć każdą 96 płytek docelowych dołka i użyj wałka do płyty, aby całkowicie uszczelnić krawędzie płytki i wszystkie studzienki. Upewnij się, że identyfikator etykiety nie zakrywa aluminiową uszczelką. Wyjmij uszczelnione talerze z okapu i umieść je na płaskiej, równej powierzchni w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Po kontakcie z biblioteką przetrzyj wszystkie powierzchnie robocze 70% etanolem. Korzystając z protokołu pokazanego w tym filmie, zreplikowano 12 kopii zestawu PA14NR, w tym płytki kontrolne, które składają się z dołków inokulowanych typu PA14 i niezaszczepionych interkalowanych w ustalony wzór. Płytki kontrolne zostały poddane oględzinom po replikacji na płytkach agarowych LB, aby upewnić się, że występują oczekiwane wzorce wzrostu.38 zmutowanych szczepów wybrano losowo z jednej z nowo wygenerowanych kopii zestawu PA14NR, a następnie przeprowadzono amplifikację PCR przy użyciu dowolnych starterów w celu potwierdzenia tożsamości mutantów transpozonów. Późniejsze sekwencjonowanie fragmentów DNA potwierdziło tożsamość mutanta u 35 z 38 badanych mutantów. Po opanowaniu replikacja całej biblioteki trwa około 80 godzin.Podczas korzystania z tego protokołu ważne jest, aby przez cały czas pamiętać o sterylności miejsca pracy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować wysokiej jakości kopie zestawu P14NR lub innych bibliotek bakteryjnych. Nie zapominaj, że praca z Pseudomonas może być niebezpieczna, a podczas wykonywania tego protokołu należy zawsze nosić środki ochrony osobistej.Protokół ten zachowuje nieredundantną bibliotekę mutantów Pseudomonas aeruginosa PA14, która nadal jest ważnym zasobem, nie tylko do wysokoprzepustowych badań przesiewowych, ale także jako źródło indywidualnych mutacji w większości genów Pseudomonas aeruginosa.

replication-ordered-nonredundant-library-pseudomonas-aeruginosa

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Kazi, M. I., et al., Generowanie bibliotek insercji transpozonów w bakteriach Gram-ujemnych do sekwencjonowania wysokoprzepustowego. J . Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje selekcję, kwantyfikację i zachowanie bakterii biorców Gram-ujemnych przenoszących inserpozycje transpozonów w oparciu o oporność na kanamycynę.

Izolacja bakterii Gram-ujemnych z insercją transpozonów genomowych

Tutaj opisujemy protokół wykorzystujący mutagenezę za pośrednictwem transpozonu mini-himar1 mariner do generowania biblioteki mutantów insercyjnych o wysokiej gęstości do badania, izolacji i identyfikacji nowych regulatorów alginianu w prototypowym szczepie Pseudomonas aeruginosa PAO1.

Identyfikacja nowych genów związanych z produkcją alginianów u Pseudomonas aeruginosa przy użyciu mutagenezy za pośrednictwem transpozonu Mini-himar1 Mariner

Enterobacter sp. YSU rośnie w pożywce z minimalnymi solami glukozy. Auksotrofy są generowane przez przekształcenie go w transposom, który losowo wstawia się do genomu gospodarza. Mutanty są znajdowane przez replikowanie posiewu ze złożonej pożywki do minimalnej pożywki. Przerwane geny są identyfikowane przez ratowanie genów i sekwencjonowanie.

Wytwarzanie auksotrofów Enterobacter sp. YSU z wykorzystaniem mutagenezy transpozonów

Tutaj moc losowej insercji niekodującego elementu DNA za pośrednictwem transpozonu została wykorzystana do określenia jego optymalnej pozycji chromosomalnej.

Określenie optymalnej lokalizacji chromosomalnej dla elementu DNA w Escherichia coli przy użyciu nowatorskiego podejścia opartego na transpozonach

Przedstawiona tutaj jest prosta metoda tworzenia biblioteki wstawiania transpozonów o dużej gęstości w Escherichia coli lub Shigella flexneri przy użyciu koniugacji bakteryjnej. Protokół ten pozwala na stworzenie kolekcji setek tysięcy unikalnych mutantów w bakteriach poprzez losową insercję genomową transpozonu.

Stworzenie gęstej biblioteki insercji transpozonów za pomocą koniugacji bakteryjnej w szczepach enterobakteryjnych, takich jak Escherichia coli czy Shigella flexneri

Opisujemy tutaj technikę, która łączy mutagenezę transpozonów z sekwencjonowaniem o wysokiej przepustowości w celu identyfikacji i ilościowego określenia transpozonów mutantów leptospiralnych w tkankach po wyzwaniu chomików. Protokół ten może być stosowany do badań przesiewowych mutantów pod kątem przeżycia i rozprzestrzeniania się u zwierząt, a także może być stosowany w badaniach in vitro.

Wysokoprzepustowe sekwencjonowanie równoległe w celu pomiaru sprawności Leptospira interrogans Mutanty insercji transpozonów podczas infekcji złotego chomika syryjskiego

Tutaj prezentujemy eksperymentalną metodę testowania roli wielokopijnych plazmidów w ewolucji oporności na antybiotyki.

Badanie roli plazmidów wielokopijnych w ewolucji oporności na antybiotyki

Opisujemy metodę generowania nasyconych bibliotek mutantów transpozonów w bakteriach Gram-ujemnych i późniejszego przygotowania bibliotek amplikonów DNA do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Jako przykład skupiamy się na patogenie ESKAPE, Acinetobacter baumannii, ale ten protokół jest podatny na szeroką gamę organizmów Gram-ujemnych.

Generowanie bibliotek insercji transpozonów w bakteriach Gram-ujemnych w celu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości

Protokół ten przedstawia szybką i skuteczną metodę identyfikacji czynników genetycznych zaangażowanych w różne typy ruchliwości u Pseudomonas aeruginosa.

Metoda wysokoprzepustowa do obserwacji fenotypów ruchliwości u Pseudomonas aeruginosa

Protokół opisujący zastosowanie systemu komórek przepływowych do hodowli i analizy biofilmów mikrobiologicznych w konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM).

Biofilm Pseudomonas aeruginosa i Saccharomyces cerevisiae w komórkach przepływowych

Poznaj protokół replikacji biblioteki mutantów transpozonowych Pseudomonas aeruginosa PA14NR z zachowaniem integralności próbek. Metoda obejmuje kontrolę jakości i minimalizację ryzyka zakażenia podczas pracy z bakteriami.

Replikacja uporządkowanej, nieredundantnej biblioteki mutantów insercji transpozonów Pseudomonas aeruginosa szczepu PA14

Przeglądaj więcej filmów