Replikacja uporządkowanej, nieredundantnej biblioteki mutantów insercji transpozonów Pseudomonas aeruginosa szczepu PA14

Ogólnym celem tego protokołu jest wygenerowanie wysokiej jakości kopii uporządkowanej, nieredundantnej biblioteki mutantów transpozonów szczepu Pseudomonas aeruginosa PA14, określanej jako zestaw PA14NR. Protokół ten zachowuje integralność zestawu PA14NR podczas replikacji, generując wysokiej jakości kopie tej biblioteki. Główną zaletą tego protokołu jest to, że zapewnia szczegółowy opis wszystkich kroków związanych z replikacją biblioteki, kontrolą jakości i prawidłowym przechowywaniem poszczególnych mutantów.

Chociaż protokół ten został zaprojektowany do replikacji zestawu P14NR, można go dostosować do replikacji innych bibliotek bakteryjnych. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności z powodu ryzyka zanieczyszczenia podczas procesu replikacji. Dlatego ten protokół zawiera szczegółowe instrukcje krok po kroku, aby zmniejszyć to ryzyko.

Nasze laboratorium dystrybuuje zestaw PA14NR do światowej społeczności naukowej. Zaleca się, aby biblioteki były replikowane przez użytkownika końcowego. Aby udzielić wskazówek, oferujemy protokół szczegółowo opisujący, jak generować wysokiej jakości kopie biblioteki.

Wizualna demonstracja tego protokołu ma kluczowe znaczenie, zwłaszcza kroki mające na celu zapobieganie zanieczyszczeniu krzyżowemu. Do samoobrony, a także ochrony kultur bakteryjnych, należy zawsze nosić fartuch laboratoryjny, rękawice i maskę podczas pracy z nieredundantną biblioteką mutantów do insercji transpozonów szczepu PA14 P aeruginosa, oznaczoną jako zestaw PA14NR. Przygotuj płytki agarowe LB, wlewając około 60 mililitrów stopionego agaru LB do prostokątnych płytek.

Wysuszyć płytki w sterylnym kapturze przez około godzinę przed użyciem. Stwórz sterylne pole za pomocą palnika Bunsena na blacie wytartym etanolem. I ustaw pojemniki z odpowiednimi roztworami do sterylizacji sworzni replikatora.

Wyjmij płytkę główną PA14NR z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i umieść ją na suchym lodzie w 4-litrowej misce do lodu. Wziąć 96-dołkową płytkę wzorcową, która ma zostać odtworzona z suchego lodu, i umieścić ją na ławce, aby umożliwić krótkie rozmrożenie. Wyrównaj płytkę wzorcową i płytkę agarową ze współrzędną A1 obu płytek w lewym górnym rogu.

Zaznacz położenie współrzędnej A1 na prostokątnej płytce agarowej. Aby wysterylizować kołki replikatora, zanurz je w 250 mililitrach 0,3 do 0,5% podchlorynu sodu na 30 sekund. Lekko postukaj w replikator, aby usunąć nadmiar płynu i zanurz szpilki w 250 mililitrach sterylnej ultraczystej wody na 10 sekund, a następnie 250 mililitrów 70% etanolu na 30 sekund i 250 mililitrów 95% etanolu na dwie minuty.

Płomieniem wysterylizuj kołki replikatora, trzymając replikator prostopadle do płomienia palnika Bunsena, powoli zbliżając się do płomienia, aż etanol się zapali, a następnie natychmiast wycofując go z płomienia. Płomień zgaśnie, gdy wypali się cały etanol. Schłodzić szpilki, przypinając je do nieużywanej prostokątnej płytki zawierającej sterylny agar LB przez 30 sekund.

Podczas gdy kołki replikatora stygną, krótko rozgrzej ręką aluminiową uszczelkę z płyty głównej zestawu PA14NR, a następnie ostrożnie ją zdejmij, upewniając się, że uszczelka nie retuszuje płytki. Użyj pęsety, aby odkleić wszelkie resztki aluminiowej uszczelki. Włóż kołki replikatora do płytki głównej, delikatnie popychając i kołysząc replikator we wszystkich czterech kierunkach, aby upewnić się, że kołki stykają się z zamrożonymi kulturami bakteryjnymi w każdym z 96 dołków.

Zwróć szczególną uwagę na studzienki znajdujące się na zewnętrznej krawędzi płytki, dociskając kołki replikatora do zamrożonych kultur w dołkach znajdujących się na krawędzi płytki. Delikatnie umieścić kołki replikatora na powierzchni płytek agarowych. Poruszaj replikatorem lekkimi ruchami okrężnymi, aby utworzyć wiele trawników o wielkości około czterech do pięciu milimetrów dla każdego zmutowanego szczepu.

Uszczelnij płytkę główną zestawu PA14NR za pomocą nowej sterylnej aluminiowej uszczelki. Użyj wałka do płyty, aby upewnić się, że każda studzienka i krawędzie płyty są całkowicie uszczelnione. Umieść 96-dołkową płytkę wzorcową z powrotem w suchym lodzie.

Po obsłudze zestawu PA14NR przetrzyj wszystkie powierzchnie robocze 70% etanolem. Przenieś zduplikowaną płytkę agarową do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza i inkubuj przez noc. Przed rozpoczęciem tej procedury upewnij się, że okap z przepływem laminarnym jest wolny od zbędnych urządzeń i włącz dmuchawę okapu na co najmniej 10 minut.

Wytrzyj powierzchnie okapu i wszelkie przedmioty umieszczone w okapie za pomocą 70% etanolu. Używając 12-kanałowej pipety elektronicznej o pojemności od 50 do 1200 mikrolitrów, napełnij każdą studzienkę bloku studzienki o głębokości 12 mililitrów 525 mikrolitrami płynnego bulionu LB zawierającego odpowiednie antybiotyki. Następnie uszczelnij głęboki blok studzienki przed wyjęciem go z okapu z przepływem laminarnym.

Następnie przenieś wypełniony pożywką blok studni głębinowej na stół wytarty etanolem. Stwórz sterylne pole z palnikiem Bunsena na blacie stołu i ustaw pojemniki z odpowiednimi roztworami do sterylizacji kołków replikatora. Zanurz kołki replikatora w każdym roztworze, jak pokazano wcześniej.

Wysterylizuj płomieniem kołki replikatora. Następnie ostudź szpilki, wkładając je do nieużywanej prostokątnej płytki zawierającej agar LB przez 30 sekund. Delikatnie umieścić kołki replikatora na płytce agarowej zawierającej wyhodowane zmutowane szczepy i sprawdzić, czy szpilki stykają się ze wszystkimi 96 mutantami na płytce agarowej.

Następnie zanurz szpilki w głębokich studzienkach zawierających płynny bulion LB na pięć do 10 sekund. Unikaj dotykania boków studzienek szpilkami. Uszczelnij blok studni głębinowej sterylną, oddychającą membraną uszczelniającą.

Użyj wałka do płyty, aby upewnić się, że każda pojedyncza studzienka jest odpowiednio uszczelniona. Po obsłudze zestawu PA14NR przetrzyj wszystkie powierzchnie robocze 70% etanolem. Hoduj zaszczepione płynne kultury w wytrząsarce o wysokiej prędkości w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 950 obr./min przez 15 do 16 godzin.

Zacznij od oczyszczenia okapu z przepływem laminarnym i włączenia dmuchawy okapu na co najmniej 10 minut. Wytrzyj wszystkie powierzchnie okapu i wszelkie przedmioty umieszczone w okapie 70% etanolem. Wyjmij 96-dołkowe płytki z plastikowej folii.

Odklej etykietę płytki dla każdej płytki i umieść ją wzdłuż krawędzi płytki znajdującej się najbliżej dołków od A1 do H1 płytki docelowej. Lekko unieś pokrywę tabliczki docelowej i umieść etykietę na dolnej krawędzi, aby wyświetlić etykietę, gdy tabliczka jest przykryta pokrywką. Wyjmij blok studni głębinowej z wytrząsarki wysokoobrotowej i przenieś blok do sterylnego okapu z przepływem laminarnym.

Ostrożnie zdejmij oddychającą membranę uszczelniającą i zastąp ją aluminiową uszczelką. Zakręć blok studni głębinowej z bardzo niską prędkością, aby zebrać kondensację. Ponieważ przenoszenie kultur na płytki docelowe stwarza największe ryzyko potencjalnego zanieczyszczenia między studzienkami, bardzo ważne jest dokładne przestrzeganie wszystkich procedur w celu utrzymania sterylności.

Włóż blok studni głębinowej do sterylnego okapu. Używając 12-kanałowej pipety elektronicznej o pojemności od 50 do 1200 mikrolitrów i sterylnych końcówek z filtrem, dodaj 525 mikrolitrów płynnej mieszanki bulionu glicerolu LB do każdej studzienki. Wymieszać, delikatnie pipetując 300 mikrolitrów w górę i w dół trzy razy za pomocą pipety elektronicznej.

Dotknij końcówek z boku studzienek przed wstrzyknięciem końcówek, aby zapobiec kapaniu. Załaduj pipetę nowymi sterylnymi końcówkami z filtrem i napełnij następny rząd studzienek płynną mieszanką bulionową glicerolu LB. Po napełnieniu wszystkich studzienek płynną mieszanką bulionową glicerolu LB, użyj 12-kanałowej pipety elektronicznej i przefiltrowanych końcówek, aby wyciągnąć 900 mikrolitrów mieszanki kultur mutantów glicerolu z każdego rzędu bloku studni głębinowej i dozować 150 mikrolitrów do studzienek w odpowiednim rzędzie na płytkach docelowych, aby wygenerować sześć kopii płytki bibliotecznej.

Użyj sterylnej aluminiowej uszczelki, aby przykryć każdą 96 płytek docelowych dołka i użyj wałka do płyty, aby całkowicie uszczelnić krawędzie płytki i wszystkie studzienki. Upewnij się, że identyfikator etykiety nie zakrywa aluminiową uszczelką. Wyjmij uszczelnione talerze z okapu i umieść je na płaskiej, równej powierzchni w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Po kontakcie z biblioteką przetrzyj wszystkie powierzchnie robocze 70% etanolem. Korzystając z protokołu pokazanego w tym filmie, zreplikowano 12 kopii zestawu PA14NR, w tym płytki kontrolne, które składają się z dołków inokulowanych typu PA14 i niezaszczepionych interkalowanych w ustalony wzór. Płytki kontrolne zostały poddane oględzinom po replikacji na płytkach agarowych LB, aby upewnić się, że występują oczekiwane wzorce wzrostu.

38 zmutowanych szczepów wybrano losowo z jednej z nowo wygenerowanych kopii zestawu PA14NR, a następnie przeprowadzono amplifikację PCR przy użyciu dowolnych starterów w celu potwierdzenia tożsamości mutantów transpozonów. Późniejsze sekwencjonowanie fragmentów DNA potwierdziło tożsamość mutanta u 35 z 38 badanych mutantów. Po opanowaniu replikacja całej biblioteki trwa około 80 godzin.

Podczas korzystania z tego protokołu ważne jest, aby przez cały czas pamiętać o sterylności miejsca pracy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować wysokiej jakości kopie zestawu P14NR lub innych bibliotek bakteryjnych. Nie zapominaj, że praca z Pseudomonas może być niebezpieczna, a podczas wykonywania tego protokołu należy zawsze nosić środki ochrony osobistej.

Protokół ten zachowuje nieredundantną bibliotekę mutantów Pseudomonas aeruginosa PA14, która nadal jest ważnym zasobem, nie tylko do wysokoprzepustowych badań przesiewowych, ale także jako źródło indywidualnych mutacji w większości genów Pseudomonas aeruginosa.